CN102365364B - 用于选择高效表达重组细胞系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用表达载体来选择高效表达重组细胞系的方法，表达载体包括：(i)包括以失活方式连接到多聚腺苷酸化信号的选择性标记基因的基因表达盒；以及(ii)编码以活性方式连接到多聚腺苷酸化信号的目标重组蛋白的基因表达盒。根据本发明的方法可用现有细胞系选择方法中等于或少于1/10的细胞群选出高产量细胞克隆。具体说来，与增加甲氨蝶呤量及包括多个扩增相的常规相基因扩增策略相比较，本发明的方法使用较低密度的甲氨蝶呤来选择高产量细胞克隆，以缩短细胞系的发育时间。本发明的方法使得在使用除甲氨蝶呤外的一般选择性标记基因时，实现高效地产生蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及一种选择高效表达相关蛋白质的细胞系(下文中称为“高产量克隆”)的方法，更具体说来，涉及通过使用表达载体来选择高产量克隆的方法，所述表达载体包括：(i)包括以不可操作方式连接到多聚腺苷酸化信号(polyA)的选择性标记基因的基因表达盒；以及(ii)编码相关重组蛋白并且以可操作方式连接到多聚腺苷酸化信号的基因表达盒；并且涉及所述表达载体。
背景技术
在生物学或医学领域中，通过将欲产生的相关蛋白质的基因插入表达载体中，将表达载体转染到产生这种蛋白质的细胞系中，大量培养所得细胞系，并使用适合的方法分离和纯化培养的细胞系，以此获得相关蛋白质。
工业上用于此目的的方法的实例包含使用二氢叶酸还原酶(dhfr，dihydrofolate reductase)中国仓鼠卵巢(CHO，Chinese hamster ovary)(-)细胞系、CHO K1细胞系、幼仓鼠肾(BHK，Baby Hamster Kidney)细胞系、NS0细胞系、SP2/0细胞系和人细胞系的方法(奥格塔(Ogata)等人，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，1993，38(4)，520-525；克拉杰(Kratje)等人，生物技术研究进展(Biotechnol.Prog.)，1994，10(4)，410-20；皮克曼(Peakman)等人，人类抗体与杂交瘤(Hum.Antibodies Hybridomas)，1994，5(1-2)，65-74)。
为了产生表达相关异源基因的稳定哺乳动物细胞系，一般通过转染将异源基因与选择性标记基因(例如，新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase))一起引入所需细胞系中。可借助单一载体或借助共转染 的单独载体来同时表达异源基因和选择性标记基因。转染后2天到3天，将细胞转移到含有选择剂(例如，在使用新霉素磷酸转移酶基因作为选择性标记基因的情况下为G418)的培养基中，并在这些选择条件下培养数周。随后分离出自然产生抗性的细胞，并针对所需基因产物的表达进行研究。由于细胞随机且非定向整合到宿主细胞基因组中，以致获得的细胞群具有完全不同的异源基因表达率。这些细胞群也可包含表达选择性标记物但不表达相关基因的非表达细胞。因此，为了鉴别能极高效表达相关异源基因的细胞克隆，需要检查并测试大量克隆，而此举是耗费时间、劳动密集且昂贵的。
基因扩增是在动物细胞培养物中进行的用于产生重组蛋白的常用技术。基因扩增可以显著提高许多哺乳动物细胞系相对较低的产率。此项技术中广泛使用的一种扩增技术是基于二氢叶酸还原酶(dhfr)的基因扩增系统，这一系统最常用于dhfr缺陷型CHO细胞中。
工业上优选dhfr缺陷型CHO细胞系的原因如下：(1)蛋白质的翻译后修饰(糖基化或磷酸化)比其它细胞更接近于人类细胞；(2)不仅可能进行粘附培养，而且还可能进行悬浮培养；(3)与其它细胞相比较，这些细胞可在无血清培养基中以相对较高的浓度培养；(4)可以使用dhfr/甲氨蝶呤(MTX，methotrexate)基因扩增系统增加明显低于微生物的相关蛋白质的生产率；和(5)经证实，这些细胞是安全的，并因此易于获得例如FDA等相关权威机构的批准。出于上述原因，dhfr缺陷型CHO细胞系已被广泛用于工业目的，用以构建产生相关蛋白质的重组细胞系。
然而，即使在使用经由将编码相关蛋白质的基因引入dhfr缺陷型CHO细胞中，随后通过逐步增加MTX浓度处理细胞，来显著增加相关蛋白质的产量的常规dhfr/MTX基因扩增系统时，选择具有高产率的细胞群也是劳动密集、耗费时间和成本的，因为需要长时间用递增浓度的MTX处理细胞的方法，而且要在此方法中筛选的细胞群数量为500到4,000个或更多。因此，已经尝试通过各种方式来简化此选择。
举例来说，此项技术中的研究人员曾试图使用以下方法来简化选择步骤：1)通过修饰起始密码子的附近来降低选择性标记基因的表达的方法(雷夫(Reff)，美国专利第5,733,779号，1998)；2)通过使选择性标记基因突变来削弱基因功能的方法(丹羽(Niwa)等人，基因(Gene)108，193-200，1991；索特(Sauter)和恩尼克(Enenkel)，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)89，530-538，2005)；3)修饰起始密码子本身并将经过修饰的起始密码子与欲表达的基因连接，由此增加基因表达水平的方法(范布洛克兰(van Blokland)等人，生物技术杂志(J of Biotechnology)128，237-245，2007)；和4)将选择性标记基因连接到内含子并表达所述基因的方法(卢卡斯(Lucas)等人，核酸研究(NucleicAcids Res.)24，1774-1779，1996)。
技术问题
因此，本发明一个目的是提供一种通过使用表达载体来选择高产量克隆的方法，所述表达载体包括以不可操作方式连接到多聚腺苷酸化信号(polyA)的选择性标记基因。
本发明另一目的是提供一种用于所述选择方法中的表达载体。
本发明另一目的是提供一种用所述表达载体转染的真核宿主细胞系。
技术解决方案
为了实现以上目的，本发明提供一种通过使用表达载体来选择高产量克隆的方法，所述表达载体包括：(i)包括以不可操作方式连接到多聚腺苷酸化信号(polyA)的选择性标记基因的基因表达盒；以及(ii)编码相关重组蛋白并且以可操作方式连接到polyA的基因表达盒。
本发明还提供一种表达载体，其包括：(i)包括以不可操作方式连接到polyA的选择性标记基因的基因表达盒；以及(ii)编码相关重组蛋白并且以可操作方式连接到polyA的基因表达盒。
本发明还提供一种用所述表达载体转染的真核宿主细胞系。
在下文中，将描述本发明中使用的术语的定义。
本文中使用的术语“选择性标记基因”是指已与相关蛋白质的基因连接并插入表达载体中，由此允许鉴别正常表达相关基因的细胞的标记基因。当向培养基中添加由选择性标记基因编码的蛋白质抑制剂时，可增加选择性标记基因的拷贝数或连接到选择性标记基因的相关蛋白质基因的拷贝数。选择性标记物的实例包含dhfr基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase)基因、嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(puromycin-N-acetyltransferase，pac)基因和印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus，Sh)ble基因。
本文中使用的术语“polyA”是指引起真核mRNA 3′端的特定位点裂解并在裂解的3′端转录后并入具有约100到200个腺嘌呤核苷酸(多聚腺苷酸尾)的序列的信号序列。polyA是指在裂解位点上游约10到30个核苷酸处的一致序列AATAAA及位于下游的序列。已知各种polyA，例如tk polyA、SV40晚期和早期polyA或BGH polyA。
本文中使用的术语“以可操作方式连接(operably linked)”是指，一个核酸片段连接到另一核酸片段，使得所述核酸片段的功能或表达受所述另一核酸片段影响。术语“以可操作方式连接”还用于描述基因序列与启动子或者其它调控或加工序列之间的连接，以致所述基因序列的转录由以可操作方式连接的启动子序列所引导，所述基因序列的翻译由以可操作方式连接的翻译调控序列所引导，或所述基因序列的翻译后加工由以可操作方式连接的加工序列所引导。术语“以不可操作方式连接(inoperably linked)”的含义与术语“以可操作方式连接”相反，且一般意欲包含由于例如裂解、缺失、点突变和氨基酸置换等所属领域技术人员已知的方法进行的人工处理而变得不可操作的连接。
在下文中，将详细地描述本发明。
本发明人已经针对选择高产量克隆的新颖方法进行了研究，结果发现， polyA将明显影响mRNA的转录和稳定性，并且当polyA的长度随时间推移略微变短时，mRNA开始降解，且因此，如果polyA不能正常操作，那么mRNA的半衰期就会比正常mRNA短得多。根据这一发现，本发明人在进行开发新颖选择方法的研究的同时，注意到了polyA。
举例来说，当使连接到表达载体中选择性标记基因的polyA不能操作，接着转染到宿主细胞中，随后在存在由选择性标记基因编码的蛋白质的抑制剂的选择条件下培养时，上面带有不能正常操作的polyA的选择性标记基因无法稳定产生mRNA，并因此大部分细胞将在选择条件下被杀死，而只有用大量载体拷贝转染过的细胞能存活下来。由于用于转染的表达载体包含选择性标记基因和编码相关重组蛋白的基因，故存在的编码相关重组蛋白的基因的较大拷贝数与选择性标记基因的拷贝数成比例。
为了说明利用连接到选择性标记基因的polyA的可操作性作为用于选择高产量克隆的新颖方法，在本发明中，用适合的限制性酶裂解连接到pCT107载体(参看图1)上选择性标记基因dhfr 3′端的polyA，以使polyA不可操作。随后，将所得表达载体转染到CHO DG44细胞系(测试组)中，并将由这一细胞系选择高产量克隆的过程与由用未经限制性酶处理的pCT107载体转染的CHO DG44细胞系(对照组)选择高产量克隆的过程相比较。结果显示，在测试组中，每一板中细胞生长的孔数是对照组的约1/7.6，且生长细胞的比率为(1/26264)∶(1/814815)，这表明测试组中生长细胞的比率是对照组中的1/31(参看表2)。
接着，为了比较对照组与测试组之间生长细胞的产率，从每一组中选出6个显示最高产率的细胞系，并研究其产率。研究发现，在对照组的情况下，6个p克隆中只有一个p克隆显示出每3天约100微克/毫升的产率，而在测试组的情况下，6个p克隆中有4个p克隆显示出每3天约100微克/毫升的产率(参看图6)。
另外，为了确定上述本发明的选择方法是否也适用于除在CHO DG44细 胞中使用dhfr选择性标记物的系统外的其它系统，使用在CHO K1细胞中带有pac选择性标记物的系统来进行实验。为此，除去pCT112载体(参看图7和图8)上的dhfr转录单元(启动子-dhfr-polyA)，并将SV40启动子和pac基因插入载体中，由此构建出测试载体(pCT130载体，参看图7)。另外，将SV40启动子、pac基因和polyA(pac转录单元)插入载体中，以构建对照载体(pCT129载体，参看图8)。随后，将构建的每一载体转染到CHO K1细胞中，并选择对照细胞系和测试细胞系，随后研究所选细胞系的产率。从图9到图13中可以看出，来源于测试组(pCT130载体)的克隆的产率高于来源于对照组(pCT129载体)的克隆的产率。已经发现，在产率明显高于在基于孔板的选择步骤中所获得的产率的摇瓶分批培养物中，来自测试组的单细胞源性克隆的产率(67微克/毫升到72微克/毫升)比来自对照组的单细胞源性克隆的产率(2微克/毫升到10微克/毫升)高得多。
因此，本发明人发现，根据本发明实施例的选择方法可用于减少通过使用各种选择标记物来选择高产量克隆的成本和时间，由此完成本发明。
一方面，本发明提供一种通过使用表达载体来选择高产量克隆的方法，所述表达载体包括：(i)包括以不可操作方式连接到polyA的选择性标记基因的基因表达盒；以及(ii)编码相关重组蛋白并且以可操作方式连接到polyA的基因表达盒。
在本发明一个实施例中，表达标记物可包括用包括除去了polyA的选择性标记基因的基因表达盒来代替包括以不可操作方式连接到polyA的选择性标记基因的基因表达盒(i)。
另一方面，本发明还提供一种选择高产量克隆的方法，所述方法包括用适合的限制性酶裂解表达载体，所述表达载体包括(i)含有以可操作方式连接到polyA的选择性标记基因的基因表达盒和(ii)编码相关重组蛋白并且以可操作方式连接到polyA的基因表达盒，由此使表达载体线性化，以致基因表达盒(i)的polyA不能操作。
在本发明一个实施例中，选择性标记基因的实例包含(但不限于)dhfr基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素磷酸转移酶基因(neomycine phosphotransferase)、潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin Bphosphotransferase)、嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)基因和印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus，Sh)ble基因。除这些标记基因外，所属领域技术人员已知的任何选择性标记基因都可用于本发明中。
在本发明一个实施例中，相关重组蛋白优选为(但不限于)单克隆抗体。
在本发明一个实施例中，宿主细胞的实例包含(但不限于)真核宿主细胞，优选人类宿主细胞，包含CHO细胞、杂交瘤细胞或F2N细胞。除这些细胞外，所属领域技术人员已知可作为产生重组蛋白的细胞系的任何细胞系都可用于本发明中。
另一方面，本发明还提供一种表达载体，其包括：(i)包括以不可操作方式连接到polyA的选择性标记基因的基因表达盒；以及(ii)编码相关重组蛋白并且以可操作方式连接到polyA的基因表达盒。
在本发明一个实施例中，表达载体可包括用包括除去了polyA的选择性标记基因的基因表达盒来代替包括以不可操作方式连接到polyA的选择性标记基因的基因表达盒(i)。
在本发明一个实施例中，表达载体可包括用供引入编码相关重组蛋白的基因的多克隆位点来代替编码相关重组蛋白且以可操作方式连接到polyA的基因表达盒(ii)。
在本发明一个实施例中，选择性标记基因为可扩增选择性标记基因，优选(但不限于)dhfr基因或谷氨酰胺合成酶基因。
在本发明一个实施例中，选择性标记基因为(但不限于)新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素B磷酸转移酶基因、pac基因或Sh ble基因。
在本发明一个实施例中，相关重组蛋白优选为(但不限于)单克隆抗体。
另一方面，本发明提供一种用所述表达载体转染的真核宿主细胞系。
在本发明一个实施例中，宿主细胞优选是动物细胞。在本发明的实例中，使用CHO细胞系，但可用于本发明中的宿主细胞不限于此。所属领域技术人员已知的产生重组蛋白的细胞系，包含杂交瘤细胞或F2N细胞，都可用于本发明中。转染优选使用所属领域技术人员已知的方法进行。
有利作用
根据本发明，可用现有细胞系选择方法中等于或少于1/10的细胞群选出高产量克隆。具体说来，与进行多个扩增步骤，同时增加MTX浓度的常规分步基因扩增策略相比较，可以使用较低浓度的MTX来选择高产量克隆。因此，可以缩短细胞系的发育期，并减少选择高产量克隆所需的劳动和成本，使得有可能更高效地产生重组蛋白。
附图说明
图1是pCT107表达载体的裂解谱图。谱图上所示的限制性酶Pme I、ClaI和Rsr II表示裂解pCT107载体，从而使连接到pCT107表达载体所编码的抗体的重链基因、轻链基因以及DHFR基因的polyA不能操作的位点。
图2显示用对照组(A)、测试组(B)、测试组(C)和测试组(D)表达载体中每一个转染的CHO细胞中IgG抗体的表达滴度的测量结果。在图2中，对照组(A)：未用限制性酶处理过的环形pCT107载体；测试组(B)：通过用Rsr II处理使连接到dhfr基因的polyA不能操作的线性pCT107载体；测试组(C)：通过用Pme I处理使连接到重链基因的polyA不能操作的线性pCT107载体；以及测试组(D)：通过用Cla I处理使连接到轻链基因的polyA不能操作的线性pCT107载体。在样品不含重链也不含轻链(测试组(C)和测试组(D))的情况下，归因于ELISA的特征，无法测量IgG的滴度。本实验总共进行5次，并且将误差范围以标准误差表示。
图3是显示在96孔板规模上根据连接到dhfr基因的polyA的存在或不存在来选择细胞克隆的方法中所示滴度比较的图。在图3中，未切割：正常的 环形pCT107载体；以及RsrII切割：通过用Rsr II处理使连接到dhfr基因的polyA不能操作的线性pCT107载体。
图4是显示在24孔板规模上根据连接到dhfr基因的polyA的存在或不存在来选择细胞克隆的方法中所示滴度比较的图。在图4中，未切割：正常的环形pCT107载体；以及RsrII切割：通过用Rsr II处理使连接到dhfr基因的polyA不能操作的线性pCT107载体。
图5是显示在6孔板规模上根据连接到dhfr基因的polyA的存在或不存在来选择细胞克隆的方法中所示滴度比较的图。在图5中，未切割：正常的环形pCT107载体；以及RsrII切割：通过用Rsr II处理使连接到dhfr基因的polyA不能操作的线性pCT107载体。
图6是显示在摇瓶分批培养条件下比较来自对照组与测试组中每一个的6个p克隆的产率的结果的图，其中这些p克隆是根据对照组和测试组中polyA的存在或不存在而选出的高滴度克隆。在图6中，未切割：正常的环形pCT107载体；以及RsrII切割：通过用Rsr II处理使连接到dhfr基因的polyA不能操作的线性pCT107载体。
图7是显示克隆pCT130表达载体的方法的示意图。
图8是显示克隆pCT129表达载体的方法的示意图。
图9是显示在96孔板规模上比较对照组与测试组产率的结果的图。在图9中，pCT129(含polyA)：具有polyA活性的对照组；以及pCT130(不含polyA)：缺失polyA的测试组。
图10是显示在24孔板规模上比较对照组与测试组产率的结果的图。在图10中，pCT129(含polyA)：具有polyA活性的对照组；以及pCT130(不含polyA)：缺失polyA的测试组。
图11是显示在6孔板规模上比较对照组与测试组的产率的结果的图。在图11中，pCT129(含polyA)：具有polyA活性的对照组；以及pCT130(不含polyA)：缺失polyA的测试组。
图12是显示在6孔板规模上比较对照组与测试组产率的结果的图。
图13是显示在使用摇瓶的分批培养中比较对照组与测试组产率的结果的图。
具体实施方式
缩写
dhfr：二氢叶酸还原酶
CHO：中国仓鼠卵巢
polyA：多聚腺苷酸化信号
p-clone：非单细胞源性克隆的初级克隆
MTX：甲氨蝶呤
ELISA：酶连免疫吸附分析
下文中，将参照实例详细描述本发明。然而，应了解，这些实例只是出于说明的目的，而不应视为限制本发明的范围。
实例1：引入不可操作的polyA
在根据polyA的存在或不存在来检查基因表达水平的第一步骤中，为了使以可操作方式连接到表达IgG抗体的pCT107载体(图1)中三个转录单元(dhfr基因、重链基因和轻链基因)的3′端的polyA不可操作，用Rsr II、PmeI和Cla I限制性酶中每一个裂解pCT107载体。限制性酶Rsr II、Pme I和ClaI是通过特异性识别并裂解dhfr基因、重链基因和轻链基因中每一个的3′端与相应polyA之间存在的特定序列来使表达IgG抗体的载体线性化的酶。
用限制性酶进行的处理是按以下方式进行。准备三个试管，并分别在试管中添加(i)30微克pCT107载体DNA和10个单位(U)Rsr II(R0501S，NEB)；(ii)30微克pCT107载体DNA和10个单位Pme I(R0560S，NEB)；和(iii)30微克pCT107载体DNA和10个单位Cla I(R1097S，NEB)且混合，并在37℃下培育4小时。接下来，向各试管中的总样品中添加以样品总 体积计0.1体积的NaOAC和3体积100％乙醇(EtOH)，并涡旋，随后使其在-70℃下静置30分钟以使DNA小球沉淀。接着，以13,000转/分钟(rpm)离心各试管的内含物10分钟，以使DNA小球沉淀在试管底部上，并除去各试管中残留的乙醇。随后，用相同体积的70％乙醇洗涤小球，并以13,000转/分钟离心10分钟，且除去各试管中残留的乙醇。随后，在空气中干燥DNA小球10分钟。将蒸馏水添加到干燥的小球中，并使其在室温下静置10分钟。随后，使用吸液管再悬浮DNA小球，以使其能完全溶解于蒸馏水中。使用纳诺多谱1000(Nanodrop 1000)分光光度计(赛默科技公司(Thermo scientific))测量DNA的浓度，并进行琼脂糖凝胶电泳以确定Rsr II、Pme I或Cla I限制性酶是否使载体DNA线性化。表达载体线性化表明，pCT107载体中连接到三个转录单元(重链基因、轻链基因和dhfr基因)的polyA都变得不可操作。
实例2：转染到CHO细胞系中
将根据实例1线性化的载体转染到相同量的CHO DG44细胞中。进行下表1中所示对照组和测试组中的转染。
[表1]
| 对照组(A) | 未用限制性酶处理过的环形pCT107载体 |
| 测试组(B) | 通过用Rsr II处理使连接到dhfr的polyA不能操作的线性pCT107载体。 |
| 测试组(C) | 通过用Pme I处理使连接到dhfr的polyA不能操作的线性pCT107载体。 |
| 测试组(D) | 通过用Cla I处理使连接到dhfr的polyA不能操作的线性pCT107载体。 |
按以下方式进行转染。使用补充有10％FBS(12105，西格玛公司(Sigma))的MEMα培养基(1140076，英杰公司(Invitrogen))将CHO DG44细胞按0.5×106个细胞/孔的密度接种到6孔板中，24小时后，用不含FBS的MEMα培养基更换所述培养基。30分钟后，将2.5微克来自对照组(A)、测试组(B)、测试组(C)和测试组(D)中每一个的载体DNA连同500微升Opti-SFM培养基(12309-050，英杰公司(Invitrogen))一起添加到各孔中，之后向其中添加6.25微升LTX(15338-100，英杰公司)，并使用涡旋混合器充分涡旋。使所得混合物在室温下静置30分钟，随后向各孔中添加500微升混合物。4 小时后，用含血清的MEMα培养基更换所述培养基。
实例3：使用ELISA确定IgG抗体基因的表达
为了确定IgG抗体基因是否得到表达，转染后3天，进行ELISA。首先，将山羊抗人免疫球蛋白G(Fcγ)(109-006-098，杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoReserarch))吸附到96孔微量滴定板(449824，纽克公司(Nunc))上。用含1％牛血清白蛋白(BSA，Bovine Serum Albumin)的磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)阻断各板，随后向各孔中添加经过连续稀释的样品。使各板在室温下静置2小时后，用过氧化物酶标记的山羊抗人κ抗体(I1514，西格玛公司(Sigma))处理样品以供检测。在室温下静置1小时后，使样品与四甲基联苯胺(TMB，tetramethyl benzidine)反应，并向其中添加1N HCl以停止反应。使用250纳克/毫升浓度由骨髓瘤血浆纯化得到的人IgG1κ(A7164，西格玛公司(Sigma))作为标准品。使用读板器(连续光谱酶标仪(Spectramax plus 384)，分子装置公司(Molecular Device))测量在450/650纳米下的吸光度。
从图2中可看出，IgG在对照组(A)和测试组(B)中正常表达，但在测试组(C)和测试组(D)中未正常表达。这表明，在使连接到相应基因3′端的polyA不能操作的基因表达盒的情况下，由所述相应基因编码的蛋白质不能正常表达(测试组(C)和测试组(D))。
另外，还发现，在至少于不存在选择性药物的情况下培养细胞的瞬时转染过程中，由选择性标记基因编码的蛋白质(DHFR蛋白)的表达不会影响由表达载体中相应基因所编码的蛋白质(尤其是抗体)的表达水平。
实例4：使用polyA不能操作的dhfr标记基因选择细胞克隆
为了处理连接到选择性标记基因dhfr 3′端的polyA以使其不能操作，在与实例1中所述相同的条件下，用Rsr II限制性酶(R0501，NEB)处理pCT107载体，由此获得测试组(E)。将所得载体转染到CHO DG44细胞系中。使用未用限制性酶处理的pCT107载体(对照组(A))作为对照组。按与实例1中所述相同的方式进行转染。在将对照组(A)载体和测试组(E)载体引入细胞系中后3天，测量出IgG抗体的表达水平分别为3.9微克/毫升和3.8微克/毫升。转染后开始培养，3天后将对照组(A)和测试组(E)中每一个的细胞转移到96孔板上，随后在含2％胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)和100纳摩尔浓度(nM)MTX(813630，贝德福德实验公司(Bedford Lab))的SFM4CHOTM培养基(SH30549.02，海克隆公司(HyClone))中培养。在对照组(A)的情况下，每个96孔板接种并培养0.5×106个细胞，且在测试组(E)的情况下，每个96孔板接种并培养2×106个细胞。
培养后，检查存在生长细胞的孔数。结果是，在对照组(A)的情况下，总共2,592个孔中有514个孔(19.8％)显示细胞生长，且在测试组(E)的情况下，总共2112个孔中有54个孔(2.5％)显示细胞生长。换句话说，在对照组(A)中每一96孔板有19个孔中存在生长细胞，且在测试组的情况下，每一96孔板有2.5个孔中存在生长细胞。根据这些结果，如果假定在细胞生长呈阳性的每一孔中生长的细胞是来源于单细胞，那么各组之间生长细胞的比率为31∶1(对照组(A)：测试组(E))，差异相当明显(表2和图3到图5)。
[表2]
随后，从具有生长细胞的孔中选出显示高滴度的孔。因此，在对照组(A)中，从514各孔中选出157个孔，且在测试组(E)的情况下，从54个孔中选出28个孔。随后，将所选孔中的细胞转移到24孔板中并培养，同时增加培养规模，并于3天后，从对照组(A)和测试组(E)中每一个选出在24孔板中显示高滴度的6个细胞群，且接种并培养于6孔板中。从对照组(A)和测试组(E)中每一个中选择的6个细胞群命名为“p克隆”，并使用不含FBS且不含MTX的培养基将其接种于埃伦迈尔烧瓶(Erlenmeyer flask)中，并在搅拌下进行培养。将对照组(A)与测试组(E)的产率相互进行比较。
结果是，在对照组(A)的情况下，6个p克隆中只有一个p克隆显示出每3天约100微克/毫升的产率，而在测试组(E)的情况下，6个p克隆中有4个p克隆显示出每3天约100微克/毫升的产率(图6)。
实例5：用于选择性标记基因的细胞生长条件
为了检查与各种细胞系中进行基因扩增无关的一般选择性标记物的效用，在表3中所示条件下，向各细胞系施加作用于各选择性标记基因的药物，并测量细胞生长的抑制情况。
实验中使用的细胞系为CHO K1和F2N78(人细胞系)，且在CD Opti CHO培养基(12681，英杰公司(Invitrogen))和EX-CELL 293无血清培养基(14571c，西格玛公司(Sigma))中培养的各细胞系在本实例中以相同培养基培养。将5毫升每一细胞系按5×104个细胞/毫升和15×104个细胞/毫升的密度添加到6孔板每一孔中，所述密度分别对应于1×106个细胞/96孔板(20毫升)和3×106个细胞/96孔板(20毫升)的密度。1×106个细胞/96孔板和3×106个细胞/96孔板的密度是在使用缺失polyA的选择性标记物的实例6选择方法中使用的细胞密度。每一细胞系使用三种药物浓度，且每3天除去各孔中一半的培养基(2.5毫升)，并用相同量的新鲜培养基更换。本实验中所用药物的类型和细节显示于下表4中。在本文中，新鲜培养基通常含有指定浓度的药物。
2周后，通过用台盼蓝(trypan blue)对细胞染色，发现在所有药物处理条件(表3)下都未观察到未经转染的CHO K1细胞和F2N细胞生长。也就是说，转染后，在药物处理下培养物中生长细胞的存在表明，经过处理的药 物在经转染的选择性标记基因作用下失活，由此细胞生长。
[表3]
CHO K1细胞和F2N细胞的各种药物处理条件
(*F2N细胞含有neo基因)
[表4]
有关选择性药物的信息
实例6：使用不带polyA的pac选择性标记基因建立产生蛋白质的细胞系
如上文所确定的，使用以不可操作方式连接到polyA的dhfr选择性标记基因的选择方法能极高效地减少在CHO DG44细胞系中选择高产量克隆所需的成本和时间。为了检查这一选择方法是否也适用于除dhfr基因外的选择性标记物以及除CHO DG44细胞系外的细胞系，在本实例中，将使用完全缺失polyA的pac选择性标记基因的选择方法应用于CHO K1细胞系以检查其功效。
为了能完全消除polyA的功能，在本实例中，通过完全除去免疫球蛋白表达载体(pCT112载体)中的dhfr转录单元(启动子-dhfr基因-polyA)，并在其中插入启动子-pac基因或启动子-pac基因-polyA，来构建pCT130载体和pCT129载体(图7和图8)。这些载体是按以下方式构建。通过使用Pvu II(10-642-690-0014，罗氏公司(Roche))和Xba I(R0145S，NEB)限制性酶，从含有pac基因的pPUR载体(631601，克罗泰克公司(Clontech))中分离出SV40启动子和编码pac基因的序列，并克隆到已经使用Nru I(R0192L，NEB)和Xba I限制性酶除去了dhfr转录单元的pCT112载体中，由此构建出pCT130载体(图7)。另外，为进行比较，使用Pvu II和BamH I(R0136S，NEB)限制性酶从pPRU载体中分离出SV40启动子、pac基因和polyA，并克隆到除去了dhfr转录单元的pCT112载体中，由此构建出pCT129载体(图8)。
用pCT129载体和pCT130载体分别转染CHO K1细胞系，并在2天后，使用补充有各种浓度嘌呤霉素(如下表5中所示)的培养基将细胞接种于96孔板中。本实例中使用的培养基为不含FBS的CD OptiCHO培养基。在用pCT129载体转染的对照组中，0.3×106个细胞/板的接种密度和6微克/毫升嘌呤霉素的选择条件是适合的，而在用pCT130载体转染的测试组中，3×106个细胞/板的接种密度和6微克/毫升嘌呤霉素的选择条件是适合的。具体说来，在本实例中，通过进行数轮转染实验，从含有带polyA的选择性标记物的对照组和含有不带polyA的选择性标记物的测试组中选出类似数量的p克隆，并将p克隆中免疫球蛋白的表达水平相互进行比较。
[表5]
接种到96孔板中的细胞的选择条件的比较
借助ELISA测量在上述表5的选择条件下生长细胞的孔的抗体产量，并从96孔板中选出显示高抗体产率的p克隆(图9)，并转移到24孔板中。随后，为了再次测量抗体产率，对每一克隆样品进行2倍连续稀释，并借助ELISA加以分析(图10)。将这些p克隆中显示高抗体产率的41个p克隆转移到6孔板中，随后测量其抗体产率(图11)。从图9到图11可以看出，在用于选择具有高抗体产率的p克隆的两种方法(在96孔板中进行的选择方法和在24孔板中进行的选择方法)中，由来源于不含polyA的pCT130载体(测试组)的p克隆选出的具有高产率的p克隆比由来源于含polyA的pCT129载体(对照组)的多。
另外，从每一组中选出具有高产率的p克隆129-4和130-35，并对其进行有限稀释克隆(limiting dilution cloning，LDC)。当在96孔板中培养所选p克隆时，用2微克/毫升嘌呤霉素进行处理，而当在24孔板和6孔板中培养克隆时，不添加嘌呤霉素。通过在96孔板、24孔板和6孔板规模上进行选择过程，从每一组中选出具有高产率的5个单细胞克隆，并检查6孔板中的产率(图12)和摇瓶中的产率(图13)。一式两份，通过在相同条件下进行分批培养来测量摇瓶中的产率。
从图12可以看出，来源于pCT130载体的克隆产率(每3天25微克/毫升到32微克/毫升)是来源于pCT129载体的克隆产率(每3天7微克/毫升到18微克/毫升)的约2倍。这表明，由在选择性标记物中不含polyA的载体可构建出具有较高产率的克隆。在允许更明确检查产率的摇瓶分批培养条件下，如图13中所示，来源于在选择性标记物中不含polyA的pCT130载体(测试组)的克隆显示62微克/毫升到72微克/毫升产率，而来源于在选择性标记物中含有polyA的pCT129载体(对照组)的克隆显示2微克/毫升到10 微克/毫升产率。在这些细胞生长条件下，两组之间的细胞生长速率类似，但来源于pCT130载体(测试组)的克隆所显示的产率是来源于pCT129(对照组)的克隆的6倍。这一明显差异可能是由在来源于pCT129载体(对照组)的克隆的情况下，IgG的表达在选择条件不存在下易受抑制或IgG基因在所述条件下易缺失的现象所致。
上述结果显示，用根据本发明实施例的含有不带polyA的选择性标记物的表达载体，而不是用含有带polyA的选择性标记物的表达载体转染细胞系，是获得具有高抗体表达水平的细胞系的方法。因此，与包括进行多个扩增步骤，同时增加MTX的量的常规分步基因扩增策略相比较，根据本发明实施例的选择方法可缩短选择高产率细胞克隆所需的时间。由此可减少产生具有高产率的细胞克隆所需的劳动和成本。
Claims (6)
1.一种通过使用表达载体来选择产生相关重组蛋白的克隆的方法，所述表达载体包括：(i)包括以不可操作方式连接到多聚腺苷酸化信号的选择性标记基因的基因表达盒或除去了多聚腺苷酸化信号的选择性标记基因的基因表达盒；以及(ii)编码相关重组蛋白并且以可操作方式连接到多聚腺苷酸化信号的基因表达盒，所述方法包括将所述表达载体转染到宿主细胞中，所述宿主细胞为所述选择性标记基因缺陷的细胞；在存在由所述选择性标记基因编码的蛋白质的抑制剂的选择条件下培养转染过的所述宿主细胞；以及在所述选择条件下选择存活下来的所述宿主细胞为所述克隆，所述”不可操作方式”是指以靶向方式使用限制性酶切进行裂解、或以靶向方式进行缺失、点突变或氨基酸置换,以修饰所述选择性标记基因和所述多聚腺苷酸化信号之间的连接，以致使所述基因表达盒(i)中的多聚腺苷酸化信号不能稳定产生mRNA，而所述基因表达盒(ii)可以正常表达。
2.一种用于选择产生相关重组蛋白的克隆的方法，所述方法包括用限制性酶裂解表达载体，所述表达载体包括(i)包含以可操作方式连接到多聚腺苷酸化信号的选择性标记基因的基因表达盒以及(ii)编码相关重组蛋白并且以可操作方式连接到多聚腺苷酸化信号的基因表达盒，所述限制性酶是特异性识别并裂解所述选择性标记基因与所述多聚腺苷酸化信号之间存在的特定序列，由此使所述表达载体线性化，以致所述基因表达盒(i)的所述多聚腺苷酸化信号不能操作；将所述表达载体转染到宿主细胞中，所述宿主细胞为所述选择性标记基因缺陷的细胞；在存在由所述选择性标记基因编码的蛋白质的抑制剂的选择条件下培养转染过的所述宿主细胞；以及在所述选择条件下选择存活下来的所述宿主细胞为所述克隆。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述选择性标记基因是二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素B磷酸转移酶基因、嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因或印度斯坦链异壁菌ble基因。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述相关重组蛋白是单克隆抗体。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述真核宿主细胞是CHO细胞或杂交瘤细胞。
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