CN102363793B - 一种光合细菌絮凝剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物絮凝剂的制备方法，公开了一种光合细菌絮凝剂的制备方法及其应用，经培养基培养，选用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonaspalustris)为出发菌株，菌种保藏编号：CGMCC1.2181，先配制培养基，后经絮凝剂的提取，获得絮凝剂白色固体粉末成品。本发明的沼泽红假单胞菌不受环境影响而变异,性能稳定,该菌种所产絮凝剂储藏性能好,常温下(38⁰C以下)储存一年,絮凝剂絮凝效率可达95%以上；以细菌培养液生产的沼泽红假单胞菌絮凝剂,方法简便,发酵周期短,成本低,适用于大规模生产。

Description

一种光合细菌絮凝剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物絮凝剂的制备方法，尤其涉及了一种光合细菌絮凝剂的制备方法。

背景技术

很长时间以来,早就发现一些微生物有细胞絮凝现象，但一直未对其产生重视，近年来，细胞絮凝技术作为一种简便和经济分离技术在连续发酵及产品分离中得到广泛的应用。

能产生微生物絮凝剂的微生物种类很多，它们大量存在于土壤和废水处理的活性污泥中，除此之外，许多用于工业生产的菌种以及一些菌种保藏中心的不少细菌亦能产生高效的微生物絮凝剂。

微生物絮凝剂的有效成分是絮凝菌的代谢产物,絮凝能力的强弱取决于代谢产物的多少。一般来说，絮凝剂的有效成分应为聚多糖和糖蛋白等。

Kurane等人利用光合细菌中的红球菌 (Rhodococcuserythropolis)研制成功生物絮凝剂NOC-1，对泥浆水、河水、粉煤灰水、活性碳粉水、膨胀污泥、纸浆废水等均有极好的絮凝和脱色效果，是目前发现的最好的微生物絮凝剂之一。

本发明是以光合细菌中的沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)为出发菌株所产的絮凝剂WkF为制备目标, 从二十世纪八十年代开始, 沼泽红假单胞菌曾作为光合细菌的一种曾被报道用于高浓度废水处理中。该菌的特点,在光照和厌氧条件下,液体呈现红色,而在无光照和好氧条件下,液体无色素,而菌体的繁殖速度却成倍增加。本发明就是在无光照和好氧条件下菌体的繁殖速度快和代谢产物多的特性制备高效的微生物絮凝剂。

国内类似技术： 

（1）西安建筑科技大学聂麦茜等人的发明专利“一种微生物絮凝剂的生产方法及使用方法”(发明专利申请号200810017351.8，公开号CN101225405A), 该发明专利是以克雷伯氏菌的一个变种(Klebsiella pneumoniae)作为出发菌株制备微生物絮凝剂。

（2）湖南大学陶然等人的发明专利“利用豆渣生产微生物絮凝剂的生产菌及其生产工艺”(发明专利申请号200610031485.6，公开号CN1844360A),将多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa GA1 CCTCC M206017)接入液体培养基,采用两段发酵培养法,制备微生物絮凝剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种性能稳定，所产絮凝剂储藏性能好，絮凝效率高，制备方法简便，发酵周期短，成本低，适用于大规模生产的光合细菌絮凝剂的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种光合细菌絮凝剂的制备方法，其特征在于，具体方法如下：

选用沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)为出发菌株，菌种保藏编号:CGMCC1.2181，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心；本菌种购自于中国科学院微生物研究所（国家菌种保藏委员会）。

a、配制培养基：

1)菌种保藏培养基：(NH₄)₂SO₄ 1g，MgSO₄﹒7H₂O 0.2g，NaHCO₃ 5g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，蛋白胨1.5g，蒸馏水加至1L，琼脂15.0g，pH7.0；10⁵Pa灭菌15min；

2)种子培养基：KH₂PO₄ 0.5-5%，CaCl₂ 0.01-0.5%，乙酸钠0.2-2.0%，葡萄糖0.1-1.0%，蛋白胨0.1-1.5%，MnCl₂﹒4H₂O 0.1-1.0%，蒸馏水加至1L，pH6.8，10⁵Pa灭菌15-20min；以上百分比为质量百分比。

3)发酵培养基：KH₂PO₄ 0.5-5%，CaCl₂ 0.01-0.5%，乙酸钠0.2-2.0%，葡萄糖1-10%，蛋白胨0.5-5%，蒸馏水加至1L,pH6.8，10⁵Pa灭菌15-20min；以上百分比为质量百分比。

b、微生物的培养和发酵条件：

所述1) 菌种保藏培养基培养条件和保藏方法：在试管中加入未灭菌的培养基，约占试管的总量的1/3，灭菌后试管垂直放置在试管架上，冷却后放置一周，确认为无菌后，在无菌室中穿刺接入培养好的菌种，在30⁰C和光照下培养2-4周，光照箱内，以40瓦的电灯对称照射，光照强度以1000勒克司左右为佳，培养成熟的标志是穿刺针周围产生红色菌落, 培养成熟后的固体培养基以灭菌的矿物油在无菌室中加入试管中, 矿物油高于培养基1cm，放在4⁰C冰箱中保存；

所述2)种子培养基培养条件: 种子培养基在灭菌后接入保藏培养基菌种, 在25⁰C-35⁰C通气培养15-40h，通气比为1:0.5-2.0；

所述3)发酵培养基发酵条件：发酵培养基在灭菌后接入5-15%种子培养基的菌种，在25⁰C-35⁰C通气培养15-40h，通气比为1:0.5-2.0；

c、絮凝剂的提取：

培养成熟后的发酵液，以高速离心机在5000-10000r/min离心分离20-40min，分别收集清液和菌体，所述清液作为絮凝剂的制备液体，菌体作为综合利用可作饲料等。

收集上述清液，加入1-3倍的无水乙醇，混合均匀后，在容器中静止8-10h，收集沉淀物，沉淀物再以4000-8000r/min离心分离20-40min，收集固体；

d、絮凝剂成品制备：

上述固体真空干燥，获得絮凝剂白色固体粉末成品，真空干燥的温度：60⁰C±2⁰C，真空度0.06MPa。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

1、本发明的沼泽红假单胞菌不受环境影响而变异,性能稳定,该菌种所产絮凝剂储藏性能好,常温下(38⁰C以下)储存一年, 絮凝剂絮凝效率可达95%以上；

2、以细菌培养液生产的沼泽红假单胞菌絮凝剂,方法简便,发酵周期短,成本低,适用于大规模生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1

选用沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)为出发菌株，菌种保藏编号:CGMCC1.2181，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

絮凝剂产生菌培养工艺

1、培养基

1)种子培养基：H₂PO₄1.5%,CaCl₂ 0.02%,乙酸钠1.0%,葡萄糖0.5 %,蛋白胨1%,MnCl₂﹒4H₂O 0.7,蒸馏水加至1L,pH6.8, 10⁵Pa灭菌15min；

2)发酵培养基：H₂PO₄ 2%,CaCl₂ 0.03%,乙酸钠1.5%,葡萄糖8.0%,蛋白胨3.5%,蒸馏水加至1L,pH6.8, 10⁵Pa灭菌15min;

2、微生物的培养和发酵条件

1)种子培养基培养条件: 种子培养基在灭菌后接入保藏培养基菌种, 在30⁰C通气培养18h，通气比为1:1;

2) 发酵培养基发酵条件: 发酵培养基在灭菌后接入10%种子培养基的菌种，在30⁰C通气培养30h，通气比为1:1.2;

3、絮凝剂的提取

培养成熟后的发酵液，以高速离心机在8000r/min离心分离30min,分别收集清液和菌体,清液作为絮凝剂的制备液体, 菌体作为综合利用可作饲料等。

收集上述清液,加入2.5倍的无水乙醇,混合均匀后,在容器中静止8h,收集沉淀物,沉淀物再以6000r/min离心分离25min,收集固体。

4、絮凝剂成品制备

上述固体真空干燥,获得絮凝剂白色固体粉末成品, 真空干燥的温度:60⁰C±2⁰C,真空度0.06MPa。

实施例2

选用沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)为出发菌株，菌种保藏编号:CGMCC1.2181，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

絮凝剂产生菌培养工艺

1、培养基;

1)种子培养基；

KH₂PO₄ 1.0%,CaCl₂ 0.5%,乙酸钠1.5%,葡萄糖0.8%,蛋白胨0.8%,MnCl﹒4H₂O 0.5,蒸馏水加至1L,pH7.0, 10⁵Pa灭菌20min;

2) 发酵培养基；

KH₂PO₄ 0.5-5%,CaCl₂ 0.01-0.5%,乙酸钠0.2-2.0%,葡萄糖1-10%,蛋白胨0.5 -5%,蒸馏水加至1L,pH6.8, 10⁵Pa灭菌15-20min;

2、微生物的培养和发酵条件

1)种子培养基培养条件: 种子培养基在灭菌后接入保藏培养基菌种, 在35⁰C通气培养25h,通气比为1:1.5;

2) 发酵培养基发酵条件: 发酵培养基在灭菌后接入8%种子培养基的菌种,在35⁰C通气培养38h,通气比为1:1.5;

3、絮凝剂的提取

培养成熟后的发酵液，以高速离心机在7000r/min离心分离35min,分别收集清液和菌体,清液作为絮凝剂的制备液体, 菌体作为综合利用可作饲料等。

收集上述清液,加入3倍的无水乙醇,混合均匀后,在容器中静止10h,收集沉淀物,沉淀物再以5000r/min离心分离35min,收集固体。

4、絮凝剂成品制备

上述固体真空干燥,获得絮凝剂白色固体粉末成品, 真空干燥的温度:60⁰C±2⁰C,真空度0.06MPa。

实施例3

选用沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)为出发菌株，菌种保藏编号:CGMCC1.2181，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

絮凝剂产生菌培养工艺

1、培养基 

1)种子培养基；

KH₂PO₄ 2.5%，CaCl₂ 0.5%，乙酸钠1.8%，葡萄糖1.0%，蛋白胨1.2%，MnCl₂﹒4H₂O 0.9，蒸馏水加至1L，pH7.2，10⁵(Pa)灭菌20min;

2)发酵培养基；

KH₂PO₄ 1.0%,CaCl₂ 0.4%,乙酸钠2.0%,葡萄糖7.5%,蛋白胨4.0%,蒸馏水加至1L,pH6.8, 10⁵(Pa)灭菌20min; 

2、微生物的培养和发酵条件

1)种子培养基培养条件: 种子培养基在灭菌后接入保藏培养基菌种, 在28⁰C通气培养35h,通气比为1: 1.2;

2)发酵培养基发酵条件: 发酵培养基在灭菌后接入12%种子培养基的菌种,在28⁰C通气培养40h,通气比为1:1.1;

3、絮凝剂的提取

培养成熟后的发酵液，以高速离心机在6000r/min离心分离40min,分别收集清液和菌体,清液作为絮凝剂的制备液体，菌体作为综合利用可作饲料等。

收集上述清液,加入1.5倍的无水乙醇,混合均匀后,在容器中静止10h,收集沉淀物,沉淀物再以7000 r/min离心分离40min,收集固体。

4、絮凝剂成品制备

上述固体真空干燥,获得絮凝剂白色固体粉末成品，真空干燥的温度:60⁰C±2⁰C,真空度0.06MPa。

微生物絮凝剂絮凝率测定方法：

向100mL比色管中加入0.5g高岭土、3mL的1%CaCl₂溶液和2mL絮凝剂,然后加蒸馏水至100mL,盖上磨口塞,将比色管上下自然翻转和振荡2min,务必使高岭土和CaCl₂溶液以及絮凝剂完全溶解和充分混合,静止5min;

取比色管中50mL处的处理液,用722型分光光度计测定其在550nm波长处的吸光度OD₅₅₀(A),以其他条件相同但用2mL新鲜培养液代替作为处理液的空白对照(B),絮凝率(FR)的计算公式如下:

FR(%)=(A-B)/A×100；

经测定，上述3个实施例的絮凝剂的絮凝效率均可达95%以上。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种光合细菌絮凝剂的制备方法，其特征在于，具体方法如下： 

选用沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)为出发菌株，菌种保藏编号:CGMCC1.2181，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心； 

a、配制培养基： 

1)菌种保藏培养基：(NH₄)₂SO₄1g，MgSO₄﹒7H₂O0.2g，NaHCO₃5g，K₂HPO₄0.5g，NaCl0.2g，蛋白胨1.5g，蒸馏水加至1L，琼脂15.0g，pH7.0；10⁵Pa灭菌15min； 

2)种子培养基：KH₂PO_$0.5-5%，CaCl₂0.01-0.5%，乙酸钠0.2-2.0%，葡萄糖0.1-1.0%，蛋白胨0.1-1.5%，MnCl﹒4H₂O0.1-1.0，蒸馏水加至1L，pH6.8，10⁵(Pa)灭菌15-20min； 

3)发酵培养基：KH₂PO_$0.5-5%，CaCl₂0.01-0.5%，乙酸钠0.2-2.0%，葡萄糖1-10%，蛋白胨0.5-5%，蒸馏水加至1L,pH6.8，10⁵Pa灭菌15-20min； 

b、微生物的培养和发酵条件： 

所述1)菌种保藏培养基培养条件和保藏方法：在试管中加入未灭菌的培养基，占试管的总量的1/3，灭菌后试管垂直放置在试管架上，冷却后放置一周，确认为无菌后，在无菌室中穿刺接入培养好的菌种，在30℃和光照下培养2-4周，光照箱内，以40瓦的电灯对称照射，光照强度 为1000勒克司，培养成熟的标志是穿刺针周围产生红色菌落,培养成熟后的固体培养基以灭菌的矿物油在无菌室中加入试管中,矿物油高于培养基1cm，放在4℃冰箱中保存； 

所述2)种子培养基培养条件:种子培养基在灭菌后接入保藏培养基菌种,在25℃-35℃通气培养15-40h，通气比为1:0.5-2.0； 

所述3)发酵培养基发酵条件：发酵培养基在灭菌后接入5-15%种子培养基的菌种，在25℃-35℃通气培养15-40h，通气比为1:0.5-2.0； 

c、絮凝剂的提取： 

培养成熟后的发酵液，以高速离心机在5000-10000r/min离心分离20-40min，分别收集清液和菌体，所述清液作为絮凝剂的制备液体； 

收集上述清液，加入1-3倍的无水乙醇，混合均匀后，在容器中静止8-10h，收集沉淀物，沉淀物再以4000-8000r/min离心分离20-40min，收集固体； 

d、絮凝剂成品制备： 

上述固体真空干燥，获得絮凝剂白色固体粉末成品，真空干燥的温度：60℃±2℃，真空度0.06MPa。