CN102341705A

CN102341705A - 克罗恩氏病诊断试剂

Info

Publication number: CN102341705A
Application number: CN2010800104585A
Authority: CN
Inventors: 须贺泰世; 森妹子; 桥本雅棋; 铃木学; 森口智美; 河口贵昭; 斎藤惠子; 高添正和
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: EA Pharma Co Ltd
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-03-05
Also published as: JP5660027B2; US20120058497A1; KR20110131262A; JPWO2010101255A1; CN102341705B; WO2010101255A1

Abstract

本发明提供用于安全、简便且特异性地诊断克罗恩氏病的试剂以及方法。提供对象的克罗恩氏病的诊断方法，该方法包括测定由该对象采取的样品中的、针对选自葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦、玉米、米和大豆中的1种以上饮食成分的各抗体，提供含有上述饮食成分的制备物的克罗恩氏病的诊断用试剂或试剂盒。

Description

克罗恩氏病诊断试剂

技术领域

本发明涉及安全且高灵敏度地、特异性地诊断克罗恩氏病的方法和克罗恩氏病的诊断用试剂，以及含有该试剂的诊断用试剂盒。

背景技术

克罗恩氏病，与溃疡性大肠炎(UC)一起，均为基于免疫学应答异常的分类为局部炎症性肠疾病(IBD)的疾病。与炎症局限于大肠的UC不同，克罗恩氏病是在从口腔到肛门的消化道的全部部位均可出现溃疡的疾病。作为临床症状，经常出现以腹痛、腹泻为主，进而发热、便血、由于吸收障碍所导致的体重减少、全身倦怠感、贫血等症状。此外，有时并发坏疽性脓皮症、结节性红斑等皮肤症状，关节病变、口腔炎等肠道外并发症。

但是，克罗恩氏病的病因仍然未充分清楚，其诊断和治疗存在限制。

例如，克罗恩氏病的诊断，除了临床所见之外，还可以对于X射线造影检查、内窥镜检查、内窥镜下采取的活体组织检查标本的组织检查等综合性地进行判断来进行，这些检查中，检查前的肠道内清洗需要时间，造影剂的给药、内窥镜对肠道的插入等对于患者在肉体上、精神上造成很大的负担，而且手艺和辨别需要经验和熟练的技术。

特别是在小肠型或小肠为主的小肠大肠型的情况下，由于小肠的结构复杂以及发病部位距离内窥镜的插入部(肛门或口腔)远等原因，利用X射线造影检查或内窥镜进行的检查，需要更高的技术。

此外，难以与表现出类似病理所见的UC等其它炎症性肠疾病进行鉴别的例子多，故要求安全、简便且对于克罗恩氏病特异性的诊断方法。

克罗恩氏病的发病和恶化，认为受到各种遗传性以及环境性原因的复杂影响，其中，暗示来源于包含肠内细菌的微生物的抗原与之相关，认为针对微生物的异常免疫应答与克罗恩氏病中的炎症反应密切相关。例如有报告指出，抗酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)抗体(ASCA)、抗I2抗体、抗外膜蛋白质C(OmpC)抗体、抗鞭毛蛋白抗体等，在克罗恩氏病患者的血清中特异性地增加。另一方面有报告指出，除了微生物之外，针对CRP、猪淀粉酶的抗体效价在克罗恩氏病患者的血清中特异性增加。基于上述发现，提出了通过检出这些抗体来非侵袭性地诊断克罗恩氏病的方法(专利文献1和2，非专利文献1～3)。

但是，使用单一的抗体作为标记物的这些方法中，灵敏度(真阳性率)均至多止于40%左右。通过组合多种抗体，可以提高灵敏度(专利文献3)，但是存在难以得到I2抗原、OmpC抗原、鞭毛蛋白抗原、CRP抗原等问题。

饮食，与肠内细菌同样地作为通过肠道的异物，有可能对肠道免疫造成影响。对于克罗恩氏病的治疗来说，要素饮食疗法是有效的，因此暗示存在一些饮食抗原作为病因或恶化因子，但是仍未清楚特定的饮食抗原在克罗恩氏病中的参与。

现有技术文献

专利文献1：日本特开平11-190734号公报

专利文献2：本特表2004-526122号公报

专利文献3：日本特开2006-308494号公报

非专利文献

非专利文献1：Jpn J Electroph 1999；43：139-145

非专利文献2：Gastroenterology 2002；123：689-699

非专利文献3：Gastroenterology 2000；119：23-31。

发明内容

发明要解决的课题

本发明要解决的课题在于，提供安全、简便且特异性地诊断克罗恩氏病的新型方法，以及用于此的试剂和含有该试剂的诊断用试剂盒。

用于解决课题的手段

解决上述课题时，本发明人首先注意到有报告指出，在克罗恩氏病中，由于肠道上皮的屏障机构存在障碍，故膜透过性亢进，易暴露于抗原，想到饮食抗原有可能参与克罗恩氏病中的炎症反应。因此，对从克罗恩氏病患者、UC患者和健康人采取的血清中的、针对各种饮食成分的抗体效价进行测定，并相互比较。结果成功地鉴定了19个品种的在来源于克罗恩氏病患者的样品中特异性地发现血清抗体效价的上升的饮食成分。其中14个品种，为至今完全未被暗示与克罗恩氏病相关的饮食成分。

进一步地，本发明人确认，通过将上述19个品种中的2种以上组合来使用，可以进一步提高克罗恩氏病诊断的灵敏度和特异度(真阴性率)，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述：

[1] 对象的克罗恩氏病的诊断方法，其特征在于，测定由该对象采取的样品中的、针对选自葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜(cabbage)、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃(pecan nut)、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦、玉米、米和大豆中的1种以上饮食成分的各抗体，其中，测定针对1种饮食成分的抗体时，该饮食成分为除了芹菜、荞麦、玉米、酵母和大豆之外的饮食成分。

[2] [1]的方法，其特征在于，测定针对2种以上的饮食成分的各抗体。

[3] [2]的方法，其中，至少一种饮食成分为除了芹菜、荞麦、玉米、酵母和大豆之外的饮食成分。

[4] [2]或[3]的方法，其特征在于，测定针对选自葡萄柚、甘蓝菜、莴苣、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦和玉米中的至少1种饮食成分的抗体。

[5] [2]～[4]中任一项的方法，其特征在于，测定至少针对酵母和玉米的各抗体。

[6] [2]～[5]中任一项的方法，其特征在于，测定针对3种以上的饮食成分的各抗体。

[7] [6]的方法，其特征在于，测定至少针对酵母、玉米、以及荞麦或芹菜的各抗体。

[8] [1]～[7]中任一项的方法，其特征在于，测定针对饮食成分中含有的多肽抗原的各抗体。

[9] [8]的方法，其中，上述多肽抗原为谷蛋白(glutelin)。

[10] 克罗恩氏病的诊断用试剂，其含有选自葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、米和甘蔗中的饮食成分的制备物。

[11] [10]的试剂，其中，上述制备物为经分离或纯化的多肽抗原。

[12] [11]的试剂，其中，上述多肽抗原为谷蛋白或具有抗原性的其部分肽。

[13] 克罗恩氏病的诊断用试剂盒，其含有选自葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦、玉米、米和大豆中的2种以上的饮食成分的制备物。

[14] [13]的试剂盒，其中，上述制备物为经分离或纯化的多肽抗原。

[15] [14]的试剂盒，其中，上述多肽抗原为谷蛋白或具有抗原性的其部分肽。

发明效果

本发明的诊断方法，通过组合对克罗恩氏病特异性的抗饮食成分抗体的抗体效价测定，在可以显著提高克罗恩氏病诊断的灵敏度和特异度，可以限定利用了需要高技术、且对患者的负担也大的内窥镜等的侵袭性方法进行诊断的适应范围方面，发挥显著的效果。此外，由于使用饮食成分，故进一步具有容易获得试剂的优点。

附图说明

图1为表示米蛋白质的CBB染色的结果的图。泳道M表示蛋白质分子量标记物，泳道a表示米蛋白质，左端的数值表示蛋白质的分子量(kDa)。

图2为表示米蛋白质的免疫印迹的结果的图。泳道C表示使用克罗恩氏病患者(CD)的血清作为抗体的结果，泳道H表示使用健康人(HC)的血清作为抗体的结果，左端的数值表示蛋白质的分子量(kDa)。“A”表示发现了与CD的血清中的抗体的特异性反应的条带。

具体实施方式

本发明提供克罗恩氏病的诊断方法，该方法包括测定由诊断对象采取的样品中的、1种以上的克罗恩氏病特异性抗饮食成分抗体。本发明中，“克罗恩氏病特异性抗饮食成分抗体”指的是，在患有克罗恩氏病的动物中，抗体效价特异性地上升的、针对饮食成分的抗体，具体地说，指的是针对葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦、玉米、米和大豆这19种饮食成分的各抗体(以下也称为“本发明的抗饮食成分抗体”)。应予说明，其中，为“克罗恩氏病特异性”指的是，在患有克罗恩氏病的动物中，抗体效价上升的频率(阳性率：真阳性率)至少比患有UC的动物和健康动物中的该频率显著性地高。

此外，本发明的抗饮食成分抗体，可以为针对各种饮食成分中含有的多肽抗原(各种饮食成分的抗原)的各抗体。饮食成分的多肽抗原，具体地说，只要是葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦、玉米、米和大豆的饮食成分中含有的多肽抗原，并且为克罗恩氏病特异性多肽抗原则可以为任意的多肽抗原。本发明中，上述19种饮食成分中，优选为米、荞麦、玉米和甘蔗，作为它们中含有的多肽抗原，若为米，则可以例示谷蛋白、乙二醛酶(glyoxylase)1、烯醇酶(enolase)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase)、天冬氨酸蛋白酶(asparatic protease)、醇溶谷蛋(prolamin)、油质蛋白(oleosin)等，若为荞麦，则可以例示网格蛋白(clathrin)等，若为玉米，则可以例示2,3-双磷酸甘油酸酯-独立磷酸甘油酸酯变位酶(2,3-bisphosphoglycerate -independent phosphoglyceratemutase)、蛋白二硫化物异构酶(protein disulfide isomerase)、酮醇酸还原异构酶(ketol-acid reductoisomerase)、延伸因子1 α (elongation factor 1 alpha)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase)等，若为甘蔗则可以例示三磷酸酯异构酶(triphosphate isomerase)1、NBS-LRR type RGA等。

本发明的诊断方法中，诊断对象可以为有可能患有克罗恩氏病(包括相当于人的克罗恩氏病的非人炎症性肠疾病)的任意动物，例如哺乳动物，具体地说，可以例示人、非人灵长类、狗、猫、兔子、大鼠和小鼠等。

用于诊断的样品，只要是可以从诊断对象分离、来源于有可能存在克罗恩氏病特异性抗饮食成分抗体的对象的成分或组织，则不特别限定，可以举出例如血液(全血、血清、血浆)、唾液、其它体液、各种组织等，但是特别优选为血清或血浆。使用用于参考的溃疡性大肠炎患者和/或作为对照的健康人的样品时，它们的样品也与之相同。

对于样品中的各抗体的测定方法，作为免疫学上的测定方法，只要是用于检出、测定抗体的方法，则可以为任意方法，可以使用以酶、荧光物质、发光物质、放射性物质、着色物质等作为标记物质的惯用测定方法中的任意方法，但是优选为酶免疫测定法、免疫色谱法等，进一步地，在可以通过着色量、吸光度而容易地将样品中的抗体量数值化方面，特别优选酶免疫测定法、例如ELISA法。作为同时测定针对多品种的抗体的方法，例如可以使用可测定93个品种食品的IgG的市售的ELISA试剂盒(93 Food IgGScreen/GENESIS Diagnostics公司等)，或依赖于民间检查机构的测定(IgG Food Antibody Assessment/Genova Diagnostics公司等)。测定所必需的各种器具、材料、试剂类、标记方法和测定条件，都可以利用公知的技术。

对于结合至抗体的标记量的测定，根据标记物质的种类来选择惯用的方法，例如以酶作为标记物质时，通过分光光度计以吸光度的方式来测定发色底物的分解是有利的。

例如，通过ELISA法进行的本发明的抗饮食成分抗体的测定可以如下进行，首先，使样品与饮食成分的制备物反应而生成抗原-抗体复合体，接着，添加酶标记的、与抗饮食成分抗体反应的物质，进一步添加酶底物进行反应，利用酶活性测定反应产物的标记量，由此可以进行上述测定。

饮食成分的制备物，可以通过利用惯用方法对饮食成分进行处理来制备。作为原料的饮食成分，可以举出市售的新鲜品、冷冻品、冷冻干燥品或其粉末材料(Allergon公司等)，作为饮食成分的处理方法，优选可举出萃取。萃取例如通过将原料在水、有机溶剂、缓冲液、或甘油中物理性地(超声波、弗氏压碎器、乳钵、均化器、玻璃珠、冻融等)或用表面活性剂进行处理。通过添加盐、加温，可以提高萃取效率。此外，作为饮食成分的制备物，除了由上述方法得到的萃取物之外，还可以使用市售的蛋白质萃取液(BioChain公司、Antigen Laboratories公司等)和/或诊断用变应原提取物(岛居药品株式会社、Antigen Laboratories公司等)等。

作为饮食成分的制备物，可以是饮食成分中含有的上述多肽抗原的分离或纯化物。经分离或纯化的多肽抗原例如如下制备：(a)由饮食成分的组织或细胞使用公知的方法或基于此的方法制备，(b)通过使用肽合成器等的公知的肽合成方法来化学性地合成，(c)培养含有编码多肽抗原的DNA的转化体，或(d)以编码多肽抗原的核酸作为模板，使用无细胞转录/翻译系统进行生物化学合成。

(a) 由饮食成分的组织或细胞制备多肽抗原时，可以将其组织或细胞均化后，将粗分级物(例如膜级分、可溶性级分)直接用作多肽抗原。或者，也可以用酸、表面活性剂或醇等进行萃取，对该萃取液，通过组合盐析、透析、凝胶过滤、反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱等色谱来进行纯化分离。得到的蛋白质可以直接作为多肽抗原，也可以通过使用肽酶等的限定分解来制备部分肽并将其作为多肽抗原。

(b) 化学性地制备多肽抗原时，作为合成肽，例如使用具有与使用上述(a)的方法、由天然材料纯化得到的蛋白质相同的结构的合成肽，具体地说，使用含有1种或2种以上的与该蛋白质的氨基酸序列中由至少3个以上、优选6个以上的氨基酸构成的任意部位的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽等。

(c) 使用含有DNA的转化体制备多肽抗原时，该DNA可以通过公知的克隆方法(例如Molecular Cloning 2nd ed.(J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989)中记载的方法等)来制备。该克隆方法，可以举出(1)使用基于编码多肽抗原的基因序列而设计的DNA探针，由饮食成分的cDNA文库通过杂交法将编码该多肽抗原的DNA分离，或(2)使用基于编码多肽抗原的基因序列而设计的DNA引物，以来源于饮食成分的cDNA为模板，通过PCR法制备编码该抗原的DNA，并将该DNA插入到适合于宿主的表达载体中的方法等。通过该表达载体，将宿主转化得到转化体，将该转化体在适当的培养基中培养，由此可以得到所需的多肽抗原。

(d) 利用无细胞转录/翻译系统时，可以举出以通过与上述(c)相同的方法制备的插入有编码多肽抗原的DNA的表达载体(例如该DNA处于T7、SP6启动子等的控制下的表达载体等)作为模板，使用含有适合于该启动子的RNA聚合酶和底物(NTPs)的转录反应液合成mRNA后，以该mRNA为模板，使用公知的无细胞翻译系统(例如：大肠菌、兔子网状细胞、小麦胚芽等的提取液)，进行翻译反应的方法等。通过调整盐浓度等至适当，可以在同一反应液中一次性进行转录反应和翻译反应。

应予说明，“分离或纯化”指的是进行除去目的的成分以外的成分的操作。“经分离或纯化的多肽抗原”中含有的目的的多肽的含量，为试样中的多肽的通常60重量%以上，优选80重量%以上，更优选为90重量%以上，最优选为95重量%以上。

作为多肽抗原，可以使用完整的蛋白质分子、含有其部分氨基酸序列的具有抗原性的肽(具有抗原性的部分肽)。作为部分氨基酸序列，可以举出例如包含3个以上的连续氨基酸残基的部分氨基酸序列，优选为包含4个以上、更优选5个以上、进一步优选6个以上的连续氨基酸残基的部分氨基酸序列。这些氨基酸残基的一部分(例如1个～数个)可以被可以置换的基团(例如Cys、羟基等)置换。用作多肽抗原的肽，具有含有1个～数个这种部分氨基酸序列的氨基酸序列。

优选的一实施方式中，饮食成分的制备物被固定化在适当的固相(例如免疫测定用多孔板等)上。固定化可以通过将根据需要用一般性的涂布用缓冲液稀释的该稀释物添加到固相中，培养一定时间来进行。从固相除去液体后，向该固相中添加样品，形成抗原-抗体复合体，将目的的抗体捕捉到固相上。

作为与抗饮食成分抗体反应的物质，可以举出例如抗免疫球蛋白抗体、蛋白质A、蛋白质G、榴莲凝素(jacalin)等，优选为抗免疫球蛋白抗体，特别优选为抗IgG抗体或抗IgA抗体。

作为标记酶，可以举出过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、微过氧化物酶、羧肽酶、磷酸化酶等，但没有特别限定。

酶底物根据标记酶的种类适当选择，以过氧化物酶作为标记酶时，例如可以使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB：Vector Laboratories Inc.公司、#SK-4400)。

除去反应液，使用酶标仪等，测定固相上的测定波长450nm的吸光度，由此可以测定与固相结合的标记量，即抗体量。

诊断对象中所调查的抗饮食成分抗体是否上升的判定，例如可以通过在与健康动物的抗体效价的比较中，是否在统计学上具有显著性来进行。例如，可以将健康动物的测定值的平均＋SD(标准偏差)、平均＋2SD、平均＋3SD等作为阳性的基准，但是不限于此。

本发明的诊断方法的优选的实施方式中，上述19种的克罗恩氏病特异性抗饮食成分抗体中2种以上(例如2、3、4、5、6、8、10或15种)的抗体作为测定对象。通过组合2种以上的抗体，可以进一步提高克罗恩氏病的诊断灵敏度和/或诊断特异度。组合2种以上抗体时，优选含有针对选自葡萄柚、甘蓝菜、莴苣、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦和玉米中的至少一种饮食成分的抗体，更优选含有至少针对酵母和玉米的各抗体。此外，另外，在其它优选方式中，本发明的诊断方法将3种或4种以上的抗体组合来使用。组合3种以上的抗体时，更优选含有至少针对酵母、玉米、以及荞麦或芹菜的各抗体。作为具体的组合例子，可以举出针对以下饮食成分的抗体的组合。

(2种饮食成分的组合的例子)

·玉米、甘蓝菜

·玉米、莴苣

·玉米、荞麦

·酵母、葡萄柚

·酵母、甘蓝菜

·酵母、芹菜

·酵母、莴苣

·酵母、荞麦

·酵母、玉米

·酵母、燕麦

·酵母、美洲山核桃

·甘蔗、甘蓝菜

·甘蔗、玉米

·甘蔗、酵母

(3种饮食成分的组合的例子)

·酵母、玉米、荞麦

·酵母、玉米、芹菜

(4种饮食成分的组合的例子)

·酵母、玉米、荞麦、葡萄柚

·酵母、玉米、荞麦、甘蓝菜

·酵母、玉米、荞麦、绿辣椒

·酵母、玉米、荞麦、西红柿

·酵母、玉米、荞麦、大豆

·酵母、玉米、荞麦、芹菜

·酵母、玉米、苜蓿、芹菜

·酵母、玉米、甘蔗、芹菜

(5种饮食成分的组合的例子)

·酵母、玉米、荞麦、葡萄柚、苜蓿

·酵母、玉米、荞麦、葡萄柚、甘蔗

·酵母、玉米、荞麦、芹菜、苜蓿

·酵母、玉米、荞麦、芹菜、甘蔗

·酵母、玉米、荞麦、绿辣椒、苜蓿

·酵母、玉米、荞麦、绿辣椒、甘蔗

·酵母、玉米、荞麦、西红柿、苜蓿

·酵母、玉米、荞麦、西红柿、甘蔗

·酵母、玉米、荞麦、大豆、苜蓿

·酵母、玉米、荞麦、大豆、甘蔗

将2种以上的抗饮食成分抗体组合来进行诊断时，会产生仅一部分抗体为阳性而对于其它抗体则为阴性的结果，此时，优选若对于任意一种抗体为阳性，则判定诊断对象患有克罗恩氏病的患有可能性高。如此可以在维持一定的诊断特异度的状态下，显著提高诊断灵敏度。

此外，本发明还提供含有与本发明的抗饮食成分抗体反应的1种以上的饮食成分制备物的、克罗恩氏病的诊断用试剂。具体地说，饮食成分制备物，通过对选自葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦、玉米、米和大豆这19种中的饮食成分进行处理来制备。该制备物的制备方法如上述本发明的方法中所记载。得到的饮食成分制备物例如可以以在塑料管等容器中溶解于水、缓冲液、甘油等中的状态来提供，冷藏或冷冻保存直至即将使用之前。

如上所述，本发明的克罗恩氏病的诊断中，优选测定样品中的2种以上的抗饮食成分抗体。因此，优选的实施方式中，本发明的克罗恩氏病诊断用试剂可以含有2种以上(例如2、3、4、5、6、8、10或15种)的饮食成分制备物作为构成。作为优选的2种以上的饮食成分的组合，如上所述。

应予说明，使用多种饮食成分制备物时，可以将它们混合制成一种试剂、或分别制成试剂，但是由于不容易提供与各种抗饮食成分抗体特异性反应的物质，因此通常分别制成试剂是合适的。

此外，本发明还提供含有本发明的试剂的克罗恩氏病的诊断用试剂盒。本发明的试剂盒含有单独的饮食成分制备物或以2种以上的组合含有饮食成分制备物，作为其它成分，根据免疫学上的测定方法的种类、所采用的检出方法，可以任意包含必要的试剂类。优选可以含有与抗饮食成分抗体反应的物质(例如抗IgG抗体、抗IgA抗体等二抗)。该物质可以预先用酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素、着色物质等标记物质标记化，另外，也可以使标记物质含有在试剂盒的构成中。此外，可以将饮食成分制备物预先固定化在固相上，另外，也可以使固相含有在试剂盒的构成中。

此外，本发明的试剂盒中可以含有对应于标记物质的底物、或用于检出标记物质与底物的反应的检出试剂。进一步地，为了方便实施测定，可以含有适当的样品稀释液、二抗稀释液、标准抗体、缓冲液、洗涤液、酶底物液、反应终止液等。此外，还可以含有用作对照的来源于健康人的标准血清。

以下通过实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明不被这些例子所限定。

[实施例]

参考例1 人血清或血浆的获得

克罗恩氏病患者80例、溃疡性大肠炎患者44例和健康人52例的血液，通过社会保险中央综合医院或味之素(株)，在签署文件同意下采取，得到血清或血浆。样品用号码等表示，匿名化。

实施例1 88品种的饮食的抗体效价(IgG)的测定

采取血液后，快速离心分离获得血清，将所获得的血清冷冻保存，通过デトックス(株)送达Genova Diagnostics(IL, USA)，并委托IgG Food Antibody Assessment(88品种的饮食)测定。88品种的饮食的详细内容如下，乳制品7品种(酪蛋白、切达干酪、农家干酪、牛奶、山羊奶、乳白蛋白、酸奶)、蔬菜22品种(苜蓿、芦笋、鳄梨、萝卜、花茎甘蓝、甘蓝菜、胡萝卜、芹菜、黄瓜、蒜、绿辣椒、莴苣、洋蘑菇、橄榄、洋葱、豆、甘薯、马铃薯、菠菜、豆角、西红柿、西葫芦)、水果16品种(苹果、杏、香蕉、蓝莓、蔓越莓、葡萄、葡萄柚、柠檬、橙、番木瓜、桃、梨、菠萝、梅子、覆盆子、草莓)、鱼类和贝类·肉类19品种(蛤、鳕鱼、螃蟹、龙虾、牡蛎、鲷鱼、鲑、沙丁鱼、虾、比目鱼、鳟鱼、金枪鱼、牛肉、鸡肉、蛋白、蛋黄、羔羊肉、猪肉、火鸡)、谷类·坚果类19品种(杏仁、荞麦、玉米、玉米麸、麸质、扁豆、小扁豆、利马豆、燕麦、花生、美洲山核桃、花斑豆、米、黑麦、芝麻、大豆、葵花子、核桃、小麦)、其它5品种(酵母、甘蔗、巧克力、咖啡、蜂蜜)。IgG通过ELISA测定，以各饮食品种的健康人的“平均值＋2SD”作为基准，将其以上的情况作为阳性。88品种的饮食的血清抗体效价阳性品种数的平均，对于克罗恩氏病患者来说为11品种，对于溃疡性大肠炎患者来说为2品种，对于健康人来说为1品种。

对于克罗恩氏病患者、溃疡性大肠炎患者、健康人分别算出各品种的抗体的阳性率(阳性样品数目/全部样品数目×100)。

接着，算出组合2～5品种时的阳性率和特异度(阴性样品数目/全部样品数目×100)、诊断效率(阳性率×特异度/100)。

结果

克罗恩氏病患者中，与健康人和溃疡性大肠炎患者相比，阳性率显著高的饮食品种为19品种(葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、芹菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、荞麦、玉米、燕麦、美洲山核桃、米、大豆、酵母、甘蔗)。19品种的克罗恩氏病患者(CD)、溃疡性大肠炎患者(UC)、和健康人(HC)的阳性率如表1所示。

[表1]

Figure 2010800104585100002DEST_PATH_IMAGE001

此外，由通过各测定得到的吸光度(抗体量)，算出组合针对19种的饮食抗原的抗体2种时的灵敏度(对于克罗恩氏病患者的全部样品，判定为阳性的样品数：阳性率)的结果如表2所示。

[表2]

由通过各测定得到的吸光度(抗体量)，算出针对各饮食抗原的抗体单独以及组合这些抗体2种～19种时的灵敏度和特异度。对于组合2品种～5品种时的一部分组合，CD阳性率、UC、HC的特异度、相对于UC的CD的诊断效率如表3-1～表3-4所示。

[表3-1]

Figure 2010800104585100002DEST_PATH_IMAGE003

[表3-2]

[表3-3]

Figure 2010800104585100002DEST_PATH_IMAGE005

[表3-4]

由以上的结果可知，通过组合抗体，与单独测定1种的抗体量时相比，灵敏度有显著性提高。此外，各组合中，可见高特异性，灵敏度与特异度相乘算出的诊断效率在抗体的组合中也同样显著提高。

因此，根据本发明，可以特异性地且有效地诊断克罗恩氏病，不经过内窥镜检查等需要高度的经验和技术，且对患者带来身体上、精神上的苦痛的侵袭性的方法，就可以安全且高灵敏度地实施克罗恩氏病的诊断。

实施例2 针对饮食成分的制备物的血清抗体效价的测定

由上述结果得到的有用的饮食成分中，选择玉米、酵母、荞麦、芹菜，对于98例的CD、50例的UC、52例的HC的血清，进行针对各种饮食成分的制备物的血清抗体效价的测定。应予说明，本实施例中，作为饮食成分的制备物，使用了粉末材料。

作为血清抗体效价测定用的抗原液，使用通过将玉米、酵母、荞麦、芹菜的各种粉末(均为Allergon公司制)用PBS(-)悬浮，离心分离(5000rpm、5分钟)而得到的上清。对于抗原液，利用涂布缓冲液(coating buffer)(SIGMA公司制、cat. No. 076K8206)制备成蛋白质浓度分别为1μg/ml，以50μl/孔的量添加到ELISA板(住友ベークライト社制、cat. No. MS-8896F)中，4℃下反应一晚。除去孔中的抗原液后，通过洗涤液(用含有0.1% Tween20的PBS(-)稀释了20倍的免疫封闭剂(DSファーマバイオメディカル社制、cat. No. KN001A))洗涤1次，使利用蒸馏水稀释了5倍的免疫封闭剂在室温下反应1小时。用洗涤液洗涤1次后，添加用洗涤液稀释了10000倍的血清，室温下反应2小时。反应后，用洗涤液进行3次洗涤，加入用洗涤液稀释了500倍的HRP标记小鼠抗人IgG单克隆抗体(Invitrogen公司制、cat. No. 05-4220)，室温下反应1小时。然后，用洗涤液进行3次洗涤，使TMB(BD Biosciences公司制、cat. No. 555214)反应，用2N硫酸终止反应，使用酶标仪(BIO-RAD Benchmark Plus)测定波长450nm的吸光度。

在该板上，准备以50μl/孔的量添加有用涂布缓冲液稀释了1000倍的抗人IgG抗体(EXBIO公司制、cat. No.11-31-9-C100)的孔，使标准血清(reference serum)(BETHYL公司制、cat. No.RS10-101)以0.01～10μg/ml反应，在各浓度下测定波长450nm的吸光度，制成标准曲线，算出血清试样的IgG效价(Titer)。

算出健康人对于各种饮食成分的IgG效价的“平均值＋2SD”，将其以上的情况评价为阳性。对于CD、UC、HC分别算出各种饮食成分的阳性率(阳性样品数目/全部样品数目×100)。

结果

对于各种饮食成分的阳性率如表4所示。使用饮食成分的制备物测定得到的抗体阳性率，尽管所使用的饮食原料不同，但是CD、UC、HC与通过Genova Diagnostics测定得到的阳性率(表1)相比，都大致同等。

[表4]

Figure 2010800104585100002DEST_PATH_IMAGE007

进一步地，上述4品种的饮食成分的组合了2～4品种时的CD阳性率、UC和HC的特异度、相对于UC的CD的诊断效率如表5-1～5-3所示。使用饮食成分的制备物进行测定时，组合了2～4品种的阳性率都约为70%，特异度也都为90%以上，得到约为65～74%的诊断效率。本结果与通过Genova Diagnostics测定得到的结果(表3-1～3-3)相比，阳性率稍低，但是特异度为同等程度以上。由这些结果，暗示可以使用本测定方法诊断克罗恩氏病。

[表5-1]

[表5-2]

Figure 2010800104585100002DEST_PATH_IMAGE009

[表5-3]

实施例3 抗原的鉴定

对于由实施例1的结果得到的有用的饮食的抗原，进行具体地可以用作抗原的蛋白质的鉴定。

作为其中之一，将米的粉末(Allergon公司制)悬浮在2%SDS溶液中，将相当于每1泳道125μg的粉末的悬浮液供于SDS-PAGE。通过SDS-PAGE分离蛋白质后，在60mA恒定电流的条件下用60分钟转印到PVDF膜上。将PVDF膜用快速染色液(rapid stain)CBB(ナカライテスク社制)染色，检出蛋白质后，将HC的血清和针对米的抗体效价为阳性的CD血清分别稀释1000倍作为一抗，将稀释5000倍的HRP标记抗人IgG抗体(GEヘルスケア公司制)作为二抗，进行免疫印迹。对利用CD的血清而特异性地检出的条带，通过Protein Research Network(http://protein-research.org/)进行肽质量指纹图谱(Peptide Mass Finger printing(PMF))解析。

结果

米蛋白质的CBB染色结果如图1所示，免疫印迹的结果如图2所示。图2中的条带A的蛋白质与CD血清中的抗体特异性地反应。条带A的蛋白质(约33kDa)的PMF解析结果如表6所示。由通过PMF解析得到的肽片段的分子量图案，推断条带A的蛋白质为谷蛋白(Accession No. ABF96730.1)(表7)。

[表6]

[表7]

此外，对于米粉末中的谷蛋白以外的蛋白质通过与上述相同的方法鉴定，进一步地，作为米以外的饮食成分，使用荞麦、玉米和甘蔗的各种粉末(均为Allergon公司制)，通过与上述米粉末相同的处理，鉴定各种饮食成分中含有的有用的蛋白质抗原。它们的结果如表8所示。

[表8]

Figure 2010800104585100002DEST_PATH_IMAGE013

实施例4 使用谷蛋白的血清抗体效价的测定

用Spectrum(商标)Plant Total RNA kit(SIGMA Aldrich公司制)从米(ひとめぼれ)提取总RNA。使用由谷蛋白type-A 3 前体(Accession No. ABF96730.1)的mRNA序列(Accession No. NM_001056948)设计的以下的引物，得到全长谷蛋白基因。

正向引物：GGATCCATGGCAACCATCAAATTCCCTATAG (序列号：1)

反向引物：GCGGCCGCTTAGTGGTGATGATGGTGATGTGCACTC (序列号：2)

将得到的谷蛋白基因导入到表达载体pGEX-6P-1(GEヘルスケア社制)中，构建His标记、GST(谷胱苷肽S-转移酶，Glutathione S-Transferase)融合谷蛋白表达载体(pGEX-GSTOSG30His)。使用导入了pGEX- GSTOSG30His的大肠菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Stratagene公司制)，表达GST-谷蛋白-His标记融合蛋白质，由菌体通过Ni-NTA Agarose(QIAGEN公司制)进行纯化，供于以下的抗谷蛋白抗体效价测定中。

对于98例的CD和52例的HC的血清，通过ELISA进行抗谷蛋白抗体效价的测定。抗谷蛋白抗体效价根据Sutton CL等人的方法(Gastroenterology 119:23-31, 2000)，从作为相对于GST融合蛋白质(谷蛋白-GST)的反应而得到的值，减去相对于GST的反应的值，由此算出。

作为抗原液，对于谷蛋白-GST和GST，以等摩尔数使用涂布缓冲液(SIGMA公司制、cat. No. 076K8206)制备成100μg/ml和32μg/ml，以50μl/孔的量添加到ELISA板(住友ベークライト社制、cat. No. MS-8896F)中，4℃下反应一晚。除去抗原液后，通过洗涤液(用含有0.1% Tween20的PBS(-)稀释了20倍的免疫封闭剂(DSファーマバイオメディカル社制、cat. No. KN001A))洗涤1次，使利用含有0.1% Tween20的PBS(-)稀释了5倍的免疫封闭剂在室温下反应1小时。用洗涤液洗涤1次后，将用洗涤液稀释了100倍的血清添加到孔中，室温下反应2小时。接着用洗涤液进行3次洗涤，使利用洗涤液稀释了500倍的HRP标记小鼠抗人IgG单克隆抗体(Invitrogen公司制、cat. No. 05-4220)在室温下反应1小时。反应后，通过洗涤液进行3次洗涤，使TMB(BD Biosciences公司制、cat. No. 555214)反应，用2N硫酸终止反应，使用酶标仪(BIO-RAD Benchmark Plus)测定波长450nm的吸光度。

在该板上，准备以50μl/孔的量添加有用涂布缓冲液稀释了1000倍的抗人IgG抗体(EXBIO公司制、cat. No.11-31-9-C100)的孔，使标准血清(BETHYL公司制、cat. No.RS10-101)以0.01～10μg/ml反应，在各浓度下测定波长450nm的吸光度，制成标准曲线，算出血清试样的IgG效价。

结果

将HC中的IgG效价的“平均值＋2SD”以上评价为阳性。HC的IgG的平均值为0.09，2SD的值为0.56，因此将0.64以上作为阳性。此时的CD的阳性样品，98例中有29例，阳性率为30%。与此相对地，健康人中的阳性样品在52例中有2例，阳性率为3.8%。

以上的结果为与表1中的对于米所示的CD的阳性率30%和健康人的阳性率0%同等的阳性率。

如此，作为针对饮食的抗体效价测定方法，通过代用饮食成分的粉末材料或饮食中的单一抗原蛋白质，可以进行针对饮食的抗体的阳性判定和克罗恩氏病诊断。此外，通过利用重组蛋白产生，可以均一且稳定地供给抗原蛋白质，若使用如此供给的单一的抗原蛋白质，则可以实现诊断试剂盒的稳定生产以及可靠性的提高。

产业实用性

通过组合对克罗恩氏病特异性的抗饮食成分抗体的测定，可以显著提高克罗恩氏病的诊断效率和特异性，此外，不经由需要高度的技术、对患者的负担也大的内窥镜等侵袭性的方法，就可以实现克罗恩氏病的确定诊断的范围显著扩大。

本申请基于在日本申请的日本特愿2009-052692(申请日：2009年3月5日)，并将其内容全部包含于本说明书中。

序列表

<110> 味之素株式会社

<120> 克罗恩氏病诊断试剂

<130> 091518

<150> JP 2009-052692

<151> 2009-03-05

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增谷蛋白基因的人工序列：PCR引物的描述

<400> 1

ggatccatgg caaccatcaa attccctata g 31

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增谷蛋白基因的人工序列：PCR引物的描述

<400> 2

gcggccgctt agtggtgatg atggtgatgt gcactc 36

Claims

1. 对象的克罗恩氏病的诊断方法，其特征在于，测定由该对象采取的样品中的、针对选自葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦、玉米、米和大豆中的1种以上饮食成分的各抗体，其中，测定针对1种饮食成分的抗体时，该饮食成分为除了芹菜、荞麦、玉米、酵母和大豆之外的饮食成分。

2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，测定针对2种以上的饮食成分的各抗体。

3. 权利要求2所述的方法，其中，至少一种饮食成分为除了芹菜、荞麦、玉米、酵母和大豆之外的饮食成分。

4. 权利要求2或3所述的方法，其特征在于，测定针对选自葡萄柚、甘蓝菜、莴苣、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦和玉米中的至少1种饮食成分的抗体。

5. 权利要求2～4中任一项所述的方法，其特征在于，测定至少针对酵母和玉米的各抗体。

6. 权利要求2～5中任一项所述的方法，其特征在于，测定针对3种以上的饮食成分的各抗体。

7. 权利要求6所述的方法，其特征在于，测定至少针对酵母、玉米、以及荞麦或芹菜的各抗体。

8. 权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，测定针对饮食成分中含有的多肽抗原的各抗体。

9. 权利要求8所述的方法，其中，所述多肽抗原为谷蛋白。

10. 克罗恩氏病的诊断用试剂，其含有选自葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、米和甘蔗中的饮食成分的制备物。

11. 权利要求10所述的试剂，其中，所述制备物为经分离或纯化的多肽抗原。

12. 权利要求11所述的试剂，其中，所述多肽抗原为谷蛋白或具有抗原性的其部分肽。

13. 克罗恩氏病的诊断用试剂盒，其含有选自葡萄柚、苜蓿、鳄梨、甘蓝菜、绿辣椒、莴苣、洋葱、马铃薯、菠菜、西红柿、燕麦、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、荞麦、玉米、米和大豆中的2种以上的饮食成分的制备物。

14. 权利要求13所述的试剂盒，其中，所述制备物为经分离或纯化的多肽抗原。

15. 权利要求14所述的试剂盒，其中，所述多肽抗原为谷蛋白或具有抗原性的其部分肽。