CN102337209A - 细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供用简便操作可快速准确地判断混入被检试料中的细菌的细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒。本发明的细菌检测器具是微阵列型器具，其中根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面。根据从被检试料中制备的探针和固定在上述基板表面的寡核苷酸是否发生杂交，可简便、快速且准确地检测、鉴定被检试料中的细菌。

Description

细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒

本申请是申请日为2005年2月25日、申请号为200580006115.0、发明名称为“细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒，具体涉及细菌的特异性寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具、使用该细菌检测器具的极其准确且操作性高的细菌检测方法及细菌检测试剂盒。

背景技术

例如麦芽酒精饮料中混入有害微生物时，会产生浑浊、风味劣化等现象，从而成为质量劣化的原因。更加具体地说，如对于啤酒来说，乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、梳状菌属(Pectinatus)等是代表性的有害细菌。其中，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)是有名的啤酒污染菌。作为检测这些有害细菌的方法，现在最普通的方法是，用膜过滤器将对象啤酒过滤后，在适当的培养基中培养，然后检测生长的菌落。

作为判断该菌落是否为上述有害细菌的方法，使用的方法是：将从菌落中提取的DNA作为模板，使用上述有害细菌特异性引物进行PCR反应，通过电泳来判断是否能够得到PCR产物(如参照日本国特开平7-289295号公报(公开日：平成7年11月7日))。但是，因为在该方法中每个菌种都需要使用多数引物进行多次PCR反应，操作极其烦杂，在快速性方面存在问题。此外，为了缩短时间，虽然可将多数引物混合并在1个试管内进行扩增反应，但可使用的引物数量有限，所以难于根据微量检体进行准确判断。

为了解决上述问题点，使用了下述方法，即、设计含有各种菌种内普遍存在的基因的种特异性序列的部分可扩增的引物，扩增后用识别种特异性序列的限制酶切割扩增产物，以电泳得到的电泳带的大小来特定其为何种菌种的基因。但是，能够识别所有对象菌种的限制酶未必都存在，并且，需要用多种类限制酶分别切割得到的扩增产物提供给电泳这样极其烦杂的操作，在快速性、简便性方面存在问题。

进而，为了解决上述问题，还实施了下述方法，即、用种特异性序列作探针，通过杂交来判断被检体中的DNA或RNA中是否存在与该序列互补的序列。

但是，上述通过杂交进行判断的方法，对于非常近缘的DNA同源性高的菌种，也存在频繁发生与别的菌种进行错误杂交的交叉杂交问题，有时难于准确鉴定菌种。

特别是，在上述代表性的啤酒污染菌即属于乳酸杆菌属的种中近缘菌非常多，使用频繁发生交叉杂交的方法，不能达到检测、鉴定有害细菌的目的。

鉴于上述问题，本发明的目的是提供：可以准确判断特定细菌是否存在的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具、使用该细菌检测器具通过简便操作能够进行快速准确判断的细菌检测方法及细菌检测试剂盒。

发明内容

本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，其结果在麦芽酒精饮料的代表性污染细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中，发现了特定属或特定种特异性序列；并且发现使用根据该碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的器具，通过和来源于被检试料的核酸进行杂交，可快速且准确地检测、鉴定目的细菌，完成了本发明。

本发明的细菌检测器具，是用于检测、鉴定被检试料中的细菌的器具，其特征在于，对象细菌是从(1)属于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的细菌、(2)属于酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的细菌、(3)属于片球菌属(Pediococcus)的细菌、(4)属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌、(5)属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌中选择的至少2种或2种以上的细菌，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌。

本发明的(1)～(5)的细菌，例如短乳杆菌(Lactobacillus brevis)是序列号7～9及序列号71所示的碱基序列全部包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)是序列号22～24所示的碱基序列全部包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。属于片球菌属(Pediococcus)的细菌是序列号36～45所示的碱基序列中至少2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌是序列号50～55所示的碱基序列中至少2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌是序列号56～58所示的碱基序列中至少2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。

作为本发明的细菌检测器具的检测对象细菌，优选包括(6)属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌、(7)属于链球菌属(Streptococcus)的细菌、(8)属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌、(9)属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌、(10)属于棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的细菌、(11)属于弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的细菌、(12)属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的细菌、(13)属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的细菌、(14)属于坏发酵乳杆菌(Lactobacillusmalefermentans)的细菌、(15)属于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)群(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus zeae)的细菌、(16)属于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的细菌、(17)属于布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的细菌、(18)属于耐久肠球菌(Enterococcus durans)的细菌、(19)属于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的细菌。

作为固定在基板表面的寡核苷酸，优选为下述所示的寡核苷酸，本发明的细菌检测器具的特征是，至少1个或1个以上的所述寡核苷酸固定在基板表面。

(A)其是根据属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号2所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号5所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸。

(B)其是根据短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号8所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号9所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号71所示的碱基序列的寡核苷酸。

(C)其是根据棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号10所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号11所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号12所示的碱基序列的寡核苷酸。

(D)其是根据弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号13所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号14所示的碱基序列的寡核苷酸。

(E)其是根据德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号16所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号17所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号18所示的碱基序列的寡核苷酸。

(F)其是根据发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列的寡核苷酸，并且是含有序列号19所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号20所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号21所示的碱基序列的寡核苷酸。

(G)其是根据酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号22所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号23所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号24所示的碱基序列的寡核苷酸。

(H)其是根据坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号25所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号26所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号27所示的碱基序列的寡核苷酸。

(I)其是根据干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)群(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus zeae)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号28所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号29所示的碱基序列的寡核苷酸；以及是根据玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae、且含有干酪乳杆菌的标准株)特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号30所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号31所示的碱基序列的寡核苷酸。

(J)其是根据鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号32所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号33所示的碱基序列的寡核苷酸。

(K)其是根据布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号34所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号35所示的碱基序列的寡核苷酸。

(L)其是根据属于片球菌属(Pediococcus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号36所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号37所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号38所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号39所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号40所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号41所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号42所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号43所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号44所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号45所示的碱基序列的寡核苷酸。

(M)其是根据属于链球菌属(Streptococcus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号46所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号47所示的碱基序列的寡核苷酸。

(N)其是根据属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号48所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号49所示的碱基序列的寡核苷酸。

(O)其是根据属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号50所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号51所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号52所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号53所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号54所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号55所示的碱基序列的寡核苷酸。

(P)其是根据属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号56所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号57所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号58所示的碱基序列的寡核苷酸。

(Q)其是根据属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号59所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号60所示的碱基序列的寡核苷酸。

(R)其是根据属于耐久肠球菌(Enterococcus durans)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号61所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号62所示的碱基序列的寡核苷酸。

(S)其是根据乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号63所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号64所示的碱基序列的寡核苷酸。

(T)其是含有属于部分明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌及属于部分乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列的共同的碱基序列中的序列号72所示的碱基序列的寡核苷酸。

通过使用将上述(A)～(T)所述的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，能够全部检测、鉴定食品中的污染菌、特别是麦芽酒精饮料中的污染菌。

此外，本发明的细菌检测器具，优选上述基板表面具有碳化二亚胺基或异氰酸酯基，且该碳化二亚胺基或异氰酸酯基与所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的连接子进行反应形成共价键。

本发明的细菌检测方法，是用于检测、鉴定被检试料中的细菌的方法，其特征在于，包括制备被检试料中的细菌的核酸的核酸制备步骤、以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤、将所述探针与固定在上述本发明细菌检测器具的基板表面的寡核苷酸进行杂交的杂交步骤、检测杂交信号的信号检测步骤。

作为本发明细菌检测方法的被检试料，优选食品，其中最优选麦芽酒精饮料。

本发明的细菌检测试剂盒，是用于实施上述本发明细菌检测方法的试剂盒，包含上述本发明的细菌检测器具，并且优选包含杂交步骤、信号检测步骤、探针制备步骤、核酸制备步骤中使用的试剂。

本发明的其他目的、特征及优点通过下述内容可以充分理解，并且本发明的利益通过下述参照附图的说明可以得以证明。

附图说明

图1(a)是表示实施例中使用的本发明的细菌检测器具的基板上固定的寡核苷酸的排列位置图。

图1(b)是表示使用在图1(a)所示的排列位置上固定寡核苷酸的细菌检测器具检测Lactobacillus brevis的结果图像。

具体实施方式

对本发明的一种实施方式进行如下说明，此外，本发明并不限于下述实施方式。

(1)本发明的细菌检测器具

本发明的细菌检测器具用于检测、鉴定被检试料中的细菌，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌。

[基板]

本发明的细菌检测器具所使用的基板的材质，只要能够使寡核苷酸稳定地固定即可。例如可以为聚碳酸酯或塑料等合成树脂、玻璃等，但并不限于这些材质。基板的形态没有特别限定，但可优选使用如板状、薄膜状等基板。

[固定在基板表面的寡核苷酸]

固定在本发明的细菌检测器具的基板表面的寡核苷酸，只要是根据检测对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸即可。通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸之间进行杂交，可检测出被检试料中含有的属于目的种或属的细菌。此外，对于根据上述检测对象细菌所属种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸，以下恰当地称之为“捕获性寡核苷酸(capture olig)”。

上述特异性碱基序列，只要从检测对象细菌的基因组碱基序列中选取属或种特异性碱基序列即可，优选从检测对象细菌的核糖体RNA基因所对应的碱基序列中选取。其中，已知道细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中具有很多属或种特异性碱基序列，特别优选从16S核糖体RNA基因所对应的DNA序列中选取属或种特异性碱基序列。核糖体RNA基因的碱基序列，可以从GenBank、EMBL、DDBJ等的数据库等中得到。

根据上述属或种特异性碱基序列来设计捕获性寡核苷酸即可。因此，其可以为上述属或种特异性碱基序列自身，只要能够与从检测对象细菌中制备的核酸进行特异性杂交，也可包含变异，变异的位置没有特别限定。

捕获性寡核苷酸的长度(碱基数)没有特别限定，如果太短难于对杂交进行检测，如果太长会发生非特异性杂交。本发明者对捕获性寡核苷酸的最适合长度进行反复研究，确定标准长度为12～24个碱基。更优选13～22个碱基，但并不限于此。本发明者确认，碱基长度主要取决于序列特性(特定的碱基含有率、同一碱基的重复)，结合性良好的序列即使链短，也可进行特异性杂交。

当捕获性寡核苷酸具有妨碍其与来源于被检试料的核酸进行杂交的发夹结构、环状结构或除此之外的立体结构时，通过将构成捕获性寡核苷酸的1个或1个以上的核苷酸置换为与肌苷或任何核苷酸不联会的核酸，可以解除其立体结构。

捕获性寡核苷酸的合成方法没有特别限定，根据公知的方法(如Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)所述方法)合成即可。一般可以用市售的DNA合成机进行化学合成。

本发明的细菌检测器具，不仅将根据上述检测对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，而且优选在此基础上将所谓的对照捕获性寡核苷酸也固定在基板表面。对照捕获性寡核苷酸包括阳性对照捕获性寡核苷酸及阴性对照捕获性寡核苷酸。阳性对照捕获性寡核苷酸用于判断下述探针制备步骤中的扩增反应是否顺利进行。阴性对照捕获性寡核苷酸用于确认未发生非特异性杂交，即未发生假阳性杂交。本发明也包含这些阳性对照捕获性寡核苷酸及阴性对照捕获性寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具。

阳性对照捕获性寡核苷酸只要根据从检测对象细菌中制备的探针中所包含的序列进行设计即可。此外，使用同一细菌检测器具同时检测多数检测对象细菌时，可以对各检测对象细菌设计阳性对照捕获性寡核苷酸，或者也可以根据从多数检测对象细菌中制备的探针中的相同碱基序列进行设计。从所有检测对象细菌中制备的探针中没有相同碱基序列时，也可分为数组分别设计阳性对照捕获性寡核苷酸。或者也可以设计引物序列部分相同、与对象细菌序列不同的人工序列，使该序列的一部分成为阳性对照捕获性寡核苷酸。以上述人工序列作模板制备探针(在本说明书中称这种探针为对照探针)，通过添加到从被检试料中制备的探针上，可以验证杂交的特异性。此外，在下面将对上述探针进行说明。

阴性对照捕获性寡核苷酸，优选以下述方式设计，即、在阳性对照捕获性寡核苷酸的碱基序列中，在1个或1个以上的碱基且小于该序列具有的碱基数的未满20％的范围内具有包含人工置换碱基的碱基序列。进行碱基置换的碱基数，取决于与杂交条件之间的关系，可选择来源于检测对象细菌的探针不发生杂交的碱基数。

检测对象细菌没有特别限定，可适当选择要从目的被检试料中检测的细菌。例如可以为混入食品中可能污染该食品的细菌。其中优选可能混入、污染麦芽酒精饮料的细菌为检测对象细菌。食品中混入有害细菌已成为公共卫生方面的非常大的问题。此外，对于啤酒、发泡酒等所代表的麦芽酒精饮料，有害细菌混入时成为浑浊、风味劣化等质量劣化的原因，因此，特别期望开发出快速且准确检测、鉴定这些有害细菌的方法。

作为污染麦芽酒精饮料的细菌，可以为属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、巨球形菌属(Megasphaera)以及梳状菌属(Pectinatus)的细菌。并且属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的菌种，可以为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、玉米乳杆菌(含有Lactobacillus zeae、Lactobacillus casei的标准株)。此外，作为污染食品的细菌，除上述之外还可以为属于明串珠菌属(Leuconostoc)及发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌，以及耐久肠球菌(Enterococcus durans)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。但检测对象细菌并不限于上述细菌。

用于检测、鉴定上述所示细菌的捕获性寡核苷酸，可以为根据属于下述菌属的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的各属的特异性序列设计的寡核苷酸，所述菌属为：乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、巨球形菌属(Megasphaera)、梳状菌属(Pectinatus)及发酵单胞菌属(Zymomonas)；以及可以为由下述菌种的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的各细菌的种特异性序列设计的寡核苷酸，所述菌种为：短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、玉米乳杆菌(含有Lactobacillus zeae、Lactobacilluscasei的标准株)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。具体来说，可以为含有序列号1～64、71及72所示的任何碱基序列的寡核苷酸，但并不限于这些寡核苷酸。

表1例举了通过根据乳酸杆菌属(Lactobacillus)特异性碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号1～6)、以及根据部分乳酸杆菌属(Lactobacillus)和部分明串珠菌属(Leuconostoc)所对应的碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号72)，可以检测出的乳酸杆菌属的细菌。但通过具有序列号1～6及72所示的任何碱基序列的捕获性寡核苷酸可检测出的细菌，并不限于这些。

[表1]

通过根据片球菌属(Pediococcus)特异性碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号36～45)可检测出的细菌如表2所示。但通过具有序列号36～45所示的任何碱基序列的捕获性寡核苷酸可检测出的细菌，并不限于这些。

[表2]

Pediococcus acidilactici
	Pediococcus pentosaceus
Pediococcus damnosus
	Pediococcus  inopinatus
Pediococcus parvulus
	Pediococcus clausseni i
Pediococcus dextrinicus
	Pediococcus urinaeequi

通过根据链球菌属(Streptococcus)特异性碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号46、47)可检测出的细菌如表3所示，但通过具有序列号46或47所示的碱基序列的捕获性寡核苷酸可检测出的细菌，并不限于这些。

[表3]

通过根据明串珠菌属(Leuconostoc)特异性碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号48、49)、以及根据部分乳酸杆菌属(Lactobacillus)和部分明串珠菌属(Leuconostoc)所对应碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号72)，可检测出的明串珠菌属的细菌如表4所示。但通过具有序列号48、49及72所示的任何碱基序列的捕获性寡核苷酸可检测出的细菌，并不限于这些。

[表4]

Leuconostoc argentinum
	Leuconostoc carnosum
Leuconostoc citreum
	Leuconostoc cremoris
Leuconostoc dextranicum
	Leuconostoc fallax
Leuconostoc ficulneum
	Leuconostoc fructosum
Leuconostoc garlicum
	Leuconostoc gasicomitatum
Leuconostoc gelidum
	Leuconostoc inhae
Leuconostoc kimchii
	Leuconostoc lactis
Leuconostoc mesenteroides
	Leuconostoc pseudofi culneum
Leuconostoc pseudomesenteroides

通过根据巨球形菌属(Megasphaera)特异性碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号50～55)可检测出的细菌，可以为Megasphaera cerevi siae、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、Megasphaera micronuciformis。但通过具有序列号50～55所示的任何碱基序列的捕获性寡核苷酸可检测出的细菌，并不限于这些。

通过根据梳状菌属(Pectinatus)特异性碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号56～58)可检测出的细菌，可以为嗜啤酒梳状菌(Pectinatuscerevisiiphilus)、Pectinatus frisingensis。但通过具有序列号56～58所示的任何碱基序列的捕获性寡核苷酸可检测出的细菌，并不限于这些。

通过根据发酵单胞菌属(Zymomonas)特异性碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号59、60)可检测出的细菌，可以为Zymomonas mobilis、Zymomonaspomaceae。但通过具有序列号59或60所示的任何碱基序列的捕获性寡核苷酸可检测出的细菌，并不限于这些。

本发明的细菌检测器具的基板表面固定的捕获性寡核苷酸，只要能够与从对象细菌中制备的探针进行杂交，没有特别限定。因此，含有上述序列号1～64、71及72所示的任何碱基序列的寡核苷酸，可以为只含有序列号1～64、71及72所示的任何碱基序列组成的寡核苷酸，也可以为含有序列号1～64、71及72所示的任何碱基序列以外的序列的寡核苷酸。作为含有序列号1～64、71及72所示的任何碱基序列以外的序列的捕获性寡核苷酸，可以为具有下述碱基序列的寡核苷酸，所述碱基序列为以各16S核糖体RNA基因的碱基序列为基础，向序列号1～64、71及72所示的各碱基序列的5’侧或3’侧、或者其两侧延伸的碱基序列，本发明也包含将这种寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具。

1个基板上固定化的捕获性寡核苷酸至少有1种或1种以上即可，没有特别限定。一般情况下，检测试料中混入的细菌时，用1个基板可以全部检测出被检试料中的可检测细菌，从操作的简便性和检查的快速性来看可谓优选。因此，本发明的细菌检测器具也最优选在1个基板上固定多数目的细菌种或属相对应的捕获性寡核苷酸，成为所谓的微阵列型器具。例如使麦芽酒精饮料作被检试料时，优选将属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、巨球形菌属(Megasphaera)、梳状菌属(Pectinatus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)等的细菌所对应的捕获性寡核苷酸固定在基板表面。

[寡核苷酸(捕获性寡核苷酸)的固定化]

寡核苷酸在基板表面的固定化方法没有特别限定，可以适当选择并使用公知的方法。例如可以利用物理吸附、静电结合或分子共价键等一般杂交法所使用的方法。本发明的细菌检测器具，优选使用表面具有碳化二亚胺基或异氰酸酯基的基材(美国专利：US5,908,746、日本国专利特开平8-23975号)进行固定化。

将寡核苷酸点样时，如果寡核苷酸的点样量太少，无法充分确保寡核苷酸和探针之间的反应性，因而难于判断。此外，高密度点样存在技术问题同时成本较高，并且，使用探针的荧光标记、化学显色等的杂交信号的检测，也需要更加精密的昂贵的检测装置(例如扫描仪)。因此，优选寡核苷酸以直径10～1000μm的尺寸固定在基板表面。寡核苷酸在基板上的点样方法没有特别限定，例如可通过使用点样机将寡核苷酸溶液点样在基板上来进行点样。因此寡核苷酸溶液通常可点样为大致的圆形。

(2)本发明的细菌检测方法

本发明的细菌检测方法是用于检测、鉴定被检试料中的细菌的方法，其包括制备被检试料中的细菌的核酸的核酸制备步骤、以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤、将根据对象细菌所属的种或属特异性序列设计的寡核苷酸与上述标记探针进行杂交的杂交步骤、检测杂交信号的信号检测步骤。本检测方法的杂交步骤优选使用上述本发明的细菌检测器具。通过使用该细菌检测器具，可简便、快速且准确地进行全面的检测、鉴定。此外，本检测方法的被检试料优选食品，特别优选麦芽酒精饮料。下面将分别对各步骤详细说明。

[核酸制备步骤]

其为制备被检试料中的细菌的核酸的步骤。从被检试料中制备核酸的制备方法，可以适当选择并使用公知的核酸制备方法。例如制备DNA时，可以根据R-F.Wang介绍的方法进行提取(Molecular and Cellular Probes(2000)14，1-5)。该方法为标准的制备方法，但还有多种替代方法，可以采用任一种方法。此外，也可以使用市售的试剂盒。

[探针制备步骤]

其为以上述核酸制备步骤所制备的核酸为模板制备标记探针的步骤。例如可使用设计成含有捕获性寡核苷酸及阳性对照捕获性核苷酸的碱基序列的引物，通过核酸扩增来制作探针。作为核酸扩增的方法，例如可以为通过PCR扩增DNA的方法，或者应用体外转录法(in vitro transcription)扩增RNA的方法，但并不仅限于这些方法。

例如通过PCR制备标记探针时，设计PCR使用的引物时使探针含有与捕获性寡核苷酸及阳性对照捕获性寡核苷酸互补的碱基序列。此外，只要能够杂交，探针可以比捕获性寡核苷酸及阳性对照捕获性寡核苷酸长，也可比其短。为了得到标记探针，可预先标记PCR使用的引物。此外也可通过预先标记PCR的基质(脱氧核苷酸三磷酸dNTP)得到标记探针。或者也可在PCR结束后标记探针。标记物质没有特别限定，例如可以使用与荧光物质、半抗原、放射性物质等通常杂交使用的探针相同的标记物质。具体来说，荧光物质可以为异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(Rodamine)、藻红素(phycoerythrin)(PE)、德州红(Texas Red)、矢车菊双甙(cyanin)类蛍光色素等，半抗原可以为生物素(BIOTIN)、地高辛(Digoxigenin)(Dig)、二硝基苯酚(DNP)、荧光素(fluorescein)等。

[杂交步骤]

杂交步骤是根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸和上述标记探针进行杂交的步骤。杂交可以在固定有上述寡核苷酸的薄膜上等进行，但优选使用本发明的细菌检测器具。通过使用该细菌检测器具，可以简便、快速且准确地进行全面的检测、鉴定。杂交步骤使用的方法没有特别限定，可以适当选择并使用公知的核酸杂交方法。下面所示的是一例具体杂交方法。

在含有SSC(Standard Saline Citrate)等盐溶液、十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂、牛血清白蛋白(BSA)等阻断溶液、以及促进融合反应的添加剂的融合液中，加入标记探针。当探针为2条链时，通过加热等进行变性。在基板上加数μl标记探针液后，进行数小时的加热操作(通常37℃～50℃)，在基板上固定的寡核苷酸和标记探针之间可以杂交。然后在基板上加5×SSC或3M四甲基氯化铵进行加热(通常37℃～50℃)，从基板上除去没有形成特异性杂交的标记探针，只有特异性杂交选择性地留在基板上。

[信号检测步骤]

信号检测步骤是判断上述杂交步骤是否发生杂交的步骤，通常与上述杂交步骤连续进行。

杂交检测步骤使用的方法，取决于上述探针制备步骤所制备的探针中导入的标记物质。即、检测杂交时要使用在探针中导入的荧光物质、半抗原等标记物质。因此，适当选择使用用于检测使用的探针中所导入的标记物质的公知方法即可。

例如，使用半抗原时，在基板上加含有识别半抗原的蛋白质或与其结合的蛋白质、碱性磷酸酯酶或辣根过氧化物酶等的结合体(酶结合物)的溶液，室温下使反应进行数10分钟。此外，在该半抗原和酶结合物进行结合反应之前，在固定有寡核苷酸的区域以外的基板区域使用酪蛋白等蛋白质将其完全覆盖，因此可以阻止酶结合物和基板的非特异性吸附反应。该过程可通过下述方式进行，即、将寡核苷酸固定后在基板上加酪蛋白等蛋白质溶液，室温下放置数十分钟。酶结合物和探针中的半抗原的结合反应结束后，用含有表面活性剂的适当缓冲液将没有与半抗原结合的酶结合物清洗、冲掉。因此，基板上仅留下与探针中的半抗原结合的酶结合物。

为使杂交可视化，仅在半抗原与酶结合物存在的情况下，添加仅可形成不溶化合物的化合物。该不溶化合物的生成通过酶反应可扩增并可视化。作为添加的化合物，当酶结合物中的酶是碱性磷酸酯酶时，可使用硝基四氮唑蓝(NBT)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-对甲苯胺盐)，当酶是辣根过氧化物酶时，可使用TMB(3，3’，5，5’四甲基联苯胺)。

通过观察已固定捕获性寡核苷酸的位置的杂交色素沉淀或荧光显色等杂交信号，判断被检试料中含有的细菌种类。即、已检测出杂交信号时，表示与该信号位置点样的寡核苷酸所对应的细菌存在于被检试料中。此外，如果在阳性对照捕获性寡核苷酸的位置发现信号，可以确认本试验正常进行；如在阴性对照捕获性寡核苷酸的位置没有发现信号，可以确认杂交在合适条件下进行。

(3)本发明的细菌检测试剂盒

本发明的细菌检测试剂盒，是用于实施上述本发明的细菌检测方法的试剂盒。因此，只要能够实施本发明的细菌检测方法，试剂盒内包含的结构没有特别限定。

本细菌检测试剂盒，优选包含本发明的细菌检测器具，使其成为包含该细菌检测器具的试剂盒，可以简便、快速且准确地进行全面的检测、鉴定。此外，本细菌检测试剂盒中优选包含上述杂交步骤及信号检测步骤使用的试剂。作为上述杂交步骤使用的试剂，例如可以为SSC(Standard SalineCitrate)等盐溶液、十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂、牛血清白蛋白(BSA)等阻断溶液以及用以促进融合反应的添加剂等。作为信号检测步骤使用的试剂，例如可以为识别半抗原的蛋白质与酶的结合体(酶结合物)、NBT、BCIP、TMB等显色基质等，但并不限于这些物质，选择适合目的的适当试剂构成试剂盒即可。

本细菌检测试剂盒中，优选包含上述探针制备步骤使用的试剂，并且还优选包含上述核酸制备步骤使用的试剂。作为探针制备步骤使用的试剂，例如可以为PCR用缓冲液、耐热性DNA合成酶、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)混合液等。作为核酸制备步骤使用的试剂，可以为溶菌用缓冲液、DNA回收用柱子、DNA提取用缓冲液等。但并不限于这些物质，选择适合目的的适当试剂构成试剂盒即可。

通过使用本发明的试剂盒(包含本发明的细菌检测器具及各步骤中使用的试剂)，收到被检试料后约6小时即可检测、鉴定被检试料中含有的细菌。

(4)本发明的用途

本发明的细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒的用途没有特别限定，可在所有需要判断细菌的用途中使用。具体来说，适合应用于如因细菌污染而对质量造成大的影响的各种工业制品的制造工程，从该工业制品、其制造环境等中分离出的细菌需要快速且准确地检测、鉴定的情况。

作为判断对象的被判断细菌的来源的上述工业制品，代表性物质可以是食品、饮料、医药品、试剂、医药部外用品、一次性医疗器具等，没有特别限定。本发明优选应用于上述例举的工业制品中的食品。作为食品，更加具体地说，可以为面包、和洋点心(包括冷冻点心)、成品菜食品、乳制品、谷类食品、豆腐、油炸豆腐类、面类、盒饭类、调味料、小麦粉、食肉等农产加工品、营养补助食品(supplement等)、长期保存食品(罐头、冷冻食品、干馏食品等)等，没有特别限定。

本发明特别优选应用于上述例举的食品中的麦芽酒精饮料。作为麦芽酒精饮料，可以为啤酒、发泡酒等，没有特别限定。

实施例

[寡核苷酸的合成]

根据规定方法，使用寡核苷酸合成机(Perkin-elmer Applied biosystems公司制)合成寡核苷酸，经脱保护后进行干燥。使用10mM Tris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA缓冲液溶解该寡核苷酸干燥体，制成100pmol/μL的寡核苷酸溶液。本实施例中使用的所有寡核苷酸均用该方法合成。合成的寡核苷酸的碱基序列用序列号1～72表示，其中序列号1～64、71及72是捕获性寡核苷酸，序列号65是检测对象细菌的阳性对照捕获性寡核苷酸，序列号66是阴性对照捕获性寡核苷酸，序列号67～68是引物，序列号69是对照探针，序列号70是对照探针的阳性对照捕获性寡核苷酸。对于捕获性寡核苷酸，使用上述合成机使氨基结合在5’末端，引物则是使生物素结合在5’末端。

[在基板上点样捕获性寡核苷酸]

对于10μL的5’末端具有氨基的寡核苷酸溶液，混合10μL微点样溶液(TeleChem International Inc.制)，分注于微孔板(Greiner LaboratoryInc制)上。在规定的点样位置放置碳化二亚胺树脂处理的载玻片Carbostation(日清纺织株式会社制)，使点样机工作。点样结束后，将载玻片置于热水的蒸气中数秒时间，然后照射600mJ紫外线。再次在蒸气中暴露数秒时间，然后将载玻片置于加热板上除去水分。将载玻片放入含有3％BSA(牛血清白蛋白)的100mM Tris-HCl(pH7.5)·100mM NaCl·0.1％Triton X-100中室温下浸渍30分钟，进行阻断。然后用缓冲液10mM Tris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA清洗。室温下干燥载玻片，使用前一直以干燥状态保存于冷暗处。图1(a)表示本实施例中实际使用的细菌检测器具的基板上固定的寡核苷酸的排列位置。

[核酸制备步骤]

作为检体使用的细菌是14种乳酸杆菌属、5种片球菌属、1种链球菌属、1种明串珠菌属、3种巨球形菌属、2种梳状菌属、2种发酵单胞菌属、1种肠球菌属、1种乳球菌属的共计30种细菌。表5表示作为检体使用的细菌。

[表5]

使用Genomic DNA Purif.Kit(EdgeBioSystems制、Cat.No.#85171)，从在最适合所述各细菌的培养条件下培养的各菌液中分别制备各细菌的基因组DNA。

[探针制备步骤]

以得到的各细菌的DNA为模板通过PCR制备核酸探针。PCR反应液的组成为，Taq聚合酶1unit、生物素化引物(序列号68和69)各10pmol、反应用缓冲液(10×)5μL、dNTP各10nmol、模板DNA：在100ng中加入灭菌蒸馏水使总量为50μL。使用热循环器，95℃保持3分钟后，95℃30秒、55℃15秒、72℃1分钟的反应循环30次，72℃保持5分钟结束反应。

此外，设计引物序列相同而与对象细菌的序列不同的人工序列，以此作为对照探针。将其作为模板进行PCR反应，制备生物素化对照探针。PCR反应液的组成除使模板DNA为1ng外其他与上述相同。此外，反应温度和循环数与上述相同。不精制探针，直接将PCR反应液作探针溶液在下述杂交步骤中使用。

[杂交步骤和信号检测步骤]

将3μL上述核酸探针溶液、1μL生物素化对照探针溶液、16μL ArrayItUnihyb Hybridization Solution(TeleChem International Inc.制)加在一起并混合，100℃加热处理1分钟后在冰中浸渍5分钟。取全量该核酸探针溶液，加在固定有捕获性寡核苷酸的基板上，在其上面放置盖玻片。将其放入保湿箱，在设定37℃的恒温器中静置120分钟。取出基板，快速浸入室温下的2×SSC溶液(2×SSC：0.033M NaCl、0.033M枸橼酸钠)中并除去盖玻片，在保持温度为37℃的2×SSC中浸渍5分钟。

从2×SSC中取出基板，放入离心机(Beckman公司制)内，以2000rpm离心1分钟，接着使用VECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR公司制)，制作卵白素-生物素化过氧化物酶复合体，在基板上滴1.4mL，室温静置30分钟。然后在PBS(10mM磷酸钠(pH7.5)、0.9％氯化钠)中清洗。使用TMB substratekit for peroxidase(VECTOR公司)制备显色溶液，在基板上滴1.4mL室温静置30分钟。用蒸馏水清洗基盘停止显色反应。

[判断]

使用爱普生公司制造的扫描仪GT-8700F及其透光单元，用600dpi扫描已进行杂交的区域，用目视来确认扫描图像有无显色。图1(b)表示作为扫描图像的一例的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的扫描图像。此外，图1(a)表示基板上的寡核苷酸的排列位置。

[结果]

作为检体使用的30种细菌的结果如表6～35所示。各表中“○”表示确认的显色点，“-”表示没有确认的显色点。表6～35所示的全部结果显示，对照探针在与其相对应的阳性对照捕获性寡核苷酸(序列号70)处显色，此外，在阴性对照捕获性寡核苷酸处没有显色，可以确认扩增及杂交步骤均正常进行。此外确认所有细菌的阳性对照捕获性寡核苷酸(序列号65)处均显色，因此可以确认从细菌中制备的核酸得到了扩增。此外，在下述结果的说明中不包括阳性对照捕获性寡核苷酸(序列号65和70)的显色。

表6表示Lactobacillus brevis的结果，确认Lactobacillus brevis在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号1)的1处和在Lactobacillus brevis检测用捕获性寡核苷酸(序列号7、8、9、71)的4处，合计仅5处显色(参照图1)。确认Lactobacillus curvatus(表8)在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号5)的1处和Lactobacilluscurvatus检测用捕获性寡核苷酸(序列号13、14)的2处，合计仅3处显色。确认Lactobacillus coryniformis(表7)、Lactobacillusdelbrueckii(表9)、Lactobacillus lindneri(表11)及Lactobacillusmalefermentans(表12)，在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号1～6)的6处中的任何1处和各细菌对应的种特异性捕获性寡核苷酸的3处，合计仅4处显色。

确认Lactobacillus fermentum(表10)在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号6)的1处、部分Leuconostoc属及部分Lactobacillus属的检测用捕获性寡核苷酸(序列号72)的1处、Lactobacillus fermentum检测用捕获性寡核苷酸(序列号19～21)的3处，合计仅5处显色。确认Lactobacillus casei(表13)在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号3、4)的2处、Lactobacillus casei检测用捕获性寡核苷酸(序列号28、29)的2处，合计仅4处显色。确认Lactobacillusrhamnosus(表14)在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号3、4)的2处、Lactobacillus rhamnosus检测用捕获性寡核苷酸(序列号32、33)的2处，合计仅4处显色。确认Lactobacillus buchneri(表15)在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号1)的1处、Lactobacillus buchneri检测用捕获性寡核苷酸(序列号34、35)的2处，合计仅3处显色。确认Lactobacillus zeae(表19)在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号3、4)的2处、Lactobacillus zeae检测用捕获性寡核苷酸(序列号30、31)的2处，合计仅4处显色。

此外，确认没有设计种特异性捕获性寡核苷酸的Lactobacillusplantarum(表16)及Lactobacillus sakei(表18)，仅在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号1～6)的6处中任何1处显色。确认Lactobacillus psittaci(表17)在Lactobacillus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号6)的1处和部分Leuconostoc属及部分Lactobacillus属的检测用捕获性寡核苷酸(序列号72)的1处，合计仅2处显色。

确认Pediococcus damnosus(表20)、Pediococcus acidilactici(表21)、Pediococcus claussenii(表22)、Pediococcus dextrinicus(表23)及Pediococcus urinaeequi(表24)仅在Pediococcus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号36～45)的10处中的任何2处显色。

确认Streptococcus alactolyticus(表25)仅在Streptococcus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号46、47)的2处显色。

确认Leuconostoc mesenteroides(表26)在Leuconostoc属检测用捕获性寡核苷酸(序列号48、49)的2处、部分Leuconostoc属及部分Lactobacillus属的检测用捕获性寡核苷酸(配列番号72)的1处，合计仅3处显色。

确认Megasphaera cerecisiae(表27)、Megasphaera elsdenii(表28)及Megasphaera micronuciformis(表29)在Megasphaera属检测用捕获性寡核苷酸(序列号50～55)的6处中的任何2处显色。

确认Pectinatus cerevisiiphils(表30)及Pectinatus frisingensis(表31)在Pectinatus属检测用捕获性寡核苷酸(序列号56～58)的3处中的任何2处显色。

确认Zymomonas mobilis(表32)及Zymomonas pomaceae(表33)，仅在Zymomonas属检测用捕获性寡核苷酸(序列号59、60)的2处显色。

确认Enterococcus durans(表34)仅在Enterococcus durans检测用捕获性寡核苷酸(序列号61、62)的2处显色。

确认Lactococcus lactis(表35)仅在Lactococcus lactis检测用捕获性寡核苷酸(序列号63、64)的2处显色。

上述结果显示，对于作为检体使用的各细菌，仅在固定有各细菌的特异性捕获性寡核苷酸的位置显色，均没有非特异性显色。因此可以确认本实施例制作的细菌检测器具能够特异性地检测Lactobacillus属、Pediococcus属、Streptococcus属、Leuconostoc属、Megasphaera属、Pectinatus属、Zymomonas属，并且确认其为能够种特异性地检测Lactobacillus brevis、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus curvatus、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus casei(包括Lactobacillusparacasei)、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae(包括Lactobacillus casei的标准株)、Enterococcusdurans及Lactococcus lactis的细菌检测器具。

[表6]被检细菌：Lactobacillus brevis

[表7]被检细菌Lactobacillus coryniformis

[表8]

被检细菌：Lactobacillus curvatus

[表9]被检细菌Lactobacillus delbrueckii

[表10]

被检细菌：Lactobacillus fermentum

[表11]

被检细菌：Lactobacillus lindneri

[表12]

被检细菌：Lactobacillus malefermentans

[表13]

被检细菌：Lactobacillus casei

[表14]

被检细菌：Lactobacillus rhamnosus

[表15]

被检细菌Lactobacillus buchneri

[表16]

被检细菌：Lactobacillus plantarum

[表17]

被检细菌：Lactobacillus psittaci

[表18]

被检细菌：Lactobacillus sakei

[表19]

被检细菌：Lactobacillus zeae

[表20]

被检细菌：Pediococcus dammosus

[表21]

被检细菌：Pediococcus acidilactici

[表22]

被检细菌：Pediococcus claussenii

[表23]

被检细菌：Pediococcus dextrinicus

[表24]

被检细菌：Pediococcus urinaeequi

[表25]

被检细菌：Streptococcus alactolyticus

[表26]

被检细菌：Leuconostoc mesenteroides

[表27]

被检细菌：Megasphaera cerevisisae

[表28]

被检细菌：Megasphaera elsdenii

[表29]

被检细菌：Megasphaera micronuciformis

[表30]

被检细菌：Pectinatus cerevisiiphilus

[表31]

被检细菌：Pectinatus frisingensis

[表32]

被检细菌：Zymomonas mobilis

[表33]

被检细菌：Zymomonas pomaceae

[表34]

被检细菌：Enterococcus durans

[表35]

被检细菌：Lactococcus lactis

此外，在用于实施本发明的优选方式项中的具体实施方式或实施例，只不过是使本发明的技术内容更明确的部分，而不应该狭义地理解为仅限于这些具体例，只要是在本发明的精神和所述的权利要求书的范围内，可以实施各种变更。

本发明的细菌检测器具，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，可以检测、鉴定被检试料中的细菌。因此，根据本发明产生的效果是能够准确且简便地检测、鉴定细菌。

此外，如果在基板表面固定多数根据细菌种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸，则可产生能够进行全面检查的效果。

本发明的细菌检测试剂盒，因为含有上述细菌检测器具及必要的试剂，所以可产生提高操作性、更加简便地检测、鉴定细菌的效果。

本发明可以在食品制造业、饮食产业、药品产业等的卫生管理、过程管理、质量管理方面利用。

Claims (29)

1.细菌检测器具，用于检测、鉴定被检试料中的细菌，其特征在于，对象细菌是从下述(1)～(5)中所述的细菌中选择的至少2种或2种以上的细菌，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌，

(1)属于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的细菌

(2)属于酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的细菌

(3)属于片球菌属(Pediococcus)的细菌

(4)属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌

(5)属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌。

2.如权利要求1所述的细菌检测器具，其特征在于，所述对象细菌还包括下述(6)～(19)中所述的细菌，

(6)属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌

(7)属于链球菌属(Streptococcus)的细菌

(8)属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌

(9)属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌

(10)属于棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的细菌

(11)属于弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的细菌

(12)属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的细菌

(13)属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的细菌

(14)属于坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)的细菌

(15)属于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)群的细菌

(16)属于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的细菌

(17)属于布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的细菌

(18)属于耐久肠球菌(Enterococcus durans)的细菌

(19)属于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的细菌。

3.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌的163核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号2所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号5所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

4.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号8所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号9所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号71所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

5.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号10所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号11所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号12所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

6.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号13所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号14所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

7.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号16所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号17所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号18所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

8.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号19所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号20所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号21所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

9.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号22所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号23所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号24所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

10.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号25所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号26所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号27所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

11.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)群的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号28所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号29所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号30所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号31所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

12.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号32所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号33所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

13.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号34所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号35所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

14.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据属于片球菌属(Pediococcus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号36所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号37所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号38所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号39所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号40所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号41所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号42所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号43所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号44所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号45所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

15.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据属于链球菌属(Streptococcus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号46所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号47所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

16.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号48所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号49所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

17.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号50所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号51所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号52所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号53所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号54所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号55所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

18.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号56所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号57所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号58所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

19.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号59所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号60所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

20.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据耐久肠球菌(Enterococcus durans)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号61所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号62所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

21.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号63所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号64所示的碱基序列的寡核苷酸组成。

22.如权利要求1～21中任一项所述的细菌检测器具，其特征在于，所述基板表面具有碳化二亚胺基或异氰酸酯基，并且该碳化二亚胺基或异氰酸酯基与所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的连接子进行反应形成共价键。

23.细菌检测器具，用于检测、鉴定被检试料中的细菌，其特征在于，含有属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌及/或属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的序列中的序列号72所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌。

24.细菌检测方法，其为检测、鉴定被检试料中的细菌的方法，其特征在于，包括制备被检试料中细菌的核酸的核酸制备步骤、以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤、使所述探针和权利要求1～23中任一项所述的在细菌检测器具的基板表面固定的寡核苷酸进行杂交的杂交步骤、检测杂交信号的信号检测步骤。

25.如权利要求24所述的细菌检测方法，其特征在于，所述被检试料是食品。

26.如权利要求25所述的细菌检测方法，其特征在于，所述食品是麦芽酒精饮料。

27.细菌检测试剂盒，其用于实施权利要求24～26中任一项所述的细菌检测方法。

28.细菌检测试剂盒，其为用于实施权利要求24～26中任一项所述的细菌检测方法的试剂盒，其特征在于，包含所述杂交步骤及/或信号检测步骤使用的试剂。

29.如权利要求28所述的细菌检测试剂盒，其还包含所述探针制备步骤及/或所述核酸制备步骤使用的试剂。

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