CN102321175B

CN102321175B - 针对乳腺癌Her2/new的纳米抗体或多肽

Info

Publication number: CN102321175B
Application number: CN 201110280031
Authority: CN
Inventors: 李胜华
Original assignee: TIANJIN SHENGFA NABIOTECH CO Ltd
Current assignee: Tianjin Shengfa NabioTech Co., Ltd.
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2031-09-21
Also published as: CN102321175A

Abstract

本发明涉及针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2（Her2/new）的多肽和纳米抗体（或称单域抗体片段，singledomainantibodyfragment）,发明还涉及了编码所述纳米抗体和多肽的核酸，制备所述纳米抗体和多肽的方法，表达或能够表达所述纳米抗体的宿主细胞，该纳米抗体能在大肠杆菌中高效表达，能应用于制备定量检测乳腺癌过表达表皮生长因子受体2（Her2/new）的乳癌病人血和体液样品的酶免疫试剂盒等。

Description

针对乳腺癌Her2/new的纳米抗体或多肽

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，特别涉及对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)的多肽和纳米抗体(或称单域抗体片段，single domainantibody fragment)，发明还涉及了编码所述纳米抗体和多肽的核酸，制备所述纳米抗体和多肽的方法，表达或能够表达所述纳米抗体的宿主细胞，该纳米抗体能在大肠杆菌中高效表达，能应用于制备定量检测乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)的乳癌病人血和体液样品的酶免疫试剂盒等。

背景技术

据世界卫生组织国际癌症研究中心最近估计，每年全球新发女性乳腺癌病例达120万，占女性恶性肿瘤发病的22.7％，每年约有50万妇女死于乳腺癌。在乳腺癌患者中约有1/3-1/4是Her2/new过表达，可以用单克隆抗体药-Trastuzumab(Herceptin)进行有效的治疗(Charles L. Vogel，Efficacy and Safety ofTrastuzumab as a Single Agent in First-Line Treatment ofHER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer，J Clin Oncol 20：719-726.)。为了对乳腺癌Her2表达的特异性检测过表达患者进行个体化、靶向性有效的治疗，首先对患者的活检组织进行Her2的定性、半定量测定，常用方法：“immunohistochemistry(IHC)，fluorescence in situ hybridization(FISH)，and chromogenic in situ hybridization(CISHH)法(参考文献见：1.Press MF，Hung G，Godolphin W，Slamon DJ.Sensitivity of HER-2/neu antibodies inarchival tissue samples：potential source of error in immunohistochemicalstudies of oncogene expression.Cancer Res.1994；54：2771-2777.2.PressMF，Slamon DJ，Flom KJ，et al.Evaluation of HER-2/neu gene amplificationand overexpression：comparison of frequently used assay methods in amolecularly characterized cohort of breast cancer specimens.J ClinOncol.2002；20：3095-3105.3.Schnitt SJ，Jacobs TW.Current status ofHER2testing：caught between a rock and a hard place.Am J Clin Pathol.2001；116：806-810.4.Foster CS，Gosden CM，Ke Y.HER2/neu expression incancer：the pathologist as diagnostician or prophet？Hum Pathol.2003；34：635-638.5.Bartlett J，Mallon E，Cooke T.The clinicalevaluation of HER-2status：which test to use？J Pathol.2003；199：411-417.)，现在运用酶标免疫学方法(ELISA)对乳腺癌Her2表达的患者血清中游离的Her2胞外区蛋白多肽进行检测，以达到对乳腺癌Her2过表达患者进行个体化、靶向性治疗的指导和治疗后的疗效评价(Ramon Colomer，Sagrario Montero，Ana Lluch，et al.Circulating HER2Extracellular Domainand Resistance to Chemotherapy in Advanced Breast Cancer，Clinical CancerResearch，2000，6：2356-2364)。

纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念，而研发的最新和最小的抗体分子。最初由比利时的科学家在骆驼血液中发现的(C.Hamers-Casterman，Naturally occurringantibodies devoid of light chains，Nature，1993，363：446-448)。针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)的多肽和纳米抗体，是运用纳米抗体技术，用基因重组的Her2的胞外区多肽，筛选纳米抗体基因库，而得到的针对Her2特异性的纳米抗体(技术参考：Tanha J，Dubuc G，Selection by phagedisplay of llama conventional V(H)fragments with heavy chain antibodyV(H)H properties，J Immunol Methods.2002，263(1-2)：97-109)(GueorguievaD，Li S，Identification of single-domain，Bax-specific intrabodies thatconfer resistance to mammalian cells against oxidative-stress-inducedapoptosis，FASEB J.2006，20(14)：2636-8)。针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)的多肽和纳米抗体对于针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)患者的检测和指导治疗将有广阔的应用前景。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)的多肽和纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列以及该纳米抗体在制备，检测乳腺癌患者过表达表皮生长因子受体2的ELISA试剂盒的应用。

技术方案

针对Her2/new的纳米抗体，包括框架区和互补决定区；，其中所述的框架区为分别为FR1-FR4，框架区的FR1-FR4的氨基酸序列具体为：

FR1：QVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSGFSQVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFD，见SEQ NO.1；

FR2：WYRQTPGNRREWVWYRQTPGNRREWV，见SEQ NO.2；

FR3：RFAISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCRFTISRDNTKNMLYLQMNSLKAEDTGLYYC，见SEQ NO.3；

FR4；WGQGTQVTVSSWGQGTQVTVSS，见SEQ NO.4；

，其特征在于互补决定区为CDR1-CDR3，互补决定区CDR1-CDR3的氨基酸序列，具体为：

CDR1为PNVMG，见SEQ NO.5或DYAMS，见SEQ NO.6；

CDR2为AAANKYGTTTYADSVKG，见SEQ NO.7或SAISWNGGSTYYAESMKG，见SEQ NO.8；

CDR3为AASTATNWDYHY，见SEQ NO.9或VAPWKF，见SEQ NO.10。

作为一种优选方式所述的纳米抗体为pH2G4或pH2F1；其中pH2G4的氨基酸序列为，见SEQ NO.11：

QVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSGFSPNVMGWYRQTPGNRREWVAAANKYGTTTYADSVKG

RFAISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASTATNWDYHYWGQGTQVTVSS；

pH2F1的氨基酸序列为，见SEQ NO.12：

QVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGSTYYAESMK

GRFTISRDNTKNMLYLQMNSLKAEDTGLYYCVAPWKFWGQGTQVTVSS。

一种针对Her2/new的多肽，其特征在于多肽包括所述的CDR1-CDR3和FR1-FR4，多肽的氨基酸序列具有与CDR1-CDR3和FR1-FR4的氨基酸序列相似度至少80％。

作为一种优选方式多肽的氨基酸序列具有与CDR1-CDR3和FR1-FR4的氨基酸序列相似度至少90％.更优选的至少95％或以上的序列相同一性。

作为一种优选方式多肽的氨基酸序列具有与CDR1-CDR3和FR1-FR4的氨基酸序列相似度95％。

作进一步说明

pH2G4的核酸序列，354，SEQ NO.13：

CAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTG

TGCAGCCTCTGGAAGCGGCTTCAGTCCCAATGTGATGGGCTGGTACCGCCAAACTCCAGGGAACC

GGCGCGAGTGGGTCGCGGCAGCTAACAAATATGGTACGACTACCTATGCAGACTCCGTGAAGGGC

CGATTCGCCATCTCCAGAGACAACGCCAAGACTACGGTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAAACC

GGAGGACACGGCCGTCTATTACTGCGCCGCAAGTACGGCAACGAATTGGGACTATCACTACTGGG

GCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

pH2G4(蛋白质的氨基酸序列，118)：

QVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSGFSPNVMGWYRQTPGNRREWVAAANKYGTTTYADSVKG

RFAISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASTATNWDYHYWGQGTQVTVSS

pH2F1(核酸序列，339)，SEQ NO.14：

CAGGTAAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTG

TGCAGCCTCTGGATTCACTTTTGATGATTATGCCATGAGCTGGGTCCGACAGGCTCCAGGGAAGG

GGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGCTGGAATGGTGGTAGCACATACTATGCAGAATCCATGAAG

GGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATACCAAGAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAA

AGCTGAGGACACGGGTCTGTATTACTGTGTGGCACCGTGGAAATTCTGGGGCCAGGGGACCCAGG

TCACCGTCTCCTCA

pH2F1(蛋白质的氨基酸序列，113)：

QVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGSTYYAESMK

GRFTISRDNTKNMLYLQMNSLKAEDTGLYYCVAPWKFWGQGTQVTVSS

pH2G4和pH2F1蛋白质的氨基酸序列：左侧开始为氨基端，右侧结束为羧基端；其顺序为：无下画线的序列分别是框架区，FR1～FR4；有下画线的是抗原结合互补区，CDR1～CDR3。

本发明的原理介绍：

本发明涉及构建了Her2胞外区多肽重组基因克隆的pET28a表达载体，获得带有His标签的Her2胞外区(Her2ECD)高纯化蛋白，与能高亲和力结合带有His标签蛋白的Ni⁺磁珠结合，展示多肽的正确空间结构，以此形式的抗原筛选非免疫纳米抗体基因库(纳米抗体噬菌体展示基因库)，而获得了针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)的特异性的纳米抗体(或称单域抗体片段，single domain antibody fragment)，将此基因与表达载体连接重组，构建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株(pH2G4，pH2F1)。在实验室进行摇瓶小规模生产，经Ni⁺树脂凝胶亲和层析纯化，可得到SDS-PAGE电泳纯达95％，约100毫克/升细菌培养物的纳米抗体。利用纳米抗体pH2G4作为Her2的捕获抗体，利用生物素标记的纳米抗体pH2F1或羊抗Her2多克隆抗体作为检测抗体，检测灵Her2敏度可达1ng/ml的水平。

其中框架区为FR1-FR4为骆驼重链抗体的VHH常规框架，

有益效果：

本发明涉及构建了Her2胞外区多肽重组基因克隆的pET28a表达载体，获得带有His标签的Her2胞外区(Her2ECD)高纯化蛋白，与带有Ni+磁珠结合，展示多肽的正确空间结构，以此形式的抗原筛选非免疫纳米抗体基因库(来源于非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)，而获得了针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)的特异性的纳米抗体(或称单域抗体片段，single domainantibody fragment)，将此基因与表达载体连接重组，构建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株(pH2G4，pH2F1)。在实验室进行摇瓶小规模生产，经Ni⁺树脂凝胶亲和层析纯化，可得到SDS-PAGE电泳纯度达95％，约100毫克/升细菌培养物的纳米抗体。利用纳米抗体pH2G4作为Her2的捕获抗体，利用生物素标记的纳米抗体pH2F1或羊抗Her2多克隆抗体作为检测抗体，检测Her2灵敏度可达1ng/ml的水平。

附图说明

图1为表达的Her2ECD蛋白，经Ni⁺树脂凝胶亲和层析纯化，SDS-PAGE的电泳图，结果所示，E1～E7为250mM咪唑洗脱出Her2ECD纯化蛋白，M为标准分子量蛋白Marker。Her2ECD的纯度可达95％以上。

图2为表达的pH2G4蛋白，经Ni⁺树脂凝胶亲和层析纯化，SDS-PAGE结果所示，W1～5为100mM的咪唑洗去杂蛋白部分；E1～E7为250mM咪唑洗脱出pH2G4纯化蛋白，M为标准分子量蛋白Marker。pH2G4的纯度可达90％以上。

图3为pH2G4，pH2F1纯化后的电泳图，SDS-PAGE显示其纯度可达95％以上，分子量约为15kd。

图4为经分子筛葡聚糖凝胶(superG75)过滤高压液相分析实验所显示，pH2G4的洗脱峰出现的时间经与标准分子量蛋白Marker相比较，其峰值的分子量应为15kd。

图5为图5a染色体系中不加入生物素化的pH2G4时，细胞染色为背景的绿色，图5b当加入生物素化的pH2G4时，与细胞表面的Her2受体结合，出现明显的染色阳性反应。

图6为结果所示，在相同浓度的包被抗体和检测抗体的条件下，抗体包被ELISA板，放置37度，其结果比放置4度过夜为佳。

图7为ELISA正交试验结果所示，捕获抗体包被浓度在5～10微克/毫升，为最佳工作浓度，生物素标记抗体的最佳检测工作浓度为1～5微克/毫升；

图8为检测Her2的灵敏度和标准曲线的结果所示，当Her2浓度稀释范围从2微克至1毫微克时，其测定浓度成较好的线性关系；

图9为pH2G4-pSJF2质粒图谱；

图10为pH2Fi-pSJF2的质粒图谱；

图11为纳米抗体的基因电泳图，其中M所示为100bp的分子Marker，PCR产物带约为500bp，用QIAgenPCRkit纯化，用限制性核酸内切酶sfiI(NewNegland Biolabs)，50度，作用3～5小时。。

五、具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：

构建Her2胞外区(Her2ECD)多肽的基因克隆，其中Her2ECD为带His标签的重组蛋白：

设计一对引物(上游引物GGAATTCatgaagctgcggctccctgc见SEQ NO.17和下游引物CGGGATCCgcggttggtgtctatcagtgt，见SEQ NO.18)，以Her2的cDNA为模板，PCR扩增Her2ECD的480个核苷酸，然后连接到pET28a载体中，经基因序列测定，以确定所获得目的克隆基因序列的正确性。(2)在大肠杆菌BL21中高效表达Her2ECD，并经Ni⁺树脂凝胶亲和层析纯化，可得到SDS-PAGE电泳纯度达95％以上的Her2ECD纯化蛋白(见图1)。

Her2的核苷酸序列，见SEQ NO.15：

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGC

其中PCR扩增的条件为：用购买的PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，按照说明书进行试验，在50微升反应体积中：模板1微升(50ng)，上下游引物(10uM)各1微升，2倍试剂盒超级混合液25微升，水补足到50微升总体积。扩增条件：94℃，4分钟；在94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，1分钟条件下共30个循环；然后在72℃，5分钟。经琼脂糖电泳检测获得500bp的PCR产物。

Her2ECD的氨基酸序列，见SEQ NO.16：

MGSSSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSEFMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNL ELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPV TGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNR。

其中黑体斜体为His的位置；下划线为HerECD的氨基酸序列。

实施例2：

针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体2(Her2/new)的特异性的纳米抗体的筛选过程：

(1)在1.5毫升的离心管中，首先加入50微克纯化的pET28a载体表达的空载体带His标签多肽(所述的pET28a载体表达的空载体带His标签多肽为天津大学孙剑教授惠赠)，加入100微升噬菌体(5x10¹¹tfu非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库，加入50微升的Ni⁺磁珠，再加入500微升的2％脱脂牛奶0.01M磷酸盐缓冲液(2％MPBS)，pH7.0，放在可调速的转鼓上，轻轻转动60次/分种，在室温下1小时。

(2)将上述(1)中反应混合物的1.5毫升离心管，放在有磁力的管架上，经1分钟磁力吸附，Ni⁺磁珠被牢牢吸附在管底靠磁力架的一侧(此步骤以去除非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库中与pET28a载体表达的空载体带His标签多肽结合的多肽和Ni⁺磁珠的非特性结合的纳米抗体)，将上清转移到一个新1.5毫升离心管中。

(3)在(2)中的上清(已经吸附过后的的噬菌体)里加入50微克的Her2ECD纯化蛋白，放在可调速的转鼓上，轻轻转动60次/分种，在室温下结合2小时。

(4)向(3)的1.5毫升反应管中，加入经2％MPBS封闭过的50微升Ni⁺磁珠，放在可调速的转鼓上，轻轻转动60次/分种，在室温下结合30分钟。

(5)将(4)中的1.5毫升反应管，放在有磁力的管架上，经1分钟磁力吸附，吸去上清，用1毫升的0.05～0.1％吐温20(T)PBS(PBST)和PBS各洗Ni⁺磁珠10次，以洗掉未结合的噬菌体。

(6)用TEA(triethylamine(7.18M))将与Her2ECD纯化蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。相同筛选过程重复3～4轮。

其中非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库的构建方法，参考文献见(Tanha J，Dubuc G，Selection by phage display of llama conventional V(H)fragments with heavy chain antibody V(H)H properties，J Immunol Methods.2002，263(1-2)：97-109)

1.cDNA的合成：采自动物园的骆驼和山西农大的羊驼外周血，提取淋巴细胞，用QIAgenRNA纯化试剂盒，纯化RNA，用Amersham BiosciencesFirst-Sttrand cDNA Synthesis Kit进行cDNA合成。

2.第一次骆驼重链PCR扩增：设计2条上游引物：LT1-5’CGC CAT CAA GGTACC AGT TGA 3’见SEQ NO.19和LT2--5’GGG GTA CCT GTC ATC CACGGA CCA GCT GA 3’见SEQ NO.20；2条下游引物：LB1-5’GCC CAG CCGGCC ATG GCC SMK GTG CAG CTG GTG GAK TCT GGG GGA 3’见SEQ NO.21和LB2--5’GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA AAG CTG GAG GAG TCT GGGGGA 3’见SEQ NO.22。PCR扩增的条件是：94℃3分钟，；在94℃30秒，55℃30秒.，72℃1分钟做30个循环；然后72℃在扩增7分钟。

3.用1％琼脂糖电泳，检测PCR产物，并将大于500bp，小于800bp的产物带，从琼脂糖中切除，并用QIAgen胶回收kit，回收PCR产物。

4.第二次PCR为构建基因库准备产物：设计上游引物gKF--5’CAT GTG TAGACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC C3’见SEQ NO.23和gKB--5CAT GTGTAG ATT CCT GGC CGG CCT GGC CTG AGG AGA CGG TGA CCT GG 3’见SEQNO.24。PCR扩增的条件是：94℃3分钟，；在94℃30秒，55℃30秒.，72℃1分钟做30个循环；然后72℃在扩增7分钟。

5.用1％琼脂糖电泳，检测PCR产物，此时得到纳米抗体的基因约500bp，见下图11：

6.噬菌体载体pHEN6(经过pHEN1改造而来)，用限制性核酸内切酶sfiI(New Negland Biolabs)，50度，作用3～5小时。

7.纳米抗体基因VHH与pHEN6载体链接反应：

反应混合物：T4连接酶(invitrogen)(高浓度5u/ul)1ul

VHH PCR产物 3mmol

pHEN6vector 1mmol

连接酶缓冲液 4ul

水补到 20ul

16度，链接过夜。

8.细菌转化：取连接反应物1ul，2ul加入到大肠杆菌TG1感受态里，用点转移仪(BioRad公司)电转后，涂在LB氨基苄青霉素平板上，32度过夜，计数细菌克隆数。

9.根据小试转化结果，当转化效率达到10⁸克隆/ng载体时，做30～50个电转化，即为非免疫骆驼噬菌体展示基因库。该基因库的容量约为10¹⁰的克隆。

10.当进行基因库筛选时，将上述9中的细菌培养，按生产噬菌体程序制备噬菌体。

实施例3：

用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选Her2ECD特异性单个阳性克隆：

(1)从上述实施例2第(6)步骤的经3～4轮筛选后含有噬菌体的细菌培养皿中，挑选单个菌落并接种于96孔细菌培养板中，培养过夜，(2)将其含有噬菌体的上清液转移到经Her2ECD纯化蛋白预先包被的ELISA板中，在室温或37度放置1～2小时，(3)用0.05％PBST洗去未结合的噬菌体，(4)加入辣根过氧化物酶标记的抗噬菌体抗体，作用1小时，(5)TMB显色，于ELISA仪上，在450nm波长，读取吸收值(OD)。(5)当样品孔OD值大于对照孔OD值2倍以上，判为阳性克隆孔。(6)PCR扩增或纯化阳性孔的质粒并进行基因测序。

依据各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株既为同一克隆株，而其序列不同的株既为不同的克隆株。

实施例4：

特异性纳米抗体表达质粒的构建：

PCR扩增实施例3所获得的特异性的纳米抗体基因，而获得带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点PCR产物，用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理PCR产物和载体(pSJF2载体)，经T4连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒pH2G4，pH2F1，并进行基因序列测定以确定其序列的正确性。

PCR的扩增条件：同实施列1，引物：上游引物TATGAAGACACCAGGCCCAGGTRMAGCTGGWGGAGTCT见SEQ NO.25；下游引物gaagatctccggatccTGAGGAGACGGTGACCTGGGT见SEQ NO.26。

pH2G4-pSJF2见SEQ NO.27和pH2F1-pSJF2见SEQ NO.28的质粒图谱见附图9、10。

实施例5：

纳米抗体蛋白在大肠杆菌中表达、纯化：

(1)将实施例4所述的含有质粒pH2G4，pH2F1的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上，37度过夜，(2)挑选单个菌落接种于20毫升的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37度，摇床培养过夜，(3)转种于1升含氨基苄青霉素的2YT培养液中，37度摇床培养，240转/分，培养到OD值达0.6～1.0时，加入0.1～0.5M IPTG，继续培养过夜。(4)离心，收菌，(5)加融菌酶裂解细菌，离心，收上清中可溶性纳米抗体蛋白。(6)经Ni+离子亲和层析高压液相制备纯度可达90％以上的蛋白。pH2G4，pH2F1的每1升细菌培养物蛋白得率分别为100毫克和65毫克。结果见图2、图3和图4所示，纳米抗体pH2G4和pH2F1表达带His标签蛋白约15kd，经分子筛葡聚糖凝胶(superG75)实验，pH2G4的洗脱峰也显示其分子量为15kd。

实施例6：

鉴定所获得的针对Her2ECD纳米抗体是否能识别和结合天然的Her2：

利用标记生物素的pH2G4对能表达Her2受体的乳腺癌细胞(SK-BR3)进行染色，可见特异性的染色反应，结果见附图5。图5a所示，染色体系中不加入生物素化的pH2G4时，细胞染色为背景的绿色，图5b当加入生物素化的pH2G4时，与细胞表面的Her2受体结合，出现明显的染色阳性反应。

实施例7：

试验研究双抗体夹心酶标免疫检测方法：

(1)包被条件的选择：用0.05M，pH9.5碳酸盐缓冲液将pH2G4纳米抗体稀释成不同的浓度，包被ELISA板，分别放置4度过夜和37度1.5小时，其结果显示，以37度1.5小时为佳。结果见图6；结果所示，在相同浓度的包被抗体和检测抗体的条件下，抗体包被ELISA板，放置37度，其结果比放置4度过夜为佳。

(2)捕获抗体最佳抗体包被浓度的优选：将捕获抗体pH2G4和检测抗体生物素标记的羊抗Her2多克隆抗体IgG或pH2F1稀释成不同的工作浓度，检测Her2浓度在1微克/毫升，OD450nm在1.0～1.5的条件下，进行正交试验，优选出最佳捕获抗体包被浓度为5～10微克/毫升。见图7。

图7：ELISA正交试验结果所示，捕获抗体包被浓度在5～10微克/毫升，为最佳工作浓度，生物素标记抗体的最佳检测工作浓度为1～5微克/毫升。

(3)检测Her2灵敏度及标准曲线的制订：以捕获抗体pH2G4工作浓度10微克/毫升包被ELISA板，将Her2稀释成不同浓度，然后加入检测抗体测定，结果显示其测定的灵敏度可达1～10毫微克/毫升(ng/ml)。见图8。附图8：检测Her2的灵敏度和标准曲线的结果所示，当Her2浓度稀释范围从2微克至1毫微克时，其测定浓度成较好的线性关系。

(4)双抗体夹心法酶标免疫检测Her2最佳优选条件的确定：

1)碳酸钠缓冲液(pH＝9.5，0.05M)稀释的10ug/ml pH2G4，100ul/孔，37℃包被1.5h；

2)PBST洗涤1次，4min；

3)0.2％酪蛋白(0.2％CPBS)250ul/孔，37℃封闭1h；

4)PBST洗涤1次，4min；

5)以Her2ECD作为抗原，以0.2％CPBS稀释，100ul/孔，37℃1h；

6)PBST洗涤3次，4min；

7)以0.2％CPBS稀释bio-IgG为2ug/ml，100ul/孔，37℃1h；

8)PBST洗涤3次，4min；

9)以0.2％CPBS稀释avidin-HRP 5000倍，100ul/孔，37℃1h；

10)PBST洗涤3次，4min；

以定量TMB底物室温显色10min。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津胜发生物技术有限公司

<120> 针对乳腺癌Her2/new的纳米抗体或多肽

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 60

<212> PRT

<213> FR1

<400> 1

Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Gln Val

20 25 30

Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

35 40 45

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp

50 55 60

<210> 2

<211> 26

<212> PRT

<213> FR2

<400> 2

Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val Trp Tyr Arg

1 5 10 15

Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val

20 25

<210> 3

<211> 60

<212> PRT

<213> FR3

<400> 3

Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Phe

20 25 30

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn

35 40 45

Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys

50 55 60

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> FR4

<400> 4

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr

1 5 10 15

Gln Val Thr Val Ser Ser

20

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> CDR1

<400> 5

Pro Asn Val Met Gly

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> CDR1

<400> 6

Asp Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> CDR2

<400> 7

Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> CDR2

<400> 8

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> CDR3

<400> 9

Ala Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr

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<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> CDR3

<400> 10

Val Ala Pro Trp Lys Phe

1 5

<210> 11

<211> 118

<212> PRT

<213> pH2G4

<400> 11

Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn

20 25 30

Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 113

<212> PRT

<213> pH2F1

<400> 12

Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 13

<211> 354

<212> DNA

<213> pH2G4

<400> 13

caggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaag cggcttcagt cccaatgtga tgggctggta ccgccaaact 120

ccagggaacc ggcgcgagtg ggtcgcggca gctaacaaat atggtacgac tacctatgca 180

gactccgtga agggccgatt cgccatctcc agagacaacg ccaagactac ggtgtatctc 240

caaatgaaca gcctgaaacc ggaggacacg gccgtctatt actgcgccgc aagtacggca 300

acgaattggg actatcacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354

<210> 14

<211> 339

<212> DNA

<213> pH2F1

<400> 14

caggtaaagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacttttgat gattatgcca tgagctgggt ccgacaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagctgga atggtggtag cacatactat 180

gcagaatcca tgaagggccg attcaccatc tccagagaca ataccaagaa catgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa agctgaggac acgggtctgt attactgtgt ggcaccgtgg 300

aaattctggg gccaggggac ccaggtcacc gtctcctca 339

<210> 15

<211> 582

<212> DNA

<213> Her2

<400> 15

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat gaagctgcgg 120

ctccctgcca gtcccgagac ccacctggac atgctccgcc acctctacca gggctgccag 180

gtggtgcagg gaaacctgga actcacctac ctgcccacca atgccagcct gtccttcctg 240

caggatatcc aggaggtgca gggctacgtg ctcatcgctc acaaccaagt gaggcaggtc 300

ccactgcaga ggctgcggat tgtgcgaggc acccagctct ttgaggacaa ctatgccctg 360

gccgtgctag acaatggaga cccgctgaac aataccaccc ctgtcacagg ggcctcccca 420

ggaggcctgc gggagctgca gcttcgaagc ctcacagaga tcttgaaagg aggggtcttg 480

atccagcgga acccccagct ctgctaccag gacacgattt tgtggaagga catcttccac 540

aagaacaacc agctggctct cacactgata gacaccaacc gc 582

<210> 16

<211> 194

<212> PRT

<213> Her2ECD

<400> 16

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His

35 40 45

Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly

50 55 60

Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu

65 70 75 80

Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln

85 90 95

Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln

100 105 110

Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro

115 120 125

Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg

130 135 140

Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu

145 150 155 160

Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys

165 170 175

Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr

180 185 190

Asn Arg

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggaattcatg aagctgcggc tccctgc 27

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgggatccgc ggttggtgtc tatcagtgt 29

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> LT1

<400> 19

cgccatcaag gtaccagttg a 21

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> LT2

<400> 20

ggggtacctg tcatccacgg accagctga 29

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> LB1

<400> 21

gcccagccgg ccatggccsm kgtgcagctg gtggaktctg gggga 45

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> LB2

<400> 22

gcccagccgg ccatggccca ggtaaagctg gaggagtctg gggga 45

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> gKF

<400> 23

catgtgtaga ctcgcggccc agccggccat ggcc 34

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> gKB

<400> 24

catgtgtaga ttcctggccg gcctggcctg aggagacggt gacctgg 47

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tatgaagaca ccaggcccag gtrmagctgg wggagtct 38

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gaagatctcc ggatcctgag gagacggtga cctgggt 37

<210> 27

<211> 167

<212> PRT

<213> pH2G4-pSJF2

<400> 27

Met Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr

1 5 10 15

Val Ala Gln Ala Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly

35 40 45

Phe Ser Pro Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg

50 55 60

Arg Glu Trp Val Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr

85 90 95

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln Lys Leu

130 135 140

Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His Lys Leu Gly Thr

145 150 155 160

Gly Arg Arg Phe Thr Thr Ser

165

<210> 28

<211> 163

<212> PRT

<213> pH2F1-pSJF2

<400> 28

Met Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr

1 5 10 15

Val Ala Gln Ala Gln Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Glu Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr

85 90 95

Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Gly Leu Tyr Tyr Cys Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

130 135 140

Asp Leu Asn His His His His His Lys Leu Gly Thr Gly Arg Arg Phe

145 150 155 160

Thr Thr Ser

Claims

1.针对Her2/new的纳米抗体，其特征在于所述的纳米抗体为pH2G4，其氨基酸序列为：SEQ ID NO:11。