CN102316866A - 皮肤治疗 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及老化皮肤的美容治疗。更具体地，本发明涉及巨大戟二萜醇化合物，特别是巨大戟二萜醇当归酸酯在治疗光老化和/或年龄老化皮肤中的应用。

Description

皮肤治疗

发明领域

本发明一般涉及老化皮肤的美容治疗。更具体地，本发明涉及巨大戟二萜醇化合物，特别是巨大戟二萜醇当归酸酯在治疗光老化和/或年龄老化皮肤中的应用。

发明背景

本说明书中对任何在先公开(或由其得到的信息)或任何已知情况的参考都不是，也不应当看作是对下列情况的确认或承认或任何形式的建议：在先公开(或由其得到的信息)或已知情况形成了本说明书所尽力涉及领域的通常的一般知识。

皮肤老化是一种动态过程，随着时间的流逝，不仅受到内在的细胞内和细胞外变化的影响，而且也受到环境或外部因素的影响，所述因素是例如缺乏营养、吸烟、过度酒精消耗，特别是长期暴露于UV辐射。

内在性或年龄性皮肤老化是真皮的结缔组织内在性退化的结果。这种形式的皮肤老化是不可避免的，尽管遗传影响会延迟其发生和/或临床进程。内在性老化皮肤显示为：表皮和真皮萎缩，表皮的表皮突变平以及成纤维细胞和肥大细胞数量减少，胶原水平降低。这在美容上的特征是一般无瑕疵的外观，但是具有细线、褶皱并丧失弹性(Baumann，L，2007；Helfrich，Y.R，2008；并将它们参考引入本文)。

光老化是外在老化的一种常见诱发因素，该术语是用于描述皮肤长期暴露于环境或人造UV辐射的美容学和生理学效应。尽管光老化可以发生在暴露于UV辐射的身体的任何部分，但是它最常见的是发生于面部、臂部、手、颈部和胸以上。光老化皮肤显示为：表皮厚度增加或表皮萎缩，最显著的是日光性弹性组织变性，真皮-表皮接界处正下方含弹性蛋白的物质蓄积。胶原和弹性纤维变得破碎且紊乱。在美容学水平上，这可以观察为皮肤变红和/或变厚(导致皮革质外观)、皮肤变脆和不规则色素沉着、品质和弹性丧失(Baumann，L，2007；Helfrich，Y.R，2008；并将它们参考引入本文)以及出现皱纹、干燥、雀斑和深沟形成。

透明质酸(hyaluronan)或透明质酸(hyaluronic acid，HA)是葡萄糖胺聚糖家族的一种高分子量(1x10⁴-1x10⁷Da)非-硫酸化的多糖组分，是皮肤细胞外基质(ECM)的一种重要组分，发挥很多中枢结构性和生理学功能。它由糖N-乙酰葡糖胺和D-葡糖醛酸的重复二糖单位构成，是由HA合酶(HAS)合成的，从HAS中已经分离出了3种脊椎动物基因，表征为HAS1、HAS2和HAS3。透明质酸可以在水中结合为其最高1000倍的重量，透明质酸与其他葡萄糖胺聚糖(GAGs)一起有助于皮肤保留和保持水分，因此保持光滑、丰润的外观。在真皮和表皮，特别是表皮细胞间隙中都可以发现透明质酸，它主要是由成纤维细胞和角质化细胞产生的。

胚胎/妊娠早期的胎儿皮肤，原型的非-年龄老化/非-光老化皮肤的特征在于较高的透明质酸水平。在胎儿皮肤中，它增强胶原晶格重组，并增强胶原III和V型的合成，在年轻人的皮肤中，在胶原和弹性纤维的周围及它们的交汇处发现有透明质酸。相反，老化皮肤的特征在于透明质酸的水平较低，同时观察到光老化皮肤显示较低水平的透明质酸。(Baumann，L.，2007并将它们参考引入本文)。

与非-年龄老化/非-光老化皮肤有关的透明质酸水平升高的原因在于透明质酸合酶(HAS)基因表达增加。一般公认，三种HAS基因对调节透明质酸合酶起作用：HAS1、HAS2和HAS3。在非-老化/非-光老化成纤维细胞中没有HAS1基因表达。HAS2被认为对胚胎/胎儿发育是必要的，HAS3与年龄老化/光老化皮肤有关。

透明质酸分子量(与浓度相结合)对于影响皮肤结构也是重要的，高分子量透明质酸形成了比低分子量透明质酸更为有效的细胞外周的包衣(Meran等人，2007，2008；Stern和Maibach，2008)。的确，在人的皮肤中，无论是表皮还是真皮中新合成的透明质酸的分子量都是高分子量。尽管HAS1和HAS3与低分子量透明质酸的合成有关而且如上所述与老化/光老化皮肤有关，但HAS2-衍生的透明质酸是高分子量的(典型地至少1.5x10⁶Da)。

尽管人们广泛承认，预防或者至少减少光老化过程的最佳和最有效途径是避免皮肤暴露于UV辐射，即避免日光并穿防护装和涂覆遮光剂，但是内在性老化过程是不可避免的，在今天迷恋年轻的社会中对于治疗仍然有强烈的需求，所述治疗可以通过逆转或者至少改善或缓解年龄老化和/或光老化过程中的一种或多种美容学现象例如线、皱纹、干燥、沟、发红、变厚、雀斑、缺乏色调和弹性、脆性和不规则色素沉着来使“时光倒流”。的确，消费者对可以恢复年龄老化或光老化皮肤特别是面部皮肤为年轻外观的化妆品的需求一直在增加，单是在美国截止2010年抗老化市场有望销售达到165亿美元以上(Helfrich，Y.R.，等人，2008)。

在这种需求下，需要新的治疗品，其可以有助于逆转、改善或缓解与皮肤的年龄老化和光老化有关的一种或多种美容学现象。

发明内容

本发明描述了下列发现：在大戟属(Euphorbia)种类中发现的巨大戟二萜醇化合物—巨大戟二萜醇-3-当归酸酯诱导皮肤成纤维细胞中内源性高分子量透明质酸的合成。因此，提供了一种改善皮肤，特别是年龄-或光老化皮肤的美容学外观的方法。

因此，在第一个方面，本发明提供一种在受试者中治疗年龄老化和/或光老化皮肤的方法，包括给所述受试者的皮肤施用巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

在另一个方面，本发明也提供巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐，以及包含药学可接受的载体和所述化合物或盐的组合物，用于治疗年龄老化和/或光老化皮肤。也提供巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐在制备治疗年龄老化和/或光老化皮肤的组合物或药物中的应用。

在另一个方面，提供一种在受试者中诱导透明质酸内源性合成的方法，包括给所述受试者的皮肤施用巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

本发明的另一个方面提供巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐在诱导受试者透明质酸内源性合成中的应用。

另一个方面提供巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐在制备诱导受试者中透明质酸内源性合成的药物中的应用。

在本发明的某些实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物局部施用于皮肤。

在本发明的某些实施方案中，所述化合物选自巨大戟二萜醇-3-当归酸酯、20-O-乙酰基-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯和20-脱氧-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯及其药学可接受的盐和前药。在一个例子中，所述化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯或其药学可接受的盐。

附图简述

图1图示了存在或不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在(A)24h和(B)72h时在0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005中培养的皮肤成纤维细胞的平均透明质酸合成(N＝3，平均值±SE，*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，与无PEP005的皮肤成纤维细胞对照比较)。

图2显示了在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24h(x200)时由在A)0，(B)0.01μg/ml，(C)0.1μg/ml，(D)1μg/ml，(E)10μg/ml和(F)100μg/ml PEP005中培养的皮肤成纤维细胞的透明质酸细胞外周包衣形成得到的代表性数字图像。

图3显示了在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在72h(x200)时由在(A)0，(B)0.01μg/ml，(C)0.1μg/ml，(D)1μg/ml，(E)10μg/ml和(F)100μg/ml PEP005中培养的皮肤成纤维细胞的透明质酸细胞外周包衣形成得到的代表性数字图像。

图4显示了在存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24h(x200)时由在(A)0，(B)0.01μg/ml，(C)0.1μg/ml，(D)1μg/ml，(E)10μg/ml和(F)100μg/ml PEP005中培养的皮肤成纤维细胞的透明质酸细胞外周包衣形成得到的代表性数字图像。

图5显示了在存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在72h(x200)时由在(A)0，(B)0.01μg/ml，(C)0.1μg/ml，(D)1μg/ml，(E)10μg/ml和(F)100μg/ml PEP005中培养的皮肤成纤维细胞的透明质酸细胞外周包衣形成得到的代表性数字图像。

图6显示了存在或不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在(A)24h和(B)72h时在0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005中培养的皮肤成纤维细胞的平均HAS1基因表达(N＝2，平均值±SE，*p＜0.05，**p＜0.01，与无PEP005的皮肤成纤维细胞对照比较)。

图7显示了存在或不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在(A)24h和(B)72h时在0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005中培养的皮肤成纤维细胞的平均HAS2基因表达(N＝3，平均值±SE)。

图8显示了存在或不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在(A)24h和(B)72h时在0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005中培养的皮肤成纤维细胞的平均HAS3基因表达(N＝3，平均值±SE)。

图9显示了在不存在TGF-β₁下，用0，0.01，0.1，1.0和10μg/ml PEP005处理的皮肤成纤维细胞的[3H]-葡糖胺掺入(在第1天)。

图10显示了在不存在TGF-β₁下，用0，0.01，0.1，1.0和10μg/ml PEP005处理的皮肤成纤维细胞的[3H]-葡糖胺掺入(在第3天)。

图11显示了在存在TGF-β₁下，用0，0.01，0.1，1.0和10μg/mlPEP005处理的皮肤成纤维细胞的[3H]-葡糖胺掺入(在第1天)。

图12显示了在存在TGF-β₁下，用0，0.01，0.1，1.0和10μg/mlPEP005处理的皮肤成纤维细胞的[3H]-葡糖胺掺入(在第3天)。

发明详述

单数形式“a”、“an”和“the”除非上下文另有清楚的说明，其包括复数方面。因此，例如当涉及“一种当归酰基-取代的巨大戟二萜”或“巨大戟二萜醇当归酸酯”时，如果适当，其包括单个化合物，以及两种或更多种化合物。

在整个说明书和权利要求中，除非上下文另有需要，词语“comprise”(“包含”)或其变形例如“comprises”或“comprising”应当理解为是指包括所述的整体或步骤或者整体的组，但是不排除任何其他的整体或步骤或者整体的组。

本文使用的“治疗”意欲是指在皮肤的美容或化妆学外观和/或生理性质(例如增加透明质酸的存在)方面的改善、完全或部分恢复，或者至少有一些逆转。在美容学上，这可以包括减少、消除、缓解或改善干燥、细线、皱纹、沟、发红、雀斑和不规则色素沉着中的一种或多种的外观。

这可以通过本领域常用的任何手段来评价或测定。一种示例性的方法使用了如本文所述的TruVu

摄影术。其他方法可以包括根据本领域已知方法测定或评价皱纹。

涉及“高分子量透明质酸”时，是指分子量的值为至少约1.5x10⁶Da。分子量的值可以根据本领域已知的方法，例如与已知标准品比较的凝胶过滤色谱法来确定，参见例如Simpson，R.M.，等人，2009。

至于涉及“巨大戟二萜醇”时，包括具有C3，C4，C5-三氧基反式二环[4.4.1]-十一烷的巨大戟二萜骨架的化合物。这些化合物被广泛地报道，并且在文献中是已知的，可以从植物例如大戟科的物种中分离出来，或者完全或部分化学合成(参见例如Winkler等人，2002和Tanino等人，2003)。合成制备的巨大戟二萜醇化合物可以包括天然巨大戟二萜醇的立体异构体。因此，本文也关注外消旋化合物和立体异构体混合物。本文所关注的化合物一般是在大戟科植物的提取物中发现的。因此，提取物可以包含从叶、茎、花、种子、树皮或树皮和茎之间渗出的或存在于上述部位中的树液或液体或半固体物质。最优选地，提取物是来自树液。此外，提取物可以包含位于从大戟科植物的树液、树叶、茎、花、树皮或其他植物原料中提取的级分中的液体或半固体物质。例如，可以物理处理植物原料以破坏植物纤维和细胞外基质物质并将组织间和组织内物质提取到溶剂包括水性环境中。所有这些化合物的来源都包括在本发明内，包括通过化学合成途径获得的化合物。在本发明的一些实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物是以分离或精制的形式使用的，也就是说它是或者已经制备成基本上不含或完全不含来自天然来源或者分离或合成方法的其他化合物或污染物。但是，应当认识到，如果需要，所述精制形式可以随后与其他化合物包括来自天然来源的那些化合物混合或配制。在一些实施方案中，基本上纯净的该化合物是至少95％纯度。在其他实施方案中，基本上纯净的该化合物是至少97或98％纯度。在另一些实施方案中，基本上纯净的该化合物是至少99或99.5％纯度。

此处涉及的大戟科家族的成员包括下列属的物种：铁苋菜属、Acidoton、Actinostemon、Adelia、Adenocline、Adenocrepis、Adenophaedra、Adisca、Agrostistachys、山麻杆属、Alchorneopsis、Alcinaeanthus、Alcoceria、油桐属、Amcmoa、雀儿舌头属、Angostyles、Anisophyllum、五月茶属、Aphora、银柴属、Aporosella、Argythamnia、Astrococcus、Astrogyne、Baccanrea、斑籽木属、Bernardia、Beyeriopsis、秋枫木属、留萼木属、Blumeodondron、Bonania、Bradleia、山漆茎属、Breyniopsis、土密树属、Buraeavia、Caperonia、Caryodendron、Celianella、Cephalocroton、口果粉衣属、刺果树属、地锦草属、Cheilosa、Chiropetalum、Choriophyllum、Cicca、假铁苋属、Cleidon、闭花木属、Cluytia、粗毛藤属、Cnidoscolus、Coccoceras、变叶木属、穴盘木属、Conami、Conceveiba、Conceveibastrum、Conceveibum、Corythea、Croizatia、巴豆属、Crotonopsis、Crozophora、Cubanthus、Cunuria、Dactylostemon、黄蓉花属、Dendrocousinsia、Diaspersus、Didymocistus、异萼木属、Discocarpus、Ditaxis、Dodecastingma、铁色属、Dysopsis、Elateriospermum、Endadenium、胚乳属、轴花属、红果属、Erythrochilus、Eumecanthus、大戟属、Euphorbiodendron、土沉香属、白饭树属、Galearia、Garcia、Gavarretia、白树属、Giara、Givotia、算盘子属、Glochidionopsis、Glycydendron、裸花属、Gymnosparia、Haematospermum、Hendecandra、橡胶树属、海厄属、Hieronyma、Hippocrepandra、澳杨属、Hymenocardia、Janipha、麻风树属、Julocroton、Lasiocroton、黄花木属、Leonardia、Lepidanthus、Leucocroton、Mabea、血桐属、锦葵属、木薯属、Mappa、Maprounea、蟲屎属、山靛属、Mettenia、微药属、Microdesmis、Microelus、Microstachy、Maocroton、翡翠塔属、Mozinna、澳杨属、圆叶血桐属、脐花属、白茶树属、Orbicularia、叶轮木属、Oxydectes、Palenga、全腺属、Paradrypeptes、Pausandra、红雀珊瑚属、Pera、多甲藻属、Petalostigma、叶下珠属、Picrodendro、Pierardia、Pilinophytum、Pimeleodendron、皮兰属、Platygyna、Plukenetia、Podocalyx、圣诞红属、Poraresia、内侧附肢属、Pseudanthus、铁线莲属、Quadrasia、Reverchonia、Richeria、龙胆木属、蓖麻属、Ricinocarpus、咖马粉属、蚂蝗属、Sanwithia、乌桕属、Savia、Sclerocroton、Sebastiana、一叶萩属、Senefeldera、Senefilderopsis、软珊瑚属、管海绵属、Spathiostemon、蜗牛属、乌桕属、宿萼木属、乳木属、四联球菌属、Tetraplandra、Tetrorchidium、Thyrsanthera、Tithymalus、Trageia、滑桃树属、三宝木属、Tyria和Xylophylla。

优选和特别适合实施本发明的属是大戟属(Euphorbia)。该属中特别有用的种类包括Euphorbia aaron-rossii、Euphorbia abbreviata、Euphorbia acuta、Euphorbia alatocaulis、Euphorbia albicaulis、Euphorbia algomarginata、Euphorbia aliceae、Euphorbia alta、Euphorbia anacampseros、Euphorbia andromedae、Euphorbia angusta、Euphorbia anthonyi、Euphorbia antiguensis、Euphorbiaapocynifolia、Euphorbia arabica、Euphorbia ariensis、Euphorbiaarizonica、Euphorbia arkansana、Euphorbia arteagae、Euphorbiaarundelana、Euphorbia astroites、Euphorbia atrococca、Euphorbiabaselicis、Euphorbia batabanensis、Euphorbia bergeri、Euphorbiabermudiana、Euphorbia bicolor、Euphorbia biformis、Euphorbiabifurcata、Euphorbia bilobata、Euphorbia biramensis、Euphorbiabiuncialis、Euphorbia blepharostipula、Euphorbia blodgetti、Euphorbia boerhaavioides、Euphorbia boliviana、Euphorbia bracei、Euphorbia brachiata、Euphorbia brachycera、Euphorbia brandegee、Euphorbia brittonii、Euphorbia caesia、Euphorbia calcicola、Euphorbia campestris、Euphorbia candelabrum、Euphorbiacapitellata、Euphorbia carmenensis、Euphorbia carunculata、Euphorbia cayensis、Euphorbia celastroides、Euphorbiachalicophila、Euphorbia chamaerrhodos、Euphorbia chamaesula、Euphorbia chiapensis、Euphorbia chiogenoides、Euphorbiacinerascens、Euphorbia clarionensis、Euphorbia colimae、Euphorbiacolorata、Euphorbia commutata、Euphorbia consoquitlae、Euphorbiaconvolvuloides、Euphorbia corallifera、Euphorbia creberrima、Euphorbia crenulata、Euphorbia cubensis、Euphorbia cuspidata、Euphorbia cymbiformis、Euphorbia darlingtonii、Euphorbiadefoliata、Euphorbia degeneri、Euphorbia deltoidea、Euphorbiadentata、Euphorbia depressa Euphorbia dictyosperma、Euphorbiadioeca、Euphorbia discoidalis、Euphorbia dorsiventralis、Euphorbia drumondii、Euphorbia duclouxii、Euphorbia dussii、Euphorbia eanophylla、Euphorbia eggersii、Euphorbia eglandulosa、Euphorbia elata、Euphorbia enalla、Euphorbia eriogonoides、Euphorbia eriophylla、Euphorbia esculaeformis、Euphorbiaespirituensis、乳浆大戟(Euphorbia esula)、Euphorbia excisa、Euphorbia exclusa、Euphorbia exstipitata、Euphorbia exstipulata、Euphorbia fendleri、Euphorbia filicaulis、Euphorbia filiformis、Euphorbia florida、Euphorbia fruticulosa、Euphorbia garber、Euphorbia gaumerii、Euphorbia gerardiana、Euphorbia geyeri、Euphorbia glyptosperma、Euphorbia gorgonis、Euphorbia gracilior、Euphorbia gracillima、Euphorbia gradyi、Euphorbia graminea、Euphorbia graminiea Euphorbia grisea、Euphorbia guadalajarana、Euphorbia guanarensis、Euphorbia gymnadenia、Euphorbiahaematantha、Euphorbia hedyotoides、Euphorbia heldrichii、Euphorbia helenae、Euphorbia helleri、Euphorbia helwigii、Euphorbia henricksonii、猩猩草(Euphorbia heterophylla)、Euphorbia hexagona、Euphorbia hexagonoides、Euphorbiahinkleyorum、Euphorbia hintonii、Euphorbia hirtula、飞扬草(Euphorbia hirta)、Euphorbia hooveri、Euphorbia humistrata、Euphorbia hypericifolia、Euphorbia inundata、Euphorbia involuta、Euphorbia jaliscensis、Euphorbia jejuna、Euphorbia johnston、Euphorbia juttae、Euphorbia knuthii、Euphorbia lasiocarpa、Euphorbia lata、Euphorbia latazi、Euphorbia latericolor、Euphorbia laxiflora Euphorbia lecheoides、Euphorbia ledienii、Euphorbia leucophylla、Euphorbia lineata、Euphorbialinguiformis、Euphorbia longecornuta、Euphorbia longepetiolata、Euphorbia longeramosa、Euphorbia longinsulicola、Euphorbialongipila、Euphorbia lupulina、Euphorbia lurida、Euphorbialycioides、Euphorbia macropodoides、Euphorbia macvaughiana、Euphorbia manca、Euphorbia mandoniana、Euphorbia mangleti、Euphorbia mango、Euphorbia marylandica、Euphorbia mayana、Euphorbia melanadenia、Euphorbia melanocarpa、Euphorbiameridensis、Euphorbia mertonii、Euphorbia mexiae、Euphorbiamicrocephala、Euphorbia microclada、小叶大戟(Euphorbiamicromera)、Euphorbia misella、Euphorbia missurica、Euphorbiamontana、Euphorbia montereyana、Euphorbia multicaulis、Euphorbiamultiformis、Euphorbia multinodis、Euphorbia multiseta、Euphorbiamuscicola、Euphorbia neomexicana、Euphorbia nephradenia、Euphorbia niqueroana、Euphorbia oaxacana、Euphorbiaoccidentalis、Euphorbia odontodenia、Euphorbia olivacea、Euphorbia olowaluana、Euphorbia opthalmica、Euphorbia ovata、Euphorbia pachypoda、Euphorbia pachyrhiza、Euphorbia padifolia、Euphorbia palmeri、Euphorbia paludicola、Euphorbia parciflora、Euphorbia parishii、Euphorbia parryi、Euphorbia paxiana、Euphorbia pediculifera、Euphorbia peplidion、Euphorbiapeploides、孛艾大戟(Euphorbia peplus)、Euphorbia pergamena、Euphorbia perlignea、Euphorbia petaloidea、Euphorbia petrina、Euphorbia picachensis、Euphorbia pilosula、治喘莠(Euphorbiapilulifera)、Euphorbia pinariona、Euphorbia pinetorum、Euphorbiapionosperma、Euphorbia platysperma、Euphorbia plicata、Euphorbiapoeppigii、Euphorbia poliosperma、Euphorbia polycarpa、Euphorbiapolycnemoides、Euphorbia polyphylla、Euphorbia portoricensis、Euphorbia portulacoides Euphorbia portulana、Euphorbia preslii、铺地草(Euphorbia prostrata)、Euphorbia pteroneura、Euphorbiapycnanthema、Euphorbia ramosa、Euphorbia rapulum、Euphorbiaremyi、Euphorbia retroscabra、Euphorbia revoluta、Euphorbiarivularis、Euphorbia robusta、Euphorbia romosa、Euphorbia rubida、Euphorbia rubrosperma、Euphorbia rupicola、Euphorbiasanmartensis、Euphorbia saxatilis M.Bieb、Euphorbia schizoloba、Euphorbia sclerocyathium、Euphorbia scopulorum、Euphorbiasenilis、Euphorbia serpyllifolia、Euphorbia serrula、Euphorbiasetiloba Engelm、Euphorbia sonorae、Euphorbia soobyi、Euphorbiasparsiflora、Euphorbias phaerosperma、Euphorbia syphilitica、Euphorbia spruceana、Euphorbia subcoerulea、Euphorbia stellata、Euphorbia submammilaris、Euphorbia subpeltata、Euphorbiasubpubens、Euphorbia subreniforme、Euphorbia subtrifoliata、Euphorbia succedanea、Euphorbia tamaulipasana、Euphorbiatelephioides、Euphorbia tenuissima、Euphorbia tetrapora、光棍树(Euphorbia tirucalli)、Euphorbia tomentella、Euphorbiatomentosa、Euphorbia torralbasii、Euphorbia tovariensis、Euphorbia trachysperma、Euphorbia tricolor、Euphorbia troyana、Euphorbia tuerckheimii、Euphorbia turczaninowii、Euphorbiaumbellulata、Euphorbia undulata、Euphorbia vermiformis、Euphorbiaversicolor、Euphorbia villifera、Euphorbia violacea、Euphorbiawhitei、Euphorbia xanti Engelm、Euphorbia xylopoda Greenm.、Euphorbia yayalesia Urb.、Euphorbia yungasensis、Euphorbiazeravschanica和Euphorbia zinniiflora。

在一些实施方案中，乳木属(Synadenium)的物种包括Synadeniumgrantii和Synadenium compactum。

在一些实施方案中，Monadenium属的物种包括Monadeniumlugardae和Monadenium guentheri。

在一个实施方案中，Endadenium属的物种是Endadeniumgossweileni。

在另一个实施方案中，当用于提供巨大戟二萜醇化合物例如巨大戟二萜醇当归酸酯的来源时，孛艾大戟(Euphorbia peplus)在本发明的实施中是特别有用的。本文涉及的孛艾大戟(“Euphorbia peplus”)或其缩写“E.peplus”包括该植物的各种品种、株、系、杂交物或衍生物，以及其植物学或园艺学的相关物质。此外，使用整个大戟科植物或其部分包括树液或种子可以实施本发明或者可以使用其他再生的物质。一般地，当使用种子或再生物质时，首先需要让植物或苗繁殖。

本文涉及的大戟科植物、大戟种类或E.peplus进一步包括遗传修饰的植物。遗传修饰的植物包括转基因植物或者其中除去特性或其中向下调节、突变或其他改变包括改变或诱导对特定基因显示调节作用的基因物质的内源基因序列的植物。因此，不以大戟科植物或大戟科或E.peplus物种天然存在的显示其特征的植物也包括在本发明中，并包括在上述术语的范围内。

在本发明的一个实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物具有下式：

其中

R¹-R³独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的酰基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、S(O)₂R′、S(O)₂O R′、P(O)(OR′)₂(其中R′是氢、烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基)和糖基，或者R¹和R²或R²和R³可以形成亚甲基或亚乙基链；和

R⁴选自氢、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的酰氧基、任选取代的芳基烷氧基、OS(O)₂R′、OS(O)₂OR′、OP(O)(OR′)₂((其中R′是氢、烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基)和糖氧基。

在一些例子中，R¹-R⁴中的至少一个不是氢。在其另一个例子中，R¹不是氢。

在本发明的一些例子中，R¹是任选取代的酰基C(O)-R。在其另一个例子中，R是任选取代的烷基、链烯基或炔基。在其另一个例子中，R可以是直链或支链的，可以最多有6或最多有10个碳原子。在其另一个例子中，R是支链的。

在本发明的某些例子中，R¹-R³中的一个是当归酰基，如下式(i)所示，或R⁴是O-当归酰基。这些化合物在本文也称作巨大戟二萜醇当归酸酯。在本发明一个这样的例子中，R¹是式(i)的当归酰基(angeloyl)。

在本发明的某些例子中，R²和R³中的一个或两个是氢。R²和R³也可以形成亚甲或亚乙二氧基。

在本发明的某些例子中，R⁴是氢、羟基或酰氧基，例如式-OC(O)C_1-6烷基的基团，例如乙酰氧基。

在本发明的某些例子中，在所述方法、应用和组合物中使用的化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯、20-O-乙酰基-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯和20-脱氧-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯(如下所示)，及其药学可接受的盐和前药。

在本发明一个实施方案中，该化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯。本文所述的“巨大戟二萜醇-3-当归酸酯”包括天然存在以及化学合成的形式。

同时，应当认识到，尽管所述化合物可以作为大戟科的树液或提取物来使用，但是本文所关注的巨大戟二萜醇化合物有利地是以至少部分精制或分离的形式，例如至少95％纯净形式，典型地，至少97，98或99％的纯度使用的。

可以使用合成化学领域已知的烷基化、烯基化、炔基化、芳基化、芳烷基化或酰基化不含羟基的基团的方法在巨大戟二萜醇化合物上进行烷基化、烯基化、炔基化、芳基化、芳烷基化或酰基化(参见例如Greene和Wutz，Protective Groups in Organic Synthesis，1999；March，Advanced Organic Chemistry，5^th Edition；Larock，ComprehensiveOrganic Transformations，1999；通过参考将其全部内容引入本文)。例如可以用烷基(或芳烷基)卤化物例如甲基碘(或苄基溴)或二烷基硫酸酯例如硫酸二甲酯或二乙酯将羟基烷基化(或芳烷基化)。可以通过用适当的羧酸、酰卤和酸酐在碱或偶合剂存在下处理来实现酰基化。可以通过化学方法实现糖苷的形成，例如将巨大戟二萜醇化合物与受保护的糖化合物反应，在所述糖化合物中C-1已经通过用羟基或羧基偶合卤化而激活，糖的羟基已经通过保护基封闭。可替代地，可以使用适当的糖基转移酶例如UDP-半乳糖依赖性半乳糖基转移酶和UDP-葡萄糖依赖性糖基转移酶，通过酶方法实现糖苷的形成。优选的C-1连接的糖是呋喃糖或吡喃糖(糖)取代基，其与巨大戟二萜醇当归酸酯结构通过糖的C-1(常规编号)连接而形成乙酰键。示例性的糖基包括还原糖例如葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖，它们都分别与巨大戟二萜醇化合物的氧原子相连接。

可以通过本领域已知的方法来制备硫酸、磺酸和磷酸基。R′的例子包括氢、C_1-6烷基、苯基和苄基。

本文使用的术语“烷基”是直链、支链或环烷基，优选C_1-20烷基，例如C_1-10或C_1-6。直链和支链烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、叔丁基、正-戊基、1，2-二甲基丙基、1，1-二甲基-丙基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、1，2，2-三甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、庚基、5-甲基己基、1-甲基己基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、4，4-二甲基戊基、1，2-二甲基戊基、1，3-二甲基戊基、1，4-二甲基-戊基、1，2，3-三甲基丁基、1，1，2-三甲基丁基、1，1，3-三甲基丁基、辛基、6-甲基庚基、1-甲基庚基、1，1，3，3-四甲基丁基、壬基、1-，2-，3-，4-，5-，6-或7-甲基-辛基、1-，2-，3-，4-或5-乙基庚基、1-，2-或3-丙基己基、癸基，1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-和8-甲基壬基、1-，2-，3-，4-，5-或6-乙基辛基、1-，2-，3-或4-丙基庚基、十一烷基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-或9-甲基癸基、1-，2-，3-，4-，5-，6-或7-乙基壬基、1-，2-，3-，4-或5-丙基辛基、1-，2-或3-丁基庚基、1-戊基己基、十二烷基，1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-，9-或10-甲基十一烷基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-乙基癸基、1-，2-，3-，4-，5-或6-丙基壬基、1-，2-，3-或4-丁基辛基、1-2-戊基庚基等等。当烷基一般是指“丙基”、“丁基”等等时，应当了解的是，如果适当，它是指任何的直链、支链和环的异构体。烷基可以被如本文定义的一个或多个任选取代基任选取代。“环烷基”是至少3个碳原子的环状烷基，例如C₃-C₈，例如C₃，C₄，C₅或C₆环烷基。环烷基的例子包含单-或多环烷基例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基，环癸基等等。环烷基可以任选被一个或多个如本文定义的任选取代基任选取代。

本文使用的术语“烯基”是由包含至少一个碳碳双键的直链、支链或环烃残基形成的基团，包括烯化的如上述定义的单-、二-或多-不饱和的烷基或环烷基，优选C_2-20烯基(例如C_2-10或C_2-6)。烯基的例子包括乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、丁烯基、异-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、环戊烯基、1-甲基-环戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、环己烯基、1-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、环辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、3-癸烯基、1，3-丁二烯基、1-4-戊二烯基、1，3-环戊二烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、1，3-环己二烯基、1，4-环己二烯基、1，3-环庚二烯基、1，3，5-环庚三烯基和1，3，5，7-环辛四烯基。烯基可以被如本文定义的一个或多个任选取代基任选取代。

本文使用的术语“炔基”是由包含至少一个碳碳叁键的直链、支链或环烃残基形成的基团，包括炔化的如上述定义的单-、二-或多-不饱和的烷基或环烷基。除非碳原子数目确定，该术语优选是指C_2-20炔基(例如C_2-10或C_2-6)。例子包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基和丁炔基异构体和戊炔基异构体。炔基可以被如本文定义的一个或多个任选取代基任选取代。

术语“芳基”是指芳香烃环系统的任何单、多核，共轭和稠合的残基。芳基的例子包括苯基、联苯基、三联苯基、四联苯基、萘基、四氢萘基、蒽基、二氢蒽基、苯并蒽基、二苯并蒽基、菲基、芴基、芘基、茚基、甘菊环基、

基。优选的芳基包括苯基和萘基。芳基可以被如本文定义的一个或多个任选取代基任选取代。

术语“酰基”是指基团C(O)-R，其中R可以是氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基残基。酰基的例子包括甲酰基，直链或支链的烷酰基(例如C_1-20)例如，乙酰基、丙酰基、丁酰基、2-甲基丙酰基、戊酰基、2，2-二甲基丙酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷酰基、十九烷酰基和二十烷酰基；环烷基羰基例如环丙基羰基、环丁基羰基、环戊基羰基和环己基羰基；直链或支链烯酰基(例如C_2-20)例如当归酰基；和芳酰基例如苯甲酰基、甲苯酰基和萘酰基。R残基可以如本文所述任选取代。

芳烷基是被如本文定义的芳基取代的如本文所定义的烷基。在一个实施方案中，烷基在末端被芳基取代。芳烷基的例子包括苯基C₁-C₂₀烷基例如苄基、苯乙基、苯丙基、苯丁基、苯戊基和苯己基。烷基和芳基中的一个或全部可以独立地被本文所述的一个或多个任选的取代基任选取代。

术语“任选取代”是指一个基团可以被一个或多个，相同或不同的取代基未取代或取代。烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳基和酰基的任选取代基包括：卤素(氯、溴、碘和氟)、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、苯基、硝基、卤代甲基(例如三溴甲基、三氯甲基、三氟甲基)，卤代甲氧基(例如三氟甲氧基、三溴甲氧基)、C(O)C_1-6烷基、氨基(NH₂)、C_1-6烷基氨基(例如甲基氨基，乙基氨基和丙基氨基)、二C_1-6烷基氨基(例如二甲基氨基、二乙基氨基和二丙基氨基)、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、硫代(SH)和C_1-6烷硫基。任选的取代基也包括CH₂基被羰基(C＝O)替代，或者可以是亚甲二氧基或亚乙二氧基。

应当认识到，在制备本发明关注的巨大戟二萜醇化合物的合成或半合成过程中，必需或需要保护其他可以反应或对所使用的反应或转化条件敏感的官能团。这些官能团的适当保护基是本领域已知的，可以根据标准的操作来使用。本文使用的术语“保护基”是指引入的官能团，它暂时使特定的官能团在该化合物将要经受的环境下失去活性。这些保护基和在适当的阶段引入并随后除去它们的方法是公知的(Greene和Wutz，1999，同上)。

本发明也涉及如本文所述使用的巨大戟二萜醇化合物的前药。作为巨大戟二萜醇化合物的前药的任意化合物都在本发明的范围和精神内。术语“前药”以最广义使用，包括能够在体内通过酶或水解转变为本发明的化合物的那些衍生物。这些衍生物是本领域技术人员容易发现的，包括例如游离的巯基或羟基转变为酯例如乙酸酯或硫酯，或者其中游离的氨基转变为酰胺的化合物。将本发明的化合物酰基化的方法，例如制备酯和酰胺前药是本领域公知的，可以包括用适当的羧酸、酸酐或氯化物在适当的催化剂或碱存在下处理该化合物。也关注羧酸(羧基)基的酯。适当的酯是C_1-6烷基酯；C_1-6烷氧基甲基酯，例如甲氧基甲基或乙氧基甲基；C_1-6烷酰氧基甲基酯，例如，特戊酰氧基甲基；酞基酯；C_3-8环烷氧基羰基C_1-6烷基酯，例如，1-环己基羰氧基乙基；1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基酯，例如，5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基；和C_1-6烷氧基羰氧基乙基酯，例如，1-甲氧基羰氧基乙基。氨基官能团的前药包括酰胺(参见，例如，Adv.BioSci.，1979，20，369，Kyncl，J.等人)、烯胺(参见，例如，J.Pharm.Sci.，1971，60，1810，Caldwell，H.等人)、希夫碱(参见，例如，US专利2,923,661和Antimicrob.AgentsChemother.，1981，19，1004，Smyth，R.等人)、

唑烷(参见，例如，J.Pharm.Sci，1983，72，1294，Johansen，M.等人)、曼尼希碱(参见，例如，J.Pharm.Sci.1980，69，44，Bundgaard，H.等人和J.Am.Chem.Soc.，1959，81，1198，Gottstein，W.等人)、羟甲基衍生物(参见，例如，J.Pharm.Sci，1981，70，855，Bansal，P.等人)和N-(酰氧基)烷基衍生物和氨基甲酸酯(参见，例如，J.Med.Chem.，1980，23，469，Bodor，N.等人，J.Med.Chem.，1984，27，1037，Firestone，R.等人，J.Med.Chem.，1967，10，960，Kreiger，M.等人，US专利5,684,018和J.Med.Chem.，1988，31，318-322，Alexander，J.等人)。选择和制备适当的前药的其他常规方法是本领域公知的，并在下列文献中进行了描述，例如，WO 00/23419；Design of Prodrugs，H.Bundgaard，Ed.，Elsevier Science Publishers，1985；Methods inEnzymology，42：309-396，K.Widder，Ed，Academic Press，1985；A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen andH.Bundgaard，Eds，Chapter 5，p113-191(1991)；Advanced DrugDelivery Reviews，8；1-38(1992)；Journal of PharmaceuticalSciences，77；285(1988)，H.Bundgaard，等人；Chem Pharm Bull，32692(1984)，N.Kakeya等人和The Organic Chemistry of Drug Desigand Drug Action，Chapter 8，pp352-401，Academic press，Inc.，1992。

所关注的前药的一些例子包括酰基酯、磺酸酯和磷酸酯。

该化合物的适当的药学可接受的盐包括但不限于药学可接受的无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的盐，或者药学可接受的有机酸例如醋酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、延胡索酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、门冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸和戊酸的盐。碱盐包括但不限于，与药学可接受的阳离子例如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵形成的盐。用试剂例如低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯例如硫酸二甲酯和二乙酯等等可以将包含氮的碱性基团变成四价。

本发明的化合物可以是游离化合物或溶剂化物(例如，在水中为水合物，或在常用有机溶剂例如醇中)的晶体形式，这些形式也意欲在本发明的范围内。溶剂化的方法是本领域内公知的，例如从给定溶剂中重结晶。

因此，根据本发明可以治疗的受试者包括哺乳动物受试者：人、灵长类、家畜(包括牛、马、羊、猪和山羊)，伴侣动物(包括狗、猫、兔、豚鼠)和俘获的野生动物。如果可以提供常规的试验系统，也可以关注实验室动物例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在本发明的某些实施方案中，也可以关注非哺乳动物类例如鸟、两栖动物和鱼。本发明的受试者也可以是指个体、病人、动物或受者。

根据本发明治疗的受试者优选是基于需要或寻求所述治疗来选择的。

所述巨大戟二萜醇化合物是以治疗有效量施用于受试者的。可以由主治医师确定用于施用(剂量)和给药方案的适当有效量，并可以取决于美容学外观、解剖学位置和所要治疗的皮肤区域，以及受试者的年龄和一般健康情况。

有利地，在一些实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物活性成分是作为药物组合物来施用的，所述药物组合物包含巨大戟二萜醇化合物和一种或多种药学可接受的辅料。因此，本发明也涉及巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药在制备治疗年龄或光老化皮肤的药物中的应用。

适合用于本发明的药物或组合物可以包含约0.0001％到高达100重量％的巨大戟二萜醇化合物。在某些实施方案中，该组合物包含约0.0001％到高达10重量％的数量的巨大戟二萜醇化合物，例如约0.0005，0.001，0.0025，0.005，0.0075，0.01，0.0125，0.015，0.02，0.025，0.05，0.075，0.1，0.125，0.15，0.2或0.25％至约0.5，1.0，2.5或5.0％。在本发明的一个实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯，存在量为约0.001-约1％。在另一个实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物，例如巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的存在量是约0.005-约0.2％。在其另一个实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物，例如巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的存在量可以是0.005-0.1％，例如约0.01％。

所述巨大戟二萜醇化合物可以以任何适当的形式施用，例如局部，如局部应用于需要治疗的区域，和/或注射到皮肤中。在本发明的具体的例子中，所述巨大戟二萜醇化合物是通过局部应用于皮肤的一个或多个区域来施用的。

应用的剂量取决于技术人员很容易即可确定的很多因素，但是可以是一天一次或多次剂量，疗程持续数天至数月，或者连续治疗直至达到期望的结果。在一些实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物每日施用1次或2次。

在本发明一个优选的实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物局部施用，即应用于期望治疗的区域。根据本发明可以治疗身体上任何区域的皮肤。在一些实施方案中，本发明涉及面部、颈部、咽喉、眼睛周围的区域(例如，眼下、眼袋和皱纹及眼角皱纹)、胸部上方、手、背部、双肩、头皮和手臂，包括前臂中的一个或多个部位的治疗。本发明的一些实施方案关注光老化皮肤的治疗。有利地，治疗应用于至少10cm²的年龄-和/或光老化皮肤的区域。在其他实施方案中，根据本发明治疗的皮肤是未患病的皮肤，即当时未患病。在一个示例性的实施方案中，根据本发明可以治疗面部和/或颈部/咽喉的区域。所述巨大戟二萜醇化合物可以以任何适当的形式局部应用，包括溶液、乳剂(水包油型、油包水型、气雾剂或泡沫)、软膏、糊剂、洗剂、粉剂、涂布剂、凝胶剂(例如PEP005(巨大戟二萜醇mebutate)凝胶剂，Peplin Inc.)、水凝胶、水胶体，可以制备霜剂以包含脂质体、微团和/或微球。可替代地，所述巨大戟二萜醇化合物可以以活性封闭敷料的形式存在，即其中所述巨大戟二萜醇化合物浸入或包被于敷料例如绷带、纱布、胶纸袋、网、面罩、橡皮膏、薄膜、膜或贴剂上。

本文关注的组合物和敷料的制剂是本领域技术人员公知的，参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18^th Edition，MackPublishing，1990。组合物可以包含任何适当的载体、稀释剂或赋形剂。这些包括任何常规的溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、包衣、抗真菌和抗细菌剂、增粘剂、成膜剂、皮肤渗透剂、表面活性剂、等张和吸收剂等。本发明所关注的组合物的载体必须是药学可接受的，意义在于与该组合物的其他成分相容且对受试者无害。

软膏是药物制剂领域公知的，是半固体制剂，典型地基于凡士林或其他石油衍生物。本领域技术人员会认识到，所使用的具体软膏基质是用于优化药物递送并优选提供其他期望的性质，例如润滑等的物质。与其他载体或赋形剂一样，软膏基质应当是惰性的、稳定的、无刺激性且不敏感的。可乳化软膏基质也称吸收性软膏基质，几乎不包含水或者不含水，包括例如，硫酸羟基甘油三硬脂酸酯、无水羊毛脂和亲水性软石蜡。乳剂软膏基质是油包水型(W/O)乳剂或水包油型(O/W)乳剂，包括，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏基质是由不同分子量的聚乙二醇制备的。

霜剂也是本领域公知的，是粘稠液体或半固体乳剂，水包油或油包水型。霜剂基质是水可洗的，包含油相、乳化剂和水相。油相也称“内”相，一般由凡士林和脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇组成。尽管不是必然，水相通常体积大于油相，一般包含保湿剂。霜剂中的乳化剂一般是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。

在药物制剂领域工作的技术人员将会认识到，凝胶剂是半固体、混悬型系统。单相凝胶剂包含基本上均匀分布于整个载体液体中的胶凝剂，胶凝剂一般是水性的，但是也优选包含醇，例如异丙醇，和任选的油。

用于递送化妆剂的洗剂是无摩擦应用于皮肤表面的制剂，典型的是液体或半液体制剂，其中固体颗粒包括活性剂存在于水或醇基质中。洗剂一般是固体的混悬液，为达到本发明的目的，优选包含水包油型的液体油性乳剂。一般不溶性物质在洗剂中是精细分散的。洗剂典型地包含悬浮剂，以产生更好的分散，以及用于集中和保持活性剂与皮肤更好的接触的化合物。

糊剂是其中活性剂悬浮于适当基质中的半固体剂型。取决于基质的性质，糊剂分为脂肪型糊剂或由单相水性凝胶制成的糊剂。脂肪型糊剂中的基质一般是凡士林或亲水性软石蜡等。单相水性凝胶制成的糊剂一般掺入羧甲基纤维素等作为基质。

在本发明的一个实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物可以典型地以基于异丙醇的凝胶剂的形式局部应用。一种适当的制剂包含异丙醇、苯甲醇、纤维素聚合物例如羟乙基纤维素和pH＜3的缓冲剂(例如，柠檬酸盐)。在本发明的另一个实施方案中，所述巨大戟二萜醇化合物可以配制成巨鲸蜡醚霜剂形式用于布局应用，例如包含聚西托醇(cetomacrogel)乳化蜡、白凡士林和液状石蜡。

也可以用脂质体、微团和微球来制备制剂。脂质体是微小的囊泡，具有包含脂质双层的脂质壁，也可以用作本文的药物递送系统。一般而言，脂质体制剂优选用于微溶性或不溶性药物。用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(带正电)、阴离子(带负电)和中性制剂。

本领域公知，微团是由表面活性剂分子构成的，所述表面活性剂分子排列，以使它们的极性头基形成外球壳，同时疏水性碳链定向于球的中心，形成芯。微团是在包含足够高浓度的表面活性剂的水溶液中形成的，结果自然产生了微团。通过置入局部或经皮递送系统的贮药器中或置入应用于身体表面的制剂中，可以将微团制剂与本发明结合使用。

与之类似，微球可以置入到本发明的制剂和药物递送系统中。与脂质体和微团一样，微球基本上包囊有药物或含药制剂。尽管不必要，微球一般是由合成或天然的生物相容性聚合物形成的，但是也可以是由带电脂类例如磷脂构成。微球的制备是本领域公知的，并在相关的文章和文献中进行了描述。

应当理解，本发明也可以与应用其他形式的抗老化或抗光老化治疗法一起实施，包括但不限于，用于治疗年龄老化或光老化皮肤的激光表面重修术、化学脱皮术、局部用视黄醇、机械表面重修术(例如皮肤摩擦术)和光动力疗法(PDT)。

与本发明结合使用的其他药物可以与所述巨大戟二萜醇化合物或化合物一起配制到组合物或敷料中，或者它们可以分别连续或一起施用。

应当认识到，尽管术语“年龄性老化”和“光老化”是用于指分别由于时间流逝和暴露于UV辐射而导致的皮肤的美容学和/或生理学效应，在一些实施方案中，受试者可以是至少20，30，40，50或60岁的成年人，但是本发明并不局限于成年受试者，如果适当，巨大戟二萜醇化合物或包含所述化合物的组合物可以用于婴儿、儿童或青少年。

当有利地关注用于治疗人老化皮肤时，本文所述的巨大戟二萜醇化合物也可以以用于兽用组合物而存在。这些组合物可以通过本领域已知的任何适当方法来制备。这些组合物的例子包括适合局部应用的那些，例如，如上所述的霜剂、软膏、凝胶剂、洗剂等。

所述巨大戟二萜醇化合物，例如巨大戟二萜醇-3-当归酸酯或其药学可接受的盐可以在受试者的皮肤中诱导内源性透明质酸合成。有利地，诱导高分子量透明质酸的合成。诱导内源性透明质酸的评价可以有利地提供用于巨大戟二萜醇化合物效力的试验或评价方法。

在一个典型的例子中，将皮肤活检(4-6mm打孔活检)固定于10％缓冲福尔马林中，并包埋于石蜡中。将由石蜡块产生的玻片去蜡，并通过一系列的二甲苯和各级醇再水合。通过将该玻片浸入在甲醇中的过氧化氢中30分钟来阻断内源性过氧化物酶。为进行HA的组织化学检测，使用由牛软骨(Seikagaku Ltd，Tokyo，Japan)得到的生物素化透明质酸结合性蛋白质(bHABP)。在4℃，以及磷酸盐缓冲盐水(PBS)和牛血清白蛋白中将玻片与bHABP培养过夜。在用PBS洗涤后，用山羊血清培养所有样品，以阻断非特异性结合位点。在PBS中洗涤后，在室温下用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(Immunopure ABC peroxidase stainingkit，Pierce，Rockford，IL，USA)培养切片。在室温下在PBS中用3，3’-二氨基联苯胺(DAB，Sigma-Aldrich)和过氧化氢使反应可见。用Mayer’s苏木精复染玻片30秒，洗涤，脱水并包埋。此外，在本领域描述了一些方案(参见，例如，Bertheim，U.和

S.，1994；Bertheim，U.，等人，2004；Asari，A.，等人，1992和Zanna G.，等人，2008)。

使用离液序列高的缓冲剂(例如氯化胍)，可以从皮肤活检检验中提取出皮肤的细胞外基质(ECM)。然后通过阴离子交换色谱从ECM中精制出透明质酸，可以用由已知标准品作对比的凝胶过滤色谱来确定分子量(参见，例如，Simpson等人，2009)。

现在参考下列的实施例来描述本发明，这些实施例仅仅是用于解释说明本发明的某些实施方案的目的，而不是意欲限制如上文所述的本发明的普遍性。

实施例

在全文使用时，术语“PEP005”是指巨大戟二萜醇-3-当归酸酯，并可与巨大戟二萜醇-3-当归酸酯互换使用。

1.材料和方法

1.1非-临床

1.1.1皮肤成纤维细胞培养

在征得同意下，从Oral Surgery Clinic，School of Dentistry，Wales College of Medicine，Cardiff护理的个体获得正常成年人皮肤活检(6mm)(n＝1)。在应用局部麻醉后，收集皮肤活检，在将样品酶降解后，通过单细胞悬浮技术确定皮肤成纤维细胞培养物。该技术早前已经可靠地用于体外确定口和皮肤成纤维细胞的存活初级培养物(Cook等人，2000；Stephens等人，2001；2003)。在包含成纤维细胞-血清的培养基中培养皮肤成纤维细胞，所述培养基包含Dulbecco’s ModifiedEagle’s培养基(DMEM)，并补充有L-谷氨酰胺(2mM)，抗生素(100U/ml青霉素G钠，100mg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)和10％胎牛血清(均购自Invitrogen Ltd.，Paisley，U.K.)。将皮肤成纤维细胞培养物保持在37℃，5％CO₂/95％大气下，每2-3天更换培养基。对于所有实验，均使用7-17代的皮肤成纤维细胞。

1.1.2PEP005的制备

将得自20mg批次的Peplin的PEP005贮存于4℃下。当需要时，将PEP005以10mg/ml的浓度溶于二甲亚砜(DMSO，＞99.9％，SigmaChemical Company，Dorset，U.K.)。将该溶液混合5分钟或至该溶液变澄清，将该PEP005/DMSO母液贮存于4℃下，在该温度下其在数个月是稳定的。在使用前，从4℃的贮存下取出该PEP005/DMSO母液，并温热至室温。将需要体积量的PEP005/DMSO分到聚丙烯容器中，并在包含成纤维细胞-血清的培养基(用于皮肤成纤维细胞培养物，Section 3.1)中将PEP005/DMSO稀释至期望的浓度(典型地是0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml和100μg/ml)，由于溶液的稳定性，每天制备上述不同浓度的新鲜的PEP005/培养基溶液。在弃去PEP005/培养基溶液前，向各溶液中加入至少2倍体积的0.1％氢氧化钠(Sigma ChemicalCompany)的95％乙醇/5％甲醇(均来自Thermo Fisher Scientific，Leicestershire，U.K.)以灭活。

1.1.3评价皮肤成纤维细胞的透明质酸合成

在胰蛋白酶消化后，以2.5x10⁴个细胞/孔的细胞密度将在不含PEP005而包含成纤维细胞血清的培养基(1ml)中的皮肤成纤维细胞接种到24孔组织培养板中。将皮肤成纤维细胞保持在37℃，5％CO₂/95％大气下48小时，然后保持在不含血清而包含成纤维细胞血清的培养基(1ml)中48小时。在这个阶段，用包含成纤维细胞血清的培养基(600μl)替代上述不含血清的细胞培养基，其中所述包含成纤维细胞血清的培养基包含0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/mlPEP005，+/-TGF-β₁(10ng/ml)(每种PEP005浓度3个培养孔)。也确定了对照物，由不含血清而包含成纤维细胞血清和1％DMSO的培养基中的细胞构成。将所述皮肤成纤维细胞保持在37℃，5％CO₂/95％大气下24或72小时，然后除去培养基。使用透明质酸定量测定试剂盒(CorgenixU.K.Ltd.，Cambridgeshire，U.K.)来定量所收集培养基中的透明质酸合成，所述试剂盒使用了对透明质酸的天然牛结合蛋白。按照制造商的说明，分析上清液，并使用分光光度计在450nm下测定光密度。通过将样品的吸光度与由反应试剂空白品和标准品绘制的参照曲线比较来确定透明质酸的浓度。各实验在三个不同的时间进行。

1.1.4皮肤成纤维细胞的透明质酸细胞外周包衣形成的评价

在胰蛋白酶消化后，以7x10⁴个细胞/皿的密度将在不含PEP005而包含成纤维细胞血清的培养基(2ml)中的皮肤成纤维细胞接种到53mm细菌级培养皿(VWR International Ltd.，Leicestershire，U.K.)中。将皮肤成纤维细胞保持在37℃，5％CO₂/95％大气下过夜，然后在PBS(2x2ml)中洗涤，并保持于不含血清而包含成纤维细胞血清的培养基(2mi)中，所述培养基包含0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005，+/-TGF-β₁(10ng/ml)(每种PEP005浓度3个培养皿)。也确定了对照物，其由不含血清而包含成纤维细胞血清和1％DMSO的培养基中的细胞构成。将所述皮肤成纤维细胞保持在37℃，5％CO₂/95％大气下24小时或72小时。在24小时或72小时时，用甲醛处理过的马血红细胞(TCS Biosciences Ltd.，Buckinghamshire，U.K.)处理该培养皿。在PBS(3x20ml)中洗涤所述甲醛处理过的马血红细胞，以除去叠氮化钠，并在4℃下以100g/7分钟离心分离。将所得红细胞沉淀再悬浮于不含血清而包含成纤维细胞血清的培养基中，至1x10⁸个细胞/ml的浓度。将等份的红细胞混悬液(500μl)补充个各培养皿中，搅拌培养皿，然后保持在37℃，5％CO₂/95％大气下15分钟。使用具有Hamamatsun C5985冷冻的CCD摄影机(Hamamatsu Photonics U.K.Ltd.，Hertfordshire，U.K.)的Zeiss Axiovery 135倒置显微镜(CarlZeiss Ltd.，Hertfordshire，U.K.)，并使用Openlab Software 3.0.8(Improvision Ltd.，Warwickshire，U.K.)，通过光学显微镜术来观察红细胞排斥的区域。各实验在三个不同的时间进行。

1.1.5皮肤成纤维细胞的透明质酸合酶(HAS)基因表达的评价

在胰蛋白酶消化后，以2.5x10⁴个细胞/孔的细胞密度将在不含PEP005而包含成纤维细胞血清的培养基(1ml)中的皮肤成纤维细胞接种到24孔组织培养板中。将皮肤成纤维细胞保持在37℃，5％CO₂/95％大气下过夜。在这个阶段，用包含成纤维细胞血清的培养基(600μl)替代上述培养基，其中所述包含成纤维细胞血清的培养基包含0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005，+/-TGF-β₁(10ng/ml)(每种PEP 005浓度3个培养孔)。也确定了对照物，其由含有成纤维细胞血清和1％DMSO的培养基中的细胞构成。将所述皮肤成纤维细胞保持在37℃，5％CO₂/95％大气下24或72小时，然后在PBS(3x1ml)中洗涤，在室温下在5分钟里将Trizol

试剂(250μl)加入到该细胞中以诱导细胞溶解。如上所述，通过苯酚-氯仿法提取RNA，同时如上所述通过随机六聚体RT产生cDNA文库。将RNA(1μg)加入到100M随机六聚体(1μl)中，将5x RT缓冲液(4μl)，2.5mM三磷酸脱氧核苷(dNTPs，5μl)，2μl DTT和不含核酸酶的水加入到该反应中(总体积，20μl)。为使RNA变性，将反应管放置于GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems，Cheshire，U.K.)中，并在95℃加热5分钟，然后冷却至4℃。向各管中加入处方标记物(1μl)和RNAsin

核糖核酸酶抑制剂(1μl，Promega，Hampshire，U.K.)，将该管在20℃下10分钟，42℃下1小时，95℃下5分钟，共30个循环，然后在4℃下贮存，直至需要时。作为阴性对照，也进行RT，用不含核酸酶的水替代RNA样品。

如上所述，用探针和引发剂进行由Applied Biosystems设计和提供的HAS1，HAS2和HAS3(靶基因)和18s核糖体RNA(参照基因)的qPCR。在20μl/样品的最终体积中进行PCR，各反应混合物由cDNA(1μl)，靶基因引发剂和探针(1μl)，Taqman

FAST Universal PCR Master Mix(10μl，Applied Biosystems)和不含核酸酶的水(8μl)构成。使用95℃1秒钟的初始循环，然后是60℃20秒钟的40个循环来进行PCR扩增。也包括不含cDNA的对照物。此外，比较性CT法用于基因表达的相对定量。各实验在三个不同的时间进行。

1.1.6新生成的透明质酸分子量的评价

在皮肤成纤维细胞合成后，如前所述进行透明质酸分子量筛选(Meran等人，2008；Simpson等人，2009)。以1.5x10⁵个细胞/孔将在不含PEP005而包含成纤维细胞血清的培养基(2ml)中的皮肤成纤维细胞接种到6孔组织培养板中。将皮肤成纤维细胞保持在37℃，5％CO₂/95％大气下保持48小时，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS，2x2ml)中洗涤，并保持在不含血清而包含成纤维细胞血清的培养基(2ml)中又48小时。在48小时时，用不含血清而包含成纤维细胞血清的培养基(2ml)(除了[³H]-葡糖胺(20μCi/ml，G.E.Healthcare)外，包含0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005，+/-TGF-β₁(10ng/ml)(每种PEP005浓度3个培养孔))补充不含血清而包含成纤维细胞血清的培养基。将所述皮肤成纤维细胞保持在37℃，5％CO₂/95％大气下24或72小时。

在24和72小时时，除去培养基，各孔在PBS(1x 2ml)中洗涤。将培养基和PBS洗液混合(条件培养基提取物，8ml)并贮存于-20℃下至需要时。一旦需要，在4℃下熔化该条件培养基提取物，然后加入等体积的溶于100mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0且包含0.05％叠氮化钠(都来自Sigma)的链霉蛋白酶。将包含链霉蛋白酶的条件培养基提取物在37℃下培养24小时，然后在DEAE Sephacel

柱(G.E.Healthcare)上进行离子交换色谱法，用在包含0.2％Triton X-100的20mM BisTris缓冲液，pH 6.0中的8M尿素来平衡，以除去低分子量肽和未结合的放射性标记物。通过DEAE Sephacel离子交换柱，用在20mM BisTris缓冲液，pH6.0中的8M尿素洗脱各提取物中的放射性标记的透明质酸，所述缓冲液包含0.2％Triton X-100和0.3M氯化钠(Sigma)。将各分离后的提取物分成两等份，在4℃下18小时，在作为共沉淀剂的4-硫酸软骨素、肝素和非放射性标记的透明质酸(均来自Sigma)存在下，用3倍体积的醋酸钾(1％，在95％乙醇中，两者均来自Sigma)沉淀放射性标记的透明质酸。

在沉淀后，将各提取物的一半再悬浮于4M氯化胍缓冲液，pH 6.0中，所述缓冲液包含50mM醋酸钠、0.5％Triton X-100和0.05％叠氮化钠(均来自Sigma))，然后通过前述的有刻度的Sephacryl

S-500柱(G.E.Healthcare)进行透明质酸分子量的评价。该柱是用[3H]盐酸葡糖胺Mr 215；[35S]硫酸软骨素葡萄糖胺聚糖，Mr 25,000；核心蛋白多糖，Mr 100,000和[35S]多功能聚糖，Mr 1,300,000标刻的。用4M氯化胍缓冲液，pH 6.0洗脱，所述缓冲液包含50mM醋酸钠，0.5％Triton X-100和0.05％叠氮化钠。为了确认所得色谱性质只是放射性标记的透明质酸本身的结果，在37℃和18小时下，用在20mM醋酸钠缓冲液，pH 6.0中的玻璃酸酶(200μl，Streptomyces hyalurolyticus，ICNPharmaceuticals)消化各提取物的另一半，所述缓冲液包含0.15M氯化钠和0.05％叠氮化钠。将这些消化后的样品与等体积(200μl)的4M氯化胍缓冲液，pH 6.0混合，所述缓冲液包含50mM醋酸钠，0.5％TritonX-100和0.05％叠氮化钠，然后进行Sephacel

S-500柱洗脱。

将各提取物的等份部分(20μlx3)转移到闪烁瓶中，然后加入70％乙醇(600μl)和液体闪烁剂(4ml)。使闪烁瓶涡旋，并用PackardTri-Carb 1900CA液体闪烁分析仪(Perkin Elmer)定量[³H]的掺入，所得的值表示为每分钟衰变数(dpm)。为了得到每个色谱性质，将各提取物的两个半部分的[³H]-活性都标准化，并相对于稀释进行校准，然后减去耐玻璃酸酶数。这样，色谱性质就仅表示经各PEP005(0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml)，+/-TGF-β₁(10ng/ml)处理的玻璃酸酶敏感性活性，数据表示为每级分的[³H]-活性，与级分数相比较。各实验在两个不同的时间进行。

1.2临床

1.2.1PEP005凝胶剂对人皮肤的美容学能力的个案研究

在第1天(基线)且征得同意后，进行简单的病史和身体检查，以确认受试者进入该研究的合格性。记录病史，并进行简单的医学检查。在面部的一侧标记面积50cm²的皮肤，并指定为治疗区域。用TruVu

进行基线摄影，记录基线测定值。然后将PEP005(巨大戟二萜醇mebutate)凝胶剂，0.005％(Peplin Inc.)应用于面部，以覆盖所述50cm²的治疗区域。

受试者在次日(第2天)回到诊所。对所述应用区域进行摄影(包括TruVu

)并测定。基于受试者的报告和研究者的观测来收集皮肤反应。将PEP005凝胶剂，0.005％再次应用于所述治疗区域。

受试者在第8，15和30天返回诊所进行摄影(包括TruVu)、测定并评价皮肤反应。在第15和30天就诊时完成医师整体评价。所述医师整体评价使用7点量表，-3至+3；-3＝显著的差，-2＝中度的差，-1＝轻微的差，0＝无变化，+1＝轻微改善，+2＝中度改善和+3＝显著改善。受试者在第30天就诊时退出该研究。

1.2.2 TruVu

照相

TruVu

摄影系统(Johnson & Johnson Consumer Companies，Inc.)使用数个不同的光线类型来获得皮肤的影像。使用下列不同的光线类型来用于该研究：可见光、平行偏振光、交叉偏振光和UV光。这四种不同的光线类型都表明了显示自然的皮肤外观，细线和皱纹，发红和UV老化。结果是以范围为“无/较低”-“中度”-“升高/较高”的任意单位由计算机产生的，最后表示为细线、皱纹、发红和UV老化的条形图。这些数据由医师手工转换为′0′(无/较低)-′5′(中度)-′10′(升高/较高)的整数。

2.结果

2.1皮肤成纤维细胞的透明质酸合成的评价

使用透明质酸定量测定试剂盒来定量，在PEP005(0.01-100μg/ml)存在下，在存在和不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时和72小时时定量皮肤成纤维细胞的透明质酸合成而获得的平均值分别如图1A和1B所示。

在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时时由皮肤成纤维细胞合成的透明质酸的平均水平(ng/ml)表明，与未处理的皮肤成纤维细胞对照物相比，PEP 005在0.01-10μg/ml的浓度下对透明质酸合成具有显著的刺激效果(图1A)。在不存在PEP 005下，在24小时时引入TGF-β₁(10ng/ml)引发对透明质酸合成轻微的刺激，而与存在PEP005(0.01-100μg/ml)但不存在TGF-β₁(10ng/ml，图1A)的未处理的皮肤成纤维细胞对照物和皮肤成纤维细胞相比，当存在PEP005和TGF-β₁(10ng/ml)时，显然对透明质酸合成显示出显著的协同效应。

与24小时一样，与未处理的皮肤成纤维细胞对照物相比，不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在72小时时由皮肤成纤维细胞合成的透明质酸的平均水平(ng/ml)表明，PEP005在0.01-10μg/ml的浓度下继续对透明质酸合成发挥显著的刺激效果(图1B)。

由于单用PEP005而不使用溶解PEP005的DMSO，在所有浓度(0.01-100μg/ml)下，PEP005对透明质酸合成的作用都进一步显示出是独特的，因为与未处理的皮肤成纤维细胞对照物相比，在1％DMSO存在下，皮肤成纤维细胞培养物在透明质酸合成方面不显示显著的差异(p＞0.05，数据未标出)。

2.2皮肤成纤维细胞的透明质酸细胞外周包衣形成的评价

如使用颗粒排斥分析所确定的那样，在存在PEP005(0.01-100μg/ml)和不存在TGF-β₁下，在24小时和72小时时由皮肤成纤维细胞的的透明质酸细胞外周包衣形成得到的代表性数字影像分别如图2和3所示。在存在PEP005(0.01-100μg/ml)和TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时和72小时时由皮肤成纤维细胞的的透明质酸细胞外周包衣形成得到的代表性数字影像分别如图4和5所示

总之，不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时时透明质酸细胞外周包衣形成的分析表明，在不含PEP005的对照物或PEP005处理的培养物中直到24小时几乎没有细胞外周包衣形成(箭头所指，图2)。相反，在72小时时，与不含PEP005的对照物相比，浓度为0.01-10μg/ml的PEP005显然在PEP005处理的样品中增大了细胞外周包衣的尺寸(箭头所指，图3)。此外，由于成纤维细胞分化，PEP005处理(0.01-10μg/ml)的成纤维细胞的形态学改变与成肌纤维细胞的存在相吻合。

在24小时时，在不存在PEP005下，引入TGF-β₁(10ng/ml)引发透明质酸细胞外周包衣形成轻微的增加，而与存在PEP005(0.01-10μg/ml)但不存在TGF-β₁(10ng/ml，箭头所指，图4)的未处理的皮肤成纤维细胞对照物和皮肤成纤维细胞相比，存在PEP005和TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时时明显显示出对透明质酸细胞外周包衣形成的较大的协同效应，这可以通过细胞外周包衣形成的显著增加(由于透明质酸蓄积)得以证明。

与不含PEP005的对照物相比，在PEP005和TGF-β₁(10ng/ml)存在下，在0.01-10μg/ml的PEP005浓度下，在24小时时得以增强的透明质酸细胞外周包衣形成在72小时时甚至进一步增强(箭头所指，图5)。细胞形态学的较大改变显然与成肌纤维细胞的存在相吻合。

由于单用PEP005而不使用溶解PEP005的DMSO，在所有浓度(0.01-100μg/ml)下，PEP005对透明质酸细胞外周包衣形成的作用都进一步显示出是独特的，因为与未处理的皮肤成纤维细胞对照物相比，在1％DMSO存在下，皮肤成纤维细胞培养物在透明质酸细胞外周包衣形成方面显示出非显著的差异(数据未标出)。

2.3皮肤成纤维细胞的透明质酸合酶(HAS)基因表达的评价

在存在PEP005(0.01-100μg/ml)下，不存在和存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时和72小时时如qPCR定量的皮肤成纤维细胞的HAS1，HAS2和HAS3表达所得到的平均值分别如图6，7和8所示。

HAS1得到的平均ΔΔCT值表明，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时时皮肤成纤维细胞的HAS1表达非常低(ΔΔCT＜0.5，图6)。因此，由于事实上HAS1表达都不显著，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下PEP005不会引发对HAS1表达的显著效果。相反，与对照皮肤成纤维细胞相比，在不存在PEP005下引入TGF-β₁(10ng/ml)引发HAS1表达较大程度地向上调节(p＜0.001，图6)。在存在TGF-β₁(10ng/ml)和PEP005(0.01-100μg/ml)下，观察到HAS1表达普遍向下调节(在0.01μg/ml下p＜0.05，在100μg/ml下p＜0.01)。

HAS1得到的平均ΔΔCT值表明，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在72小时时皮肤成纤维细胞的HAS1表达仍然相对较低(ΔΔCT＜1.0，图6)，因此在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，PEP005不会引发对HAS2表达的显著效果。相反，与对照皮肤成纤维细胞相比，在不存在PEP005下引入TGF-β₁(10ng/ml)也会引发HAS1表达向上调节(图6)。在存在TGF-β₁(10ng/ml)和PEP 005(0.01-100μg/ml)下，PEP005在所有PEP005浓度下(0.01-100μg/ml，图6)都会引发HAS1表达的普遍向下调节。但是，在72小时时由PEP005和TGF-β₁(10ng/ml)观察到的HAS1基因向下调节被认为是非显著性的(p＞0.05)。

HAS2得到的平均ΔΔCT值表明，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时时皮肤成纤维细胞的HAS2表达也相对较低(ΔΔCT＜1.0，图7)。它还进一步表明，与未处理的皮肤成纤维细胞对照物相比，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，PEP005在0.1-10μg/ml的浓度下对皮肤成纤维细胞中HAS2表达具有刺激效果，尽管在24小时时由PEP005观察到的HAS2基因向上调节认为是非显著性的(p＞0.05)。如前述确定(Meran等人，2006，2007)，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，引入TGF-β₁(10ng/ml)在24小时时对于皮肤成纤维细胞中HAS2表达几乎没有效果。与未处理的皮肤成纤维细胞对照物相比，在存在TGF-β₁(10ng/ml)下PEP005也会引发皮肤成纤维细胞中HAS2表达向上调节。但是，这种HAS2表达向上调节也被认为是非显著性的(p＞0.05)。

HAS2得到的平均ΔΔCT值表明，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在72小时时皮肤成纤维细胞的HAS2表达也相对较低(ΔΔCT＜1.0，图8)。但是，在0.1-10μg/ml浓度下PEP005显示出在HAS2基因表达中刺激其较大程度的向上调节(图8)。然而，在0.1-10μg/ml的浓度下观察到的HAS2基因向上调节被认为是非显著性的(p＞0.05)。与对照的皮肤成纤维细胞相比，在PEP005不存在下引入TGF-β₁(10ng/ml)令人惊奇地对HAS2表达只引发了很小的效果(p＞0.05，图8)。然而在TGF-β₁(10ng/ml)和PEP005(0.01-100μg/ml)存在下，PEP005在所有PEP005浓度(0.01-100μg/ml，图8)下都引发了HAS2基因表达普遍的向下调节。然而，与不含PEP005的皮肤成纤维细胞对照物相比，在72小时时由PEP005和TGF-β₁(10ng/ml)观察到的HAS2基因向下调节被认为是非显著性的(p＞0.05)。

HAS 3得到的平均ΔΔCT值表明，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在24小时时皮肤成纤维细胞的HAS 3表达也相对较低(ΔΔCT＜1.0，图8)。它还进一步表明，与未处理的皮肤成纤维细胞对照物相比，PEP005在所有PEP005浓度(0.01-100μg/ml)下都完全去除了皮肤成纤维细胞中的HAS 3表达(图8)，尽管由于HAS 3表达一般水平相对较低，所观察到的HAS3基因向下调节是非显著性的(p＞0.05)。与不存在PEP005(0.01-100μg/ml)和TGF-β₁(10ng/ml)下的皮肤成纤维细胞相比，在不存在PEP005下，引入TGF-β₁(10ng/ml)在24小时时对于皮肤成纤维细胞中HAS3表达也有抑制效果(p＜0.01，图8)。与未处理的皮肤成纤维细胞对照物相比，在存在TGF-β₁(10ng/ml)下PEP005在0.1-10μg/ml的浓度下也会引发皮肤成纤维细胞中HAS 3表达向下调节至几乎不可检测的水平。但是，在所有PEP005浓度(0.01-100μg/ml)下，这种HAS3表达向下调节也被认为是非显著性的(p＞0.05)。

HAS3得到的平均ΔΔCT值表明，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在72小时时皮肤成纤维细胞的HAS3表达也相对较低(ΔΔCT＜1.0，图8)。但是，在不存在TGF-β₁(10ng/ml)下，在1-10μg/ml浓度(图8)下PEP005显示出在HAS3基因表达中刺激其向上调节至大于24小时时观察到的HAS 3基因表达水平(图8)。但是，在这些PEP005浓度下，这种HAS3表达向上调节也被认为是非显著性的(p＞0.05)。与对照皮肤成纤维细胞相比，在不存在PEP005下，引入TGF-β₁(10ng/ml)在72小时时也对皮肤成纤维细胞中的HAS3表达具有抑制效果。尽管在TGF-β₁(10ng/ml)存在下在72小时时HAS3表达事实上是可忽略的水平，但是在TGF-β₁(10ng/ml)存在下在72小时时在所有PEP005检测浓度(0.01-100μg/ml，图8)下的PEP005都显示出对皮肤成纤维细胞中的HAS3表达没有显著的效果(p＞0.05)。

2.5使用TruVu

评价0.005％PEP005凝胶剂在人皮肤上对于细线、皱纹、发红和UV老化的效果

在第1和2天在面部面积为50cm²的皮肤上的两次每日涂用0.005％PEP005凝胶剂后，在第30天评价细线、皱纹、发红和UV老化的水平，并与同一受试者涂用前(基线)所评价的水平进行比较。它表明了，对于该受试者而言，细线的水平从10降低到4，皱纹从8降低到5，发红没有影响，UV老化从2降低到1。该受试者的医师整体评价评定为+2或中度改善，表明总体上而言，与基线相比，两次涂用0.005％PEP005凝胶剂使得在第30天时该受试者(所治疗的皮肤区域)的全部美容学评价都达到“中度改善”(表2.5-1)。

表 2.5-1

2.6新生透明质酸分子量的评价

在0，0.01，0.1，1.0和10μg/ml PEP005存在下，在TGF-β₁存在或不存在下，[3H]-葡糖胺掺入的平均值如图9-12所示。

在PEP005存在下合成的透明质酸主要是高(＞1.5x10⁶Da)和中等(＜1.5x10⁶-4x10⁵Da)分子量，第3天的数据显示出了另外的透明质酸合成。可以推定，所观察到的中等和低分子量透明质酸是由于透明质酸降解。当成纤维细胞在存在TGF-β₁下培养时，透明质酸降解的总体程度降低。

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Claims (16)

1.一种在受试者中治疗年龄老化和/或光老化皮肤的方法，包括给所述受试者的皮肤施用巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

2.一种在受试者中诱导透明质酸内源性合成的方法，包括给所述受试者的皮肤施用巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物具有下式：

其中

R¹-R³独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的酰基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、S(O)₂R′、S(O)₂O R′、P(O)(OR′)₂(其中R′是氢、烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基)和糖基，或者R¹和R²或R²和R³可以形成亚甲基或亚乙基链；和

R⁴选自氢、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的酰氧基、任选取代的芳基烷氧基、OS(O)₂R′、OS(O)₂OR′、OP(O)(OR′)₂(其中R′是氢、烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基)和糖氧基。

4.根据权利要求3的方法，其中R¹是当归酰基。

5.根据权利要求4的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物选自巨大戟二萜醇-3-当归酸酯、20-O-乙酰基-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯和20-脱氧-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯。

6.根据权利要求5的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯。

7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物施用于至少10cm²的皮肤区域。

8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物施用于面部和/或颈部和/或咽喉部和/或眼睛周围的区域。

9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物局部施用于皮肤。

10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物是以基于异丙醇的凝胶剂或大鲸蜡基醚霜剂的形式施用的。

11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中受试者的皮肤未患病。

12.根据权利要求1的方法，其中所述治疗用于改善细线、皱纹和UV-老化中的一种或多种的外观。

13.一种用于治疗年龄-和/或光老化皮肤的组合物，包含巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐和药学可接受的载体。

14.一种用于在受试者的皮肤中诱导内源性透明质酸合成的组合物，包含巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐和药学可接受的载体。

15.巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐在制备治疗年龄-和/或光老化皮肤的组合物中的应用。

16.巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐在制备在受试者的皮肤中诱导内源性透明质酸合成的组合物中的应用。

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