CN102316742A - 含有丝状真菌的颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
在制备含有丝状真菌的颗粒的方法中，将丝状真菌培养物与至少一种改性淀粉和生粉混合，然后将填料和可能的营养素加入到所得的产物中，从而获得了随后会进行成粒和干燥的糊状物。
Description
技术领域
本发明涉及植物健康产品技术领域。具体而言，本发明涉及以工业水平生产在水中高度可分散且含有植物健康剂(特别是食线虫真菌)的颗粒的方法。本发明还包括因此而获得的水可分散颗粒。
背景技术
多年来已知的是，攻击几乎所有类型农作物的植物寄生线虫每年造成的损失全球总计约5亿美元。由于植物寄生线虫对化学处理具有极强的耐受性，它们的破坏意味着要使用选择性差且一般对自然环境有害的产品。
从1992年在里约热内卢举行的地球峰会开始，且根据最近的生物环境法，逐年禁止多种常规的杀线虫剂，使得取决于气候区域和农作物，农民对于可能多少有些变得严重的问题得不到保护。因此，更关注于替代方法或有机方法，这意味着不使用常规化学杀虫剂。然而，为了得到发展，“有机”控制方案的这些方法不仅需要证明它们自身的效力，而且它们对于农民来说还必须如常规产品那样易于实际实现。
在有机杀虫剂方法中，拮抗微生物的使用在实际中变得越来越普通。例如，已知有基于细菌(即，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))扩散的抗蚊处理。类似的，可以使用蜡蚧轮枝菌(Verticillium leucanii)幼虫的寄生真菌的孢子来控制影响蔬菜作物的粉虱，如温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)。
丝状真菌(半知菌类，一般被称为霉菌)的特征在于通常透明的、直径在微米范围内的薄管状结构(菌丝)；菌丝整体形成菌丝体；它们通过分生孢子无性繁殖。属于丛梗孢科(Moniliales)的一些丝状真菌(特别是圆锥节丛孢菌(Arthrobothrys conoides Dreschsler))已证明对线虫有用：它们以食用线虫为生，从而为具有这些寄生虫的土壤消毒。
为了有效利用丝状真菌，必须获得含有高真菌数且易于控制和向土壤施用的稳定制剂。然而很不幸，这些真菌(特别是食线虫真菌)的生产和储存技术仍是经验性的，且到目前为止所获得的结果仍不完全令人满意。
专利申请No.WO-A-2005078067记载了用于丝状真菌生长的有效培养基，但是并没有指明配制和/或施用的具体方法。专利申请GB-A-857161记载了用食线虫真菌培养物进行表面处理的无机载体(浮石、蛭石、石棉绒)的制备。
美国专利US 5,811,092说明了用食线虫真菌培养物对玉米粒进行表面处理；经如此处理的玉米与小部分土壤混合以形成接种物并将后者分布到要处理的土壤中；该方法一般是有效的，但是所述玉米粒的真菌数的变化相当大，且在土壤中的施用极少是均一的。
专利申请No.US 2007/0292932说明了适合对土壤施用的、含有食线虫真菌的胶凝颗粒的制备；然而，这些颗粒的制备、储存和处理相当复杂。
此外，现有技术产品在水中极少是可分散的，且需要以固体形式分散在土壤中；这些固体颗粒保持在表面中，且不能使真菌适当地穿透到土壤更深的层中；只有以土壤进一步运动动作(犁耕)为代价才能实现所述穿透。
因此，不考虑上述发展，到目前为止已确定的产品无一完全令人满意。具体的困难在于提供干燥的颗粒产品(其因此易于储存和控制)，所述产品在水中具有高分散性并且确保培养物具有十分令人满意的存活性，后两种条件在干燥条件下是不利的。
本发明基于用于以工业水平以能够确保稳定性、存活性和易用性的干燥颗粒形式生产丝状真菌(更特别的是食线虫真菌)的方法。具体地，本发明使得能够获得具有高真菌数、易于控制和向土壤施用、能够在经处理表面上发挥高的、均一的杀线虫剂活力的组合物；所述组合物可通过简单、廉价且对菌丝体存活性无害的制备方法获得。
发明内容
本发明说明了用于将丝状真菌掺入到特定固相制剂中的方法，特别地，该特定固相制剂经研究能够将真菌简单、均一并且有效地施用到土壤中。本发明基于对丝状真菌培养物的处理，其导致获得具有高真菌数并且易于在水中分散的干燥颗粒。所述处理包括在将培养基接种丝状真菌之后与生粉和改性淀粉混合。然后，将所得的产物与特定填料和可能的营养素以适合于形成易于成粒的糊状物的比例混合；回收通过已知技术本身可获得的颗粒并将其干燥至确定的含水量，该含水量一般在5至15％之间。因此，所获得的颗粒产品特别适合于保护菌丝体的存活性，在触摸时是干燥的，易于由操作员控制并且在水中是高度可分散的。更具体而言，该方法包括以下步骤：
a)在适合的液体培养基中使丝状真菌生长确定的一段时间；
b)将a)的产物与生粉和改性淀粉混合；
c)将b)的产物与适合的填料和可能的营养素混合以获得可成粒的糊状物；
d)形成颗粒，将颗粒回收，然后将其干燥，从而将颗粒的含水量降至5至15％之间的值。
本发明的另一个目的在于上述颗粒产品，其具体地包含b)点中所使用的组分。本发明还包括包含上述颗粒产品的杀线虫剂组合物，以及上述产品用于处理被线虫所感染的土壤和/或培养物中的用途。
附图说明
图1示出作为参考的在先技术的颗粒悬液(右侧)和本发明的可分散颗粒悬液(左侧)的搅拌之间的比较。
具体实施方式
本发明可以应用于所有通常已知的丝状真菌；有利的是，所使用的真菌为杀线虫真菌，属于(例如)丛梗孢科(Moniliales)；在该科中特别优选的是节丛孢属(Arthrobotrys)圆锥节丛孢种(conoides)的真菌，特别是圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides Dreschsler)。
丝状真菌培养基可以选自本领域已知的培养基。根据一优选实施方式，丝状真菌培养基包含选自糖蜜、麦芽浸膏、蔗糖的至少一种碳源和选自酵母浸膏和所谓“玉米浆”的至少一种有机氮源。在专利申请WO-A-2005078067中广泛说明了该培养基的制备，该专利申请通过引用并入本文。在该培养基中，碳源优选占培养基干重的70至85重量％，而上述有机氮源占培养基干重的15至30重量％。该培养基还可以包含由硝酸盐或铵盐组成的无机氮源。在一般情况下，这种无机氮源在真菌生长期间逐渐加入到培养基中，该无机氮源的量不超过培养基干重的10重量％(优选5至8重量％之间)。
第一优选的培养基由75-85％的麦芽浸膏和15-25％的酵母浸膏组成，该百分比是基于培养基干重的按重量计所给出的。另一种可用的培养基包含60-65％的糖蜜、10-15％的蔗糖、10-15％的玉米浆和10-15％的酵母浸膏。另外，这种培养基还含有5-8％的无机氮源，特别是磷酸氢二铵。最后一种优选的培养基含有两种碳源，即25-30％之间的麦芽浸膏和40-45％之间的糖蜜以及25-30％之间的玉米浆。
麦芽浸膏是通过发芽的谷类(一般为大麦)所获得的。当发芽时，会产生酶，特别是会产生淀粉酶，其使得淀粉转化为糖。麦芽浸膏含有约60％的麦芽糖、维生素及其它多种少量元素。
糖蜜是制糖业的副产品，并且为粘稠棕黑色液体的形式，其含有10％的水、35％的蔗糖、20％的其它糖类和15％的灰分。酵母浸膏是通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的自溶作用获得的，并且为浅黄色细粉的形式，其易溶于水。酵母浸膏含有肽、游离氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基以及水溶性维生素B类。酵母浸膏的总氮含量为10％，α-胺氮含量为5％。
玉米浆是通过在50℃下在含有二氧化硫的水中浸渍玉米24-48小时所获得的。二氧化硫试剂使得能够将围绕玉米粒的蛋白质网络结合并具有在浸渍期间防止不希望有的微生物发展的优势。玉米浆的总氮含量为7％，α胺氮含量为1.7％并且还含有5％的糖、4％的钾、3％的磷和17％的矿物质。
在根据本发明的生产方法中，优选在23至30℃的恒定温度下，使丝状真菌在上述培养基中生长5-10天的时间。为了生产所述颗粒，制备由改性淀粉和生粉组成的混合物。在该混合物中，改性淀粉优选占按重量计30-60％(更优选地为33％)，而生粉即剩余的70-40％(更优选地为67％)，这些百分比指的是干物质。优选的改性淀粉为纯胶(Cleargum，辛烯基琥珀酸淀粉钠)，它是通过蜡质玉米淀粉的酶催化水解所获得的产物。所述生粉可以是任何谷类粉或其它淀粉性产品；优选为玉米粉。
在所述混合物与培养基混合前，在沸水中以40-60％的重量比(更优选是相对于水52％的重量比)对所述混合物进行适当地稀释。例如，100g溶于沸水中的物质由17g改性淀粉、35g生粉和48g水组成。
冷却后，向该第一混合物中优选以1∶1的体积比添加上述培养基，其中所述培养基中先前已接种了丝状真菌并使其生长。然后，向所得溶液中加入适合的填料和可能的营养素，它们与配方中的其它物质一起赋予真菌稳定性和营养，并且使得能够获得具有所需一致性和体积的颗粒。
优选地，所述填料为硅藻土，并且所述营养素选自面粉和糖。优选的填料为Celaton FPM 0.08，其为基于颗粒尺寸约0.08微米的硅藻壳体(单细胞二氧化硅藻)的产品。该产品能够吸收限定量的水，从而使得能够获得具有所需体积的颗粒，因此保护微生物抵抗可能的外部侵袭(温度变化、湿度等)。
在可用作营养素的面粉当中，优选玉米粉。这是能够吸收比自身体积大几倍的水量的天然产品，并且在特定的情况下，它还有助于构成颗粒的体积。此外，玉米粉是颗粒中所含丝状真菌的重要营养源并且当分散到要处理的土壤中时，它是立即可用的。
糖有助于提高真菌的存活性，具体地，有助于稳定细胞膜。
在本发明的方法目的中，将上述的填料和可能的营养素加入到b)点所形成的混合物中。当仅使用填料时，所述填料优选为硅藻土。当填料与营养素一起使用时，优选使用硅藻土和面粉的混合物，其中可以加入少量的糖。优选的混合物是由按重量计30-50％(特别是33％)的填料和剩余70-50％(特别是67％)的面粉组成的。如果使用糖，则糖相对于填料和面粉的混合物一般以按重量计10-20％之间的量存在。
将填料和可能的营养素以混合形式或单独地加入到b)点所述的混合物中直至获得紧密的糊状物。优选地，在所述糊状物中，在c)点使用的填料和可能的营养素的混合物按重量计占15％至50％。例如，将34g填料和营养素的混合物加入到100g于b)点所述的混合物中。一般地，如此获得的糊状物的含水量在30至60％之间的范围内，优选地在35至55％之间，更优选地为约47％。因此，对所得混合物进行常规成粒处理，如(例如)挤出，从而获得了直径尺寸优选地在3至5mm的颗粒。在颗粒干燥前，颗粒的含水量与糊状物的基本相同。可以在无菌气流中、在25-30℃的温度下进行颗粒干燥。干燥后，含水百分比降低至低于13％的值，优选地在9至10％的范围内。通过这种方式，所述颗粒达到所需的一致性和体积。
本发明包括由上述方法获得的颗粒产品。这种产品为颗粒形式，触摸时干燥，并且特别地，其特征在于含有一种或多种丝状真菌、步骤b)中所述的改性淀粉和生粉，以及步骤c)中所述的适当填料和可能的营养素。所述颗粒产品可以照这样使用，或根据本身已知的方法与其它常规成分一起配制；所得的杀虫剂组合物等同地构成了本发明的目的。最后，本发明扩展至上述产品用于处理被对丝状真菌敏感的线虫或其它寄生虫感染的基底中的用途。
本发明存在多种优势，这些优势罗列如下。
对于生产：
-操作次数低，这使得能够保持该过程的无菌性；
-考虑到起始来源中的含水量已经很低，所以干燥快速；
-高度可分散的产品，这使得能够更好地评价微生物含量；
-保护微生物活力的工艺。
对于用户：
-高度可分散的制剂使得实现不同的用途：撒在裸露的土壤上，另外有利地，可以加入到灌溉系统中；
-将产品加入到灌溉用水中，消除了分散杀线虫剂所需的额外处理；液体产品均匀地分散在表面上，并且有利地，还分散在土壤更深的层中，而不需要用于移动土壤的耕犁或其它操作；
-在环境温度中，在轻微搅拌下快速在水中发生分散(在几秒内)；
-低含水量的颗粒制剂产生易于用户操作、接触时干燥、可流动、易于从加料斗装卸等并且对容器壁不具有颗粒粘附性的产品。
出于说明性和非限制性目的提供本发明的下列实施例，所述实施例是使用丛梗孢科(Moniliales)的丝状真菌、特别是使用圆锥节丛孢菌(Arthrobotrysconoides Dreschsler)丝状真菌制备的。
实验部分
实施例1
在含有1.2升培养基的2升反应器中获得丝状真菌培养物。该反应器是由配备了螺旋搅拌器、温度调节器和冷却器、进气口以及用于检测pH、O2浓度和温度的探头的圆底容器组成的。在接种圆锥节丛孢(A.conoides)真菌分生孢子前，对由20g/l的麦芽浸膏和4g/l的酵母浸膏所组成的装置灭菌。在约27℃的温度下，将该培养物在接种后保持6天。在培养期间，对培养基采样以确定干重(g/l)，并因此确定繁殖体的数目(CFU/l)。为了确定干重，将20ml培养基过滤，然后在烘箱中在100℃下干燥24小时。对1ml培养基确定繁殖体的数目。在指定的时间段结束时获得了约8g/l的真菌，其繁殖体数目等于每升6×109。
将含有纯胶(Cleargum)和玉米淀粉(1∶1的重量比)的混合物以按重量计54％的浓度分散在沸水中。冷却后，以与先前加入的水相同的比例加入含有真菌的培养基。然后，相对于该第一混合物以按重量计28％的量将Celaton FPM0.08加入到如此获得的混合物中，直至获得紧密的糊状物。通过刮刀将该糊状物引入到注射器中，然后以固定的量分散到铝箔上。在最大30℃的气流下干燥数分钟后，产品的含水百分比等于7.9％，并且颗粒自由地与铝箔分离。
在9ml无菌水和几种稀释剂中引入颗粒后，有可能确定颗粒所含的繁殖体数目，其等于8×103CFU/颗粒(关于五个颗粒确定值的算术平均数)，对应于50％的存活百分比。对于本文所述的方法类型来说，该百分比被认为是非常令人满意的。
实施例2
使用实施例1的同一真菌培养物进行了对该实施例的测试，但是改变了配方的比例。将含有18％纯胶(Cleargum)和36％玉米淀粉的混合物在适量的沸水中混合从而形成了45％的总混合物。冷却后，以与先前所加入水的量相等的量加入含有真菌的培养基。然后，以相对于该第一混合物按重量计25％的量，将Celaton FPM 0.08加入到如此获得的混合物中，直到获得紧密的糊状物。在30℃的气流中干燥几分钟后，产品的水分百分比等于8.8％。在9ml无菌水和几种稀释剂中溶解颗粒后，可以确定颗粒中所含的繁殖体数目。繁殖体数目为1×104CFU/颗粒，相当于66％的存活百分比。对于本文所述类型的方法来说，该百分比被认为是最佳的。
实施例3
本实施例的测试基于实施例1的同一真菌培养物，但是改变了配方中的比例。含有16％纯胶(Cleargum)和31.5％玉米淀粉的混合物与52.5％的沸水混合。冷却后，以与先前所加入水的量相等的量加入含有真菌的培养基。然后，以相对于该第一混合物按重量计45％的量，将由54％玉米淀粉和46％CelatonFPM 0.08组成的混合物加入到如此获得的混合物中，直至获得紧密的糊状物。在30℃下在气流中干燥几分钟后，所得产品的湿度百分比等于9％。
在9ml无菌水和几种稀释剂中溶解颗粒后，可以确定颗粒中所含的繁殖体数目，其等于1.2×104CFU/颗粒，相当于83％的存活百分比。对于本文所述类型的方法来说，该百分比被认为是高的。在18至25℃之间的温度下，在塑料容器中储存一个月后，存活百分比(与颗粒制备后立即观察到的繁殖体数目相比的繁殖体数目)仍很高，大约为95％。
实施例4
通过磁力搅拌器，在500rpm的轻微搅拌条件下搅拌5分钟，将150g实施例3中获得的颗粒产品在环境温度下分散到1000ml水中。
同时，在相同条件下处理150g根据US2007/0292932(参考文献)的实施例1所获得的胶状颗粒。在搅拌结束时，目视观察两溶液以评价产品的溶解状况。从图1可以清楚地看出，参考胶状颗粒1仍是完整的、不溶解的并且沉积在溶液底部；相反，本发明实施例3的颗粒2完全分散。(图1)。
Claims (15)
1.一种制备含有丝状真菌的颗粒的方法，该方法包括：
a)将丝状真菌培养物与至少一种改性淀粉和生粉混合；
b)将填料和可能的营养素加入到a)的产物中，从而获得随后会进行成粒和干燥的糊状物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌属于丛梗孢科，优选为圆锥节丛孢菌。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其中所述培养基含有一种或多种碳源和/或氮源，所述碳源和/或氮源优选地选自：麦芽浸膏、酵母浸膏、糖蜜、蔗糖、玉米浆。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中所述改性淀粉为纯胶，所述生粉为玉米粉。
5.根据权利要求1-4所述的方法，其中所述改性淀粉和所述生粉以30∶70至60∶40之间的重量比存在。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中步骤b)中加入的所述填料为硅藻土，而所述可能的营养素选自一种或多种面粉和糖。
7.根据权利要求1-6所述的方法，其中在步骤b)中，向a)中所得的混合物中添加重量比在30∶70至50∶50之间的填料和面粉的混合物，并且任选地加入糖，从而获得了含水量在30至60％之间、优选在35至55％之间的糊状物。
8.根据权利要求1-7所述的方法，其中将步骤b)中所得的颗粒干燥至含水百分比低于13％，优选在9至10％之间。
9.一种颗粒产品，包含一种或多种丝状真菌、至少一种改性淀粉、至少一种生粉、适合的填料和可能的营养素。
10.根据权利要求9所述的颗粒产品，其中所述改性淀粉为纯胶，所述生粉为玉米粉，并且所述填料为硅藻土，所述可能的营养素以糖为代表。
11.根据权利要求9-10所述的颗粒产品，其中所述丝状真菌属于丛梗孢科，优选地为圆锥节丛孢菌。
12.通过权利要求1-8中所述的方法获得的颗粒产品。
13.杀虫剂组合物，包含如权利要求9-12中所述的产品。
14.如权利要求9-13中所述的产品或组合物在处理由对丝状真菌敏感的线虫或其它寄生虫所感染的基底中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中将所述产品或组合物分散在液体媒介中并通过喷雾施用到所述基底上。
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