CN102304540B

CN102304540B - 一种在里氏木霉分泌表达外源蛋白的表达设备及其应用

Info

Publication number: CN102304540B
Application number: CN2011102494765A
Authority: CN
Inventors: 王玮; 魏东芝; 吕丹丹
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: Baikaisheng Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2031-08-26
Also published as: CN102304540A

Abstract

本发明公开了一种用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞分泌表达外源蛋白的表达设备。该表达设备从5’至3’依次包括以下元件：(1)里氏木霉的外切葡聚糖纤维二糖水解酶II启动子；(2)分泌表达的信号肽；(3)多克隆位点序列；(4)里氏木霉的外切葡聚糖纤维二糖水解酶II终止子。将外源基因插入上述表达设备中，经T-DNA二元载体转化根瘤农杆菌，和里氏木霉接合，所得里氏木霉基因工程菌可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因，从中获得外源蛋白的大量生产。该里氏木霉培养条件粗放，适合固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，产生的胞外蛋白质易于分离纯化，成本低廉。

Description

一种在里氏木霉分泌表达外源蛋白的表达设备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种一种在里氏木霉(Trichodermareesei)分泌表达外源蛋白的表达设备及其应用。

背景技术

里氏木霉是在二战时期从所罗门群岛的棉制油布中分离得到的一种嗜温腐生性丝状真菌，具有良好的降解纤维素材料的能力。由于该菌由ReeseE.T.博士筛选鉴定，因此被命名为Trichoderma reesei。作为工业菌株，T.reesei能够生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶等，其中一些里氏木霉突变株的胞外酶蛋白产量可达60g/L，而最主要的纤维素酶CBHI(cellobiohydrolase I，纤维二糖水解酶I)、CBHII(cellobiohydrolaseII，纤维二糖水解酶II)，分别可以达蛋白分泌总量的50％(约30g/L)和40％(约24g/L)。里氏木霉作为工业生产菌株生产纤维素酶、半纤维素酶已有多年的历史，这些酶类被广泛应用于纺织、造纸、制浆等工业领域。除具有极好的合成和分泌蛋白的能力以外，T.reesei还具有真核的蛋白分泌机制和与哺乳动物系统相似的蛋白质翻译后修饰、加工性能，如高甘露糖型和N-糖基化。由于其适于蛋白生产的诸多优点，而且对人类没有毒性，里氏木霉也已成为相关研究人员开展真菌细胞学、遗传学和生理生化研究的重要生物材料。美国能源部(NOE)资助支持了里氏木霉基因组的测序工作，目前全基因组序列已经完成并公布。里氏木霉全基因组测序的完成为利用功能基因组学方法研究具有重要生物学意义的功能基因奠定了基础。

农杆菌介导转化法是利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA将外源基因转移到真菌基因组中的方法。根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是近年来发展的一种新方法，与传统的转化方法相比，该方法操作简便，可导入大片段的DNA，转化效率高，导入基因大多是单拷贝，表达效果好，稳定遗传。基于上述优点，农杆菌介导的转化技术已成为目前真菌分子生物学研究中快速发展的转化方法，成为真菌系统突变分析的有效工具。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对外源蛋白表达量低，分离纯化困难的不足，提供一种操作简便快捷的用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备及其应用和所获得的里氏木霉基因工程菌，可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因。

本发明的第一方面提供一种用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备，其中，所述的表达设备从5’至3’依次包括以下元件：(1)控制外源基因在里氏木霉中转录的里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II启动子(P_cbhII)；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；(3)多克隆位点序列；(4)控制外源基因在里氏木霉中终止转录的里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II终止子。

本发明中，所述的启动子是能够控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子，较佳的为里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II启动子(P_cbhII)，更佳的启动子的序列是序列表中SEQ ID NO：1的第7位至第980位所示。

本发明中，所述的信号肽可以是本领域中能够控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的任何信号肽(分泌肽)，较佳的信号肽的编码序列为序列表中SEQ ID NO：1第981位至第1043位所示。

本发明中，所述的多克隆位点可以是本领域各种常规的多克隆位点，较佳的多克隆位点序列是序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明中，所述的终止子是能够控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子(T_cbhII)，较佳的是里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II终止子，更佳的终止子的序列是序列表中SEQ ID NO：1的第1074位至第2169位所示。

较佳的，所述的表达设备还包括以下元件：(5)筛选标记基因的表达盒，其位于元件(1)启动子的上游或元件(4)终止子的下游。

本发明中，所述的筛选标记基因的表达盒能够在里氏木霉中表达各种本领域的常规筛选标记，较佳的，所述的筛选标记是新霉素磷酸转移酶、庆大霉素乙酰基转移酶、或潮霉素磷酸转移酶，较佳的筛选标记是潮霉素磷酸转移酶，其基因序列较佳的是GeneBank的登录号为Z32698.1的第1437位至第4057位所示。

本发明所述的表达设备最优选的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

较佳的，所述的在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备还进一步包括外源蛋白的编码序列，其位于第(3)元件多克隆位点序列之中、之前或之后。所述的外源蛋白是指来源于里氏木霉以外的蛋白，包括动物、植物和真菌的蛋白。

本发明中，较佳的，所述的表达设备还进一步包括第二个多克隆位点序列，该第二个多克隆位点序列位于第(4)元件终止子和第(5)元件筛选标记基因的表达盒之间。

本发明第二方面提供一种含有上述任何一种表达设备的载体，较佳的是根瘤农杆菌二元载体，如T-DNA表达载体pPZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA或pPK2，但不限于这些载体，更佳的选自pPZP201BK、pBI121、或pCAMBIA。

本发明第三方面提供一种含有上述任何一种载体的宿主细胞，较佳的是根瘤农杆菌LBA4404、GV2260、C58C1、GV3100、A136、GV3101、GV3850、AGL-1、EHA101、EHA105，更佳的是根瘤农杆菌GV3101。

本发明第四方面提供一种表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，其基因组中含有任何一种如上所述的表达设备。所述的里氏木霉属于里氏木霉种，较佳的是里氏木霉Trichoderma reesei QM6a、QM9414、QM 9123、Sa28、QM 9136、NRRL 3653、ME-446、DB746、4065MG4、4065MG5、NRRL 3652或NRRL 11236，更佳的是里氏木霉Trichoderma reesei RUT C30。

本发明第五方面提供一种该表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌的制备方法包括，将上述含有外源蛋白基因的表达设备的根瘤农杆菌二元载体转化根瘤农杆菌，将所得的根瘤农杆菌转化子和里氏木霉接合，挑选基因组中整合有外源蛋白基因的表达设备的接合子，即为表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌。该里氏木霉基因工程菌可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因。

本发明第六方面提供一种生产蛋白的方法，包括培养所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，从培养物中获得该外源蛋白。

本发明的里氏木霉基因工程菌可应用于制备工业酶制剂、饲料添加剂和蛋白质药物。所述酶制剂为纤维素内切酶、纤维素外切酶、纤维二糖酶、β葡萄糖苷酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、普鲁兰酶、淀粉酶、植酸酶、脂肪酶、蛋白酶、脂肪氧合酶。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的里氏木霉表达设备在一环化质粒上，易于保存和DNA操作。

2、本发明的里氏木霉表达设备利用农杆菌结合转移技术，可提高转化效率，缩短操作时间和工作量。

3、本发明的里氏木霉表达设备具有优化的分泌表达能力，适合大多数异源基因的分泌表达。

4、本发明的里氏木霉表达设备的多克隆位点中含有稀有接口和平末端接口，兼容绝大多数异源基因的连接，节约操作时间提高工作效率。

5、本发明的基因工程菌可高效表达酸性、中性纤维素内切酶，在造纸业和纺织业具有很重要的应用。

6、本发明提供的表达设备，可实现来源于动物、植物和真菌的异源蛋白质基因在丝状多细胞真核微生物里氏木霉中的高效分泌表达。由于里氏木霉培养条件粗放，适用于固体培养和液体深层发酵；里氏木霉本身没有毒性，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，符合国际食品安全认证；里氏木霉产生的胞外蛋白质易于分离纯化，成本低廉。因此本发明可以为洗涤、纺织、饲料、食品、造纸、医药等酶制剂行业提供基因工程生产菌株，提高酶制剂的生产效率降低生产成本。

7、本发明的表达设备(包括启动子终止子)变短，最终构建的表达盒较小，更利于构建表达质粒的连接操作和转化效率的提高。表达量更加平稳，不会受培养条件影响而有较大的波动。如果表达盒依赖于培养条件的波动较大，则对操作人员要求较高。本发明的表达设备的表达，菌体培养基的条件可以更加粗犷、低廉。可以使用稻草秸秆等农业肥料。菌体生长较快，减少时间就是降低成本。本发明表达盒可以和其他表达盒组合使用，同时表达两个异源蛋白质。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1为里氏木霉表达设备WEIIF的物理图谱。PcbhII：cbhII启动子；MCS：多克隆酶切位点；TcbhII：cbhII终止子；Hgy Box：潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒。

图2为里氏木霉表达载体pWEIIF00的构建图。

图3为含红色荧光蛋白的重组表达载体pWEIIF01的构建图。

图4为红色荧光蛋白在里氏木霉中的表达。A.诱导培养的菌丝在普通光源下观察；B.诱导培养的菌丝在红色荧光光源下观察。

具体实施方式

里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II基因的启动子在该基因的5’端，约由974个核苷酸组成。该基因的终止子在该基因的3’端，约由1096个核苷酸组成。在该基因的启动子后还连接着一段分泌肽序列，编码21个氨基酸序列的分泌肽。本发明取该里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II基因的启动子、分泌肽和终止子，并在分泌肽后加入加入几种限制性内切酶位点(多克隆位点、MCS)，从而便于外源基因顺利嵌入得以表达，因而本发明得到了结构为启动子-分泌肽-MCS-终止子的表达设备。该表达设备能够在里氏木霉中分泌表达各种外源蛋白，表达量高、易于分离纯化，成本低廉。

一、里氏木霉异源表达设备

本发明提供了一种里氏木霉异源表达设备。该表达设备通过农杆菌结合转移里氏木霉细胞。宿主菌属于里氏木霉种，较佳的是里氏木霉Trichodermareesei RUT C30。被表达的基因是与里氏木霉异源的任何外源基因。

本发明的里氏木霉表达设备的制备方法：

(1)通过PCR扩增，分别得到包含分泌肽序列的里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II启动子(P_cbhII)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶II终止子(T_cbhII)、潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒各自DNA序列。

(2)将启动子(P_cbhII)、多克隆位点、终止子(T_cbhII)、潮霉素B筛选标记盒依次连接到表达载体中，构建得到重组表达载体1，即pWEIIF00。这里的表达载体主要起大量拷贝本表达设备和提供农杆菌结合转移位点的作用，所以可以选择任何一种农杆菌二元载体，如PZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、pPK2，但不限于这些载体。

(3)将外源目的基因插入到上述表达载体1中，使外源基因位于启动子和T_cbhII之间，得到重组表达质粒2，即pWEIIF01、pWEIIF02和pWEIIF03。

上述步骤(2)中所述的多克隆位点为人工合成；将启动子、多克隆位点、终止子和筛选标记连接，可用限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法将各个元件连入表达载体，所述的限制性内切酶酶切和连接酶连接都是本领域常规做法。

上述步骤(3)中，将外源基因插入到上述表达载体1中，可用限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法将外源基因连入表达载体1中，所述的限制性内切酶酶切和连接酶连接都是本领域常规做法。

二、里氏木霉基因工程菌

本发明提供了一种里氏木霉基因工程菌，该基因工程菌是将本发明的表达设备通过农杆菌接合转移入里氏木霉细胞，培养筛选转化子制备而得，具体制备步骤如下：

(1)将本发明的含有表达设备的载体电转化根癌农杆菌；再利用接合转移机制转化里氏木霉细胞。

(2)将上述转化后的细胞进行筛选、鉴定，得到表达外源蛋白的重组里氏木霉菌株。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的下述实施例中，

PDA培养基配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，自然pH。

Luria Bertani(LB)培养基的配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g。

马丁氏培养基的配方如下：PePtone 1g，YE 0.3g，乳糖20g，(NH₄)₂SO₄1.4g，Urea 0.3g，KH₂PO₄ 2.0g，CaCl₂ 0.34g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，Mandels微量元素液1mL。

Mandels微量元素液(1000×)：

FeSO₄·7H₂O 5g，MnSO₄·H₂O 1.6g，ZnSO₄·7H₂O 1.4g，CoCl·6H₂O2g，水定容至1L。

结合转移用的培养基：

a.MM salts(1L)

KH₂PO₄ 3.625g，K₂HPO₄ 5.125g，NaCl 0.375g，MgSO₄·7H₂O 1.250g，CaCl₂·2H₂O 0.165g，FeSO₄·7H₂O 0.0062g，(NH₄)₂SO₄ 1.250g.

b.1M MES

21.32g定容到100mL，pH5.3(5M KOH调节)需要过膜除菌。

c.5M KOH

7.013g定容到25mL。

d.M-100Trace(0.5L)

H₃BO₃ 30mg，MnCl₂·4H₂O 70mg，ZnCl₂ 200mg，Na₂MoO₄·2H₂O 20mg，FeCl₃·6H₂O 50mg，GuSO₄·5H₂O 200mg.

e.M-100Salt (1L)

KH₂PO₄ 16g，Na₂SO₄ 4g，KCl 8g，MgSO₄·7H₂O 2g，CaCl₂ 1g，M-100Trace 8mL.

f.Induction Medium

MM salts 80mL，葡萄糖0.36g，甘油1.26g，24mLx8分装8瓶，水定容至192mL，接种时每瓶加1mL(1M MES，过膜除菌)调节pH值，起到缓冲的作用。

g.Induction Medium Plates

MM salts 160mL，葡萄糖0.36g，甘油2.52g，水定容至384mL，96mLx4分装4瓶，每瓶中加入1.5g琼脂，115℃，20min灭菌。倒平板前每瓶加入4mlL1M MES(过膜除菌)。

h.M-100plates

葡萄糖10g，KNO₃ 3g，M-100 Salt solution 62.5mL，水定容至1L，100mLx10瓶分装，每瓶加入0.75g琼脂。115℃，20min灭菌。

i.乙酰丁香酮(AS)

0.01962使用DMSO溶解定容至0.5mL。

DNA提取液的配方如下：Tris-HCl(pH7.5)0.2mol/L，NaCl 0.5mol/L，EDTA 0.01mol/L，SDS 1％。

在本发明的下述实施例中使用的里氏木霉是Trichoderma reesei RUTC30(ATCC)。

质粒提取试剂盒购自Invitrogen(USA)，胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

实施例1包含本发明的里氏木霉表达设备的表达载体的构建

1.1、里氏木霉基因组的提取及检验

将里氏木霉Trichoderma reesei RUT C30接种于PDA培养基上，于28℃下恒温培养7天至孢子成熟。制备适量孢子悬液接种于马丁氏培养基液体种子培养基中，于30℃180rpm条件下培养2天至菌丝体浓度达到4～5g/L用于提取基因组。

本实施例采用本领域常用的真菌快速提取基因组法提取里氏木霉的基因组DNA，提取完毕后使用琼脂糖凝胶电泳电泳检验所提取的基因组DNA。

1.2、里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II启动子(P_cbhII)的分离根据GeneBank上发布的cbhII启动子的序列，以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物P1和下游引物P2进行特异的PCR扩增分离P_cbhII。

上游引物P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其中含有EcoRV酶切位点。

下游引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其中含有XbaI酶切位点。

PCR扩增反应条件以及反应体系参照试剂盒说明书，PCR的扩增产物包含分泌肽和XbaI酶切位点在内，大小共为1045bp：其中1-6bp为EcoRV酶切位点，7-980bp为启动子，紧接其后的981-1040bp为分泌肽，最后1040-1045bp为XbaI酶切位点。该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析和DNA序列分析，结果表明所获得的扩增产物为目的片段。

1.3、外切葡聚糖纤维二糖水解酶II终止子(T_cbhII)的分离

根据GeneBank上发布的cbhII终止子的序列，以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物P3和下游引物P4进行特异的PCR扩增分离T_cbhII。

上游引物P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其中含有StuI酶切位点。

下游引物P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，其中含有SacI酶切位点。

PCR扩增反应条件以及反应体系参照试剂盒说明书，PCR的扩增产物包含酶切位点在内大小为1108bp：其中1-6bp为StuI酶切位点，7-1102bp为终止子，紧接其后的1103-1108bp为SacI酶切位点。该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析和DNA序列分析，结果表明所获得的扩增产物为目的片段。

1.4、多克隆位点MCS合成

利用DNA基因合成技术，人工合成多克隆位点MCS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该MCS对应的限制性内切酶酶切位点如下：XbaI-PacI-SwaI-StuI。其中，XbaI是CBHII分泌肽末端自身包含的酶切位点；PacI、SwaI是识别8个碱基对的限制性内切酶，物种基因DNA中出现此类位点的几率很低，适用范围广；SwaI、StuI酶切末端为平头，可以与任意DNA平末端(如EcoVR的酶切位点，高保真DNA聚合酶PCR反应的产物等)相连，适用范围广。

1.5、潮霉素B筛选标记盒的获得

以质粒pAN7-1(NCBI gi：475166)为模板，使用引物P5和P6经PCR扩增得到了潮霉素磷酸转移酶筛选标记盒。

上游引物P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其中含有SacI酶切位点；

下游引物P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中含有HindIII酶切位点。

PCR扩增反应条件以及反应体系参照试剂盒说明书，PCR的扩增产物包含酶切位点在内大小为2655bp，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析和DNA序列分析，结果与质粒pAN7-1中的序列一致，所获得的扩增产物为目的片段。

1.6、里氏木霉pWEIIF00表达载体的构建

用两种限制性内切酶的组合体系(EcoRV和XbaI，XbaI和StuI，StuI和SacI，SacI和HindIII，及EcoRV和HindIII)分别双酶切上述1.2、1.3、1.4、1.5得到的P_cbhII、T_cbhII、多克隆位点、潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒片段和农杆菌二元载体pPZP201BK(取自新泽西州立大学的瓦克斯曼研究所的Peter Hajdukiewicz)。再用DNA连接酶将上述多个双酶切片段相连。DNA连接反应完成将连接液转入大肠杆菌感受态DH5a(天根公司)，然后涂布含有卡那霉素(50μg/ml)的LB平板。挑出单克隆，接入含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基，菌液用plasmid extraction kit(Omega，USA)提质粒。测序验证出阳性转化子，获得表达载体PWEIIF00，即得到用于表达外源基因的里氏木霉表达载体。表达载体PWEIIF00的构建过程示意图如图2所示。插入序列结构示意图如图1所示。测序验证得到插入序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其中第7-980位是P_cbhII，第981-1043位是分泌肽，第1040-1073位是多克隆位点(即和序列表中SEQ IDNO：2所示序列相同)，第1074-2169位是T_cbhII，第2170-4824位是潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒。

实施例2利用里氏木霉表达设备表达红色荧光蛋白

2.1、红色荧光蛋白基因Red的获得

以质粒pDSRed2-N1(Clontech公司，货号632406)为模板，使用引物P7、P8经PCR扩增得到了695bp(包含酶切位点在内)的红色荧光蛋白Red基因。

上游引物P7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，其中含有XbaI酶切位点；

下游引物P8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，其中含有EcoRV酶切位点。

扩增产物的长度及序列分析的结果均与预期相符。

2.2、Red与表达设备的对接

EcoRV和StuI酶切位点都为平末端，因此两末端可以相互连接。将上述扩增产物(red基因)经过XbaI，EcoRV限制性酶切，使用T4连接酶连接到经过XbaI，StuI限制性酶切的表达载体PWEIIF00中，得到了含P_cbhII-Red-T_cbhII表达设备的重组载体PWEIIF01(如图3所示)。将PWEIIF01转化DH5a(天根公司)，然后涂布含有卡那霉素(50μg/ml)的LB平板。挑出单克隆，接入含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基，菌液用plasmid extractionkit(Omega，USA)提质粒。测序验证出阳性转化子，获得表达载体PWEIIF01，即得到用于表达红色荧光蛋白的里氏木霉表达载体PWEIIF01。

2.3、pWEIIF01电转根瘤农杆菌

质粒PWEIIF01电转根瘤农杆菌GV3101感受态细胞(购买于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)，涂布在含庆大霉素(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，确保细胞浓度稀释到全部根瘤农杆菌均以单克隆形式出现。在30℃下培养48h。挑取单克隆的根瘤农杆菌接种到加了Gen+Kan的LB培养基中，放在30℃，200rpm的摇床中培养24h。使用引物对做菌落PCR，筛选阳性转化子。

2.4、根瘤农杆菌结合转移

倒Induction Medium Plates平板，并将硝酸纤维素膜覆盖在培养基的上面。将里氏木霉T.reesei RUT C30的孢子稀释成10⁵～10⁸个/ml范围的梯度浓度孢子悬液。把上述步骤3电转后的阳性根瘤农杆菌和不同浓度的里氏木霉孢子悬液等体积混合，点到上述硝酸纤维素膜上。放在25℃下共培养48h后，把加了潮霉素(150μg/ml)和头孢霉素(100μg/ml)的M-100固体培养基倒在膜上，即为上层培养基。将平板放在30℃下培养5天。

2.5、转化子的鉴定及目的基因的表达

提取实施例2步骤2.4所得的阳性转化子的基因组DNA作为模板，用引物P7(其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示)和P8(其核苷酸序列如SEQID NO：10所示)进行PCR扩增。结果显示，抗性转化子的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到大小约为695bp的red基因的特异带，而用原始菌株T.reeseiRUT C30的基因组DNA为模板进行同样的PCR反应，没有出现扩增产物。使用引物P1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)和P4(其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)扩增出2836bp的片段，对应于表达设备P_cbhII-Red-T_cbhII的大小。

将获得的重组里氏木霉菌株接种于马丁氏液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养72h后，取发酵液点到载玻片上，放到荧光显微镜下观察，红色荧光蛋白的激发光557nm，发射光579nm。结果如图4所示，重组里氏木霉菌丝体在荧光显微镜下发出红色荧光，而原始的里氏木霉菌丝体在荧光显微镜下没有红色荧光。

实施例3探究CBHII表达设备的分泌能力

将实施例2步骤2.4得到的重组里氏木霉基因工程菌的孢子接种到添加了2％乳糖的马丁氏液体培养基中，于30℃，200rpm振荡培养48h，菌体生长至生长旺盛期后，用0.45μm滤膜过滤得到发酵液1。过滤后的菌体用没有添加任何糖的马丁氏液体培养基洗涤菌体3次，滤膜过滤收集菌体用灭菌滤纸吸干水分，然后用液氮研磨30min，以与发酵液1相同体积的无糖马丁氏液体培养基震荡10min萃取菌体碎片中的可溶蛋白质，离心得到发酵液2。使用荧光酶标仪测定在激发光535nm，发射光595nm处的荧光吸收值，结果显示发酵液1的荧光量约为发酵液2的3.5倍。因此可推算，利用CBHII表达设备后约78％的红色荧光蛋白质分泌表达到发酵液中，剩余的22％在细胞内聚集。

Claims

1.一种用于在里氏木霉（Trichoderma reesei）细胞内分泌表达外源蛋白的表达设备，其特征在于，所述的表达设备从5’至3’依次包括以下元件：（1）控制外源基因在里氏木霉中转录的里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II启动子（P_cbhII）；（2）控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；（3）多克隆位点序列；（4）控制外源基因在里氏木霉中终止转录的里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II终止子（T_cbhII）；所述的里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II启动子的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示序列的第7位至第980位；所述的里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶II终止子的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示序列的第1074位至第2169位；所述的控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列如序列表中SEQID NO:1所示序列的第981位至第1043位；所述的多克隆位点的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示序列的第1040位至第1073位；其中，所述的信号肽的编码序列的末4位碱基同时也为所述的多克隆位点的序列的头4位碱基。

2.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述的表达设备还包括以下元件：（5）筛选标记基因的表达盒。

3.如权利要求1或2所述的表达设备，其特征在于，所述的在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备还进一步包括外源蛋白的编码序列，其位于第（3）元件多克隆位点之中、之前或之后。

4.一种含有如权利要求1～3任一项所述表达设备的载体。

5.一种含有如权利要求4所述载体的转化子。

6.一种表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，其特征在于，其基因组中含有如权利要求3所述的表达设备。

7.一种如权利要求6所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括将含有如权利要求2所述的表达设备的根瘤农杆菌二元载体转化根瘤农杆菌，将所得的根瘤农杆菌转化子和里氏木霉接合，挑选基因组中整合有外源蛋白基因表达设备的接合子，即为表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌。

8.一种生产蛋白的方法，其特征在于，包括培养如权利要求6所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，从培养物中获得外源蛋白。

9.如权利要求6所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌在制备工业酶制剂、饲料添加剂或蛋白质药物中的应用。