CN102304495A - 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 - Google Patents
高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102304495A CN102304495A CN201110266082A CN201110266082A CN102304495A CN 102304495 A CN102304495 A CN 102304495A CN 201110266082 A CN201110266082 A CN 201110266082A CN 201110266082 A CN201110266082 A CN 201110266082A CN 102304495 A CN102304495 A CN 102304495A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- point mutation
- seq
- virus
- pbd
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 95
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 title abstract description 5
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 title abstract description 5
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 title abstract description 5
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 title abstract description 5
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 title abstract description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 159
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 115
- 102220057256 rs730881168 Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 28
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 25
- 101150080862 NA gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 101150076514 NS gene Proteins 0.000 claims description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 claims description 36
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 23
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 18
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 9
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 claims description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 abstract description 4
- 101710102873 Polymerase basic protein 2 Proteins 0.000 abstract description 4
- 101710085035 RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 abstract 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 15
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000197306 H1N1 subtype Species 0.000 description 6
- 241001473385 H5N1 subtype Species 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 241000827370 H10N8 subtype Species 0.000 description 5
- 241001473386 H9N2 subtype Species 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 5
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 5
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- QTUSJASXLGLJSR-OSUNSFLBSA-N Ile-Arg-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N QTUSJASXLGLJSR-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- RVDVDRUZWZIBJQ-CIUDSAMLSA-N Arg-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RVDVDRUZWZIBJQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- RKQRHMKFNBYOTN-IHRRRGAJSA-N Arg-His-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RKQRHMKFNBYOTN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- YHZQOSXDTFRZKU-WDSOQIARSA-N Arg-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)=CNC2=C1 YHZQOSXDTFRZKU-WDSOQIARSA-N 0.000 description 3
- OWUCNXMFJRFOFI-BQBZGAKWSA-N Asn-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OWUCNXMFJRFOFI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- BCADFFUQHIMQAA-KKHAAJSZSA-N Asn-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCADFFUQHIMQAA-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 3
- CRRFJBGUGNNOCS-PEFMBERDSA-N Gln-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CRRFJBGUGNNOCS-PEFMBERDSA-N 0.000 description 3
- QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N Gln-Leu-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- CAXXTYYGFYTBPV-IUCAKERBSA-N Gln-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CAXXTYYGFYTBPV-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- PSERKXGRRADTKA-MNXVOIDGSA-N Gln-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O PSERKXGRRADTKA-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 3
- ILKYYKRAULNYMS-JYJNAYRXSA-N Gln-Lys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ILKYYKRAULNYMS-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- QJCKNLPMTPXXEM-AUTRQRHGSA-N Glu-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QJCKNLPMTPXXEM-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 3
- IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- 241000252868 H7N7 subtype Species 0.000 description 3
- 108700039609 IRW peptide Proteins 0.000 description 3
- WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N Ile-Thr-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N 0.000 description 3
- DLCXCECTCPKKCD-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DLCXCECTCPKKCD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CN=CN1 CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- OYQUOLRTJHWVSQ-SRVKXCTJSA-N Leu-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OYQUOLRTJHWVSQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- FKQPWMZLIIATBA-AJNGGQMLSA-N Leu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FKQPWMZLIIATBA-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 3
- VUTWYNQUSJWBHO-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O VUTWYNQUSJWBHO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- DNDVVILEHVMWIS-LPEHRKFASA-N Met-Asp-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DNDVVILEHVMWIS-LPEHRKFASA-N 0.000 description 3
- YLLWCSDBVGZLOW-CIUDSAMLSA-N Met-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YLLWCSDBVGZLOW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- DGNZGCQSVGGYJS-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DGNZGCQSVGGYJS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N Phe-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- OCWWJBZQXGYQCA-DCAQKATOSA-N Ser-Lys-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OCWWJBZQXGYQCA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- BUYHXYIUQUBEQP-AVGNSLFASA-N Ser-Phe-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BUYHXYIUQUBEQP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- ILZAUMFXKSIUEF-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ILZAUMFXKSIUEF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XXNLGZRRSKPSGF-HTUGSXCWSA-N Thr-Gln-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O XXNLGZRRSKPSGF-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 3
- CQNFRKAKGDSJFR-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O CQNFRKAKGDSJFR-NUMRIWBASA-N 0.000 description 3
- VLDMQVZZWDOKQF-AUTRQRHGSA-N Val-Glu-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N VLDMQVZZWDOKQF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 3
- OJPRSVJGNCAKQX-SRVKXCTJSA-N Val-Met-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N OJPRSVJGNCAKQX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 3
- 108010059459 arginyl-threonyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 241000252870 H3N2 subtype Species 0.000 description 2
- 241001219885 H4N2 subtype Species 0.000 description 2
- 241001087382 H6N4 subtype Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 231100000645 Reed–Muench method Toxicity 0.000 description 2
- BRGQQXQKPUCUJQ-KBIXCLLPSA-N Ser-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BRGQQXQKPUCUJQ-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N Thr-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 2
- TWJDQTTXXZDJKV-BPUTZDHNSA-N Trp-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O TWJDQTTXXZDJKV-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010018691 arginyl-threonyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- TTXMOJWKNRJWQJ-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N TTXMOJWKNRJWQJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AWAXZRDKUHOPBO-GUBZILKMSA-N Ala-Gln-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AWAXZRDKUHOPBO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WUHJHHGYVVJMQE-BJDJZHNGSA-N Ala-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WUHJHHGYVVJMQE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- VEAPAYQQLSEKEM-GUBZILKMSA-N Ala-Met-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VEAPAYQQLSEKEM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CNQAFFMNJIQYGX-DRZSPHRISA-N Ala-Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 CNQAFFMNJIQYGX-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- BGGAIXWIZCIFSG-XDTLVQLUSA-N Ala-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BGGAIXWIZCIFSG-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NKBQZKVMKJJDLX-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NKBQZKVMKJJDLX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- NKNILFJYKKHBKE-WPRPVWTQSA-N Arg-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NKNILFJYKKHBKE-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- PSOPJDUQUVFSLS-GUBZILKMSA-N Arg-Met-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PSOPJDUQUVFSLS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZEBDYGZVMMKZNB-SRVKXCTJSA-N Arg-Met-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N ZEBDYGZVMMKZNB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XSPKAHFVDKRGRL-DCAQKATOSA-N Arg-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XSPKAHFVDKRGRL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DNLQVHBBMPZUGJ-BQBZGAKWSA-N Arg-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O DNLQVHBBMPZUGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N Arg-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- LEFKSBYHUGUWLP-ACZMJKKPSA-N Asn-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LEFKSBYHUGUWLP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- WVCJSDCHTUTONA-FXQIFTODSA-N Asn-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WVCJSDCHTUTONA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PQAIOUVVZCOLJK-FXQIFTODSA-N Asn-Gln-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PQAIOUVVZCOLJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JLNFZLNDHONLND-GARJFASQSA-N Asn-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JLNFZLNDHONLND-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- UOUHBHOBGDCQPQ-IHPCNDPISA-N Asn-Phe-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N UOUHBHOBGDCQPQ-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- PLTGTJAZQRGMPP-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(N)=O PLTGTJAZQRGMPP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JWQWPRCDYWNVNM-ACZMJKKPSA-N Asn-Ser-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JWQWPRCDYWNVNM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N Asp-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- KHBLRHKVXICFMY-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Lys Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O KHBLRHKVXICFMY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SCQIQCWLOMOEFP-DCAQKATOSA-N Asp-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O SCQIQCWLOMOEFP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YTXCCDCOHIYQFC-GUBZILKMSA-N Asp-Met-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O YTXCCDCOHIYQFC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QOJJMJKTMKNFEF-ZKWXMUAHSA-N Asp-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QOJJMJKTMKNFEF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- WAJDEKCJRKGRPG-CIUDSAMLSA-N Cys-His-Ser Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N WAJDEKCJRKGRPG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- WUAYFMZULZDSLB-ACZMJKKPSA-N Gln-Ala-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O WUAYFMZULZDSLB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- INFBPLSHYFALDE-ACZMJKKPSA-N Gln-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O INFBPLSHYFALDE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JXFLPKSDLDEOQK-JHEQGTHGSA-N Gln-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O JXFLPKSDLDEOQK-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- IOFDDSNZJDIGPB-GVXVVHGQSA-N Gln-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IOFDDSNZJDIGPB-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- XGKNQFOKIBKFTR-CIUDSAMLSA-N Gln-Met-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O XGKNQFOKIBKFTR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PAOHIZNRJNIXQY-XQXXSGGOSA-N Gln-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAOHIZNRJNIXQY-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- OACPJRQRAHMQEQ-NHCYSSNCSA-N Gln-Val-Arg Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OACPJRQRAHMQEQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CGYDXNKRIMJMLV-GUBZILKMSA-N Glu-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CGYDXNKRIMJMLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N Glu-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VGOFRWOTSXVPAU-SDDRHHMPSA-N Glu-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O VGOFRWOTSXVPAU-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N Glu-Ser-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VNCNWQPIQYAMAK-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNCNWQPIQYAMAK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- KFMBRBPXHVMDFN-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCNC(N)=N KFMBRBPXHVMDFN-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FMNHBTKMRFVGRO-FOHZUACHSA-N Gly-Asn-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CN FMNHBTKMRFVGRO-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BPQYBFAXRGMGGY-LAEOZQHASA-N Gly-Gln-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)CN BPQYBFAXRGMGGY-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HDNXXTBKOJKWNN-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDNXXTBKOJKWNN-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N Gly-Leu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- MHZXESQPPXOING-KBPBESRZSA-N Gly-Lys-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O MHZXESQPPXOING-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- NGRPGJGKJMUGDM-XVKPBYJWSA-N Gly-Val-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O NGRPGJGKJMUGDM-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- CKRJBQJIGOEKMC-SRVKXCTJSA-N His-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CKRJBQJIGOEKMC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KQJBFMJFUXAYPK-AVGNSLFASA-N His-Met-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N KQJBFMJFUXAYPK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HDOYNXLPTRQLAD-JBDRJPRFSA-N Ile-Ala-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N HDOYNXLPTRQLAD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- TZCGZYWNIDZZMR-UHFFFAOYSA-N Ile-Arg-Ala Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NC(C)C(O)=O)CCCN=C(N)N TZCGZYWNIDZZMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HLYBGMZJVDHJEO-CYDGBPFRSA-N Ile-Arg-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N HLYBGMZJVDHJEO-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- UNDGQKWQNSTPPW-CYDGBPFRSA-N Ile-Arg-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N UNDGQKWQNSTPPW-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N Ile-Arg-Pro Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N Ile-Asp-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 1
- OVPYIUNCVSOVNF-ZPFDUUQYSA-N Ile-Gln-Pro Natural products CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O OVPYIUNCVSOVNF-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- NHJKZMDIMMTVCK-QXEWZRGKSA-N Ile-Gly-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NHJKZMDIMMTVCK-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- PWUMCBLVWPCKNO-MGHWNKPDSA-N Ile-Leu-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PWUMCBLVWPCKNO-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- BLFXHAFTNYZEQE-VKOGCVSHSA-N Ile-Trp-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N BLFXHAFTNYZEQE-VKOGCVSHSA-N 0.000 description 1
- WJBOZUVRPOIQNN-KJYZGMDISA-N Ile-Trp-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)C1=CN=CN1 WJBOZUVRPOIQNN-KJYZGMDISA-N 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- AVEGDIAXTDVBJS-XUXIUFHCSA-N Leu-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AVEGDIAXTDVBJS-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- AUBMZAMQCOYSIC-MNXVOIDGSA-N Leu-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O AUBMZAMQCOYSIC-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- JNDYEOUZBLOVOF-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O JNDYEOUZBLOVOF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IZPVWNSAVUQBGP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IZPVWNSAVUQBGP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCN=C(N)N NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N Lys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- PBIPLDMFHAICIP-DCAQKATOSA-N Lys-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PBIPLDMFHAICIP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N Lys-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- KQAREVUPVXMNNP-WDSOQIARSA-N Lys-Trp-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O KQAREVUPVXMNNP-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N Lys-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UOENBSHXYCHSAU-YUMQZZPRSA-N Met-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O UOENBSHXYCHSAU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JPCHYAUKOUGOIB-HJGDQZAQSA-N Met-Glu-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPCHYAUKOUGOIB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- RRIHXWPHQSXHAQ-XUXIUFHCSA-N Met-Ile-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O RRIHXWPHQSXHAQ-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- PCTFVQATEGYHJU-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PCTFVQATEGYHJU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CKAVKDJBSNTJDB-SRVKXCTJSA-N Met-Val-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC CKAVKDJBSNTJDB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- XMPUYNHKEPFERE-IHRRRGAJSA-N Phe-Asp-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 XMPUYNHKEPFERE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DDYIRGBOZVKRFR-AVGNSLFASA-N Phe-Asp-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N DDYIRGBOZVKRFR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N Phe-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- MPFGIYLYWUCSJG-AVGNSLFASA-N Phe-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MPFGIYLYWUCSJG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WEMYTDDMDBLPMI-DKIMLUQUSA-N Phe-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N WEMYTDDMDBLPMI-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- BSKMOCNNLNDIMU-CDMKHQONSA-N Phe-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O BSKMOCNNLNDIMU-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N Phe-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N 0.000 description 1
- LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XZGWNSIRZIUHHP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XZGWNSIRZIUHHP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OBVCYFIHIIYIQF-CIUDSAMLSA-N Pro-Asn-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OBVCYFIHIIYIQF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AUQGUYPHJSMAKI-CYDGBPFRSA-N Pro-Ile-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AUQGUYPHJSMAKI-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- QKDIHFHGHBYTKB-IHRRRGAJSA-N Pro-Ser-Phe Chemical compound N([C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 QKDIHFHGHBYTKB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JDJMFMVVJHLWDP-UNQGMJICSA-N Pro-Thr-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JDJMFMVVJHLWDP-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N Ser-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CJINPXGSKSZQNE-KBIXCLLPSA-N Ser-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CJINPXGSKSZQNE-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- PMTWIUBUQRGCSB-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PMTWIUBUQRGCSB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LLSLRQOEAFCZLW-NRPADANISA-N Ser-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LLSLRQOEAFCZLW-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- CAGTXGDOIFXLPC-KZVJFYERSA-N Thr-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CCCN=C(N)N CAGTXGDOIFXLPC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- MQBTXMPQNCGSSZ-OSUNSFLBSA-N Thr-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)CCCN=C(N)N MQBTXMPQNCGSSZ-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- SHOMROOOQBDGRL-JHEQGTHGSA-N Thr-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SHOMROOOQBDGRL-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- LHEZGZQRLDBSRR-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LHEZGZQRLDBSRR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- UBDDORVPVLEECX-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O UBDDORVPVLEECX-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- XTCNBOBTROGWMW-RWRJDSDZSA-N Thr-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XTCNBOBTROGWMW-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N Thr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- WNQJTLATMXYSEL-OEAJRASXSA-N Thr-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WNQJTLATMXYSEL-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- LECUEEHKUFYOOV-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LECUEEHKUFYOOV-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- HYNAKPYFEYJMAS-XIRDDKMYSA-N Trp-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HYNAKPYFEYJMAS-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- OFTGYORHQMSPAI-PJODQICGSA-N Trp-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OFTGYORHQMSPAI-PJODQICGSA-N 0.000 description 1
- WTXQBCCKXIKKHB-JYJNAYRXSA-N Tyr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WTXQBCCKXIKKHB-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- WPVGRKLNHJJCEN-BZSNNMDCSA-N Tyr-Asp-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WPVGRKLNHJJCEN-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ARPONUQDNWLXOZ-KKUMJFAQSA-N Tyr-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ARPONUQDNWLXOZ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WAPFQMXRSDEGOE-IHRRRGAJSA-N Tyr-Glu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WAPFQMXRSDEGOE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HVHJYXDXRIWELT-RYUDHWBXSA-N Tyr-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O HVHJYXDXRIWELT-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- JXGUUJMPCRXMSO-HJOGWXRNSA-N Tyr-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JXGUUJMPCRXMSO-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- ZYVAAYAOTVJBSS-GMVOTWDCSA-N Tyr-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZYVAAYAOTVJBSS-GMVOTWDCSA-N 0.000 description 1
- UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N Val-Asn-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- SYOMXKPPFZRELL-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N SYOMXKPPFZRELL-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N Val-Gly-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N Val-Lys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- YTNGABPUXFEOGU-SRVKXCTJSA-N Val-Pro-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O YTNGABPUXFEOGU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N Val-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 229920006103 Verton® Polymers 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010010430 asparagine-proline-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 108010084525 phenylalanyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了一种PR8重组流感病毒及其制备方法和应用，所述重组流感病毒含有H1、H3、H4、H5，H6、H7、H9或H10亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。通过构建重组质粒、共转染细胞和SPF鸡胚扩增得到的PR8重组流感病毒能高效表达HA蛋白和/或NA基因，可用于大规模制备流感疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及到疫苗的生产领域，具体地，是涉及到一种高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用。
技术领域
流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，高致病性禽流感被国际动物卫生组织确定为A类疫病。流感病毒根据基质蛋白(Matrixprotein，M)的不同可以分为A、B、C三型。根据流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性的差异，又可将流感病毒分为不同的亚型，A型流感病毒根据HA划分为16个亚型，根据NA划分为9个亚型。流感病毒具有高度传染性，可通过飞沫传播，因此它能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行。1983-1984年，美国宾州的高致病性禽流感暴发，造成1700万家禽死亡，损失近6500万美元。2003年年底，亚洲多个国家和地区暴发了高致病性的禽流感。禽流感的暴发，使1亿多只家禽死亡或被扑杀，部分国家禽肉产量和销售量急剧下降，价格下跌，禽肉及其制口进出口暂时中止；此外，家禽养殖业、饲料行业和旅游业也都受到不利的影响。据粮农组织估计，由此遭受的损失至少为5亿美元。此外，许多亚型的禽流感病毒具有跨宿主传播至人的能力，因而，该病的暴发也同时危害着社会公共安全。世纪爆发了三次流感的大流行，分别是1918年西班牙流感(H1N1)、1957年亚洲流感(H2N2)和1968年香港流感(H3N2)，其中最大规模的流行为西班牙流感。该流感疫病造成全球2000万人的死亡，超过第一次世界大战死亡人数，列全球所有传染病死亡的第一位。
流感病毒的基因组由单股，负义RNA片段组成.。A型流感病毒分为8个片段，编码11种功能蛋白，片段1、2、3分别编码三个聚合酶蛋白PB2、PB1和PA；片段4编码血凝素HA；片段5编码核衣壳蛋白NP；片段6编码神经氨酸酶NA；片段7编码基质蛋白M1和离子通道M2；片段8编码非结构蛋白NS1和NS2。其中HA和NA是流感病毒最主要的两种表面糖蛋白，HA蛋白是流感病毒最重要的保护性抗原。
目前，各国对动物和人流感的预防控制采取了不同的措施，但是疫苗接种仍然是预防流感的最佳选择，因此研制有效的流感疫苗对于控制流感流行具有极其重要的意义。全病毒灭活疫苗是目前应用最广泛的疫苗，该疫苗安全性好，不会出现毒力返强和变异的危险，能够经受同种亚型流感病毒的攻击。目前已上市的流感疫苗基本都是使用鸡胚培养制备，国内外使用鸡胚培养疫苗已经有50年历史。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的鸡胚，鸡胚带有潜在污染可能，而且培养周期过长，不易于扩大产量，不利于应对大规模的流感爆发。为此，世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。为加快细胞培养流感疫苗技术的开发，美国政府决定投资11亿美元资助葛兰素史克、edImmune、诺华、DynPort、Solvay和巴斯德6个主要的流感疫苗开发新技术。在2007年，全球最大的生物制药公司之一诺华宣布其人用流感疫苗Optaflu上市，成为唯一获批(欧盟批准)的人用细胞培养流感疫苗，是50年流感疫苗生产史最重大的创新之一。
无论采用鸡胚法和大规模细胞制备法获得病毒，重要的影响因素便是疫苗种毒本身是不是高产量的病毒株。A/Puerto Rico/8/34(PR8)是一株鸡胚适应病毒株，是目前在鸡胚上高产株之一，疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组(6+2模式)，将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度。为了进一步提高PR8的病毒滴度，满足在流感大暴发时，巨大的疫苗需求量，科研人员进行了大量的研究，通过优化病毒基因来提高病毒株产量。研究发现该流感病毒一些蛋白的某个氨基酸位点对该病毒的增殖能力具有重要的影响，如PB2上360位的酪氨酸(Tyr)和NS1上55位的谷氨酸(Glu)也起到一定作用。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供一种PR8突变重组流感病毒，该重组流感病毒可高效表达HA蛋白。
实现上述目的技术方案如下：
一种PR8重组流感病毒，其含有H1亚型流感病毒的HA和/或NA基因，且含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变NP蛋白的NP基因(含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸组成为：分别如SEQ ID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQ ID.NO：24-27)。
一种PR8突变重组流感病毒，其含有H3亚型流感病毒的HA和/或NA基因，且含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变NP蛋白的NP基因(含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸组成为：分别如SEQ ID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQID.NO：24-27)。
一种PR8突变重组流感病毒，其含有H4亚型流感病毒的HA和/或NA基因，且含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变NP蛋白的NP基因(含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸组成为：分别如SEQ ID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQID.NO：24-27)。
一种PR8突变重组流感病毒，其含有H5亚型流感病毒的HA和/或NA基因，且含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变NP蛋白的NP基因(含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸组成为：分别如SEQ ID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQID.NO：24-27)。
一种PR8突变重组流感病毒，其含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因，且含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变NP蛋白的NP基因(含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸组成为：分别如SEQ ID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQID.NO：24-27)。
一种PR8突变重组流感病毒，其含有H7亚型流感病毒的HA和/或NA基因，且含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变NP蛋白的NP基因(含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸组成为：分别如SEQ ID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQID.NO：24-27)。
一种PR8突变重组流感病毒，其含有H9亚型流感病毒的HA和/或NA基因，且含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变NP蛋白的NP基因(含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸组成为：分别如SEQ ID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQID.NO：24-27)。
一种PR8突变重组流感病毒，其含有H10亚型流感病毒的HA和/或NA基因，且含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变NP蛋白的NP基因(含有编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，和/或编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸组成为：分别如SEQ ID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQID.NO：24-27)。
本发明的另一目的是提供制备上述PR8突变重组流感病毒的方法。
实现该目的的技术方案如下：
一种制备上述的PR8突变重组病毒的方法，包括以下步骤：
(一)、构建重组质粒：
A、分别获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段；
优选地，所述分别获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段的制备为：
以含有PR8病毒NP基因的重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：7和SEQ ID.NO：6以及引物SEQ ID.NO：5和SEQ ID.NO：8在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：7和SEQ ID.NO：8为引物，进行第二次PCR扩增融合，获得点突变G132A的PR8病毒NP基因片段；
以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：2以及引物SEQ ID.NO：1和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及SEQ ID.NO：3和引物SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以上述的编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及引物SEQ ID.NO：3和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码同时含有E74S和E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；B、获得H1、H3、H4、H5，H6、H7、H9、H10亚型流感病毒的HA和NA基因；
获得H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10亚型流感病毒的HA和NA基因的方法为：
分别抽提H1、H3、H4、H5、H6、H9和H10亚型流感病毒的总RNA；
分别以总RNA为模板，反转录合成H1、H3、H4、H5、H6、H9、H10亚型流感病毒的cDNA；
以获得的cDNA为模板，分别用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14以及SEQ ID.NO：11和SEQ ID.NO：12为上下游引物，分别扩增出H1、H3、H4、H6、H9、H10亚型流感病毒的HA基因和H1、H3、H4、H5、H6、H9、H10亚型流感病毒的NA基因；
以H5亚型流感病毒的cDNA为模板，用突变H5HA碱性裂解位点的引物SEQ ID.NO：15和SEQ ID.NO：13、及引物SEQ ID.NO：16和SEQ ID.NO：14分别扩增，再用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14引物进行PCR融合扩增，获得含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的H5N1亚型流感病毒的HA基因；
所述H7亚型流感病毒的HA和NA基因的制备为：人工合成H7亚型流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的HA基因，并用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14和SEQ ID.NO：11和SEQ ID.NO：12为上下游引物，分别进行扩增，分别扩增出H7亚型流感病毒的HA基因和NA基因。
C、制备重组质粒：分别将获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段和上述获得的HA和NA基因经过酶切、连接及转化，获得相应的重组质粒；所述重组质粒为以下中的一种以上：PBD-(H1)HA、PBD-(H1)NA；PBD-(H3)HA、PBD-(H3)NA；PBD-(H4)HA、PBD-(H4N2)NA；PBD-(H5)HA、PBD-(H5)NA；PBD-(H6)HA、PBD-(H6)NA；PBD-(H7)HA、PBD-(H7)NA；PBD-(H9)HA、PBD-(H9)NA；PBD-(H10)HA、PBD-(H10)NA；PBD-PR8NS-NS2E67/74S、PBD-PR8NS-NS2E67S、PBD-PR8NS-NS2E74S、PBD-PR8NP-G132A、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、PBD-PR8PA、PBD-PR8NP、PBD-PR8M、PBD PR8NS(Zejun Li，et al.JVI，2005，79(18)：12058-12064)。
(二)、制备重组PR8突变病毒：将上述获得的重组质粒按照相应组合，转染于293T细胞；转染后的细胞上清用TPCK-Trypsin处理后，接种SPF鸡胚，培养；收获鸡胚尿囊液，获得上述的重组PR8突变病毒。
本发明的另一目的是上述PR8重组流感病毒的应用。
具体技术方案如下：
上述任一所述的PR8重组流感病毒在制备流感疫苗中的应用。
本发明的发明人发现当PR8病毒株的NS2蛋白第67位氨基酸由E突变为S(E67S点突变)，或NS2蛋白第74位氨基酸由E突变成S(E74S点突变)，或NS2蛋白第64和74位氨基酸同时由E突变成S(E67S/E74S点突变)，病毒突变株在鸡胚上的增殖能力明显提高。此外，NP蛋白的第132位氨基酸由G突变为A时(G132A点突变)，突变体的病毒株在细胞上的增殖能力明显提高。利用这些高增殖能力突突病毒的内部基因和不同亚型(H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10)流感病毒进行人工重组，获得本发明所述的高效表达HA抗原的重组病毒，这些重组病毒可用于大规模研制流感疫苗。
附图说明
图1重组PR8突变病毒及重组PR8病毒在鸡胚上的血凝活性。
图2重组PR8突变病毒及重组PR8病毒在细胞上的血凝活性。
具体实施方式
实施例1
一、重组质粒的构建与鉴定
1、引物设计
设计流感病毒PR8的NS和NP的突变引物；流感病毒12bp反转录引物、A型流感的通用引物、H5和H7HA裂解位点突变引物由本实验室设计。上述引物具体的序列见表1(本发明中所用到的引物序列，具体见表1)，均由上海Invitrogen公司合成。
2、两点定点突变
采用两步PCR方法对预期突变氨基酸位点的核苷酸进行突变。首先以PBD-PR8NP为模板，分别用BSPQI-NP-forward和PR8-NP-400R以及PR8-NP-387F和BSPQI-NP-reverse为上下游引物，在Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)的作用下分别进行PCR扩增。PCR获得的两个片段，通过胶回收试剂盒回收。以回收的两段PCR产物为模板，以BSPQI-NP-forward和BSPQI-NP-reverse为引物，进行第二次PCR融合。如此获得定编码G132A点突变的NP蛋白的NP基因片段。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min-1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。反映结束后，PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳实验。
用同样的方法，利用表1中NS2突变引物：PR8-NS2-193F、PR8-NS2-204R，PR8-NS2-215F、PR8-NS2-224R和NS基因扩增引物：BSPQI-NS-forward和BSPQI-NS-reverse分别获得含有NS2E67S、E74S和NS2E67/74S点突变的NS基因PCR扩增产物。
具体如下：以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：2以及引物SEQ ID.NO：1和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及SEQ ID.NO：3和引物SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以上述的编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及引物SEQ ID.NO：3和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码同时含有E74S和E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；3、HA和NA基因的PCR扩增
HA和NA基因来源于不同亚型的流感病毒(HxNy，代表H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2、H10N8亚型流感病毒)。除H7N7亚型流感外，其他病毒用Trizol(Invitrogen)抽提总RNA。
用反转录试剂盒(TakaRa)，根据其说明书，用12bp引物5′-AGCAAAAGCAGG-3′(表1)为特异性引物，合成cDNA第一链。以获得的cDNA的第一链为模板，用BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse和BSPQI-NA-forward、BSPQI-NA-reverse为上下游引物(含有BspQI酶切位点，如表1)，分别扩增出片段的H1N1、H3N2、H4N2、H6N4、H9N2、H10N8亚型流感病毒的HA和H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H9N2、H10N8亚型流感病毒的NA基因。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳验证。
抽提获得H5N1亚型流感病毒HA基因后，用突变H5HA碱性裂解位点的下游引物H5-reverse和BSPQI-HA-forward、突变碱性裂解位点的上游引物H5-forward和BSPQI-HA-reverse分别进行PCR扩增，再用BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse引物进行融合PCR。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳验证。获得含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的H5的HA基因。
在本研究中人工合成了H7N7流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的HA基因，并用BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse和BSPQI-NA-forward、BSPQI-NA-reverse为上下游引物(含有BspQI酶切位点，如表1)，分别进行了PCR扩增。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳验证。
4、PCR产物的割胶回收
电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒回收DNA。具体方法如下：在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，放入一无菌的1.5ml的EP管中，加入3倍凝胶体积(100mg＝100ul体积)的Buffer DE-A(凝胶液)，混合均匀后于75℃加热，间断混合(2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B(结合液)，混合均匀；当回收的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。将混合液转移到DNA制备管中，12000×g离心1min，倒掉收集管中的废液。将制备管置回收集管中，加入500ul Buffer W1(洗涤液)，12000×g离心30s，弃掉收集管中的废液。将制备管置回收集管中，加入700ul Buffer W2(去盐液)，12000×g离心1min，弃掉收集管中的废液，以同样的方法再洗一次。将制备管置回收集管中，12000×g空离1min。最后将制备管置于洁净的1.5ml EP管中，在制备膜中央加入30ul的去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA，置于-20℃保存备用。
5、酶切、连接及转化
上述PCR纯化产物与PBD载体(Zejun Li，et al.JVI，2005，79(18)：12058-12064)分别用BSPQI限制性内切酶进行消化，用胶回收试剂盒回收目的片段与PBD质粒的酶切产物，然后用T4连接酶将酶切后的PCR产物与酶切处理的PBD载体进行连接。连接产物转化于感受态细胞JM109(上海索莱生物科技有限公司)，无菌条件下涂布于含Amp的LB固体培养基上，37℃培养8-20h。
6、重组质粒的鉴定
挑取LB固体培养基上的单个菌落，放入加有约3ml含Amp的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养10h。将菌液用碱性抽提法抽提的质粒，用PCR方法进行验证。鉴定为阳性的质粒进行序列测定，用DNAstar序列分析软件进行序列分析，确定序列正确无误。分别如SEQID.NO：20-23所示的核酸序列，或其蛋白质组成为SEQ ID.NO：24-27。此外，各个亚型的HA和NA基因的序列经核实也是正确的。
表1 NS2、NP基因的定点突变引物和A型流感病毒通用引物
实施例2、重组PR8突变病毒的拯救
1、转染质粒准备
用超纯抽提试剂盒(OMEGA)提取上述方法构建的重组质粒，包括：PBD-(H1)HA、PBD-(H1)NA；PBD-(H3)HA、PBD-(H3)NA；PBD-(H4)HA、PBD-(H4)NA；PBD-(H5)HA、PBD-(H5)NA；PBD-(H6)HA、PBD-(H6)NA；PBD-(H7)HA、PBD-(H7)NA；PBD-(H9)HA、PBD-(H9)NA；PBD-(H10)HA、PBD-(H10)NA；PBD-PR8NS-NS2E67/74S 、PBD-PR8NS-NS2E67S、PBD-PR8NS-NS2E74S、PBD-PR8NP-G132A、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、PBD-PR8PA、PBD-PR8NP、PBD-PR8M、PBD PR8NS，并测定质粒浓度。
2、拯救获得重组PR8突变病毒
将上述质粒按照设计好的组合，利用脂质体2000共转染于293T细胞。转染后6h，弃去细胞上清，加入2ml OPTI-MEM，置于37℃的CO2培养箱中培养72h。转染后的细胞上清用TPCK-Typsin处理后，接种于9-11日龄SPF鸡胚(北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，用石蜡封口后置于37℃孵化器内继续孵化。48-72h后放入4℃过夜，取出，收获鸡胚尿囊液。尿囊液用血凝试验测定有无凝集活性。
本发明拯救获得了含H1亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H1N1-PR8(简称1-PR8)，H1N1-PR8-NS2E67S(简称1-67)，H1N1-PR8-NS2E74S(简称1-74)H1N1-PR8-NS2E67S/E74S(简称1-67/74)，H1N1-PR8-NP-G132A(简称1-132)和H1N1-PR8-NPG132A-NS2E67S/E74S(简称1-132/67/74)。
本发明拯救获得了含H3亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H3N2-PR8(简称3-PR8)，H3N2-PR8-NS2E67S(简称3-67)，H3N2-PR8-NS2E74S(简称3-74)，H3N2-PR8-NS2E67S/E74S(简称3-67/74)，H3N2-PR8-NPG132A(简称3-132)和H3N2-PR8-NPG132A-NS2E67S/E74S(简称3-132/67/74)。
本发明拯救获得了含H4亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H4N2-PR8(简称4-PR8)，H4N2-PR8-NS2E67S(简称4-67)，H4N2-PR8-NS2E74S(简称4-74)，H4N2-PR8-NS2E67S/E74S(简称4-67/74)，H4N2-PR8-NPG132A(简称4-132)和H4N2-PR8-NPG132A-NS2E67S/E74S(简称4-132/67/74)。
本发明拯救获得了含H5亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H5N1-PR8(简称5-PR8)，H5N1-PR8-NS2E67S(简称5-67)，H5N1-PR8-NS2E74S(简称5-74)，H5N1-PR8-NS2E67S/E74S(简称5-67/74)，H5N1-PR8-NPG132A(简称5-132)和H5N1-PR8-NPG132A-NS2E67S/E74S(简称5-132/67/74)。
本发明拯救获得了含H6亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H6N4-PR8(简称6-PR8)，H6N4-PR8-NS2E67S(简称6-67)，H6N4-PR8-NS2E74S(简称6-74)，H6N4-PR8-NS2E67S/E74S(简称6-67/74)，H6N4-PR8-NPG132A(简称6-132)和H6N4-PR8-NPG132A-NS2E67S/E74S(简称6-132/67/74)。
本发明拯救获得了含H7亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H7N7-PR8(简称7-PR8)，H7N7-PR8-NS2E67S(简称7-67)，H7N7-PR8-NS2E74S(简称7-74)，H7N7-PR8-NS2E67S/E74S(简称7-67/74)，H7N7-PR8-NPG132A(简称7-132)和H7N7-PR8-NPG132A-NS2E67S/E74S(简称7-132/67/74)。
本发明拯救获得了含H9亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H9N2-PR8(简称9-PR8)，H9N2-PR8-NS2E67S(简称9-67)，H9N2-PR8-NS2E74S(简称9-74)，H9N2-PR8-NS2E67S/E74S(简称9-67/74)，H9N2-PR8-NP132A(简称9-132)和H9N2-PR8-NPG132A-NS2E67S/E74S(简称9-132/67/74)。
本发明拯救获得了含H10亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H10N8-PR8(简称10-PR8)，H10N8-PR8-NS2E67S(简称10-67)，H10N8-PR8-NS2E74S(简称10-74)，H10N8-PR8-NS2E67S/E74S(简称10-67/74)，H10N8-PR8NP-G132A(简称10-132)和H10N8-PR8-NPG132A-NS2E67S/E74S(简称10-132/67/74)。
3、重组病毒的鉴定
用Trizol抽提重组病毒的尿囊液总RNA，并用12bp引物反转录，获得cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，用BSPQI-HA-forward和BSPQI-HA-reverse、BSPQI-NA-forward和BSPQI-NA-reverse、BSPQI-NP-forward和BSPQI-NP-reverse、BSPQI-NS-forward、BSPQI-NS-reverse为上下游引物，用PCR的方法分别扩增HA、NA、NP、和NS片段，将这些PCR产物纯化后测序，测序结果证实重组PR8突变病毒所含的片段皆为预期的，没有发现非预期突变。
三、救获的重组病毒生长特性鉴定
1、救获的重组病毒EID50测定
含病毒的鸡胚尿囊液按照10倍倍比稀释，将10-5～10-9各稀释度分别接种到3枚9-11日龄的SPF鸡胚中，37℃继续孵化48h。通过测定感染胚尿囊液的血凝活性来判断其是否感染，利用Reed-Muench法计算EID50(鸡胚半数感染量)。重组病毒EID50测定结果如表2所示(其中，病毒稀释液体积为100ul)。
表2 重组病毒株的EID50
2、救获的重组病毒TCID50测定
从1∶10-2开始10倍稀释，把不同稀释度的重组病毒接毒于长满单层MDCK细胞的48孔板中，接毒的过程如下：先用PBS清洗MDCK细胞两遍，然后在每一孔加入100ul病毒，每个稀释度做3个重复，把48孔板放入37℃CO2培养箱让病毒吸附到细胞上，每隔20min摇晃一次培养板，1.5h-2h后把细胞培养板中的液体弃掉，用PBS清洗细胞两次，然后加入含有TPCK-Trypsin的无血清培养基300ul，细胞在CO2培养箱继续培养72h，然后测定每一个孔的血凝活性，利用Reed-Muench法计算TCID50(组织细胞半数感染量)。重组病毒TCID50测定结果如表3所示(其中，病毒稀释液体积为100ul)。
表3 重组病毒株的TCID50
3、救获的重组病毒在鸡胚上生长特性比较
将含有100EID50的重组病毒稀释液100ul接种9-11日龄的SPF鸡胚，在接毒后6h，12h，24h，36h，48h时，分别取出3枚，收集尿囊液并测定它们的血凝效价。不同亚型重组病毒在鸡胚上增殖后的血凝滴度呈现相似的结果，接毒后12小时以内接种病毒鸡胚的尿囊液均没有血凝性，24-48h，含突变病毒PR8-NS2-E67/74S的六个内部基因的重组病毒(HxNy-PR8-NS2-E67S/E74S，简称x-67/74)的血凝效价最高，其他重组病毒血凝效价由高到低依次是：含突变病毒PR8-NS2-E67S的六个内部基因的重组病毒(HxNy-PR8-NS2-E67S，简称x-67)，含PR8-NS2-E74S的六个内部基因的重组病毒(HxNy-PR8-NS2-E67S，简称x-74)，含PR8病毒六个内部基因的重组病毒(HxNy-PR8简称x-PR8)，含有PR8-NP-G132A的六个内部基因的重组病毒(HxNy-PR8-NP-G132A，简称x-132)，含有PR8-NP-G132A-NS2-E67S/E74S的六个内部基因的重组病毒(HxNy-PR8-NP-G132A-NS2-E67S/E74S简称x-132/67/74)。如图1所示，以H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2和H10N8亚型重组病毒，直观地展示了上述结果。
4、救获的重组病毒和PR8在MDCK细胞上生长特性的比较
将含有100TCID50的重组病毒稀释液200ul，接种T25细胞培养瓶中的MDCK细胞。在接毒后6h，12h，24h，36h，48h时，分别收集其细胞上清并测定血凝效价，比较重组病毒在MDCK细胞上的生长情况。不同亚型重组病毒在细胞上增殖后的血凝滴度呈现相似的结果，接毒后12h以内，重组病毒感染细胞上清均无血凝活性。在接毒后24h，36h和48h，含有PR8-NP-G132A的六个内部基因的重组病毒(x-132)血凝价最高，其他重组病毒血凝效价由高到低依次是：含有PR8-NP-G132A-NS2-E67S/E74S的六个内部基因的重组病毒(x-132/67/74)、含PR8病毒六个内部基因的重组病毒(x-PR8)、含突变病毒PR8-NS2-E67/74S的六个内部基因的重组病毒(x-67/74)、含突变病毒PR8-NS2-E67S的六个内部基因的重组病毒(x-67)和含PR8-NS2-E74S的六个内部基因的重组病毒(x-74)。如图2所示，以H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2和H10N8亚型重组病毒，直观地展示了上述结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所
<120>高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用
<160>27
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tggcggtcac aattaggtca 20
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ttgtgaccgc catttctcgt ttct 24
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
agttttcaga aataagatgg tt 22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tctgaaaact tctgacctaa tt 22
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aacggctgca ctgactcaca tgat 24
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tcagtgcagc cgttgcatcg tcacca 26
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cacacagctc ttcggccagc aaaagcaggg ta 32
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cacacagctc ttctattagt agaaacaagg gtattttt 38
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cacacagctc ttctattagc aaaagcaggg tg 32
<210>10
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cacacagctc ttcggccagt agaaacaagg gtgtttt 37
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
cacacagctc ttctattagc aaaagcagga gt 32
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cacacagctc ttcggccagt agaaacaagg agtttttt 38
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
cacacagctc ttctattagc aaaagcaggg g 31
<210>14
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
cacacagctc ttcggccagt agaaacaagg gtgtttt 37
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tagtcctctt ctctctcctt g 21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
caaggagaga gaagaggact a 21
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cgaaatccca ggcctatttg gt 22
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
accaaatagg cctgggattt cg 22
<210>19
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
agcaaaagca gg 12
<210>20
<211>366
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(199)..(201)
<400>20
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag 60
ttggagtcct catcggagga cttgaatgga atgataacac agttcgagtc tctgaaactc 120
tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg agaatgggag acctccactc actccaaaac 180
agaaacgaga aatggcggtc acaattaggt cagaagtttg aagaaataag atggttgatt 240
gaagaagtga gacacaaact gaagataaca gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg 300
caagccttac atctattgct tgaagtggag caagagataa gaactttctc gtttcagctt 360
atttag 366
<210>21
<211>366
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(220)..(222)
<400>21
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag 60
ttggagtcct catcggagga cttgaatgga atgataacac agttcgagtc tctgaaactc 120
tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg agaatgggag acctccactc actccaaaac 180
agaaacgaga aatggcggga acaattaggt cagaagtttt cagaaataag atggttgatt 240
gaagaagtga gacacaaact gaagataaca gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg 300
caagccttac atctattgct tgaagtggag caagagataa gaactttctc gtttcagctt 360
atttag 366
<210>22
<211>366
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(199)..(201)
<220>
<221>mutation
<222>(220)..(222)
<400>22
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag 60
ttggagtcct catcggagga cttgaatgga atgataacac agttcgagtc tctgaaactc 120
tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg agaatgggag acctccactc actccaaaac 180
agaaacgaga aatggcggtc acaattaggt cagaagtttt cagaaataag atggttgatt 240
gaagaagtga gacacaaact gaagataaca gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg 300
caagccttac atctattgct tgaagtggag caagagataa gaactttctc gtttcagctt 360
atttag 366
<210>23
<211>1565
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(874)..(876)
<400>23
agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca aaatcatggc gtcccaaggc 60
accaaacggt cttacgaaca gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc 120
agagcatccg tcggaaaaat gattggtgga attggacgat tctacatcca aatgtgcaca 180
gaacttaaac tcagtgatta tgagggacgg ttgatccaaa acagcttaac aatagagaga 240
atggtgctct ctgcttttga cgaaaggaga aataaatacc tggaagaaca tcccagtgcg 300
gggaaggatc ctaagaaaac tggaggacct atatacagaa gagtaaacgg aaagtggatg 360
agagaactca tcctttatga caaagaagaa ataaggcgaa tctggcgcca agctaataat 420
ggtgacgatg caacggctgg tctgactcac atgatgatct ggcattccaa tttgaatgat 480
gcaacttatc agaggacaag ggctcttgtt cgcaccggaa tggatcccag gatgtgctct 540
ctgatgcaag gttcaactct ccctaggagg tctggagccg caggtgctgc agtcaaagga 600
gttggaacaa tggtgatgga attggtcagg atgatcaaac gtgggatcaa tgatcggaac 660
ttctggaggg gtgagaatgg acgaaaaaca agaattgctt atgaaagaat gtgcaacatt 720
ctcaaaggga aatttcaaac tgctgcacaa aaagcaatga tggatcaagt gagagagagc 780
cgggacccag ggaatgctga gttcgaagat ctcacttttc tagcacggtc tgcactcata 840
ttgagagggt cggttgctca caagtcctgc ctggcagcct gtgtgtatgg acctgccgta 900
gccagtgggt acgactttga aagagaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga 960
ctgcttcaaa acagccaagt gtacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag 1020
agtcaactgg tgtggatggc atgccattct gccgcatttg aagatctaag agtattgagc 1080
ttcatcaaag ggacgaaggt ggtcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt 1140
gcttccaatg aaaatatgga gactatggaa tcaagtacac ttgaactgag aagcaggtac 1200
tgggccataa ggaccagaag tggaggaaac accaatcaac agagggcatc tgcgggccaa 1260
atcagcatac aacctacgtt ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag aacaaccgtt 1320
atggcagcat tcactgggaa tacagagggg agaacatctg acatgaggac cgaaatcata 1380
aggatgatgg aaagtgcaag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440
ctctcggacg aaaaggcagc gagcccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500
tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tacgacaatt aaagaaaaat acccttgttt 1560
ctact 1565
<210>24
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(67)..(67)
<400>24
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Leu Arg Met
1 5 10 15
Ser Lys Met Gln Leu Glu Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile
20 25 30
Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Glu Lys
50 55 60
Trp Arg Ser Gln Leu Gly Gln Lys Phe Glu Glu Ile Arg Trp Leu Ile
65 70 75 80
Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln
85 90 95
Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu
100 105 110
Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile
115 120
<210>25
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(74)..(74)
<400>25
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Leu Arg Met
1 5 10 15
Ser Lys Met Gln Leu Glu Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile
20 25 30
Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Glu Lys
50 55 60
Trp Arg Glu Gln Leu Gly Gln Lys Phe Ser Glu Ile Arg Trp Leu Ile
65 70 75 80
Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln
85 90 95
Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu
100 105 110
Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile
115 120
<210>26
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(67)..(67)
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(74)..(74)
<400>26
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Leu Arg Met
1 5 10 15
Ser Lys Met Gln Leu Glu Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile
20 25 30
Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Glu Lys
50 55 60
Trp Arg Ser Gln Leu Gly Gln Lys Phe Ser Glu Ile Arg Trp Leu Ile
65 70 75 80
Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln
85 90 95
Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu
100 105 110
Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile
115 120
<210>27
<211>498
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(277)..(277)
<400>27
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
20 25 30
Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asp Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu
245 250 255
Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Ala Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Val
340 345 350
Val Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Val Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
420 425 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
Asp Asn
Claims (10)
1.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H1亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
2.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H3亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
3.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H4亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
4.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H5亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
5.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
6.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H7亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
7.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H9亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
8.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H10亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
9.一种制备权利要求1-8任一项所述的PR8重组病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)、构建重组质粒：
A、分别获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段；
所述分别获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段的制备为：
以含有PR8病毒NP基因的重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：7和SEQ ID.NO：6以及引物SEQ ID.NO：5和SEQ ID.NO：8在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：7和SEQ ID.NO：8为引物，进行第二次PCR扩增融合，获得点突变G132A的PR8病毒NP基因片段；
以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：2以及引物SEQ ID.NO：1和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及SEQ ID.NO：3和引物SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以上述的编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及引物SEQ ID.NO：3和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码同时含有E74S和E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
B、获得H1、H3、H4、H5，H6、H7、H9、H10亚型流感病毒的HA和NA基因；
获得H1、H3、H4、H5、H6、H9、H10亚型流感病毒的HA和NA基因的方法为：
分别抽提H1、H3、H4、H5、H6、H9和H10亚型流感病毒的总RNA；
分别以总RNA为模板，反转录合成H1、H3、H4、H5、H6、H9、H10亚型流感病毒的cDNA；
以获得的cDNA为模板，分别用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14以及SEQ ID.NO：11和SEQ ID.NO：12为上下游引物，分别扩增出H1、H3、H4、H6、H9、H10亚型流感病毒的HA基因和H1、H3、H4、H5、H6、H9、H10亚型流感病毒的NA基因；
以H5亚型流感病毒的cDNA为模板，用突变H5HA碱性裂解位点的引物SEQ ID.NO：15和SEQ ID.NO：13、及引物SEQ ID.NO：16和SEQ ID.NO：14分别扩增，再用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14引物进行PCR融合扩增，获得含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的H5亚型流感病毒的HA基因；
所述H7亚型流感病毒的NA基因的制备为：人工合成H7亚型流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的HA基因，并用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14和SEQ ID.NO：11和SEQ ID.NO：12为上下游引物，分别进行扩增，分别扩增出H7亚型流感病毒的HA基因和NA基因。
C、制备重组质粒：分别将获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段和上述获得的HA和NA基因经过酶切、连接及转化，获得相应的重组质粒；所述重组质粒为以下中的一种以上：PBD-(H1)HA、PBD-(H1)NA；PBD-(H3)HA、PBD-(H3)NA；PBD-(H4)HA、PBD-(H4)NA；PBD-(H5)HA、PBD-(H5)NA；PBD-(H6)HA、PBD-(H6)NA；PBD-(H7)HA、PBD-(H7)NA；PBD-(H9)HA、PBD-(H9)NA；PBD-(H10)HA、PBD-(H10)NA；PBD-PR8NS-NS2E67/74S、PBD-PR8NS-NS2E67S、PBD-PR8NS-NS2E74S、PBD-PR8NP-G132A、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、PBD-PR8PA、PBD-PR8NP、PBD-PR8M、PBD PR8NS；
(二)、制备重组突变病毒：将上述获得的重组质粒按照相应组合，转染于293T细胞；转染后的细胞上清用TPCK-Trypsin处理后，接种SPF鸡胚，孵化；收获鸡胚尿囊液，获得如权利要求1-8任一所述的重组PR8突变病毒。
10.权利要求1-8任一所述的PR8突变重组流感病毒在制备流感疫苗中的应用。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110266082A CN102304495A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| US14/343,605 US20140227310A1 (en) | 2011-09-08 | 2012-09-04 | Recombinant influenza virus highly expressing ha protein and preparation method and use thereof |
| CA2848117A CA2848117A1 (en) | 2011-09-08 | 2012-09-04 | Recombinant influenza virus highly expressing ha protein and preparation method and use thereof |
| AU2012306866A AU2012306866A1 (en) | 2011-09-08 | 2012-09-04 | Recombinant influenza virus highly expressing HA protein and preparation method and use thereof |
| PCT/CN2012/080965 WO2013034069A1 (zh) | 2011-09-08 | 2012-09-04 | 高效表达 ha 蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110266082A CN102304495A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
Related Child Applications (7)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012103507841A Division CN102864130A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| CN2012103495011A Division CN102876638A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| CN2012103507358A Division CN102851258A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| CN2012103495187A Division CN102839160A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| CN2012103507019A Division CN102864127A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| CN2012103507625A Division CN102864129A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| CN2012103507254A Division CN102864128A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102304495A true CN102304495A (zh) | 2012-01-04 |
Family
ID=45378413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110266082A Pending CN102304495A (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20140227310A1 (zh) |
| CN (1) | CN102304495A (zh) |
| AU (1) | AU2012306866A1 (zh) |
| CA (1) | CA2848117A1 (zh) |
| WO (1) | WO2013034069A1 (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013034069A1 (zh) * | 2011-09-08 | 2013-03-14 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 高效表达 ha 蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| CN104592367A (zh) * | 2014-12-24 | 2015-05-06 | 中国科学院微生物研究所 | 流感病毒np蛋白突变体及其编码基因与应用 |
| WO2016134678A1 (zh) * | 2015-02-28 | 2016-09-01 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 新的甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用 |
| CN106381290A (zh) * | 2015-08-06 | 2017-02-08 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 重组欧洲禽源h1n1亚型猪流感疫苗株及其制备方法和应用 |
| CN111647610A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-09-11 | 扬州大学 | 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2493912B1 (en) | 2009-10-26 | 2020-07-29 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells |
| US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
| WO2015009743A1 (en) | 2013-07-15 | 2015-01-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in mdck or vero cells or eggs |
| WO2015196150A2 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
| CN104693291A (zh) * | 2015-02-16 | 2015-06-10 | 武汉思齐源生物科技有限公司 | 一种h7亚单位抗原在动物模型评价中的应用 |
| US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
| US9890363B2 (en) | 2015-07-06 | 2018-02-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
| GB201602535D0 (en) * | 2016-02-12 | 2016-03-30 | Univ Edinburgh | Improved flu vaccine yield |
| EP3417056A1 (en) | 2016-02-19 | 2018-12-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) | Improved influenza b virus replication for vaccine development |
| US11197926B2 (en) | 2017-10-25 | 2021-12-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs |
| EP3840780A1 (en) | 2018-08-20 | 2021-06-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Vectors for eliciting immune responses to non-dominant epitopes in the hemagglutinin (ha) protein |
| US11241492B2 (en) | 2019-01-23 | 2022-02-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to genes in influenza viruses |
| WO2020163804A1 (en) | 2019-02-08 | 2020-08-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Humanized cell line |
| CN114929269A (zh) | 2019-05-01 | 2022-08-19 | 威斯康星校友研究基金会(Warf) | 用于疫苗开发的改进的流感病毒复制 |
| WO2021041624A2 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Yoshihiro Kawaoka | Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1970081A (zh) * | 2006-11-09 | 2007-05-30 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 禽流感病毒标记疫苗及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2879182C (en) * | 2004-05-25 | 2017-02-14 | Medimmune, Inc. | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
| CN101053658A (zh) * | 2006-04-12 | 2007-10-17 | 金宁一 | H3、h9亚型流感复合多表位二价核酸疫苗 |
| CN101643721B (zh) * | 2009-08-17 | 2011-05-25 | 诺华生物科技（武汉）有限责任公司 | 广谱安全型动物用抗甲型流感病毒疫苗 |
| CN101732711A (zh) * | 2009-12-31 | 2010-06-16 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备及其应用 |
| CN102304495A (zh) * | 2011-09-08 | 2012-01-04 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
-
2011
- 2011-09-08 CN CN201110266082A patent/CN102304495A/zh active Pending
-
2012
- 2012-09-04 WO PCT/CN2012/080965 patent/WO2013034069A1/zh active Application Filing
- 2012-09-04 AU AU2012306866A patent/AU2012306866A1/en not_active Abandoned
- 2012-09-04 CA CA2848117A patent/CA2848117A1/en not_active Abandoned
- 2012-09-04 US US14/343,605 patent/US20140227310A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1970081A (zh) * | 2006-11-09 | 2007-05-30 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 禽流感病毒标记疫苗及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 20101215 王朝霞 PR8流感突变株的制备及其生长特性的研究 第25页 1-10 , 第12期 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013034069A1 (zh) * | 2011-09-08 | 2013-03-14 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 高效表达 ha 蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 |
| CN104592367A (zh) * | 2014-12-24 | 2015-05-06 | 中国科学院微生物研究所 | 流感病毒np蛋白突变体及其编码基因与应用 |
| CN104592367B (zh) * | 2014-12-24 | 2019-01-18 | 中国科学院微生物研究所 | 流感病毒np蛋白突变体及其编码基因与应用 |
| WO2016134678A1 (zh) * | 2015-02-28 | 2016-09-01 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 新的甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用 |
| CN105985413A (zh) * | 2015-02-28 | 2016-10-05 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 新的甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用 |
| CN106381290A (zh) * | 2015-08-06 | 2017-02-08 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 重组欧洲禽源h1n1亚型猪流感疫苗株及其制备方法和应用 |
| CN106381290B (zh) * | 2015-08-06 | 2019-09-03 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 重组欧洲禽源h1n1亚型猪流感疫苗株及其制备方法和应用 |
| CN111647610A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-09-11 | 扬州大学 | 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用 |
| CN111647610B (zh) * | 2020-06-02 | 2021-09-03 | 扬州大学 | 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2013034069A1 (zh) | 2013-03-14 |
| CA2848117A1 (en) | 2013-03-14 |
| AU2012306866A1 (en) | 2014-04-10 |
| US20140227310A1 (en) | 2014-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102304495A (zh) | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 | |
| CA3014435C (en) | Improved influenza b virus replication for vaccine development | |
| O’Donnell et al. | The contribution of animal models to the understanding of the host range and virulence of influenza A viruses | |
| JP5438065B2 (ja) | 突然変異した膜タンパク質をコードするウイルス | |
| CN107949636B (zh) | 活减毒病毒以及生产和使用方法 | |
| AU2014290203A2 (en) | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in MDCK or vero cells or eggs | |
| WO2020223699A1 (en) | Improved influenza virus replication for vaccine development | |
| WO2016134678A1 (zh) | 新的甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用 | |
| US20220160863A1 (en) | High growth influenza virus | |
| WO2013030176A2 (en) | Live attenuated influenza virus | |
| US20240238403A1 (en) | Influenza virus replication for vaccine development | |
| Demirden et al. | Influenza vaccine: an engineering vision from virological importance to production | |
| Choi et al. | Development of a dual-protective live attenuated vaccine against H5N1 and H9N2 avian influenza viruses by modifying the NS1 gene | |
| CN101624580A (zh) | 一种表达人工修饰合成的甲型h1n1流感病毒ha-na-m1基因的重组杆状病毒 | |
| Wang et al. | Enhanced cross-lineage protection induced by recombinant H9N2 avian influenza virus inactivated vaccine | |
| CA2652595C (en) | Defective interfering virus | |
| CN102864127A (zh) | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 | |
| CN102864128A (zh) | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 | |
| CN102864130A (zh) | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 | |
| CN102864129A (zh) | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 | |
| CN102839160A (zh) | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 | |
| CN102876638A (zh) | 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用 | |
| GB2437799A (en) | Defective interfering (DI) virus | |
| Ran | Development of a chimeric bat influenza A virus as a live vaccine | |
| KR101855006B1 (ko) | 생산능이 향상된 재조합 조류 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120104 |