CN102304180A

CN102304180A - 禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的单克隆抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN102304180A
Application number: CN201110284909A
Authority: CN
Inventors: 成子强; 王峰; 张利; 王桂花; 王玥; 于琳琳; 姜艳萍; 王晓伟; 陈洪博
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2012-01-04

Abstract

本发明属于分子免疫学和病毒学交叉技术领域，具体选取了禽网状内皮组织增生症病毒（REV）env基因相对保守区域共1200bp的基因片段，该片段表达的400个氨基酸包涵了REV病毒90%以上的抗原位点，这样既保留了病毒绝大部分的抗原位点又排除了因基因变异带来的干扰，利用含有该保守基因片段的env基因获得原核表达产物His-env融合蛋白，免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到REVENV蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体为禽网状内皮组织增生症的诊断预防及科学研究提供技术支撑。

Description

禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及分子免疫学和病毒学交叉技术领域，具体涉及一种由杂交瘤细胞分泌的禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白（ENV）保守序列的单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

禽网状内皮组织增生症（RE）是由禽网状内皮组织增生症病毒(REV) 引起的以网状细胞增生为主要特征的一组综合症(Witter R. L,1997)，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病，可引发为严重的生长抑制和免疫抑制。继禽马立克氏病和禽白血病之后，RE是迄今己经确定的禽类第三种传染性肿瘤病。

除已知火鸡、鸡、鸭、鹅、日本鹌鹑等家禽可感染不同的REV毒株外，还从野鸭、野火鸡以及野生鸟类中分离到该病毒。研究显示，目前，我国商品化鸡群REV抗体阳性率普遍偏高，有的地区更是高达80%。净化鸡群，减少REV对禽类生产的危害任重道远。

1、REV病毒的囊膜蛋白

REV基因组编码gag、pol和env三个结构蛋白。其中env基因编码的囊膜蛋白（ENV）包涵了REV病毒99%以上的抗原位点。世界各地学者对REV 研究发现，其env基因为该病毒的高变区域，极易发生突变。基于env表面蛋白基因gp90制备的单抗不能排除REV突变的影响，很大程度上影响了RE疾病的诊断精准率。以env基因中保守区域制备单抗，既保留了病毒绝大部分的抗原位点又排除了因基因变异带来的干扰，将有效的提高REV诊断的精准率。

2、禽网状内皮组织增生症的诊断方法研究现状

目前对禽网状内皮组织增生症的诊断，可通过临床剖检和组织病理学检查初步诊断，进一步确诊需要通过PCR、免疫组织化学、间接免疫荧光和ELISA等方法。PCR技术容易受到很多因素干扰，并可能出现假阳性和假阴性结果；目前我们使用的ELISA单克隆抗体试剂盒产于国外，价格昂贵，检测成本高，不利于大规模的鸡群检测和净化。免疫组织化学和间接免疫荧光方法检测REV、制备国产化抗体检测试剂盒均需要高特异性的单克隆抗体。研制出廉价高效且具有代表性的单克隆抗体，对净化集群，减少REV对养禽业带来的损失势在必行。

发明内容

针对于env基因编码的囊膜蛋白因基因突变带来的各种不便，本发明选取了env基因的相对保守区域共1200bp的基因片段，该片段表达的400个氨基酸包涵了REV病毒90%以上的抗原位点，这样既保留了病毒绝大部分的抗原位点又排除了因基因变异带来的干扰，利用含有该保守基因片段的env基因获得原核表达产物His-env融合蛋白，免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到REV ENV蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可有效地防止因REV突变对诊断效果的影响，为禽网状内皮组织增生症的诊断、预防提供科学基础和技术支撑。

本发明提供的由杂交瘤细胞分泌的REV囊膜蛋白的单克隆抗体；是通过如下具体步骤获得的：

根据REV标准毒株SNV株的前病毒基因组DNA env基因两端的一段序列作为引物。上游引物为5’-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3’ 其基因序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物为5’-CGACTCGA- GAACAATATGAGCCCAAACA- 3’ 其基因序列如SEQ ID NO.3所示，并在引物中分别添加了EcoR I和Xhol I酶切位点。PCR扩增，DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，利用pET-28a获得重组载体pET-28a-env重组质粒，将该重组质粒按常规方法转化入CaCl₂法制备的感受态细胞BL21，酶切法鉴定阳性克隆，阳性克隆送往测序公司测序，最终获得的env基因其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

将上述含有重组质粒的BL21菌接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基培养，使用0.4mmol/L IPTG诱导表达出了带有HIS标签的融合蛋白His-env，得到以包涵体形式表达His-env蛋白。通过透析得到的上清即为纯化完成的His-env融合蛋白。使用SDS-PAGE法检测纯化后的蛋白，其分子量为45KD。得到的蛋白经过Bradford 法测定蛋白含量，稀释到0.5mg/ml分装-20℃保存备用。

将上述获得的纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，通过生物免疫学技术，筛选和克隆得到能分泌禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，发明人将该杂交瘤细胞进行生物保藏，保藏号为CGMCC NO 5019，保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏时间为2011年7月18日。

由上述杂交瘤细胞分泌的REV 囊膜蛋白（ENV）的单克隆抗体（以下简称单抗1），可与REV的囊膜蛋白受体特异性结合；

长势良好的该杂交瘤细胞在其培养液中常规培养2-3天，培养液由橘红色变为黄色，这就表明该培养液中含有该杂交瘤细胞株分泌出的单克隆抗体，即单抗1；经间接免疫荧光方法检测，该单抗1与接种REV的DF-1细胞特异性的结合，在荧光显微镜下观察，细胞膜及细胞浆呈现明亮的荧光信号，细胞内的细胞核区域无荧光；经酶联免疫吸附方法检测，酶标仪测OD值：单抗1与纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白可发生特异性结合，其OD值与阴性对照的OD值得比值不小于2；通过转印免疫印迹方法检测单抗1，结果发现单抗1能与目的蛋白特异性的结合，并确定表达蛋白的分子量。基于上述的理由，本发明所获得的单克隆抗体为检测、预防禽网状内皮组织增生症奠定了基础。

在筛选杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体时，为了获得抗REV ENV蛋白的单克隆抗体，可采用下述三种方法：

1. 将纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白与该单抗1在体外结合，采用酶联免疫吸附方法筛选抗REVHis-env的单克隆抗体，筛选时发生了特异性结合的OD值与阴性对照的OD值比值不小于2；

2. 将纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白与该单抗1在体外结合，采用转印免疫印迹方法确定与抗体发生结合反应的蛋白分子量，在45KD处出现一条特异性的蛋白条带，与预计的蛋白分子量相符，筛选获得抗REV His-env的单克隆抗体。

3. 将REV SNV标准株接种DF-1细胞，使该单抗1与病毒结合，采用间接免疫荧光筛选抗REV His-env的单克隆抗体，筛选时与接种REV SNV的特异性结合的，在荧光显微镜下观察，细胞膜呈现明亮的荧光信号，细胞内的细胞核区域无荧光。

通过上述方法筛选出的单克隆抗体，具有如下的优点：

1 虽然国外特异性检测REV抗体的单克隆抗体检测试剂盒已经商品化，但由于昂贵，很难大范围使用。REV嚢膜蛋白（ENV）包涵了REV病毒99%以上的抗原位点，是作为检测REV抗体的首选抗原。但是经世界各地学者研究发现，env基因属于该病毒的高变区域，极易发生突变。因此经过比对REV病毒多个毒株，本发明选取了env基因的相对保守区域共1200bp的基因片段，该片段表达的400个氨基酸包涵了REV病毒90%以上的抗原位点，这样既保留了病毒绝大部分的抗原为点又排除了因基因变异带来的干扰。

2 本发明适用于大规模批量生产，经过进一步的研究会根据该单克隆抗体开发出针对REV的治疗药物和疫苗，一旦得到有利推广，可针对禽白血病广泛性的开展研究、预防、治疗等工作。总之，本发明所提供的REV囊膜蛋白的单克隆抗体在今后的科技和生产中具有很大的开发潜力。

发明人对本发明所制备的杂交瘤进行了生物保藏，具体保藏信息如下：

保藏信息

保藏时间：2011年7月18日

保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心 CGMCC

保藏编号：CGMCC NO 5019

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名: 杂交瘤细胞。

附图说明

图1为 PCR法扩增REV His-env基因电泳图，

图中M为 DL5000 marker，1为DF1细胞感染REV，2为正常DF1细胞；

图2 为pET-28a-env重组质粒酶切鉴定电泳图，

1为使用EcoRⅠ和XholⅠ酶切pET-28a-env，2为使用EcoRⅠ和XholⅠ酶切pFastHTb空质粒，M为1kb DNA Ladder；

图3为 pET-28a-env重组质粒表达的融合蛋白SDS-PAGE电泳图，

M为 Protein marker（KD）；2为pET-28a-env/BL21破碎产物沉淀; 3和4均为pET-28a- env/BL21破碎产物上清; 5为pET-28a-env/BL21全菌体；

图4为 His-env蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图，

M为Protein marker (KD); 1为His-env融合蛋白纯化产物；

图5 为间接免疫荧光检测法检测单克隆抗体(200倍)检测结果图，

A为Positive control; B为 Negative control; C和D均为单抗1。

图6为 Western blot法检测单抗1硝酸纤维素膜杂交图，

M. Protein Marker (KD); 1和2均为单抗1。

具体实施方式：

（1）主要试剂

PEG-1500, HT, HAT为Sigma公司产品；

弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂购自北京美科美生物有限公司；

DMEM高糖培养基为Invitrogen公司产品；

胎牛血清为Hyclone公司产品；

HRP酶标二抗，FITC标记荧光二抗为博奥森生物有限公司产品；

TMB单组份底物显色溶液，DAB显色试剂盒为天根公司产品；

Taq聚合酶，限制性内切酶Ecol I、Xhol I、BamH I、Pst I 、T4 连接酶、dNTP、DNA Marker为大连宝生物有限公司产品；

PCR产物纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；

蛋白预染Marker为北京全式金生物技术有限公司产品；

胰蛋白胨（Tryptone）及酵母抽提物（Yeast Extract）为Oxiod公司产品；

蛇皮透析袋（SnakeSkin Pleated）为Thermo公司产品；

其余试剂为国产分析纯试剂。

（2）主要仪器

细胞培养箱为Healforce公司产品；

PCR仪、分光光度计为Eppendorf公司产品；

低温高速离心机为湖北湘仪公司产品；荧光倒置显微镜为Nikon公司产品；

凝胶成像系统为北京君意公司产品；

酶标仪为Thermo公司产品；

恒温摇床为上海申能博彩公司产品；

恒温培养箱、超净工作台为上海博迅公司产品；

电泳仪、SDS-PAGE电泳槽、Western-blot膜转印装置为北京六一公司产品；

细胞超声波粉碎机为宁波新芝生物有限公司产品。

实施例1 REV env基因的克隆及测序

根据REV标准毒株SNV株前病毒基因组DNA env基因两端的一段序列作为引物。上游引物为5’-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3’ 其基因序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物为5’-CGACTCGA- GAACAATATGAGCCCAAACA- 3’ 其基因序列如SEQ ID NO.3所示，并在引物中分别添加了EcoR I和Xhol I酶切位点。PCR反应条件为：95℃ 5min，充分变性后进入循环体系：95℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 2 min，共30个循环；然后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，使用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。

将pET-28a载体与PCR纯化产物分别用限制性内切酶EcoR I、Xhol I双酶切6h，按照胶回收试剂盒说明分别回收大片段，于16℃下连接过夜。连接体系为：pET-28a载体 1μL，双蒸水3μL，纯化的DNA目的片段4μL，T4连接酶1μL ，10×buffer 1μL，总体积为10μL。

转化产物按常规方法转化入CaCl₂法制备的感受态细胞BL21，酶切法鉴定阳性克隆，结果如图2所示，出现两条条带的为阳性克隆，阳性克隆送往测序公司测序，最终获得的env基因其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

所采用的EcoR I和Xhol I酶切法均为现有技术。

实施例2 His-env蛋白的表达和纯化

将含有重组质粒的BL21菌接种于含卡钠霉素的LB固体培养基，37℃培养过挑取单菌落接种于含Kan(终浓度为30μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡(200rpm)，培养至0D600=0.6，加入IPTG至终浓度为 0.4mmol/L，37℃继续培养3h，同时设未诱导的重组质粒转化BL21菌作为对照。

经SDS-PAGE分析显示，目的蛋白His-env以包涵体形式表达，检测步骤如下：

收集培养的工程菌菌液，5000rpm，离心5min，弃上清；称取30g收集到的湿菌于500ml烧杯中，加入300ml的重悬液，加入转子在磁力搅拌器上搅拌20min，使菌体分散均匀；将上述烧杯置于冰浴，用超声破菌仪超声破菌，120W，工作4s,间歇4s，超声1h左右，用枪头吹吸菌液，待菌体不再黏着时，第一次超声破菌结束；将超声破菌液转入500ml离心管中，配平，放入高速冷却离心机中，12000rpm，4℃，离心20min；取沉淀，加入200ml的重悬液，用上述方法进行第二次超声粉碎，离心，超声粉碎2～4次后，去沉淀，处理后用SDS-PAGE电泳检测，其结果如图3所示，在45KD处出现明显的蛋白条带。

His-env蛋白的纯化步骤如下：

将上述沉淀用9倍体积的洗涤液I 重悬沉淀，静置5min后，12000rpm，15min弃上清。用9倍体积的洗涤液II重悬沉淀，静置5min后，12000rpm，15min，弃上清，保留粘稠上清。用9倍体积的洗涤液III重悬沉淀，静置5min后，12000rpm，15min，弃上清，保留粘稠上清。按100ml菌液加4ml溶解液，剧烈震荡1h。12000rpm，离心15min。取上清，即为溶解的包涵体。

包涵体纯化所述试剂配制方法：

（1）细菌重悬液(250ml):PBS(NaCl 2g, KCl 0.05g, Na₂HP0₄ 0.36g KH₂PO4 0.06g),1 mm/L EDTA.

（3）洗涤液I（250ml）：500mmol/L Tris-Cl（PH=8.0），100mmol/L NaCl， 100mmol/L EDTA

（3）洗涤液II（250ml）：洗涤液I，2M尿素

（4）洗涤液III（250ml）：洗涤液I，4M尿素

（5）包涵体溶解液（250ml）：洗涤液I，8M尿素

将上述溶解的包涵体装入透析袋中，依次使用20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 4M尿素透析2h，20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 2M尿素透析2h， 20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 4M尿素透析1h， 20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 0.5M尿素透析2h, 20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0），透析6h，12000rpm离心2min 弃掉沉淀，得到的上清极为纯化完成的His-env融合蛋白。使用SDS-PAGE法检测纯化后的蛋白，结果如图4所示，纯化后应不含其它杂带。

得到的蛋白经过Bradford 法测定蛋白含量，稀释到0.5mg/ml分装-20℃保存备用。

其中所采用的SDS-PAGE操作步骤如下：

1）将玻璃板洗干净，用夹子固定，垂直放置，配置12%分离胶，快速注入到两玻璃板之间，胶上部加 1mL蒸馏水封口，保持胶平整。待分离胶凝固后（约40min），倒去分离胶表面的液体，用滤纸吸去残留水。注入浓缩胶，快速插入梳子，并注意防止气泡的产生。等待其凝固。

2）取纯化后的His-env蛋白100μl等量2×SDS上样buffer，煮沸5-10min。

3）往电泳槽加入1×Tris-甘氨酸缓冲液，待浓缩胶凝固后（约30min），小心拔掉梳子，用缓冲液冲洗加样孔，用微量进样器上样，10μl/孔，正确连接电泳槽正负极，打开电源。先用80V电压电泳，待样品浓缩成一条线并进入分离胶后，提高电压至150V，电泳至溴酚蓝到达胶的底部时停止电泳。

4）染色：取下凝胶，用蒸馏水冲洗，放入考染溶液中，染色4h以上。

5) 脱色：将凝胶放入脱色液中，置于摇床上脱色，期间更换3次以上脱色液，待凝胶蓝色背景全部脱去停止，将凝胶放入蒸馏水中终止脱色。拍照保存。

使用上述纯化得到的His-env融合蛋白包被ELISA板，使用酶联免疫吸附试验检测该蛋白的生物学活性。以IDEXX公司生产的REV抗体检测试剂盒检测为阳性的鸡血清为阳性对照，健康SPF鸡血清为阴性对照，HRP标记羊抗鼠IgG酶标二抗按说明书使用。结果显示阳性对照与阴性对照的OD值比值大于2，说明该蛋白有良好的生物学活性和抗原性。

ELISA具体步骤如下：

1）包被：取纯化的重组蛋白His-env，以碳酸盐缓冲液（每200ml碳酸盐缓冲液含Na2CO3 0.32g，NaHCO3 0.58g）稀释至最佳浓度，包被反应板，100μl/孔，4℃过夜。

2）洗涤：甩去酶标板中的包被液，用PBST（PBS，0.05%Tween-20）加满各孔，室温静置3min，弃去PBST，洗涤3次，3min/次，拍干。

3) 封闭：各孔加入稀释液（5% 脱脂乳），350μl/孔，置37℃培养箱孵育2h，洗涤3次，3min/次，拍干。

4) 加样：将待待检血清按梯度稀释后加入包被板，100μl/孔，同时设立阴阳性血清对照。置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。

5) 用封闭液将HRP羊抗鼠IgG酶标二抗按1:3000稀释，100μl/孔，置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。

6) 显色：使用TMB单组份显色试剂盒（TIANGEN公司产品）按100 μl/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H2SO4终止显色。

7) 用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD450值为N，阳性对照OD450值为P。若P/N>2.0判为阳性。

实施例3 动物免疫

以上述提纯的His-env融合蛋白免疫6周龄Balb/C雌性小鼠，每次每只的免疫剂量为40ug，免疫方法为腹腔注射，共免疫四次。

第一次免疫使用上述蛋白为抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，两周后进行二次免疫，免疫时将灭活抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，两周后进行三次免疫，免疫方法及剂量同二次免疫。三次免疫一周后,小鼠眼眶采血测其效价,监测血清抗体效价。三免两周后,选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原腹腔注射加强免疫一次，3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。

实施例4 细胞融合

融合前1～2d按照常规方法制备腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，将其密度调整为2-5×10⁵个/ml，按照100ul/孔铺入96孔板。将培养板放入37℃5%CO2培养箱中培养，备用。

融合用免疫小鼠眼球采血，制备血清备用。按照常规方法去得小鼠脾脏，取出脂肪组织后，用无抗无血清DMEM反复冲洗脾脏。使用10ml注射器内芯在200目细胞筛上轻轻研磨，用DMEM冲洗，使细胞充分分散，将细胞悬液转移至离心管中，800rpm离心10min，用适量的DMEM悬浮细胞，活细胞计数后备用。

用无抗无血清DMEM培养基将处于对数生长期的SP2/0吹下，加入融合管内;将免疫小鼠摘眼球处死，收集脾细胞悬液，加入融合管内；1000rpm离心10min后弃上清，将融合管置手掌上来回轻轻震动以使沉淀松散。45s内加入1 mL预热的浓度为50%的PEG1500，再于90s内先慢后快加入无抗无血清DMEM培养基30mL，37℃温育15min后800rpm离心10min，用60mLHAT培养基悬浮，滴加于提前铺入饲养细胞的96孔细胞培养板，置37℃，5-6%CO2的细胞培养箱中培养。5d后每个细胞培养孔补加原孔一半体积的新鲜配置的HAT培养基，然后每天观察SP2/0细胞和脾细胞对照孔，当SP2/0细胞和脾细胞全部死亡时，用新鲜配制的HT培养基全部置换出HAT培养基。逐日观察，待融合的杂交瘤细胞生长至孔底十分之一，且上清变黄时进行检测。

实施例5 阳性克隆的筛选与亚克隆

克隆的筛选主要采用如下3种方法：

（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）

使用纯化得到的His-env包被ELISA板，25ng/孔，以免疫小鼠血清为阳性对照，未免疫昆明小鼠血清为阴性对照。HRP标记羊抗鼠IgG酶标二抗按说明书使用。具体方法如下：

1）包被：取纯化的重组蛋白His-env，以碳酸盐缓冲液（每200ml碳酸盐缓冲液含Na₂CO₃ 0.32g，NaHCO₃ 0.58g）稀释至最佳浓度，包被反应板，100μl/孔，4℃过夜。

6) 显色：使用TMB单组份显色试剂盒（TIANGEN公司产品）按100 μl/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H₂SO₄终止显色。

7) 用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD₄₅₀值为N，阳性对照OD₄₅₀值为P。若P/N>2.0判为阳性。

（2）间接免疫荧光检测法（IFA）

使用DF-1细胞，铺入96孔细胞培养板，使用含10%胎牛血清的DMEM培养待细胞长成单层时接种REV SNV毒株，37℃作用2h后，更换含1%胎牛血清的DMEM，维持7天后做IFA检测，步骤如下：

倒出细胞培养液，用PBS洗3次每次3min；丙酮：乙醇（3:2）固定细胞7-8 min，用PBS洗3次，每次5min；以细胞培养上清为一抗按100μL/孔加入，37℃温箱抚育60 min，用PBS洗3次，每次5min；以FITC标记羊抗鼠IgG为二抗，37℃温箱60 min，用PBS洗3次，每次5min；每孔加入100μl 50%甘油；倒置荧光显微镜下观察，拍照，其结果如图5所示，阳性细胞膜及细胞浆应出现绿色荧光。

（3）Western-blot检测法

1）取1mL诱导表达的菌液，12000r/min，离心2min，弃上清，加100μl灭菌双蒸水，悬浮沉淀，加100μl 2x上样缓冲液，煮沸5-10min。取20μl/孔加样，进行SDS-PAGE电泳。

2）剪一张与凝胶大小相同的NC膜，用去离子水浸透，同时将与凝胶大小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透。

3）按三明治法安装转印装置，即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-正极夹，使NC膜位于转印的正极面，凝胶位于负极面，其间无任何气泡间隙。将转印装置放入转移电泳仪中，加入转移缓冲液，140mA电泳2h。

4）转印结束后，将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍，将NC膜浸泡于封闭液中，4℃封闭过夜。

5）用PBST洗涤NC膜三遍，每次10 min。

7）使用免疫小鼠阳性血清为一抗，NC膜与一抗37℃反应1h，用PBST洗膜三次，10 min/次。

8）NC膜置于过HRP标记的羊抗鼠IgG中，37℃反应1h，用PBST洗膜三次，10 min/次。

9）使用DAB显色试剂盒避光显色；此时应密切观察显色过程，并在较浅本底且达到适当显色强度时流水终止显色。在45KD处应出现特异的杂交带，拍照结果如图6所示，保存。

Claims

1.一种禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的单克隆抗体，其特征在于：是由保藏号为CGMCC NO 5019的杂交瘤产生的。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：该方法是纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的单克隆抗体，简称单抗1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的筛选方法为：

将纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白与该单抗1在体外结合，采用酶联免疫吸附方法筛选REV His-env的单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的筛选方法为：

将纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白与该单抗1在体外结合，采用转印免疫印迹方法确定与抗体发生结合反应的蛋白分子量，进一步筛选REV His-env的单克隆抗体。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的筛选方法为：

将REV SNV标准株病毒接种DF-1细胞，使该单抗1与病毒结合，采用间接免疫荧光筛选REV His-env的单克隆抗体。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白是通过如下方法获得的：将REV SNV标准株的env基因克隆入表达载体pET-28a质粒，得到了重组载体pET-28a-env重组质粒，使用0.4mmol/L IPTG诱导表达出了带有His标签的融合蛋白His-env，其分子量为45KD，之后采用SDS-PAGE法检测纯化。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的env基因其基因序列如SEQ ID NO.1所示。