CN102296113A - 单色多重定量pcr方法测量染色体端粒绝对长度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单色多重定量 PCR 方法测量染色体端粒绝对长度的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（ 1 ）设计并筛选染色体端粒的引物和用于扩增内参基因的单拷贝基因引物，要求端粒基因的引物和单拷贝基因引物的 Tm 值的差值在 10 ～ 20 ℃范围内；（ 2 ）以 SEQNo ： 1 的端粒序列和 SEQNo ： 2 的单拷贝基因为标准序列，通过外标法绘制标准曲线；（ 3 ）提取模板 DNA ，将模板 DNA 加入具有步骤（ 1 ）的引物的 PCR 反应体系中对模板 DNA 中目标基因进行 PCR 扩增；（ 4 ）以标准曲线为对照通过定量 PCR 方法测定染色体端粒绝对长度。该方法消除了加样误差，使结果更准确，突破了普通定量 PCR 只能测量端粒的相对长度的局限。

Description

单色多重定量PCR方法测量染色体端粒绝对长度的方法

技术领域

本发明属于基因测量技术领域，具体涉及一种单色多重定量PCR方法测量染色体端粒绝对长度的方法。

背景技术

端粒(tolemere)是染色体末端的DNA重复序列，在人的染色体中是(TTAGGG)的串联重复。端粒是染色体末端的一种特殊结构，在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。端粒的作用是保持染色体的完整性。细胞分裂一次，由于DNA复制时的方向必须从5′方向到3′方向，DNA每次复制端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致动脉硬化和某些癌症。近年来报道了多种端粒长度测量方法，包括DNA印迹法(Southern blot，SB)、杂交保护分析法(hybridization protection assay，HPA)、流式细胞计量-荧光原位杂交(Flow-FISH)、定量PCR。端粒结构的特殊性和复杂性对分析带来很大不便，特别是高度重复序列和各种空间结构使得测量的精度有所降低。

DNA印迹法除了提供染色体所有端粒长度外，还包括部分亚端粒区长度，所以这种方法虽然能够检测绝对长度，但是结果比端粒的实际长度偏长。这种方法不能进行大通量的检测，耗时耗力、需要大量DNA样品。总的来说，Southern blot是应用最广泛的方法，被称为金标准。流式细胞计量-荧光原位杂交(Flow-FISH)，这种技术相当复杂，且需要完整的细胞才能够分析端粒长度。定量PCR方法简便、快捷、大通量、灵敏度高、重复性好、用DNA量少等优点。但是不能绝对量。虽然有文章报道用PCR方法测量端粒的绝对长度但是精度只有0.67。由于现有技术中缺乏有效的端粒绝对长度测量方法，本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种单色多重定量PCR方法测量染色体端粒绝对长度的方法，解决了现有技术中测量染色体端粒绝对长度耗时耗力、需要大量DNA样品以及测量精度低等问题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种单色多重定量PCR方法测量染色体端粒绝对长度的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选染色体端粒的引物和用于扩增内参基因的单拷贝基因引物，要求端粒基因的引物和单拷贝基因引物的Tm值的差值在10～20℃范围内；

(2)以SEQ No：1的端粒序列和SEQ No：2的单拷贝基因为标准序列，通过外标法绘制标准曲线；

(3)提取模板DNA，将模板DNA加入具有步骤(1)的引物的PCR反应体系中对模板DNA中目标基因进行PCR扩增；

(4)以标准曲线为对照通过定量PCR方法测定染色体端粒绝对长度。

优选的，所述方法中端粒的引物具有SEQ No：3和SEQ No：4的正反向核苷酸序列。

优选的，所述方法中单拷贝基因引物具有SEQ No：5～10的正反向核苷酸序列。

优选的，所述方法中进行PCR扩增的PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液          终浓度1～10×；

dNTPs              0.1～0.5mM；

引物序列终浓度为   0.1～1μM；

模板DNA            0.1～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶       0.01～0.10U/μL；

MgCl₂              终浓度为1～3mM；

荧光染料           0.5～3×。

优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液          终浓度1～5×；

dNTPs              0.2～0.3mM；

引物序列终浓度为   0.5～1M；

模板DNA            0.5～1.0ng/μL；

TaqDNA聚合酶       0.02～0.06U/μL；

MgCl₂            终浓度为2～3mM；

荧光染料         0.5～2×。

优选的，所述荧光染料选自SYBR Green I；所述PCR缓冲液包括Tris-Cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

优选的，所述方法进行PCR扩增的条件包括：92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，45～55℃退火10～30s，1～5个循环；92～97℃变性10～30s，60～70℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s进行信号捕获，30～40个循环。

优选的，所述方法进行PCR扩增的条件包括：第一阶段：95℃预变性15分钟；第二阶段：94℃变性15秒，49℃退火15秒，共两个循环；第三阶段：94℃变性15秒，62℃退火10秒，74℃延伸15秒信号捕获；84℃退火10秒，88℃延伸15秒后再一次信号捕获，共32个循环。

优选的，所述多孔PCR板为96孔PCR板或384孔PCR板，标准序列放入标准样品孔用作标准曲线。

本发明旨在能够大通量高精度的测量端粒的绝对长度。

1.方法说明如下：

(1)提取基因组DNA。

(2)特异设计的两对引物：

端粒引物序列：

Telg：5’-ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3’；Tm：73.5℃

Te l c：5’-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA-3’；Tm：71℃

单拷贝基因引物(内参)：选用其中一对引物作为内参引物

Albu：5’-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGaaatgctgcacagaatccttg-3’；Tm：88.9℃

Albd：5’-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGgaaaagcatggtcgcctgtt-3’；Tm：90.5℃

36B4F：5’-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’；Tm：90.6℃。

36B4R：5’-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’；Tm：89.1℃

b-globin F：5’-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGcttcatccacgttcaccttg-3’；Tm：90℃

b-globin R：5’-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGgaggagaagtctgccgtt-3’Tm：90.6℃

(3)两个标准序列：

端粒标准序列：

Telomere standard：5’-(TTAGGG)14-3’

单拷贝基因标准序列：

Albminstandard：

5’-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGA

CCATGCTTTTCCGGCGGGACGGGCGCGGCGGGCCGGGC-3’

本发明将端粒扩增的引物和单基因扩增的引物能够在同一个反应管中反应而且互相之间又没有干扰，我们是利用两对引物Tm值得差异，在低温条件下只扩增端粒而不扩增单基因，在高温条件下只扩增单基因而不扩增端粒。提高单基因扩增的Tm值是通过在单拷贝基因引物5’端加上高GC的序列实现的。

本发明进行测量端粒的绝对长度是需要引入端粒和单拷贝基因的标准序列的。本发明通过引物的不完全匹配设计，引物对与端粒序列并不完全匹配但仍能以端粒为模板进行扩增，而且这种引物克服了引物二聚体的形成。

本发明对内参序列引物进行了设计，内参序列要求在染色体上只有一个拷贝，并且引物的5’端设计了高GC的序列，以增加引物的Tm值。本发明还涉及标准序列的应用，设计了已知长度和分子个数的两个标准序列，为计算端粒长度提供重要参数。

本发明进行定量PCR温度循环分两个阶段，高温阶段和低温阶段。

应用于端粒长度测量取得了很好的效果，与端粒测量的金标准(Southern Blot)方法相比，具有很强的一致性(R2＝0.869).本发明方法具有稳定、易操作、快速、高通量的特点，适用于商业化。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。

引物设计遵循以下原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15～30碱基之间。④G+C含量在40％～60％之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

引物设计的软件有Primer Premier 5，Beacon Designer 7。

本发明所用引物通过亚磷酰胺三酯法合成，亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。具体方法如下：1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引物。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

(1)与普通实时定量PCR相比，目的基因(端粒)与内参基因(单拷贝基因)的反应置于同一管中，消除了加样误差，使结果更准确。精确度为0.869。

(2)通过引入标准序列代替基因组做标准曲线，能够测量端粒的绝对长度，突破了普通定量PCR只能测量端粒的相对长度的局限。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明进行单色多重定量PCR方法测量染色体端粒绝对长度的方法流程图。

图2为获得的端粒标准曲线；

图3为获得的单拷贝基因标准曲线；

图4为方法灵敏度考察结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例

1、引物的设计、合成

引物设计是根据文献通过亚磷酰胺三酯法合成。

2、标准曲线的绘制

在一个标准样品反应孔中用梯度稀释的端粒和单拷贝基因的标准序列替代基因组DNA，为了弥补稀释的标准序列不足20ng要求，在标准反应孔中加入pBR322质粒DNA，以使标准样孔中有20ng的DNA。标准样品孔用来做标准曲线。以下分别进行说明：

端粒标准曲线：

将已知分子个数的合成的84聚体(TTAGGG)₁₄进行系列稀释，每一个标准的重复数按如下的方法计算：

标准序列的长度是84bp(TTAGGG重复14次)，分子量(MW)为26667.2。

单个标准序列分子的质量＝分子量MW/阿伏伽德罗常数＝2.6667×10⁴/6.02×10²³＝0.44×10^-19g。

每个反应中的最高浓度标准是60pg(60×10^-12g)。

因此，有60×10^-12/0.44×10^-19＝1.36×10⁹个分子。

在最高浓度标准反应中，端粒序列量计算如下：1.36×10⁹×84(聚体长度)＝1.18×10⁸kb

通过梯度稀释最高浓度标准获得1.18×10⁸/10～1.18×10⁸/10⁶的稀释样品系列(系列1和系列2为重复系列)。标准曲线通过对这些系列稀释样品进行qPCR分析作出。

质粒DNA(pBR322)需要添加到每一个反应中，为了维持每个反应管中有20ng的总DNA量。这条标准曲线用于测量每个基因组样品中端粒序列的长度。

单拷贝基因标准曲线的绘制：

单拷贝基因用于每个扩增样品的对照并确定每个样品中基因组拷贝数。单拷贝基因的选择对于结果的可靠性至关重要。拷贝数的任何变化都可能影响端粒绝对长度的测量。用白蛋白(albumin)、酸性核糖体磷酸蛋白(36B4)、球蛋白(b-globin)作为单拷贝基因。

本实施例以albumin为例做标准曲线：

每个反应的基因组拷贝数计算如下

合成的albumin寡聚体标准序列(CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCCGGCGGGACGGGCGCGGCGGGCCGGGC)长度是98bp，分子量是30610。

单个标准序列分子的质量＝3.061×10⁴/6.02×10²³＝0.508×10^-19g。

最高浓度标准定为每个反应200pg(200×10^-12g)。则每个反应中有200×10^-12/0.508×10^-19＝1.016×10⁹个标准序列。

因为在二倍体基因组中，有两个albumin拷贝，所以相当于一个反应中有5.08×10⁸个二倍体基因组。

标准曲线是通过qPCR检测系列稀释标准浓度样品(10^-1～10^-6稀释，系列1)获得。

质粒DNA(pBR322)添加到每一个标准样品中，为了维持每个反应管中有20ng的总DNA。此标准曲线用于测量每个样品中二倍体基因组的拷贝数。

3、组织DNA的提取：使用康为世纪的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒提取口腔细胞基因组DNA，具体如下：

样本采集：使用棉签在面颊内擦拭10次。(为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内请勿进食和饮水。)将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400μl裂解缓冲液。

DNA提取：使用康为世纪的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。

DNA纯化(若提取的DNA，0D值A260/A230：2.0-2.2；A260/A280：1.8-2.0，没有在标准范围内，则需要此步骤)：加入等体积的氯仿-异戊醇(25∶1)，向下翻转离心管5min以充分混匀，13000rpm离心10min小心吸出上清液至另一1.5ml离心管；加入1/10体积的醋酸钠(pH5.2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇匀，沉淀DNA13000rpm离心3min，轻轻倒去上清液，加入70％乙醇洗一次，13000rpm，离心3min，去上清液，倒置5-10min(倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸管吹打使DNA充分溶解。

4、PCR条件优化

在96孔板上加样，在一个实验样品反应孔中加入如下试剂(每一个样有三个重复)：

SYBR Green I采用100×SYBR Green I的规格。

将加样后的96孔板放入荧光定量PCR系统中，PCR循环条件：

第一阶段：95℃预变性15分钟；

第二阶段：94℃变性15秒，49℃退火15秒(共两个循环)；

第三阶段：94℃变性15秒，62℃退火10秒，74℃延伸15秒信号捕获；84℃退火10秒，88℃延伸15秒后再一次信号捕获(共32个循环)。

第三阶段的两次捕获信号是因为端粒在低温下能够扩增，而单拷贝基因在高温下可以扩增，两种序列的信号互不干扰。

5、数据处理：

荧光定量PCR系统自动生成两个标准曲线，如图2和图3所示，对于端粒的标准曲线横坐标是log[TL(kb)]，纵坐标是Ct值；对于单拷贝基因来说横坐标是log[alb(copies)]，纵坐标是Ct值。按照如下公式计算获得端粒的绝对长度：

整个二倍体基因组的端粒长度＝TL(kb)/alb(copies)；

单个端粒长度＝整个二倍体基因组长度/92(二倍体基因组有46条染色体，每条染色体有两个端粒)。

6、灵敏度实验和检测精度分析

将qPCR方法与测量端粒绝对长度的Terminal Restriction Fragmentanalysis(TRF)进行比较。如图4显示64个样品进行测量两者有很好的相关性。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种单色多重定量PCR方法测量染色体端粒绝对长度的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）设计并筛选染色体端粒的引物和用于扩增内参基因的单拷贝基因引物，要求端粒基因的引物和单拷贝基因引物的Tm值的差值在10～20℃范围内；

（2）以SEQ No：1的端粒序列和SEQ No：2的单拷贝基因为标准序列，通过外标法绘制标准曲线；

（3）提取模板DNA，将模板DNA加入具有步骤（1）的引物的PCR反应体系中对模板DNA中目标基因进行PCR扩增；

（4）以标准曲线为对照通过定量PCR方法测定染色体端粒绝对长度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中端粒的引物具有SEQ No：3和SEQ No：4的正反向核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中单拷贝基因引物具有SEQ No：5～10的正反向核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中进行PCR扩增的PCR反应体系包括PCR 缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液 终浓度为1～10×；dNTPs  0.1～0.5mM；引物序列    终浓度为0.1～1μM；模板DNA    0.1～1.5ng/μL；TaqDNA聚合酶   0.01～0.10U/μL；MgCl₂ 终浓度为1～3mM；荧光染料    0.5～3×。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液 终浓度1～5×；dNTPs 0.2～0.3mM；引物序列    终浓度为0.5～1M；模板DNA   0.5～1.0ng/μL；TaqDNA聚合酶     0.02～0.06U/μL；MgCl₂   终浓度为2～3mM；荧光染料    0.5～2×。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述荧光染料选自SYBR Green I；所述PCR缓冲液包括 Tris-Cl，氯化钾，硫酸铵， 氯化镁； -20℃下pH值在8.0-9.0间。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法进行PCR扩增的条件包括：92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，45～55℃退火10～30s，1～5个循环；92～97℃变性10～30s，60～70℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s进行信号捕获，30～40个循环。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法进行PCR扩增的条件包括：第一阶段：95℃预变性15分钟；第二阶段：94℃变性15秒，49℃退火15秒，共两个循环；第三阶段：94℃变性15秒，62℃退火10秒，74℃延伸15秒信号捕获；84℃ 退火10秒，88℃延伸15秒后再一次信号捕获，共32个循环。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述多孔PCR板为96孔PCR板或384孔PCR板，标准序列放入标准样品孔用作标准曲线。

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