CN102292433B - 通过低温保存来分离细胞类产品的方法 - Google Patents

Abstract

分离例如胰岛等细胞类产品的方法，可用于糖尿病研究和治疗移植。所述方法可包括：提供含有较不易受冷冻损害的所需细胞和较易受冷冻损害的非所需细胞的组织，或对组织进行预处理使之具有上述特性。所述方法可包括冷冻组织，粉碎组织，回温组织和将所需细胞与非所需细胞物质分离，获得细胞类产品。因此，所述方法提供了分离细胞类产品的无酶或少酶方法，与传统方法相比具有更高的一致、可靠性，更低的毒性。所述方法能够得到最佳量的细胞类产品，且所述产品保留了足够的功能完好性，从而可用作移植源。

Description

通过低温保存来分离细胞类产品的方法

相关申请信息

本申请不是临时申请。本申请要求基于美国临时申请61/121,957的全部权利，该临时申请的申请日为2008年12月12日。该临时申请的全部内容通过援引纳入本申请。

背景技术

现代医学中，细胞疗法、再生疗法和组织工程都涉及活细胞和组织的采集、扩增、修饰和再植等技术。一种重要的例子是分离的朗氏(Langerhans)胰岛细胞移植，用于治疗I型(胰岛素依赖型)糖尿病。采集供体细胞的过程需要有控制地将所需的治疗细胞与供体组织中不需要的其它细胞分离开来。

此前，分离胰岛的方法一直依赖于组织的粗切片段化，这无法将目标细胞与非所需细胞分离开来。现在，胰岛移植依赖于酶法消化，这一方法能够破坏组织的胞外基质，释放出其中包裹的胰岛，接受进一步的处理和纯化。被广泛采用的这一方法也有缺点，主要是由于难以控制消化过程来获取最佳的活细胞量。并且，这一方法比较严苛，甚至有一定毒性，不可避免地会损失部分有价值的细胞。并且，这一方法要求最纯的酶，这样的酶非常昂贵，并且仍然会因批次间差异造成不稳定和不一致，妨碍此类工艺的优化和标准化。

发明概要

此处揭示的方法用于分离细胞类产品，无需或减少对细胞类产品的酶法消化，转而利用细胞易受冷冻伤害的特点，通过差异冷冻和低温保存技术将需要的组织与不需要的组织分开。

一些实施方式中，用包括以下步骤的方法来分离细胞类产品：提供既有不易受冷冻伤害的所需细胞又有易受冷冻伤害的不需要细胞的组织，冷冻该组织，将该组织粉碎，将该组织升温，将所需细胞与非所需细胞材料分离，由此获得所需细胞类产品。

某些实施方式中，用包括以下步骤的方法来分离细胞类产品：对组织进行预处理以使所需细胞更不易受到冷冻伤害而非所需细胞更受到冷冻伤害，将该组织冷冻，将该组织升温，然后将所需细胞与非所需细胞材料分离，由此获得所需细胞类产品。

某些实施方式中，用包括以下步骤的方法来分离胰岛：通过脉管系统(vascular system)向胰岛组织输注包含低温保护剂(CPA)的低温保护液，通过导管系统(ductal system)向腺泡组织输注水溶液，将胰脏冷冻，将胰脏粉碎，将胰脏升温，然后分离胰岛。

某些实施方式中，分离的胰岛组织保留了足够完好的功能，能够用作移植源，这样的胰岛细胞是用包括以下步骤的方法分离的：手术制备离体(ex vivo)胰脏用于脉管和导管插管，将制备的胰脏冷却到4°C至7°C左右，用低温保护剂对胰岛组织进行平衡，通过导管冲洗向胰脏输注水溶液，以此促进冷冻时大量结冰，将胰脏冷冻至-10°C至-200°C左右，机械粉碎同时保持胰脏在冷冻状态下，将胰脏浸在介质中融化，由此析出CPA，过滤出胰脏，洗涤，然后梯度纯化或对胰岛组织进行培养。

以下，通过具体实施方式的描述了产生本发明的更多特征和优点。

附图说明

图1A和1B描绘的是为低温分离胰岛组织进行的预处理。图1C是图1A和1B中虚线A截面的放大图。

图2A和2B描绘的是胰岛组织存活率，作为不同冷冻速率和升温速率下二甲亚砜("DMSO")渗透率的函数。

具体实施方式

本发明实施方式提供的是分离细胞类产品的无酶或少酶方法，与主要依赖于酶消化的方法相比，本发明方法具有较高的一致性、可靠性和较低的毒性。本发明实施方式提供的方法能够产生足量的所需细胞，这些细胞保留了足够完好的功能，是有用的移植来源。

本文所述方法的实施方式可用来分离各种细胞类产品用于治疗或科研，只要所需细胞和非所需细胞已经或能够经预处理而促进差异冷冻反应。用这样的方法就能够以冻结状态保存和运输冻结的组织，继而能够向终端用户提供完好组织，降低所需细胞对于缺血性损伤的敏感性。

某些实施方式中，可通过提供既有比较不易受冷冻伤害的所需细胞又有较易受冷冻伤害的非所需细胞的组织来分离细胞类产品。这样的组织可能天然具有差异冷冻特性，因此在损伤性冷冻过程中使得有些细胞被破坏而有些细胞被保留。例如，有些组织可能含有成核温度即冻点温度不同的细胞，例如，所需细胞的冻点温度低于非所需细胞。

某些实施方式中，可以通过对组织进行预处理从而使得所需细胞更不易受冷冻伤害而非所需细胞更易受冷冻伤害来分离细胞类产品。例如，给所需细胞输注低温保护剂(CPA)会使得所需细胞变得更不易受到冷冻伤害，而给非所需细胞输注不含CPA的溶液则会使非所需细胞变得更易受冷冻伤害。然后，可将该组织冷冻后粉碎，由此可从非所需细胞物质中分离出所需细胞，从而获得细胞类产品。可将组织升温，将所需细胞与非所需细胞物质分离，由此获得包含所需细胞的细胞类产品。

某些实施方式中，采用低温保存(cryopreservation)来选择性保存所需细胞而破坏非所需细胞。低温保存是加热与物质转移相互偶联的复杂过程，一般在非平衡条件下进行。简单地冷冻细胞或组织得到的的物质通常是死的，无功能的。

缓慢冷却过程中，当胞外环境中开始结冰时，水从细胞和组织中析出。细胞外的水结冰打破了渗透压平衡，导致水向胞外区间外渗，并在胞外结冰。持续地失水，直至达到水的跨膜扩散可以忽略不计的温度。细胞的失水量取决于胞外结冰后的冷却速率。低速延长了细胞水向胞外空间的渗透，由此造成更严重的细胞脱水。过度脱水导致一系列细胞损伤机制，统称为“溶液效应”，包括液相水流失造成的电解质毒性浓缩增多，和细胞过度收缩造成的细胞膜损坏。

快速冷冻过程中，细胞膜的透水性跟随温度迅速降低，由此缩短了水向外渗透的时间。水被留在细胞内，随着由此造成的水热力学失衡加剧，细胞质变得超冷。

最后，胞内水与胞外溶液热力学平衡导致的相变将胞内水转变为冰。一致认为，胞内广泛结冰与致死性细胞损伤相关。

对多数细胞类型来说，存在着能够最大程度保留细胞活力的最佳冷却速度。这些冷却速度引起的细胞脱水足以避免胞内结冰，但不会造成过度失水，过度失水会造成细胞因“溶液效应”而受伤。

将细胞从冻存状态升温通常采用尽可能快的速度，以避免样品温度由低温升至溶液熔点时小冰晶重结晶为较大的冰。复温过程中的重结晶是有害的，会降低细胞活力，尽管损伤机制尚不完全明确。然而，当细胞升温时能够快速通过会发生重结晶的条件，活力通常较高。

在生物材料冷冻后融化过程中使用CPA是已知的。有多种在用CPA，使用最广泛的是DMSO。这些化学物质通常分为两类：(1)胞内CPA，分子量低，能透入细胞；(2)胞外CPA，分子量高(大于或等于蔗糖的342道尔顿)，不能透过细胞。透过性CPA的主要保护模式是由CPA取代胞内水。有控制地去除胞内水对于抑制胞内致死性结冰来说至关重要。

受冻组织经历广泛的胞外结冰，即使是原本能够保持极佳细胞活力的过程亦是如此。虽然普通组织病理学方法无法在融化后检出冰，低温取代技术能够揭示组织内冰的位置。已用这些技术发现显著的胞外基质变形和损伤。冷冻伤害的程度取决于系统内游离水的量，和冷冻过程中这些水的结晶能力。

为了说明，以下将特别描述分离胰岛的实施方式。然而，本领域普通技术人员懂得，还有除胰细胞之外的其它实施方式。

某些实施方式中，图1A、1B和1C所示，方法包括：预处理胰脏10，使得胰岛组织16更不易受冷冻伤害，而腺泡组织18更易受冷冻伤害。可通过区别灌注来预处理胰脏10，从而最大程度地破坏腺泡组织18而保存胰岛组织16。例如，可通过脉管系统，例如通过腹腔干12和肠系膜上动脉14，给胰岛组织16输注含有CPA的低温保护液。胰岛组织16充分平衡后，可通过胰管20给腺泡组织18输注水溶液。

某些实施方式中，胰脏预处理可在受控条件下进行，从而优先平衡胰腺内的胰岛组织。例如，脉管输注可在约2°C至约35°C进行。而且，透过性CPA灌注的持续时间必须足以平衡胰岛组织，但并非整个胰腺。例如，灌注可持续约20分钟至约70分钟，例如约25至35分钟，或约30分钟。这一步骤的原则是给胰岛组织提供足够的CPA以保护其在后面的胰脏冷冻过程中免收冷冻伤害。

某些实施方式中，低温保护液将CPA包含在水溶液中，例如经缓冲的生物学介质。举例来说，CPA可选自：DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖和海藻糖。已知，DMSO是比甘油更好的CPA，约0.5至约3.0摩尔浓度的CPA对于尽可能减少低速冷冻生物系统中的细胞损伤往往特别有效。

某些实施方式中，可给腺泡组织输注水溶液，例如水或等渗盐水。往胰管内逆向输注水溶液可在如上所述对胰岛组织的脉管输注完成后立即开始。这一步骤的原则在于用水溶液浸润腺泡组织，促进冷却和冷冻时无低温保护腺泡组织内广泛的破坏性结冰。

较好的是，腺泡组织输注可在受控条件下持续，直至胰腺被水溶液浸透，例如直至看得出胰腺膨大以促进冷冻时大量结冰。例如，可在约100至约120mmHg压力下输注约300至约400ml水或等渗盐水，持续约5至约10分钟，在控压系统内进行。

某些实施方式中，所述方法接着将胰脏冷冻。可将胰脏冷却至零度以下(sub-zero)，直至冻结。这一步骤的原则在于：在无保护组织内形成尽可能多的结冰，促进组织破坏，利于此后胰腺解体释放出受低温保护的胰岛组织。

某些实施方式中，可将胰脏冷冻到约-10°C至约-200°C，例如约-40°C至约-170°C，或约-80°C至约-130°C。某些实施方式中，冷冻胰脏可以约1°C/分钟至约20°C/分钟的冷却速度进行，例如约6°C/分钟至约15°C/分钟。某些实施方式中，冷却速度可以是约0.5°C/分钟至约5°C/分钟。

胰脏冷冻速度结合迅速的升温速度可提供获得功能性胰岛组织的最佳条件。在图2A显示的例子中，以11°C/分钟的速度冷冻，在用2摩尔浓度DMSO完全或部分平衡后迅速升温，与之对应的是超过50%的胰岛功能保留。图2A还显示，如果冷冻速度降至约1°C/分钟并升温迅速，存活率可升高至约80%。图2B显示：就例举的缓慢冷冻胰岛来说，缓慢升温是不利的(约20%存活率)，不论是否用CPA完全或部分平衡胰岛。某些实施方式中，可通过将胰脏直接浸在温热的介质，例如浸在经渗透压缓冲的介质中将胰脏升温。

可以理解的还有：CPA平衡程度可能并不重要，尤其是向着迅速升温结合缓慢冷却来优化热交换的时候。这或许是有利的，因为结合尽可能减少CPA向外泌细胞内渗透的要求来确定胰岛原位完全平衡所需的条件不容易。

某些实施方式中，可用液氮供应系统来冷冻胰脏。为了加强胰脏的粉碎，可将大体积升温与液氮冷冻结合，同时增加浸在热水浴中的压缩空气换热器。这样，就能够融化胰腺而无需将其从工作平台上移出。可在升温过程中粉碎胰腺。

某些实施方式中，补充低剂量消化酶可能是有利的，这有助于最终的结缔组织分散，当冷冻和粉碎尚不能完全释放粉碎后组织中的低温保护胰岛时。如果低温下冷冻胰脏的迅速释放被视为有利，可将探针瞬时加热，从而仅融化包围探针的一薄层胰脏，降低探针粘连胰脏的可能性。

某些实施方式中，将胰脏粉碎，从而由解体的腺泡组织中释放出被低温保护的胰岛组织。可在胰脏仍然冻结或其升温时将其粉碎。某些实施方式中，所述粉碎可采用机械应力、差异膨胀诱导的热力-机械应力、陡直温度梯度诱导的热力-机械应力、冷冻时体积改变诱导的热力-机械应力，或它们的组合。

热力-机械应力是材料受冻趋于收缩的结果，可能受到三种不同作用的驱动：前文所述冷冻后的体积改变，陡直温度梯度和复合材料的差异膨胀。实际上，上述中的两项或以上可能协同作用。后文会解释如何利用这些作用来促进粉碎。

陡直温度梯度的作用：大多数材料降温时会收缩(一个例外是水在相变时的不规则表现)。当形成温度梯度时，相邻层的材料会以不同速度收缩。为了使相邻层材料的实际收缩相互匹配就会产生机械张力，于是造成材料内的应力。当温度梯度造成的应力超过了冷冻材料的强度，就发生断裂。

差异热膨胀的作用：即使整个器官的温度均匀，但随时间而变化，仍然会因不同材料收缩速度不同而发生断裂。

某些实施方式中，预处理后，冷冻胰脏有两类主要区域：被等渗溶液充满的区域和被CPA充满的区域，其中，由于胰脏的形态，大量的小CPA区域会被包裹在大的冷冻等渗溶液区域之内。此外，材料的不连续性，例如，在胰岛表面或者结缔组织与其他腺体组成之间的材料不连续性，也参与造成差异热膨胀和收缩所致的结构破坏。固态时-当整个器官处于极低温度-材料的不连续性对于断裂的发展几乎没有作用。

然而，在某些中等低温(cryogenic temperature)，断裂对胰岛的损伤可能较小，此时，由于CPA的存在，众多断裂在一定程度上就像粘稠物质。玻璃化CPA的粘度随温度降低指数性升高，但是，高到直至玻璃转化温度以上10°C的粘度值应该能够在任何实际的时间尺度(practical time scale)上让CPA呈现好像流体或液体的状态。就本发明而言，中等低温的上限是纯水的冻点(0°C)，下限则是CPA的玻璃转化温度(对DMSO来说是-123°C左右)。例如，CPA的热收缩率可达纯水的3倍，这可能影响到应力分布，继而影响到胰岛周围的断裂方式。

另一些实施方式中，粉碎胰脏可以通过机械粉碎冻结组织来进行。例如，这可以分两阶段进行。第一阶段可以是用物理方式将胰脏碎成小片，例如用榔头和凿子。第二阶段可以是将冻结组织的碎片浸在温水或等渗介质中进行研磨，例如用电动碎冰机或搅拌机。这还具有在对组织进行机械研磨的同时快速升温和稀释低温保护剂的作用。

某些实施方式中，所述方法还包括将胰岛与不需要的胰脏物质分离。分离胰岛组织可以通过例如以下手段实施或它们的组合来完成：过滤、密度梯度分离、组织培养。过滤可用过滤装置进行，例如不锈钢筛网(茶漏)。分离可以包括用含有蛋白酶抑制剂(例如

和脱氧核糖酶(例如

的介质洗涤过滤后的胰脏，由此去除来自被裂解外泌组织的有害内源性蛋白酶和DNA。某些实施方式中，可用胰岛指示剂(例如双硫腙)对过滤后的胰脏进行染色，然后在显微镜下检看完整的胰岛组织。

分离出的胰岛组织可能没有与腺泡组织完全分离，并且，或许不是所有胰岛组织都完整。例如，有些胰岛组织的组织可能比较松散，这可能表明经受了胰脏回温过程中直接浸入水性介质所致的渗透压冲击。某些实施方式中，可以通过以下手段避免这一问题：在融化胰脏过程中或融化后，在从胰岛组织中洗去CPA过程中采用等渗缓冲液。采用等渗缓冲技术能够保护胰岛组织的结构，尽可能减少透过性CPA流出时的渗透性膨胀和裂解。但同时，等渗缓冲不影响腺泡细胞的解体和裂解，因为这些细胞没有受到CPA渗透作用的保护。

为了更彻底地分离胰岛组织，某些实施方式中，可将上述低温分离方法与温和酶消化组合来纯化胰岛组织。另一种方法可以是采用组织培养作为一种“清除”模式，因为低温分离过程中受损的残余腺泡组织会在培养中死亡或解体。

以下用实施例来说明可用于本发明实施方式的不同组成(compositions)和条件。所有比例都是重量比，除非另作说明。然而，显而易见，根据前文和后文所述，本文所揭示的内容可用多种不同的组成和来实施，并且可以具有多同不同的用途。例如，本领域技术人员很容易明白，以下实施例同样可用于分离人的胰岛，因为猪胰脏是本领域公认的人胰脏模型。

猪胰脏成为有用的模型至少出于以下原因：(1)猪胰脏是重要热转移和物质转移参数的合适模型；(2)猪胰脏是大型动物模型；(3)猪被认为是将来临床异种移植最有希望的胰岛来源；(4)猪胰脏可经手术分成彼此独立的可灌注的两叶，由此可以采用同一胰脏进行比较处理，避免动物个体/组织差异的影响。

实施例1

手术制备猪胰脏用于全器官灌注和分叶灌注.

用器官保存液原位低温冲洗后，从供体取出胰脏，保留胰头周围连着的一段十二指肠以保护胰十二指肠上、下动脉。在灌注准备阶段，胰脏在冰上维持于低温状态。保留的十二指肠段包括总胆管和胰管的开口。在切除脾脏之前先将脾侧脾静脉和脾动脉结扎。保留与胰脏相连的5-7cm长的一段大动脉，供以后器官插管进行全胰脏灌注。保留的大动脉段包括肠系膜上动脉(SMA)和腹腔干(CT)血管的开口。细心寻找和结扎胰脏胃十二指肠侧和肝侧边缘所有露出的支动脉，保证整个腺体内灌注均匀且流出液仅从门静脉流出。用十二指肠侧的开口进行胰管插管，保留全部前期支管(early duct branches)，保证以后器官扩张良好以利腺体的消化和胰岛的分离。

要进行胰脏灌注，将一个密封圈套管(ORS，德斯·普雷恩城，伊利诺伊州)装在从大动脉段(包括SMA和CT的开口)切下的大动脉片上，不影响SMA和CTl两管的管腔。该插管提供胰脏和灌注系统之间的密封流动连接。将大动脉片套管与泵式输注端口相连。

要进行分叶灌注，小心地将胰脏分成胰头叶和胰尾叶。在接近SMA的腹腔干位置将胰脏一切为二，把SMA留给尾叶。对于尾叶，直接用源自腹腔干的脾动脉插管灌注。如有必要，按照猪供体解剖所需，可以给在肠系膜上动脉上接装第二插管以促进尾叶低位部分的灌注。对于头叶(“c”形)灌注，直接用胃十二指肠和/或肝动脉插管灌注。头叶灌注期间，十二指肠仍留在器官上。等分两叶之间的门静脉，确保灌注过程中出液顺畅。用于两叶直接插管的套管直接与泵式输注端口相连。

低温分离猪胰岛可选用的条件如下所述。

用2摩尔浓度DMSO作为CPA，因为它被广泛用于胰岛的低温保存。关于脉管输注CPA的模式，用密封环套管和蠕动泵进行腹腔/SMA灌注30分钟，温度为4°C至7°C。关于导管输注水的模式，用注射器通过胰管向胰脏注水，直到可见的胰脏膨胀。冷冻步骤中，将埋有热电偶的胰脏放在不锈钢盘上，盘子被支撑在-196°C沸腾液氮的上方。该不锈钢盘提供了冷却大浸润器官所需的大表面和导热性。关于胰脏组织粉碎的模式，利用热冲击，即将冻结组织直接浸入温热介质来令组织断裂。或者，可用电子碎冰机，用温热介质对组织进行机械粉碎，温热介质有助于迅速升温和稀释。

上述条件下的胰岛低温分离产生的冷冻速度为11°C/分钟，冻结胰脏内的最终温度低于-160°C。将固体的冻结胰腺一分为二，进行不同模式的粉碎和升温。首先，将含有热电偶的冻结块直接浸入温热(30°C)组织培养基。由此形成的升温速度是12°C/分钟，但无法获得宏观断裂。由此可知：这一升温模式不大可能产生广泛的热力断裂将组织碎成含有胰岛的小碎片。

第二种粉碎和升温模式包括分两阶段机械粉碎冻结组织。首先，用榔头和凿子通过物理手段将冻结胰脏粉碎。接着，浸在温热介质中作物理研磨。

结果显示，可以对同一胰脏采用不同的冷冻条件，由此实现原位低温保存完好胰岛，同时加强周围腺泡组织的破坏。

实施例2

差异冷冻技术被用来在冷冻破坏胰脏令胰岛解体从而释放出活胰岛的过程中原位地选择性保护胰岛。具体地说，先手术制备离体胰脏用于脉管和导管插管。为了避免动物个体差异和限制研究所需猪的数量，采用了分叶制备，猪胰脏的手术制备使得能够彼此独立地进行胰头灌注和胰尾灌注，见后文。对照(传统酶法)和试验(低温分离)组可各自研究5个平行样本。

然后将胰脏冷却至4°C至7°C，用CPA/Unisol混合物灌注30分钟，用10mmHg的压力。每个胰岛代表一个渗透压平衡单元，所以，平衡会很快(大约60分钟不到)。用一调压系统，通过导管冲洗方式以100-120mm Hg的压力向胰脏软组织注入300-400ml蒸馏水或盐水，5-10分钟。以1-10°C/分钟的冷冻速度立即将胰脏冷却至-40°C或低于-140°C，冻结胰脏的同时保护胰岛。冻结组织机械粉碎后装入组织搅拌机(在此阶段，保持组织的冻结状态)。组织在搅拌机中，在蔗糖介质中，被粉碎的同时被融化。然后用不锈钢筛网(例如茶漏)过滤产物。这一步骤去除大块的没有粉碎的外泌组织和纤维废料。然后用含有

和

的介质搅拌洗涤产物，由此去除裂解的外泌组织释放的有害内源性蛋白酶和DNA。对产物进行梯度纯化和/或培养，从外泌裂解物中纯化胰岛。

低温分离的效率根据差异冷冻产生的胰岛和胰脏碎片的大小分布来评价。这包括对产生的碎片的双硫腙染色评定，所述碎片包括含有被包埋胰岛的碎片，含有完全分离的游离胰岛的碎片，和部分分离的所谓有覆盖(mantled)胰岛的碎片。该基线低温分离技术的相对效率通过与传统胶原酶(例如，罗氏公司(Roche)出品的LIBERASE，或Serva或VitaCyte的胶原酶)技术的比较来判断，比较采用本文所述的对照和现有技术中猪胰脏分离中对照的数据。

某些实施方式中，评价分离和纯化胰岛组织的技术可以包括胰岛定量，采用葡萄糖刺激胰岛素分泌试验的胰岛活力和功能性活力评价。

胰岛质量评价：按照胰岛分离和纯化规程，用解剖显微镜目镜里的计数标线来测定胰岛总数，并标化为胰岛当量(IE)。胰岛用双硫腙染色、计数，然后转化为胰岛当量(IE)。两次重复计数的结果与计算机细胞计数器(例如

软件)得出的数值相当。根据双硫腙染色组织与非染色外泌组织之比评定胰岛制备物的纯度。

胰岛活度：用两项基本实验来评价胰岛活度：基于的吖啶橙/碘丙啶(AO/PI)活/死染色，或Syto绿/溴乙啶荧光膜完整度检测，和基于alamarBlue^TM的代谢实验。AO/PI实验可得出胰岛完好性的半定量指标。相比之下，alamarBlue^TM实验是一种体外(invitro)非介入性测定胰岛活度的定量方法，并且，因为反应试剂无毒，该实验可对还将接受后续检测的胰岛进行。

胰岛功能和结构的体外评价：组织完好性和坏死的形态学检测包括常规染色(H&E)，电子显微镜检查和细胞凋亡(TUNEL实验)以及氧化压力(谷胱甘肽水平)和能量(ATP实验)等参数。可用常规技术检测胰岛素含量及其受激分泌。

实施例3

本实施例代表了以酶消化补充低温分离技术的实施方式，采用了减量(即浓度)的胶原酶。这是因为，完全无酶低温分离胰岛可能无法完全将胰岛组织从胰脏分离，某些实施方式中，温和的酶消化与低温分离组合能够获得更好的产物。因此，在冷冻腺体之前，在导管灌注中加入低剂量胶原酶(例如罗氏公司的LIBERASE，或Serva或VitaCyte的胶原酶)的方法是有利的。用常规剂量(1.4mg/ml)的半剂量(0.7mg/ml)和十分之一剂量(0.14mg/ml)进行平行实验，测定它们在升温后对胰岛分离的影响。评定方式为：如此前所述，比较胰岛得率和游离、有覆盖和被包埋胰岛之比。总共9头猪可进行每组N=6的组间比较，详见表1。

表1

表1所示的实验设计可使每组的胰头、胰尾分配均等。在升温后立即测定胰岛得率和分离参数，并在37°C培养24小时后再次测定。

胶原酶消化技术

用含有如

(1.4mg/ml)等消化酶的无血清溶液通过胰管输注令胰脏膨大。此时，除净所有的胰脏外部组织。接着，将浸润后的胰脏切碎，放入450ml不锈钢胆(chamber)，例如Ricordi胆，其具有7个中空不锈钢球(BT公司(Biorep Technologies，Inc.)，迈阿密)和位于其中的一张500目孔径的钢丝筛网。用经过一换热器的管路系统让整个系统充满Hanks平衡盐溶液(HBSS)。然后将消化温度提高到35±2°C。然后，溶液以200ml/分钟的速度再循环，垂直摆动消化胆，300摆/分钟，摆幅1.8cm。定时取样的样品用双硫腙染色，在显微镜下查看消化程度。当消化充分时，用新鲜的冷的HBSS冲洗消化胆，将胰岛溶液收集到离心管中。在胎牛血清或过量钙和镁存在下，55g，4°C离心两分钟，停止酶消化。吸去上清，由外泌组织和内分泌组织构成的组织沉淀用冷HBSS洗涤后收集用于分离。用Ficoll/EuroCollins和离心机(例如

通过密度梯度离心纯化胰岛。据罗氏公司所述，所述离心机能够进行连续的密度梯度分离。在此，先进行Cobe液压测试。然后，将管路组装到位，经过众阀门，从隔膜(diaphragm)到钢加重的盖子的背面，到全部管线。用EuroCollins配制所需的Ficoll梯度。将胰脏消化物沉淀重悬在第一梯度(1.108)溶液中，泵送到离心机中(200mL/分钟，3分钟)。加液完成后，从离心机中排除气体。接着，设定离心速度和泵速(分别为1000rpm和50ml/分钟)，然后启动离心。达到所需速度时，先后泵入另两个梯度溶液(1.096和1.037)。然后，泵入50mL的HBSS，直到液位到达旋转密封圈，释放过量压力。室温下离心5分钟。取出离心后的各组份，检查胰岛的纯度(用双硫腙)。各组份洗涤两次(1200rpm离心2分钟)，弃上清，将细胞重悬于培养基。然后测定胰岛得率。

Claims (17)

1.一种分离胰岛的方法，包括：

对胰脏组织进行预处理使得胰岛更不易受冷冻损害而腺泡组织更易受冷冻损害，

冷冻胰脏组织，

粉碎胰脏组织，

使胰脏组织升温，和

将胰岛与腺泡组织分离，得到分离的胰岛，

所述预处理包括：

通过脉管系统给胰岛提供含有低温保护剂的低温保护液，和

通过导管系统给腺泡组织输注水溶液。

2.如权利要求1所述的方法，还包括用消化酶处理胰岛。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述低温保护剂选自：二甲亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖和海藻糖。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述水溶液是水或等渗盐水。

5.如权利要求1所述的方法，其中，通过脉管系统给胰岛提供含有低温保护剂的低温保护液进行至胰岛与低温保护剂达到热力学平衡。

6.如权利要求1所述的方法，其中，给胰岛输注低温保护液在2°C至35°C进行20至70分钟。

7.如权利要求1所述的方法，其中，给腺泡组织输注水溶液持续到胰脏组织看得见地膨胀。

8.如权利要求1所述的方法，其中，低温保护剂在低温保护液中的浓度为0.5摩尔浓度至3.0摩尔浓度。

9.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻胰脏组织包括将胰脏冻至-10°C至-200°C。

10.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻胰脏组织的冷却速度为1°C/分钟至20°C/分钟。

11.如权利要求1所述的方法，其中，使胰脏组织升温的升温速度高于12°C/分钟。

12.如权利要求1所述的方法，其中，使胰脏组织升温是通过将所述组织直接浸入温热的经渗透压缓冲的介质中。

13.如权利要求1所述的方法，其中，粉碎胰脏组织采用选自以下的技术：机械应力、差异膨胀诱导的热力-机械应力、陡直温度梯度诱导的热力-机械应力、冷冻时体积改变诱导的热力-机械应力、和它们的组合。

14.如权利要求1所述的方法，其中，粉碎胰脏组织是在胰脏组织冻结状态下或者胰脏组织融化状态下完成的。

15.如权利要求1所述的方法，还包括从胰岛中洗去低温保护剂和在此期间对胰脏组织进行渗透压缓冲。

16.如权利要求1所述的方法，还包括向胰脏组织加入浓度低于1.4mg/ml的胶原酶。

17.一种分离保留了功能完好性从而适合用作移植源的胰岛组织的方法，包括：

将用于脉管插管和导管插管的离体胰脏冷却至2°C至35°C；

用低温保护剂平衡胰岛组织；

通过导管冲洗给胰脏输注蒸馏水或盐水，促进冷冻时广泛结冰；

将胰脏冻至-10°C至-200°C；

机械粉碎胰脏，同时保持胰脏冻结状态；

通过浸入介质以析出低温保护剂来融化胰脏；

过滤胰脏；

用含有蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的介质清洗胰脏；和

梯度纯化或培养胰岛组织。

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