CN102286025A

CN102286025A - Fitc-ip3的制备方法及在荧光偏振分析中的应用

Info

Publication number: CN102286025A
Application number: CN2011102421444A
Authority: CN
Inventors: 丁兆
Original assignee: Sichuan Huiyu Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sichuan Huiyu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2011-08-23
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明公开了FITC-IP₃的制备方法，步骤如下：（1）反应体系配置：将2-氧-(2-氨乙基)-IP₃溶解于四氘代甲醇中，添加三乙基胺，再添加FITC固体；（2）将上述体系摇匀后，避光室温孵育48h；（3）上述所得到的混合物纯化后，即得到FITC-IP₃。本发明在制备FITC-IP₃时，在氘代甲醇中添加三乙基胺，使得FITC可以选择性地和2-氧-(2-氨乙基)-IP₃连接反应，避免了染料FITC的水解。本发明还公开了FITC-IP₃在荧光偏振分析中的应用，FITC-IP₃用于荧光偏振分析中，测定荧光各向异性度，从而测定目的化合物和具有IP₃结合结构域的IP₃受体多肽之间的亲和力。

Description

FITC-IP<sub>3</sub>的制备方法及在荧光偏振分析中的应用

技术领域

本发明涉及靶向药物功效预测方法的技术领域，具体的，涉及FITC-IP₃的制备方法及其在荧光偏振分析中的应用。

背景技术

1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP₃受体）是调节Ca²⁺释放的配体门控通道。该受体可以结合IP₃后被激活。IP₃受体是四聚体。每个亚单位包括2700个残基，每个亚基N末端（NT，1-604）附近具有IP₃结合中心（IBC，224-604），C-末端具有6个跨膜蛋白。最末端的一对跨膜区域，连同其四个亚单位的每个转弯环区，构成孔隙结构。当3～4个部位被IP₃占据时, IP₃受体复合物构象发生改变, 打开孔隙结构, 储存的Ca²⁺ 随即释放。因此，寻找IP₃受体靶向药物的必经步骤是筛选与IP₃受体亲和力高或活性强的化合物并预测此类化合物的药物功效。

1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓荧光去偏振现象。

近年来，以这种物理学现象为基础的技术正在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。本申请人将荧光偏振现象结合现代物理中的热动力学应用于药学研究当中，发明了一套高通效的药物功效预测技术。由于该高通效的药物功效预测技术采用的荧光偏振的原理，因此需要设计相应的荧光配体配合使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种荧光标记的化合物FITC-IP₃的制备方法，该制备方法得到的FITC-IP₃适合于IP₃受体的荧光偏振分析。

本发明所要解决的技术问题还包括FITC-IP₃在荧光偏振分析中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：FITC-IP₃的制备方法，包括如下步骤：

（1）反应体系配置：将2-氧-(2-氨乙基)-IP₃溶解于四氘代甲醇中，添加三乙基胺，再添加FITC 固体；

（2）将上述反应体系摇匀后，避光室温孵育48h；

（3）上述步骤所得到的混合物纯化后，即得到产物FITC-IP₃。

上述技术方案中，选用2-氧-(2-氨乙基)-IP₃作为原料，因为在IP₃的带电磷酸基团附近具有活性氨基，这使得2-氧-(2-氨乙基)-IP₃的活性乙基与与活性染料FITC的连接反应在反应体系中更加有竞争力。在普通条件下这个反应是非常缓慢的，并且活性染料本身存在水解反应，所以合成FITC-IP₃时需要过量使用活性染料。但是，本发明人发现，在四氘代甲醇环境中，添加三乙基胺后，FITC可以选择性地与2-氧-(2-氨乙基)-IP₃起反应。

本发明进一步的技术方案，FITC-IP₃的制备方法，包括如下步骤：（1）反应体系配置：将20 μmol 2-氧-(2-氨乙基)-IP₃溶解于0.75 ml四氘代甲醇中，添加50μl三乙基胺，再添加50 μmol FITC 固体。（2）将上述反应体系摇匀后，避光室温孵育48h。（3）上述步骤所得到的混合物纯化后，即得到产物FITC-IP₃。

进一步的技术方案，所述步骤（2）中20 μmol FITC 固体分两次加入，第一次添加30 μmol FITC固体，封口，摇匀，避光室温孵育4h；此时第二次添加20 μmol FITC固体，继续避光室温孵育44h。

本发明进一步的技术方案，所述步骤（3）中的纯化步骤为：用甲醇将步骤（2）处理后的反应体系冲洗到圆底烧瓶中，然后减压浓缩至圆底烧瓶中物质呈固体粉末状;往圆底烧瓶中添加10ml去离子水吸收减压浓缩后的固体；将圆底烧瓶的液体加载到避光的Q Sepharose Fast Flow resin凝胶上；先用去离子水洗提，再用0.6M 的TEAB缓冲液洗提，直到洗脱液无色为止；Q Sepharose Fast Flow resin凝胶继续用梯度浓度的TEAB洗脱，收集洗脱液作为目标液体；将目标液体浓缩和结晶后，得到橙黄色的结晶体即为FITC-IP₃。

本发明进一步的技术方案，所述纯化步骤还包括：将所得到的结晶体重新溶解于去离子水中，加载到Chelex 100 分子生物纯树脂柱,然后用去离子水洗提；洗提液经过冷冻干燥后，得到高纯度的FITC-IP₃。

本发明解决上述问题所采用的技术方案还包括FITC-IP₃在荧光偏振分析中的应用，FITC-IP₃用于荧光偏振分析中，在荧光偏振分析实验中测定荧光各向异性度。

进一步的，在所述荧光偏振分析实验中，测定目的化合物和IP₃受体或具有IP₃结合结构域的IP₃受体多肽之间的亲和力。

综上所述，本发明与现有技术相比，具有如下优点：

（1）本发明在制备FITC-IP₃时，在氘代甲醇中添加三乙基胺，使得FITC可以选择性地和2-氧-(2-氨乙基)-IP₃发生连接反应，并避免了染料FITC的水解。

（2）由于FITC的荧光寿命为4ns，并且分子量较小，为0.85 kDa，具有较宽的弛豫时间，因此本发明选用异硫氰酸荧光素FITC作为荧光标记，更加适合IP₃受体的荧光偏振分析。

(3)本发明制备得到的FITC-IP₃纯度高，适合于荧光偏振分析。

（4）在IP₃和IP₃受体的结合复合物中，IP₃的2位氧是暴露的，即IP₃的2位氧与IP₃受体没有显著接触；因此本发明选用2-氧-(2-氨乙基)-IP₃作为原料，不影响FITC-IP₃作为IP₃受体配体的功能。

（4）本发明通过放射性配体结合分析和荧光偏振配体结合分析，两种方法测定FITC-IP₃与IP₃受体的解离平衡常数K _D值，得出了相近的结果。因此，证明了荧光偏振实验完全可以应用于配体分析，并且由于荧光偏振技术的安全性和高通量性，其具有比放射性配体分析更大的优势。

名词解释。

1具有IP₃结合结构域的IP₃受体多肽：本发明中所提及的“具有IP₃结合结构域的IP₃受体多肽”可以是通过现有技术获得，通常以“IP₃受体全长”为模板进行克隆和表达经纯化后获得，亦可以是以“IP₃受体全长”为模板通过突变试剂盒获得的突变受体多肽。

2放射性配体结合分析：原理是基于放射性核素标记的配体与特异受体的理化结合反应。应用放射性标记配体和含有受体的制剂一起温育，使受体和配体充分结合，形成受体-配体复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定受体-配体复合物的放射性，经过数据处理，求得受体对配体的亲和力（K _D）和受体的最大结合容量（Bmax）。放射性配体分析作为一种现有技术，常常用于测定多种药物对受体的亲和力（常以平衡解离常数K _D表示）研究。

本发明涉及的放射性配体结合分析的实验包括有以下两种类型，本发明放射性配体结合分析的实验的设计是为了验证本发明的荧光偏振配体结合分析所测得到的亲和力达到与放射性配体结合分析同等的准确度：(1) 饱和实验与Scatchard分析，用于测定放射性配体对受体的亲和力(K _D)以及最大结合容量（Bmax)。采用不同浓度的放射性配体(6～12个浓度）与受体在一定条件下温育一定时间，分离与受体结合的放射性配体。(2)竞争抑制实验，用于测定未标记的待测竞争配体与受体的亲和力；一种浓度的放射性配体及多种浓度的未标记待测竞争配体(14～16种浓度)，与受体在一定条件下温育，分离与受体结合的放射性配体。未标记待测竞争配体与放射性配体竞争性与受体结合，未标记待测竞争配体的浓度越大，与受体结合的放射性配体的量越少，依此可得放射性配体结合分析的竞争抑制结合曲线。　

3荧光偏振结合分析（Fluorescence Polarization binding assay，本文简称为FP分析或FP测量），本发明涉及下述两种类型实验:

饱和结合分析实验：采用不同浓度的荧光标记配体(6～12个浓度）与受体在一定条件下温育一定时间，测定反应体系在结合过程中的荧光各向异性度A。

本发明中对IP₃受体配体结合分析采用饱和结合分析实验步骤如下：用CLM培养液按浓度梯度稀释的受体多肽（包含0.4-400 nM 的IP₃结合位点）与固定浓度0.5 nM 的FITC-IP₃混合，最终体积为 50ul 。

竞争结合分析实验：用于测定未标记的待测竞争配体与受体的亲和力；一种浓度的荧光标记配体及多种浓度的未标记待测竞争配体(14～16种浓度)，与受体在一定条件下温育，测定体系的荧光各向异性度A。未标记待测竞争配体与荧光标记配体竞争性与受体结合，未标记待测竞争配体的浓度越大，与受体结合的放射性配体的量越少，依此可得荧光偏振配体结合分析的竞争抑制结合曲线。　

本发明中对IP₃受体配体结合分析采用竞争结合分析实验步骤如下：用CLM培养液按浓度梯度稀释未标记的待测竞争配体、固定浓度0.5 nM 的FITC-IP₃、和受体蛋白（NT 80 nM；IBC 15 nM）在一个容器内混合温育。

荧光偏振结合分析与放射性配体结合分析方法不同的是，FP测量时不需要分离结合态配体，即可以在不损坏配体结合态自然性状的情况下就可以测量荧光各向异性度A。

4、本文提及的 IP₃受体每个亚基全长包括IP₃结合结构域（IBC，225-604）、前导序列（SD,1-224）和跨膜区（TMD）。

5、 NT: IP₃受体每个亚基全长位于1-604的肽段。

6、 IBC: IP₃结合区，IP₃受体全长每个亚基位于残基224-604的肽段。

7、CLM培养液成分：140 mM KCl, 20 mM NaCl , 2 mM MgCl2 ,1 mM EGTA, 和20 mM PIPES, pH 7.0。

8、Tris/EDTA 培养基：50 mM Tris和1 m M EDTA, pH=8.3。

附图说明

图1为FITC-IP₃的分子结构式。

图2为2-氧-(2-氨乙基)-IP₃的分子结构式。

图3为IP₃受体的一个亚基的肽链示意图，全长为2749个氨基酸，每个亚基全长包括IP₃结合区（IBC，225-604）、前导序列（SD,1-224）和跨膜区（TMD）。

图4为DT40-IP₃R1细胞的膜片钳实验过程中单通道电流记录图。用对称的铯磺酸（200 mM）作为电荷载体，记录表达重组大鼠IP₃R1的DT40细胞外层核被膜的电流。该实验中，以10 μM IP₃或FITC-IP₃刺激DT40- IP₃R1细胞膜片的IP₃R1通道；其中C表示通道关闭状态，钳制电位为40 mV。

图5表示10 μM IP₃或FITC-IP₃刺激IP₃R1通道的电流（i）-电压（v）关系图。

图6和图7分别表示10 μM IP₃或FITC-IP₃刺激IP₃R1通道的单通道开放概率Po和通道平均开放时间τo。

如图4、5、6和 7所示，FITC-IP₃和IP₃打开IP₃R1单通道的Cs⁺电导率是相同的，图4显示电导率γ_Cs都约为220 pS。

但是在最大有效浓度情况下，FITC-IP₃的单通道开放概率Po比IP₃低。图6-1所示，FITC-IP₃的单通道开放概率Po=0.057±0.01（n = 4)；IP₃的单通道开放概率Po= 0.41±0.04（n = 5)。

图7所示，用FITC-IP₃和IP₃刺激细胞膜片离子通道的平均通道开放时间τo是相同的，τo=10 ms。这表明IP₃受体全长结合不同配体时通道开放的速率是不同的。

图8为一个IP₃受体亚基结构示意图，该结构示意图标明了用于纯化的N末端的GST标签。箭头表示裂解剪切位点。下划线表示剪切后，在蛋白N末端插入的外源残基。

图9所示为银染后胶显色图（左）和western 印迹（右）；上样为纯化的NT，4 ug，5.1 pmol。

图10所示为银染后胶显色图（左），右为western 印迹（右）；上样为IBC，4 ug，1.7 pmol。

图11为放射性标记IP₃与NT受体饱和结合的实验曲线Scatchard plot。在TEM培养基（30 ng 总蛋白）中，进行 [3H] IP₃与NT的受体饱和结合实验，并绘制得到的Scatchard plot。

图12为IP₃、放射性标记IP₃与NT受体的竞争结合的实验曲线。在TEM培养基（150 ng 总蛋白）和CLM（4 ug 总蛋白）中，分别进行一定浓度放射性标记的[³H] IP₃（0.75 Nm）、梯度系列浓度的IP₃、与NT蛋白进行受体竞争结合实验，并计算结合率。

图13和图14为荧光偏振实验测定了FITC-IP₃与NT或IBC结合时的平衡解离常数K _D。

图15：荧光偏振实验，4℃、0.5 nM 的荧光配体FITC-IP₃和梯度设置系列浓度的 NT受体蛋白进行的受体结合实验。

图16： [3H] IP₃（0.75 Nm）、NT蛋白（4 ug）和梯度设置系列浓度的FITC-IP3；竞争抑制结合实验。

图17：FITC-IP₃（0.5 nM）、NT蛋白（80 nM）和梯度设置系列浓度的IP₃；竞争抑制结合实验。

具体实施方式

下面结合实施例及附图，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不仅限于此。

实施例1 FITC-IP₃的制备及纯化

将以下反应设置在NMR样品管中反应，以便于通过核磁共振谱对反应过程进行监测。包括如下步骤：将20 μmol 2-氧-(2-氨乙基)-IP₃溶解于0.75 ml四氘代甲醇中，添加50μl三乙基胺，添加30 μmol FITC固体，封口，摇匀，避光室温孵育4h后；再次添加20 μmol FITC固体，继续避光室温孵育44h。

上述步骤所得到的混合物纯化后，即得到产物FITC-IP₃。

所述的纯化步骤为：用甲醇将步骤（2）处理后的反应体系冲洗到圆底烧瓶中，然后减压浓缩至圆底烧瓶中物质呈固体粉末状;往圆底烧瓶中添加10ml去离子水吸收减压浓缩后的固体；将圆底烧瓶的液体加载到避光的Q Sepharose Fast Flow resin凝胶(8×2cm, 碳酸氢盐)上；先用去离子水洗提，再用0.6M 的TEAB缓冲液洗提，直到洗脱液无色为止；Q Sepharose Fast Flow resin凝胶继续用梯度浓度的TEAB（0.6-2.0M，250ML）洗脱，收集10ml的洗脱液作为目标液体；将目标液体浓缩和结晶后，得到橙黄色的结晶体即为FITC-IP₃。

进一步的纯化步骤还包括：将所得到的结晶体重新溶解于去离子水中，加载到Chelex 100 分子生物纯树脂柱（Na⁺，2.5ml）,然后用去离子水洗提；洗提液经过冷冻干燥后，得到高纯度的FITC-IP₃。通过核磁共振谱验证，产物分子式为C₂₉H₃₁N₂O₂₀P₃S，分子量为851.0330。使用磷酸分析法精确定量，得到16umol FITC-IP₃，产率为80%。

实施例2 IP ₃ R1 的N 末端片段的表达和纯化

本实施例IP₃R1 的N 末端片段是指具有IP₃结合结构域的IP₃受体多肽片段，包括NT（残基1-604）；IBC（残基224-604）。

IP₃R1的N端片段的扩增模板是缺失S1剪切位点的IP₃R1全长基因，分别用两对引物扩增制备NT和IBC，基因定量时使用的参考基因为IP₃R1全长（S1+）（GenBank登录号：GQ233032)。使用QuickChange mutagensis kit 试剂盒（Stragene，La Jolla，CA）将S1剪切位点插入到IBC片段中。将PCR产物连接到pGEX-6p-2载体（GE Healthcare），使用BamHI/XhoI 的酶切，分别形成pGEX-NT和pGEX-IBC。形成的pGEX-NT和pGEX-IBC都包含一个N端GST标签，该N端GST标签是通过PreScission蛋白酶剪切位点与IP₃R片段连接。得到的所有终产物序列通过DNA测序验证。如图8所示，在将GST标签切掉后，IP₃R片段仍然保留5个外源N端残基。因为IP₃和NT、IBC的解离平衡常数相似，因此可以推断这几个外源残基也不会影响IP₃的结合。将这些产物转化到E. coli AVB101, 1 ml培养物，37℃在LB培养基（含100 ug/ml 氨苄青霉素）中培养12h，然后放置在22℃ 直到OD₆₆₀ 达到1.5，添加诱导剂异丙基-β- D-半乳糖苷（IPTG) ，15℃，诱导20h，使蛋白诱导表达。

取诱导后的菌液，离心（6000g，5min）收集菌体，固体重悬于 Tris/EDTA 培养基（TEM; 50 mM Tris和1 m M EDTA, pH=8.3）。

在上述菌悬液中添加溶菌酶（100 ug/ml）和RNAase(10 ug/ml) 后，冰上放置30分钟，然后裂解液超声粉碎。离心(30,000g, 60min)，50 ml 上清液中添加0.5 ml glutathione Sepharose 4B beads (GST柱材料)20℃持续旋转30分钟使其结合。所有的GST柱材料填充到PD-10 空层析柱中，使用添加了1mM 4℃二硫苏糖醇（DTT）的无Ca ²⁺细胞类似液CLM培养液冲洗5次。

GST柱材料然后在0.5 ml（1柱床体积）的CLM培养液中，和1 mM 二硫苏糖醇和120单位/ml 的GST标签蛋白PreScission 蛋白酶，4℃，孵育12h。收集洗脱的不含PreScission 蛋白酶的IP₃R片段。蛋白浓度以γ-球蛋白 (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Hertfordshire, UK) 作为对照标准，使用DC 蛋白定量试剂盒(去垢剂兼容)对蛋白进行定量。

蛋白样品使用4-12% NuPage凝胶分离。样品通过银染技术或使用iBlot 系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)转移到硝酸纤维素膜。分别使用对应于残基62 to 75 (Cardyetal.,1997)或者326 to 343 (S1剪切位点)多肽的抗血清，鉴定NT和IBC。

如图9所示为银染后胶显色图（左）和western 印迹（右）；上样为纯化的NT，4 ug，5.1 pmol。

如图10所示为银染后胶显色图（左），右为western 印迹（右）；上样为IBC，4 ug，1.7 pmol。

实施例3 [ ³ H] IP ₃ 放射性配体结合实验

放射性配体饱和结合分析的实验：如图9-1所示，放射性标记IP₃与NT受体饱和结合的实验曲线Scatchard plot。在TEM培养基（含30 ng 总蛋白）中，进行 [³H] IP₃与NT的饱和结合实验，并绘制得到Scatchard plot。

放射性配体竞争结合分析的实验：在4°C，500ul CLM中进行。CLM中含有[³H] IP₃（0.75 nM），纯化受体蛋白（1-4 ug）和作为竞争配体的待测化合物。部分实验中用TEM代替CLM。反应10分钟后，通过添加500 ul 的冰CLM终止反应。该CLM中包含30% 聚乙二醇8000和γ-球蛋白（600 ug），然后离心（20,000g，5min，4°C）。

离心后的固体溶解在200 ul 的CLM中，该CLM中含有2% Triton X-100,并且混有EcoScintA scintillation cocktail (National Diagnostics, Atlanta, GA) ，然后检测放射性。非特异性结合的检测是通过添加10 uM IP₃，或根据IP₃浓度的竞争结合曲线来进行推测，两种结果无明显区别。结合结果适用于Hill 方程（(Prism ver.5; GraphPad Software, San Diego, CA)。根据这一方程得到IC ₅₀, 继而，计算K _D and B _max (Kenakin,1997)。

如图9-2所示，为根据IP₃、放射性标记IP₃与NT受体的放射性配体竞争结合的实验绘制的曲线。在TEM培养基（150 ng 总蛋白）和CLM（4 ug 总蛋白）中，分别进行固定浓度的放射性标记[³H] IP₃（0.75 Nm）、梯度变化系列浓度的IP₃、与NT蛋白进行受体竞争结合实验，并计算结合率。

实施例4 使用FITC-IP ₃ 为荧光标记的荧光偏振（FP）实验

FP测量在温控室内，96-孔、半区、黑色圆底的聚苯乙烯微孔板(Greiner Bio-One, Gloucester, UK)上进行，使用Pherastar 酶标仪(BMG Labtech, Aylesbury, UK)读数。使用一套自动液体处理系统(Qiagility;QIAGEN, Crawley,WestSussex, UK)来进行液体稀释的自动操作。往微孔板添加液体的大部分动作也是这套系统自动化进行。隔一定时间定期评价这套自动化系统的精度和重复性(经过8次连续稀释后通常是5%的误差)都高于人工移液。

荧光偏振饱和结合分析实验：用CLM按梯度浓度稀释的蛋白（包含0.4-400 nM 的IP₃结合位点）与FITC-IP₃（0.5 nM ）混合，最终体积为 50ul 。

荧光偏振竞争结合分析实验：用CLM按系列浓度稀释的竞争配体、 FITC-IP₃（0.5 nM ）混合、和受体蛋白（NT 80 nM；IBC 15 nM）混合。

每个温度条件下的微孔板在达到平衡（4-37℃）20分钟后进行FP测量。在这个温度范围内，CLM培养液中，由于Ca²⁺从培养基中释放出来引起的pH值改变(7.05-6.98)是微不足道的。在无[Ca²⁺]培养液中，pH值保持改变。激发波长为485 nm，发射波长为538 nm，测定水平方向和垂直方向的荧光强度。

荧光各向异性度（A）是从垂直方向(I _v)和水平方向(I _h) 的荧光强度计算得来的：

。

游离态FITC-IP₃的荧光各向异性度（A _F）可以在不添加受体蛋白时进行测量，FITC-IP₃结合态的荧光各向异性度（A _B）是在IBC饱和浓度（100 nM）或NT饱和浓度（300 nM）情况下测量。FITC-IP₃结合率（F _B）与体系荧光各向异性度（A _M）之间的关系如下：

。

FITC-IP₃结合率（F _B）是指与受体结合的FITC-IP₃结合态在荧光体总量中所占的分数。

非特异性结合导致的荧光各向异性度（A _NS）通过检测受体蛋白在每个浓度条件下被IP₃饱和结合（浓度10 uM）时的荧光各向异性度（A _I）。因为当FITC-IP₃与NT或IBC结合时，游离的FITC-IP₃浓度减少，对于IP₃没有饱和的情况，A _I值高估了其非特异性结合。我们的校正假设非特异性结合和游离的FITC-IP₃浓度是线性关系：

。

FITC-IP₃与IP₃Ｒ片段的特异性结合的荧光各向异性度（A _S）计算如下：

。

FITC-IP₃的特异性结合率：

。

实施例5　基于荧光偏振分析ＦＰ的平衡解离常数计算

测量FITC-IP₃与IBC、NT的平衡解离常数K _D，固定浓度的FITC-IP₃（0.5 nM）和不同浓度的受体蛋白一起孵育。测定能导致50%的FITC-IP₃（本实验中是0.25 nM）被结合的总受体蛋白浓度（R ₅₀）。导致50% FITC-IP₃被结合的游离蛋白浓度（K _D）可以通过纠正结合的蛋白浓度计算：K _D= R ₅₀-0.25 nM 。IP₃和Adenophostin A，与FITC-IP₃ 平衡竞争结合实验可以测定其平衡解离常数K _D。特异性导致FITC-IP₃复合物50%减少的竞争配体的受体蛋白（IC ₅₀），每个温度下竞争配体的K _D值（K _I）可以计算(Kenakin, 1997):

其中，K _D为FITC-IP₃在每个温度下的K _D；L _T=总 [FITC-IP₃]；R _T=总[NT]或总[IBC];B=在IC ₅₀条件下的[NT/IBC- FITC-IP₃复合物]，计算如下，B= L _T×F _BS。I=在IC ₅₀条件下的[游离的竞争配体],得自

I= IC ₅₀-0.5 R _T。

表1

表1列出了两种实验分析法测得的亲和力KD值。在相同条件（CLM 培养液4℃），FP和放射性配体结合分析,对这三个配体得到的KD值相近。

表2

表2显示了两种分析法提供了对K _D和B _max近似的估计。

综上所述，传统的放射性分析法和荧光偏振FP分析提供了近似的 K _D 估计值。NT 与 FITC-IP₃结合的K _D值(12.5±0.6 nM, n = 3) 的检测，通过在 CLM， 4°C， FITC-IP₃ (0.5 nM)条件下，测定荧光各向异性度A值随NT浓度增长的函数。如图11-1所示，为该条件下，荧光各向异性度A值随NT浓度增长的函数曲线。这个 K _D值和通过相同条件下与[³H] IP₃ (11.8±0.2 nM)的竞争分析得到的数值是近似的。

采取上述方式，就能较好地实现本发明。

Claims

1.FITC-IP₃的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）将上述反应体系摇匀后，避光室温孵育48h；

2.如权利要求1所述的FITC-IP₃的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）反应体系配置：将20 μmol 2-氧-(2-氨乙基)-IP₃溶解于0.75 ml四氘代甲醇中，添加50μl三乙基胺，再添加50 μmol FITC 固体；

（2）将上述反应体系摇匀后，避光室温孵育48h；

3.如权利要求2所述的FITC-IP₃的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中20 μmol FITC 固体分两次加入，第一次添加30 μmol FITC固体，封口，摇匀，避光室温孵育4h；此时第二次添加20 μmol FITC固体，继续避光室温孵育44h。

4.如权利要求1至3任一项所述的FITC-IP₃的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的纯化步骤为：用甲醇将步骤（2）处理后的反应体系冲洗到圆底烧瓶中，然后减压浓缩至圆底烧瓶中物质呈固体粉末状;往圆底烧瓶中添加10ml去离子水吸收减压浓缩后的固体；将圆底烧瓶的液体加载到避光的Q Sepharose Fast Flow resin凝胶上；先用去离子水洗提，再用0.6M 的TEAB缓冲液洗提，直到洗脱液无色为止；Q Sepharose Fast Flow resin凝胶继续用梯度浓度的TEAB洗脱，收集洗脱液作为目标液体；将目标液体浓缩和结晶后，得到橙黄色的结晶体即为FITC-IP₃。

5.如权利要求4所述的FITC-IP₃的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤还包括：将所得到的结晶体重新溶解于去离子水中，加载到Chelex 100 分子生物纯树脂柱,然后用去离子水洗提；洗提液经过冷冻干燥后，得到高纯度的FITC-IP₃。

6.FITC-IP₃在荧光偏振分析中的应用，其特征在于，FITC-IP₃用于荧光偏振分析中，在荧光偏振分析实验中测定荧光各向异性度。

7.如权利要求6所述的FITC-IP₃在荧光偏振分析中的应用，其特征在于，在所述荧光偏振分析实验中，测定目的化合物和IP₃受体或具有IP₃结合结构域的IP₃受体多肽之间的亲和力。