CN102277440A

CN102277440A - 结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102277440A
Application number: CN2011102534476A
Authority: CN
Inventors: 吴蓓蓓; 王晓萌; 丛黎明; 帅江冰
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明提供了一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒，主要包括样品DNA提取试剂、PCR反应试剂和特异性扩增引物，所述特异性扩增引物由16S rRNA扩增引物MTC与Rv0355扩增引物CD192组成，所述引物序列如下：MTC-1：5’-ACGGTGGGTA CTAGGTGTGGGTTTC-3’，MTC-2：5’-TCTGCGATTACTAGCGACTC CGACTTCA-3’；CD192-1：5’-TCCGCTGCCGAGAATGT TGTAAT-3’，CD192-2：5’-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3’。本发明通过对结核与非结核分枝杆菌种属特异性基因的分析、引物的选择设计以及检测条件的优化后，提供的多重PCR检测试剂盒在应用中更加准确、灵敏、快速。

Description

结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

结核病是严重危害我国人民健康的慢性传染病，它不仅是重要的公共卫生问题，而且是一个复杂的社会经济问题，在一定程度上影响了社会经济的发展。其疫情的严重性主要表现为高感染率、高患病率、高死亡率、高耐药率、低递降率。尽管近年来我国在执行标准化治疗和提高治愈率上有了长足的进步，但仍然是结核病高负担国家。快速准确诊断技术的缺乏和病人发现的困难是我国控制结核病的最大障碍。我国依旧用落后的细菌学方法(痰涂片及固体培养)作为结核病的实验室诊断工具，检出率低、漏检率高、时效性差，严重延误患者特别是耐多药结核病患者的最佳治疗时间。非结核分枝杆菌广泛存在于自然界，当机体免疫受损时，也会引发肺内或肺外感染，其临床症状与结核病酷似，临床上固体培养阳性的分枝杆菌中，5％-10％为非结核分枝杆菌。目前国内外已建立了一些检测结核分枝杆菌的分子生物学方法，但非结核分枝杆菌的检测方法较少，同时检测结核与非结核分枝杆菌并能稳定应用于临床样本的检测方法更少。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中的不足，提供一种快速检测试剂盒，以及基于该试剂盒的检测方法。

本发明通过对16S rRNA及新基因Rv0355的分析、引物的选择以及检测条件的优化，设计一种准确、灵敏、快速的双重PCR检测试剂盒及检测方法，以期提高我国结核与非结核分枝杆菌检测能力。

本发明采用的技术方案是：

一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒，主要包括样品DNA提取试剂、PCR反应试剂和特异性扩增引物，其特征在于：所述特异性扩增引物由16S rRNA扩增引物MTC与Rv0355扩增引物CD192组成，所述引物序列如下：

引物MTC(产物长度543bp)：

上游引物MTC-1：5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’

下游引物MTC-2：5’-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3’

引物CD192(产物长度238bp)：

上游引物CD192-1：5’-TCCGCTGCCGAGAATGTTGTAAT-3’

下游引物CD192-2：5’-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3’。

本发明的关键在于扩增引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。其中样品DNA提取试剂可包括稀释液和裂解液，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将Tris-HCl、KCl、MgCl₂等按比例混合进行配制，进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物混合，再加入待测样品或对照品，即可进行PCR扩增反应。

为进一步提高试剂盒检测准确性，所述试剂盒中还可包括结核分枝杆菌阳性对照品和非结核分枝杆菌阳性对照品。

具体的，所述试剂盒可由5个冻存管组成：

冻存管A装有裂解液5mL；

冻存管B装有PCR反应体系溶液，组成如下：

溶剂为水；

PCR buffer终浓度为1×，是指PCR buffer中各组分在PCR反应体系中的终浓度与1×PCR buffer相同。通常采用体积为PCR反应体系1/10的10×PCR buffer，或者1/5的5×PCR buffer。

冻存管C装有0.2mL结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管D装有0.2mL非结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管E装有稀释液5mL。

本发明还涉及一种利用所述试剂盒检测结核与非结核分枝杆菌的方法，所述方法包括：

(1)利用DNA提取试剂提取待测样品DNA；

(2)以待测样品DNA为模板，加入PCR反应试剂和特异性扩增引物配制PCR反应体系，进行PCR扩增；

(3)扩增产物进行凝胶成像系统分析，若待测样品扩增出543bp和238bp两条条带，判断为结核分枝杆菌；若待测样品只扩增出543bp条带，则判断为非结核分枝杆菌。

优选的，所述试剂盒由5个冻存管组成：

冻存管A装有裂解液5mL；

冻存管B装有PCR反应体系溶液，组成如下：

溶剂为水；

冻存管C装有0.2mL结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管D装有0.2mL非结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管E装有稀释液5mL；

所述方法如下：

(A)富集经4％(w/w)NaOH消化的样本或菌株，加入冻存管E中稀释液20μL，涡旋震荡混匀后，加入冻存管A中的裂解液20μL；

(B)98℃恒温金属浴30min，13000rpm离心3min后，-20℃保存备用；

(C)分别取冻存管B中的溶液22μL加入PCR反应管中，再分别取冻存管C或D中的阳性对照溶液或待检样品3μL加至各PCR反应管与冻存管B溶液混合；

(D)将各PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃5min；94℃35s，67℃30s，72℃1min30s，45或者25个循环(样本45个循环，菌株25个循环)；72℃10min；

(E)将扩增后的产物在1.5％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析；

(F)结果判定：若待检样品与阳性对照溶液C同时扩增出543bp和238bp两条条带，判断为结核分枝杆菌；若待检样品与阳性对照溶液D同时只扩增出543bp条带，判断为非结核分枝杆菌；若阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带，则判断为阴性即非分枝杆菌；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。

本发明的有益效果主要体现在：通过对结核与非结核分枝杆菌种属特异性基因的分析、引物的选择设计以及检测条件的优化后，提供的多重PCR检测试剂盒在应用中更加准确、灵敏、快速。

(四)附图说明

图1为结果判定示意图；M为100bp DNA Ladder Marker；Lane1为空白对照；Lane2，3为阳性对照；Lane4，5，6为待检样品。

图2为结核与非结核分枝杆菌阳性对照扩增产物电泳图；M为100bpDNA Ladder Marker；Lane1为空白对照；Lane2为非结核分枝杆菌阳性对照；Lane3为结核分枝杆菌阳性对照。

图3为本试剂盒检测特异性-不同分枝杆菌扩增产物电泳图；M为100bp DNA Ladder Marker；Lane1为结核分枝杆菌H37Rv；Lane2为牛分枝杆菌；Lane3卡介苗；Lane4为非洲分枝杆菌；Lane5为草分枝杆菌；Lane6瘰疬分枝杆菌；Lane7为戈登；Lane8为胞内分枝杆菌；Lane9鸟分枝杆菌；Lane10为土分枝杆菌；Lane11为偶然分枝杆菌；Lane12为耻垢分枝杆菌；Lane13为堪萨斯分枝杆菌；Lane14龟或脓肿分枝杆菌；Lane16为假白喉棒状杆菌；Lane17为普通变形杆菌。

图4为本试剂盒检测灵敏度-阳性对照菌株不同细菌量扩增产物电泳图；M为100bp DNA Ladder Marker；A：结核分枝杆菌H37Rv，1为9×10⁷CFU/mL，2为9×10⁶CFU/mL，3为9×10⁵CFU/mL，4为9×10⁴CFU/mL，5为9×10³CFU/mL，6为9×10²CFU/mL，7为9×10CFU/mL，8为9×10⁰CFU/mL，9为9×10^-1CFU/mL，10为9×10^-2CFU/mL，11为9×10-3CFU/mL，12为9×10^-4CFU/mL，13为9×10^-5CFU/mL；B：胞内分枝杆菌，1为3×10⁷CFU/mL，2为3×10⁶CFU/mL，3为3×10⁵CFU/mL，4为3×10⁴CFU/mL，5为3×10³CFU/mL，6为3×10²CFU/mL，7为3×10CFU/mL，8为3×10⁰CFU/mL，9为3×10^-1CFU/mL，10为3×10^-2CFU/mL，11为3×10-3CFU/mL，12为3×10^-4CFU/mL，13为3×10^-5CFU/mL；C：堪萨斯分枝杆菌，1为5×10⁸CFU/mL，2为5×10⁷CFU/mL，3为5×10⁶CFU/mL，4为5×10⁵CFU/mL，5为5×10⁴CFU/mL，6为5×10³CFU/mL，7为5×10²CFU/mL，8为5×10CFU/mL，9为5×10⁰CFU/mL，10为5×10^-1CFU/mL，11为5×10^-2CFU/mL，12为5×10^-3CFU/mL，13为5×10^-4CFU/mL。

图5为本试剂盒检测分离株及临床样本；A：分离株检测，M为2000bpDNA Ladder Marker，Lane1～16为结核分枝杆菌分离株；B：临床样本检测，Lane1～-14为临床样本，Lane1为非分枝杆菌；Lane10，13，14为非结核分枝杆菌；Lane15为空白对照；Lane16为结核分枝杆菌阳性对照。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

本发明的试剂盒包括5个含有不同成分的冻存管，若辅以100个PCR管及加样及检测步骤说明组成，可进行100次检测。

一、冻存管组成

A管为5mL裂解液(Triton-x 100 0.2mL，Tris 1mol/L)。

B管为混合液2.5mL，由如下溶液混合而成：

10×PCR buffer(市购，北京全氏金生物技术有限公司)0.25mL；

250μM dNTP(市购，北京全氏金生物技术有限公司)0.2mL；

各10μM引物对(序列见表1)16S rRNA、Rv03550.1mL；

0.05U/μL Taq DNA polymerase(市购，北京全氏金生物技术有限公司)0.05mL；以ddH₂O补足至2.5mL。保存于-20℃。

C管含有0.2mL结核分枝杆菌阳性对照溶液(9×1⁰2CFU/mL结核分枝杆菌H37Rv裂解液)。保存于-20℃。

D管含有0.2mL非结核分枝杆菌阳性对照溶液(6×10²CFU/mL耻垢分枝杆菌裂解液)。保存于-20℃。

E管为5mL稀释液(ddH₂O)。

二、加样及检测步骤说明

(1)富集经4％NaOH消化的样本或菌株，加入冻存管E中稀释液20μL，涡旋震荡混匀后，加入冻存管A中的裂解液20μL；

(2)98℃金属浴30min，灭活并裂解细菌，13000rpm离心3min后，-20℃保存备用；

(3)将冻存管B中的溶液22μL加入PCR反应管，再将冻存管C、D中的阳性对照溶液3μL或待检样品3μL加至同一PCR反应管，混合均匀，立即检测；

(4)将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃5min；94℃35s，67℃30s，72℃1min30s，45个循环(菌株25个循环)；72℃10min；

(5)将扩增后的产物在1.5％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析；

(6)结果判定：检测后，待检样品与阳性对照溶液C同时扩增出543bp和238bp两条条带的为结核分枝杆菌(图1)；待检样品与阳性对照溶液D同时扩增出543bp条带的为非结核分枝杆菌(图1)；阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为待检样品阴性；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。

下面通过具体试验对本发明的使用效果进行论证和描述。

1材料与方法

1.1菌株及样本

参考菌株H37Rv由中国结核病参比实验室提供，由浙江省疾病预防控制中心保存；牛结核分枝杆菌、卡介苗由浙江省疾病预防控制中心保存；部分分枝杆菌由上海肺科医院惠赠；以上菌株均经过生化鉴定及博奥生物有限公司分枝杆菌菌种鉴定方法验证(详见表1)。929株结核分枝杆菌分离株分离自浙江各市县，由浙江省疾病预防控制中心保存。其他常见呼吸道细菌的参考菌株如假白喉棒状杆菌(Corynebacteriumpseudodiphtheriticum)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、弗氏枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、粪肠球菌(Enterrococcus faecalis)、白色念珠菌(Candida acicans)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)等亦由浙江省疾病预防控制中心保存(详见表1)。152份临床样本包括涂阴及涂阳痰标本、灌洗液、尿液、脓液与穿刺液等均来自杭州市红十字会医院。

表1：分枝杆菌参考菌株及阴性对照菌株

种别	菌株	种别
			结核分枝杆菌复合群	H37Rv	非洲分枝杆菌
	牛结核分枝杆菌	卡介苗
			非结核分枝杆菌	草分枝杆菌	瘰疬分枝杆菌
	戈登分枝杆菌	胞内分枝杆菌
				鸟分枝杆菌	土分支杆菌
	偶然分支杆菌	耻垢分枝杆菌
				堪萨斯分枝杆菌	龟或脓肿分枝杆菌
非分枝杆菌	假白喉棒状杆菌	普通变形杆菌
				弗氏枸橼酸杆菌	大肠埃希氏菌
	肺炎克雷伯杆菌	铜绿假单胞菌
				表皮葡萄球菌	金黄色葡萄球菌
	变异链球菌	唾液链球菌
				化脓链球菌	粪肠球菌
	白色念珠菌	淋病奈瑟氏菌

1.2DNA模板制备

离心1.5mL富集菌株或经4％NaOH消化的样本，灭菌水吹洗1次后，加入等体积裂解液和稀释液重悬，于沸水中作用30min后，13000rpm 4℃离心3min，保存于-20℃备用。

1.3PCR体系建立

1.3.1引物设计

国内外对结核与非结核分枝杆菌检测方法的研究较多，主要靶基因为16s rRNA、IS6110、rpoB及hsp65等，但对Rv0355基因的研究很少，其功能未知。分析基因序列并设计耐药基因扩增引物，引物序列详见表2。

表2：引物序列及产物长度

1.3.2PCR反应体系及条件

通过PCR体系及条件的优化，确定多重PCR反应体系为：10×TaqBuffer(含Mg²⁺)2.5μL，250μM dNTP Mix 2μL，10μM引物各1μL，DNA模板3μL，0.05U/μL Taq DNA polymerase 0.5μL，10×loading buffer2.5μL，加ddH₂O补足体积至25μL；反应条件为：95℃5min；94℃35s，67℃30s，72℃1min30s，25个循环；72℃10min。

loading buffer为上样缓冲液，可预先直接加在PCR反应体系中以简化操作步骤，也可在PCR结束后上样过程中添加。

1.3.3PCR产物测序鉴定

扩增产物割胶回收纯化后，按照T-A克隆策略连接至pMD18-T载体中，并热激法转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α。重组质粒通过PCR和EcoR I、HindIII双酶切鉴定后，将阳性克隆送往上海英骏生物技术有限公司测序。所测序列由Lasergene(version 7)软件分析。

1.3.4特异性试验

以分枝杆菌中结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、卡介苗、草分枝杆菌、戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶然分支杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、胞内分枝杆菌、土分支杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌等作为阳性对照，用建立的PCR方法进行扩增。以假白喉棒状杆菌、普通变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、变异链球菌、唾液链球菌、化脓链球菌、粪肠球菌、白色念珠菌、淋病奈瑟氏菌等14种细菌以及双蒸水作为阴性对照和空白对照，用建立的PCR方法进行扩增。

1.3.5菌落计数

用接种环分别取结核分枝杆菌H37Rv、胞内分枝杆菌及堪萨斯分枝杆菌，加适量PBS研磨并调整至标准Mcfarland No.1比浊管浓度。10倍梯度稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12菌悬液备用。用微量加样器吸取10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10的菌悬液0.1ml分别接种于无药培养基上作活菌计数。

1.3.6敏感性试验

取1mL各稀释度菌悬液离心，提取DNA模板，用建立的PCR方法进行扩增。

1.5分离株及临床样本检测

929株结核分枝杆菌分离自浙江各市县，152份临床样本来自杭州市红会医院。用本试剂盒进行检测。

1.6加样及检测步骤

1.6.1将富集经处理的临床样本或菌株，加入冻存管E中稀释液20μL，涡旋震荡混匀后，加入冻存管A中的裂解液20μL；98℃金属浴或30min，灭活并裂解细菌，13000rpm离心3min后，-20℃保存待检；

1.6.2将冻存管B中的溶液22μL加入PCR反应管，再将冻存管C、D中的阳性对照溶液3μL或待检样品3μL加至同一PCR反应管，混合均匀，立即检测；

1.6.3将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃5min；94℃35s，67℃30s，72℃1min30s，45个循环(菌株25个循环)；72℃10min；

1.6.4将扩增后的产物在1.5％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。

2结果

2.1检测基因鉴定与分析

国内外对结核与非结核分枝杆菌检测方法的研究较多，主要靶基因为16s rRNA、IS6110、rpoB及hsp65等，但对Rv0355基因的研究很少，其功能未知。将两个目的基因扩增后割胶回收纯化，连接至pMD18-T载体，重组质粒PCR和EcoR I、HindIII双酶切鉴定阳性，测序结果经序列分析确定为16s rRNA和Rv0355基因。

2.2多重PCR和试剂盒检测结果

利用试剂盒对阳性对照DNA进行扩增，如图2所示，结核分枝杆菌在543bp和238bp处得到目的条带，非结核分枝杆菌在543bp处得到目的条带。

2.3特异性试验

利用本试剂盒分别对结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、卡介苗、非洲分枝杆菌、草分枝杆菌、戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶然分支杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、胞内分枝杆菌、土分支杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌进行扩增，结果如图3所示，结核分枝杆菌复合群的菌株均显示543bp和238bp两条目的条带，非结核分枝杆菌均显示543bp一条目的条带。对假白喉棒状杆菌、普通变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、变异链球菌、唾液链球菌、化脓链球菌、粪肠球菌、白色念珠菌、淋病奈瑟氏菌等14种细菌进行扩增，结果显示无任何条带，表明该多重PCR反应扩增基因片段具有良好的特异性。

2.4敏感性试验

利用试剂盒对各稀释度的菌液进行检测，结果见图4。结合菌落计数结果显示，当结核分枝杆菌菌液含有约9×10⁰CFU/mL细菌时，均可见相应的目的条带产物，表明该方法对结核分枝杆菌敏感性可达9CFU/mL以上；当胞内分枝杆菌菌液含有约3×10⁰CFU/mL细菌时，均可见相应的目的条带产物，表明该方法对胞内分枝杆菌敏感性可达3CFU/mL以上；当堪萨斯分枝杆菌菌液含有约5×10⁰CFU/mL细菌时，均可见相应的目的条带产物，表明该方法对堪萨斯分枝杆菌敏感性可达5CFU/mL以上。以上结果表明该方法对分枝杆菌各个种的敏感性均可达10⁰CFU/mL。

2.5多重PCR检测方法和试剂盒在临床菌株和样本的初步评价

利用试剂盒对929株结核分枝杆菌分离株和152份临床样本进行检测。929株分离株的检测结果显示，只有1株结核分枝杆菌未显示目的条带，后经16s rRNA测序分析显示该菌株为非分枝杆菌，其余928株均显示2条目的条带，如图5所示。结合临床样本的涂片镜检及培养结果，152个临床样本的检测结果显示，涂片镜检2+以上的22个样品均PCR阳性；仅有数条及1+的39个样本有35个PCR阳性，有34个培养阳性；在20个涂阴培阳临床样本中，17个PCR阳性，71个涂阴培阴临床样本中，15个PCR检测阳性。随机选取扩增产物进行序列检测，测序结果均与阳性对照基因序列一致。以上结果均证实该多重PCR快速检测试剂盒有较高准确性和可靠性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省疾病预防控制中心

<120> 结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

acggtgggta ctaggtgtgg gtttc 25

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

tctgcgatta ctagcgactc cgacttca 28

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

tccgctgccg agaatgttgt aat 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

cgcgggcgtg ctggtatc 18

Claims

1.一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒，主要包括样品DNA提取试剂、PCR反应试剂和特异性扩增引物，其特征在于：所述特异性扩增引物由16S rRNA扩增引物MTC与Rv0355扩增引物CD192组成，所述引物序列如下：

引物MTC：

上游引物MTC-1：5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’

下游引物MTC-2：5’-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3’

引物CD192：

上游引物CD192-1：5’-TCCGCTGCCGAGAATGTTGTAAT-3’

下游引物CD192-2：5’-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3’。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括结核分枝杆菌阳性对照品和非结核分枝杆菌阳性对照品。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由5个冻存管组成：

冻存管A装有裂解液5mL；

冻存管B装有PCR反应体系溶液，组成如下：

溶剂为水；

冻存管C装有0.2mL结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管D装有0.2mL非结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管E装有稀释液5mL。

4.利用权利要求1所述试剂盒检测结核与非结核分枝杆菌的方法，所述方法包括：

(1)利用DNA提取试剂提取待测样品DNA；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试剂盒由5个冻存管组成：

冻存管A装有裂解液5mL；

冻存管B装有PCR反应体系溶液，组成如下：

溶剂为水；

冻存管C装有0.2mL结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管D装有0.2mL非结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管E装有稀释液5mL；

所述方法如下：

(A)富集经4％NaOH消化的样本或菌株，加入冻存管E中稀释液20μL，涡旋震荡混匀后，加入冻存管A中的裂解液20μL；

(B)98℃恒温金属浴30min，13000rpm离心3min后，-20℃保存备用；

(D)将各PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃5min；94℃35s，67℃30s，72℃1min30s，45或者25个循环；72℃10min；

(F)结果判定：若待检样品与阳性对照溶液C同时扩增出543bp和238bp两条条带，判断为结核分枝杆菌；若待检样品与阳性对照溶液D同时只扩增出543bp条带，判断为非结核分枝杆菌；若阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带，则判断为阴性；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。