CN102277398B - 高生物利用度改性果胶制备工艺及抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多糖的制备工艺及应用，尤其涉及一种高生物利用度、低分子量改性果胶(MPHB)的制备工艺及其在抗肿瘤领域中的应用。所公开工艺包括如下步骤：将果胶与水混合，加热，溶胀；冷却，用碳酸盐溶液调节pH，以果胶酯酶(EC 3.1.1.11)降低酯化度，提高温度灭活酶；冷却，以聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)或果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)降解果胶主链，产物经膜过滤、脱盐、浓缩与干燥获得MPHB。本发明所述工艺利于规模化制备MPHB，利于控制其分子量与分子量分布。MPHB具有抗肝癌、宫颈癌等活性，在其口服配方中添加肠吸收促进剂，利于进一步提高生物利用度。

Description

高生物利用度改性果胶制备工艺及抗肿瘤应用

技术领域

本发明涉及一种多糖的制备工艺及应用，尤其涉及一种高生物利用度改性果胶的制备工艺及其在抗肿瘤领域的应用。

背景技术

提高生物活性、降低毒性、提高生物利用度是开发新药，获得成功的重要方法。提高生物利用度，对于高分子药物意义尤其重大。

果胶(pectin)是一种主要来源于植物的多糖，产生于较为高等的植物初级细胞壁和细胞间质内，它是一个异型分枝(heterogeneous branched)的杂多糖家族。几乎所有的植物中都含有果胶，柑橘、苹果等水果含量尤为丰富。果胶被世界粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)等机构确定为食品原料，证实了其安全性。以果胶为原料制备抗肿瘤药物或功能食品，是其区别于具有较高毒性的化疗药物的优势之一。

某些多糖其生物活性与其高级结构有关；某些多糖其生物活性仅与其线性结构有关。对于后者，分离其活性片断、简化其分子(例如通过降解多糖获得低分子多糖)，有利于富集其“药效基团(pharmacophore)”，提高多糖的“类药性(druglikeness)”和生物活性。果胶一词描述的是这样一组多糖：其分子中存在大量部分甲酯化的半乳糖醛酸和少量鼠李糖。果胶结构由两部分组成：长长连续的、“平滑的”同聚半乳糖醛酸(homogalacturonan，缩写作HG)骨架，以及短短的、“毛发状的”(hairy region or ramified region)鼠李糖半乳糖醛酸聚糖支链。α-(1→4)糖苷键连接的D-半乳糖醛酸单元被(1→2)糖苷键连接的鼠李糖残基插入，形成鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan，缩写作RG)。

4)-α-D-GalpA-(1，2)-α-L-Rhap-(1，

果胶毛发区分为RG-I和RG-II两类。连接有半乳糖、木糖和阿拉伯糖等中性糖侧链的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖，称为RG-I。RG-II含有非常复杂的中性糖支链，例如芹菜糖(apiose)、2-酮-3-脱氧辛糖酸(2-keto-3-deoxy-octanoic acid，KDO)，但半乳糖残基含量不显著。

天然多糖往往生物活性缺失或很低，但经过改性可提高其生物活性。多糖常作为生物应答调节剂(biological response modifier，BRM)起作用，而作为BRM首先要求生物体能够吸收它，即具有高生物利用度。对果胶进行改性，提高其生物利用度可提高生物活性便是多糖改性成功的例子。果胶在肿瘤预防、治疗中的应用早有研究。据李时珍《本草纲目》记载：“乳癌(乳房内有核如指头，不痛不痒，五、七年成痈，名乳癌)。用青皮四钱，加水一碗半煎成一碗，徐徐服下。一天服一次，或用酒送服亦可。”这里所述的青皮指柑橘皮。用现代的观点推断，存在于柑橘皮中的果胶多糖经过煎煮使得长链被打断变成短链并易于被血液吸收。研究较多的果胶的抗癌活性是其抗结肠癌活性[高林.MCP多糖的制备、分析鉴定及其抗肿瘤作用的研究[D].天津大学硕士学位论文，2005；张文博.改性柑橘果胶的制备、表征及抗癌活性[D].天津大学博士学位论文，2006]。早期的果胶抗肿瘤研究通常都是指不溶性果胶，其抗癌机理可能与其作为膳食纤维(dietary fiber)的功能有关。

对果胶改性以提高其抗肿瘤活性并扩大其“抗癌谱”，其一需要提高其生物利用度，其二需要富集和暴露其“药效基团”。改性柑橘果胶(modified citrus pectin，MCP)是通过水解天然柑橘果胶(CP)而获得的一种分子量更小、酯化度(degree of methylation，DM)更低、分枝更短的果胶多糖，是果胶改性成功的典范。与CP相比，酸碱降解后的果胶更易被小肠微绒毛吸收，并直接进入血管进而在体内存留。Platt等[Platt D，Raz A.Modulation of the Lung Colonization of B16-F1Melanoma Cells by Citrus Pectin[J].J Natl Cancer Inst.1992，84(6)：438-442.]报道，注射MCP可明显减少小鼠植入B16-F1黑色素瘤细胞后的肺部集落，而CP则增加其肺部集落。MCP可能通过与肿瘤表面过表达的半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)相互作用而起到抗肿瘤转移等作用。目前国内外多家研究机构与公司，通过降解柑橘果胶或者其他类型的果胶以获得分子量更低、酯化度更低能够被人体吸收，具有抗肿瘤活性的低分子量改性果胶(Modified Pectin with HighBioavailability，low molecular mass and antitumor activities，本文简称MPHB)。MCP中末端半乳糖残基可能起到识别Gal-3的作用，从而具有抗肿瘤转移等活性。酯化度、糖醛酸含量等可能影响MPHB在体内的吸收、转运、降解等过程。MCP具有较低的DM。果胶在较高DM(超过30％)时，主要在肠道起作用[Kunz etal.Method for producing pectin hydrolysis products[P].美国专利：7960351，2010-06-14.]；较低DM则能不仅增强果胶的水化度，而且可能还会使MCP易于接近体内靶点。虽然果胶HG与毛发区对于免疫增强活性或凋亡诱导活性可能有贡献，但尚无确切结论，而且果胶高级结构与抗肿瘤活性之间的关系尚无系统研究。张文博等[张文博等.改性柑橘果胶的制备、表征及抗癌活性[J].高等学校化学学报，2010，31(5)：964～969.]制备的MCP其骨架结构主要为HG和RG-I，并含有末端半乳糖，据作者推测，与RG-I相连的分枝结构可能是该多糖抗肿瘤活性的关键位点。

果胶既可以通过酸碱处理(化学法)、也可以通过酶法处理(生物法)获得适宜的酯化度(degree ofmethylation，DM)、适宜分子量的低分子量改性果胶。碱皂化反应，降解半乳糖醛酸甲酯键，在降低酯化度的同时，发生β-消除反应，能降低果胶分子量。果胶进一步经过高温酸解，分子量继续降低。皂化与酸解过程发生一种脱皮效应(peeling effect)，导致果胶毛发区部分或完全被降解，中性糖含量降低。事实上，HG的糖苷键受到羧酸根的影响，在酸处理下的稳定性远远大于中性糖组成侧链对酸的稳定性。果胶，尤其是酯化度高的果胶，几乎完全不能溶解于水，生物利用度几乎为零。将果胶与水混合，其状态与普通淀粉和水混合的状态一致，即团块表面已经逐步水化、溶胀，而团块中心可能仍然干燥。采用规模较大的容器对果胶进行降解之初期，有些团块完全悬浮于溶液主体表面；有些团块粘附于容器壁；有些团块沉淀在容器底部。即便搅拌速度很快，这些团块表面发生皂化后，仍然有很多果胶尚未发生反应。但是，由于皂化反应、脱皮效应、β-消除反应等过程几乎同时进行，导致部分果胶片段分子量过小，成为分子量小于2000道尔顿(简称Da)的果胶寡糖或皂化完全的果胶酸(pectic acid)；部分果胶尚未充分反应，成为溶解度差、难以吸收的胶状果胶。这种酸碱降解的工艺，在产能放大时，导致分子量分布严重变宽。此外，据Jackson报道[Jackson CL et al.Pectin induces apoptosis in human prostate cancer cells：correlation of apoptotic functionwith pectin structure[J].Glycobiology，17(8)：805-819.]，经过碱处理的果胶将失去诱导肿瘤细胞凋亡的能力，而加热处理是使果胶获得诱导肿瘤细胞凋亡能力的关键因素。Sathisha UV等[Sathisha UV，et al.Inhibition ofgalectin-3mediated cellular interactions by pectic polysaccharides from dietary sources[J].Glycoconj J.2007，24(8)：497-507.]对从燕麦、印度菝葜、黑色小茴香种、姜、柑橘等六种植物提取的果胶半乳糖凝集素活性抑制情况进行了比较，其结果表明，半乳糖等中性糖含量高的果胶，其半乳糖凝集素酶抑制活性越高。总之，通过酸碱处理果胶，果胶毛发区降解程度远远快于主链HG降解程度，不利于控制分子量与分子量分布，不利于保持毛发区的含有末端半乳糖的活性结构，而不一致的降解程度导致不一致的活性。MCP已经证实能够在肿瘤生长、肿瘤血管生长、侵袭、转移等过程中起抑制作用。以含有RG-II结构的果胶为原料制备的MCP，具有帮助体内排出铅等重金属的作用，这种作用可能与半乳糖醛酸的螯合作用有关。MCP是一种特殊的MPHB。在研究MPHB的过程中，其抗肿瘤活性与结构特征之间的构效关系必将更加清晰。通过专一性酶解析果胶结构是研究其构效关系的主要方法。

降低分子量是使药物候选物(drug candidate)获得“类药性(druglikeness)”的重要方式，降低果胶分子量的同时有助于增加其生物利用度。对于己糖醛酸而言，降低酯化度之后，羧酸之邻位效应导致酸降解果胶主链HG的糖苷键效率大大下降；而酶对于降解果胶主链糖苷键效率高。果胶酶(pectinase)是一类降解果胶的酶的总称，有时也专指果胶内切酶(Polygalacturonase或pectic enzyme，EC3.2.1.15，简称PG或endo-PG)。PG能专一裂解果胶的HG部分，使果胶分子量下降。果胶酯酶(pectinesterase，EC3.1.1.11)能专一性降解聚半乳糖醛酸与羧基相连的甲氧基。酶作用于果胶，条件温和可控，不存在脱皮效应、β-消除反应等过程，在降低分子量与酯化度的同时，不会导致果胶毛发区中性糖含量的下降。而保持RG-I结构的相对完整性，并可能富集果胶的药效位点-末端半乳糖残基，这些步骤可能对于保证MPHB具备抗肿瘤活性非常关键。经PG降解后的果胶，通常可以使分子量小于70000Da。对于某些高分子量果胶原料，根据原料果胶结构的差异，经PG处理后，需要补加鼠李糖半乳糖醛酸酶、木聚糖酶或阿拉伯聚糖酶，才能高收率地获得低分子量果胶。

当前制备具有抗肿瘤活性低分子量果胶的工艺普遍采用乙醇或甲醇沉淀法纯化[Platt.Modifiedpectin[P].美国专利：7491708，2009-02-17；范晓青.低分子柑桔果胶用于调节血糖血脂和改善脂肪肝中的应用[P].中国专利：200610051667.X，2006-12-27.]。但产物的分子量分布(polydispersity，PD)往往在2以上，而且随着规模的放大，分子量分布不断加大。此外，乙醇沉淀法获得的产品往往混有较多的氯化钠。Kunz等[Kunz et al.Method for producing pectin hydrolysis products[P].美国专利：7576070，2009-08-18.]采用离心或过滤的方式纯化多糖。但是，由于果胶黏度大，离心或普通的过滤方法不适宜处理大量样品，在中试或产业化领域没有应用前景。

超滤法具有分子级分离，无相变，无污染，条件易控制等优点。采用错流过滤模式可以有效地避免浓差极化现象及减少膜污染。将适量的酶加入果胶稀溶液，采用边降解，边过滤的方式，可以实现在线分离。这种反应与分离同时进行的模式，可以有效提高MPHB收率。

多糖含有大量羟基，不易干燥。如果采用普通烘干或加热真空干燥的工艺，产品容易凝结成块、硬度大、颜色深，所以少量样品往往采用冷冻干燥的方式。但是由于冷冻干燥工艺成本太高，不适宜大规模制备样品。喷雾干燥、微波干燥都是工业上的高效烘干方法，能够处理大批量物料。通过进料多糖含量、进风温度、出风温度、进风压力等参数可以优化喷雾干燥的条件，获得粉末状产品。微波干燥设备简单、干燥速率快。

作为一种BRM，包括MPHB在内的多糖，常会表现出量效关系不明显的现象。肠道吸收促进剂(intestinal absorption enhancers，IAE)有利于提高多糖类药物的生物利用度，减少病人用药量，减轻量效关系不明显的影响。并非所有的IAE对多糖吸收都有促进作用。许多肠吸收促进剂具有细胞毒性，从而影响了MPHB的药效作用。有些IAE则对MPHB无吸收促进作用。经Caco-2细胞模型筛选，表明癸酸钠、n-月桂基-β-D-麦芽吡喃糖苷等IAE对MPHB具有良好的吸收促进作用且无明显毒性。

发明内容

本发明的目的在于公开一种制备改性果胶MPHB的新工艺。

本发明的目的还在于提供一种规模化生产MPHB的纯化方法及质量控制方法。

本发明的另一目的在于提供一种MPHB的应用方法。

为实现上述目的，本发明技术方案包括：

为了制备MPHB，原料果胶在加热条件下用水溶解和溶胀，用碳酸盐溶液调节pH至4.5～8.5之间(果胶溶液通常偏酸性)，冷却温度达到或略高于果胶酯酶(EC3.1.1.11)的最适反应温度，并以果胶酯化度达到0.4％至10％范围内为反应终点。降低温度，达到适合聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)或果胶裂解酶(EC4.2.2.10)进行催化的条件反应，用该两种酶中的一种或其组合控制分子量及分子量分布，产物经膜过滤、脱盐、浓缩与干燥获得改性果胶MPHB。干燥方法包括但不限于喷雾干燥、微波干燥、红外干燥和冷冻干燥。

为了控制MPHB的分子量与分子量分布，同时为了得到较纯的产品，采取多次膜过滤法，便于工艺放大。采用超滤膜，以错流过滤模式进行操作。首先以第一组截流分子量(MWCO)在280000Da到70000Da之间的膜进行过滤以除去大分子果胶与果胶酶，起到纯化和降低第二组膜操作压力的作用，操作压力维持在0.08-0.30MPa之间；滤出液采用第二组膜(其MWCO在10000Da到70000Da之间)进行过滤，操作压力维持在0.06-0.20MPa之间，操作温度维持在30-45℃。如果膜的操作压力过大，可以在料液中适度添加聚半乳糖醛酸酶或果胶裂解酶。使用MWCO在2000Da～200Da之间的超滤膜或纳滤膜，滤除小分子部分，其中包括盐(例如碳酸钠)、果胶寡糖等成分。

为了使MPHB具有抗肿瘤活性，其质量控制需采取如下方案：原料果胶需具备RG-I结构，毛发区需含有半乳寡聚糖、产物MPHB需含有末端半乳糖残基结构；产物分子量需在70000Da到2000Da之间；产物酯化度介于0.4％至10％之间。

为了提高MPHB的生物利用度，可在口服配方中添加肠道吸收促进剂。肠道吸收促进剂包括但不限于中链脂肪酸盐、胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、壳聚糖及其衍生物、卡波姆、十二烷基麦芽糖苷。

本发明的有益效果在于：本制备工艺的方案有利于规模化制备MPHB；有利于控制分子量及其分布；有利于脱除盐类等小分子杂质、纯化产品和质量控制；有利于替代使用污染环境的盐酸和氢氧化钠的工艺；添加肠道吸收促进剂的技术方案有利于提高MPHB的生物利用度。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明的范围。

实施例一

称取5kg酯化度为60％的柑橘果胶，加入5000L水，混合，加热至60℃，保持12h，以充分溶胀；冷却至45℃，向同一容器内用碳酸钠溶液调节pH至8.0，加入市售果胶酯酶，搅拌均匀。经测定，果胶酯化度降低到1％时，升温至80℃保持1h，以终止果胶酯酶的作用。向同一容器内加入市售聚半乳糖醛酸酶，经酶降解，采用高效凝胶色谱检测分子量及分子量分布，使产物主要组分峰均分子量在70000Da到2000Da的范围。采用第一组截流分子量(以下简称MWCO)为100000Da的膜，分离除去高分子量果胶和酶；采用MWCO45000Da的第二组膜浓缩果胶溶液，如果过滤操作压力超过0.30MPa且持续不降低，则补加少量聚半乳糖醛酸酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶，继续过滤。滤出液采用MWCO为2000Da的第三组膜浓缩果胶溶液，同时除去寡糖、盐等小分子组分，浓缩，产物经微波干燥，获得具有抗肿瘤活性可口服的4.25kg改性果胶MPHB。

实施例二

称取100kg酯化度为40％的椪柑(ponkan)皮果胶加入1000L水，混合，加热至95℃，保持3h，溶胀；冷却至55℃，向同一容器内用碳酸钾溶液调节pH至4.5，加入果胶酯酶，搅拌均匀。经测定，果胶酯化度降低到0.4％时，升温至90℃保持30min。向同一容器内加入果胶裂解酶，经酶降解，使产物主要组分峰均分子量在50000Da到2000Da的范围。采用MWCO为70000Da的膜，分离除去高分子量果胶和酶；采用MWCO为45000Da的膜浓缩果胶溶液，产物经喷雾干燥，获得具有抗肿瘤活性可口服的83.50kg MPHB。

实施例三

称取1kg酯化度为70％的柚(Citrus grandis)皮果胶加入50L水，混合，加热至90℃，保持8h，溶胀；冷却至50℃，向同一容器内用碳酸钠溶液调节pH至8.5，加入果胶酯酶，搅拌均匀。经测定，果胶酯化度降低到10％时，升温至85℃保持90min。向同一容器内加入果胶裂解酶和聚半乳糖醛酸酶的混合液，经酶降解，使产物主要组分峰均分子量在20000Da左右。采用MWCO80000Da的膜，分离除去高分子量果胶和酶；采用MWCO20000Da的膜浓缩果胶溶液，产物经冷冻干燥，获得具有抗肿瘤活性可口服的0.68kg MPHB。

实施例四

为了筛选与验证MPHB的抗肿瘤活性，进行如下实验：

(一)、抗肝癌测试

取昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g。小鼠肝癌H₂₂细胞由小鼠腹腔内接种连续传代。无菌抽取接种后第7天的H₂₂小鼠的腹水，用无菌生理盐水按1∶3稀释后，制成细胞悬液(肿瘤细胞数为：2.5×10⁷个/mL)，每只小鼠左腋下接种0.2mL。接种后50只小鼠随机分5组，分别为生理盐水对照组(NS组)、阳性对照组(环磷酰胺，CY，30mg/kg)、MPHB高剂量(4mg/kg)、中剂量(2mg/kg)、低剂量(1mg/kg)组，小鼠自由进食，饮水，活动。接种24h后MPHB给药组灌胃(ig)给药，连续给药7d，CY组试验期间腹腔注射两次，隔日给药。期间，每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。最后一次给药24h后，断颈处死动物，称量瘤重并计算抑瘤率。

若试验期间阴性组动物肿瘤平均重量小于1g或20％的鼠瘤重小于400mg，表示肿瘤生长不良。治疗期间试验组动物死亡超过20％或平均体重下降大于15％者，表示药物毒性。根据《抗肿瘤药物体内筛选规程》，若试验组抑瘤率大于30％，可认为该药物具有体内抗肿瘤作用。

试验期间各组小鼠食水、毛色、活动状态正常。小鼠接种H₂₂细胞后3天，各组均可触及皮下肿瘤，试验期间MPHB各给药组小鼠活动状态正常。第8天处死动物，解剖时发现，与NS组比较，MPHB组肿瘤浸润范围较小、深度局限、瘤体易剥离。MPHB组各剂量组小鼠体重与NS组比较无明显差异，CY组小鼠体重较NS组低，进一步表明MPHB不具有毒性。MPHB对H₂₂荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用见表1。试验结果表明：MPHB对肿瘤生长的抑制作用基本呈剂量依赖关系。MPHB高剂量组(4mg/kg)肿瘤重量明显低于NS组，具有统计学意义(p＜0.01)，与NS组比较，抑瘤率为47.8％(＞30％)，表明MPHB在高剂量(4mg/kg)下，对肝癌H₂₂细胞具有抑制作用。MPHB中剂量(2mg/kg)及低剂量组(1mg/kg)的抑瘤率均低于30％。

表1MPHB对H₂₂荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用(n＝10)

Tab.1The anti-tumor effect of MPHB against H₂₂cell line in vivo

^**＜0.01vs NS

MPHB对肝癌H₂₂细胞的抑制作用较强，高剂量(4mg/kg)下抑制率达到47.8％。且MPHB各剂量组小鼠体重与NS组比较无明显差异，进一步在体内条件下表明MPHB对机体不具有毒性，这与常见化疗药物(例如CY)形成明显对照。

(二)、抗宫颈癌测试

昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，无菌抽取处于生长旺盛期的U₁₄小鼠的腹水，用无菌生理盐水稀释后，制成细胞悬液，每只小鼠左腋下接种细胞数为5×10⁶个/只。接种后随机分5组，分别为生理盐水对照组(NS组)、阳性对照组(CY，30mg/kg)、MPHB高剂量(4mg/kg)组、中剂量(2mg/kg)组和低剂量(1mg/kg)组。接种24h后MPHB给药组灌胃(ig)给药，连续给药7d，处死动物，称瘤重并计算抑瘤率。

试验期间各组小鼠活动状态正常，小鼠接种U₁₄细胞后8天，NS组肿瘤生长至1.61g，处死动物，解剖时发现，与NS组比较，MPHB组肿瘤浸润范围较小、深度局限、瘤体易剥离。MPHB对U₁₄荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用见表2。其中MPHB高剂量(4mg/kg)与中剂量(2mg/kg)组对U₁₄瘤株的抑制率分别达到36.5％和38.5％，但与NS组比较，不存在明显差异(p＞0.05)。

表2MPHB对U₁₄荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用(n＝10)

Tab.2The anti-tumor effect of MPHB against U₁₄cell line in vivo

^*＜0.05vs NS

实施例五

采用下列方案进行原料与产品的质量控制，但不限于使用其它方案进行质量控制：

按照实施例1～3的方法制备MPHB，并按照实施例4的方法测试其抗肿瘤活性。对果胶原料和具备抗肿瘤活性的MPHB进行结构表征，采用核磁共振(¹H NMR、¹³C NMR和2D NMR)、红外(FT-IR)、质谱(先对样品采用广泛所知的箱守法或Kuhn改良法进行多糖甲基化处理，然后用GC-MS分析)技术，解析出具有抗肿瘤活性的MPHB，其基本结构特征在于含有末端半乳糖残基、同聚半乳糖醛酸(HG)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I)。采用高效液相-空间排阻色谱(HPLC-SEC)-视差折光法测定其分子量及分布，采用容量法测定酯化度。

实施例六

考虑到肿瘤患者的顺应性，MPHB以口服方式给药优于注射方式。口服给药方案包括：(1)直接服用MPHB水溶液；(2)在MPHB原料中添加常规辅料，以常规口服方式给药；(3)在口服配方中添加吸收促进剂，以增加大分子药物的生物利用度。具体举例如下：

在100克MPHB粉末中，添加150克预胶化淀粉、20克羧甲基淀粉钠、10克微晶纤维素、10克水、1克癸酸钠、1克乳糖、500毫克滑石粉、100毫克硬脂酸镁，经压片制作成为片剂；

将100克MPHB与1克氯化钙、1克n-月桂基-β-D-麦芽吡喃糖苷混合，制作成为结肠给药系统；

将100克MPHB与100毫克氯化钙、500毫克鹅去氧胆酸钠、18克卡波姆混合，制作成为胃肠道缓释生物黏附给药系统；

将100克MPHB与50克N-三甲基壳聚糖、100毫克ε-聚-L-赖氨酸，制作成水凝胶。

缩写与符号说明

BRM，biological response modifier                         生物应答调节剂

CP，citrus pectin                                         柑橘果胶

CY，cyclophosphamide                                      环磷酰胺

Da，Dalton，                                              道尔顿(分子量单位)

DM，degree of methylation                                 酯化度，本文指半乳糖醛酸甲酯化的程度

DE，degree of esterification                              酯化度

FT-IR，Fourier transform infrared                         傅立叶变换红外光谱分析

Gal-3，galectin-3                                         半乳糖凝集素-3

GC-MS，gas chromatography-mass spectroscopy               气质联用

HG，homogalacturonan                                      同聚半乳糖醛酸

HPLC-SEC(HPSEC或HPGPC)，                                  高效液相-空间排阻色谱；

High Performance Size Exclusion Chromatography            高效液相凝胶渗透色谱

IAE，intestinal absorption enhancers                      肠道吸收促进剂

M，mol/L                                                  摩尔每升

MCP，modified citrus pectin                               改性柑橘果胶

MWCO，molecular weight cut-off                            截流分子量

NS，normal saline                                         生理盐水

PD，polydispersity ie.Molecular Weight Distribution，MWD  多分散性，即分子量分布(Mw/Mn，重均分子量与数均分子量之比)

PG，polygalacturonase                                     聚半乳糖醛酸酶

RG，rhamnogalacturonan                                    鼠李糖半乳糖醛酸聚糖，分RG-I和RG-II两类

SD，Sprague Dawley Rat                                    SD大鼠

Claims (4)

1.一种制备具有抗肿瘤活性高生物利用度改性果胶(以下简称MPHB)的新工艺，其特征在于包括如下步骤：(1)在1份果胶中加入10～1000份水，混合，加热至60～95℃，溶胀3～12小时；(2)冷却至45～55℃，在同一容器内用碳酸钠溶液调节pH至4.5～8.5之间，加入果胶酯酶(EC3.1.1.11)，搅拌均匀，使用容量法监控酯化度，待容器内果胶酯化度降低到0.4％至10％范围内，提高温度至80～90℃，保持30-90分钟；(3)上述溶液冷却至40～55℃，向同一容器内加入聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、果胶裂解酶(EC4.2.2.10)和鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.X)中的任意一种，使用高效液相-空间排阻色谱-视差折光法监控分子量及分布；(4)产物经超滤膜过滤，采用错流过滤模式，首先以截流分子量在280000Da到70000Da之间的第一组膜过滤，操作压力维持在0.08-0.30MPa之间，滤出液采用截流分子量在70000Da到10000Da之间的第二组膜过滤，操作压力维持在0.06-0.20MPa之间；(5)滤出液使用超滤膜或纳滤膜滤除小分子，膜的截流分子量在2000Da～200Da之间，最终经浓缩与干燥获得改性果胶MPHB。 

2.根据权利要求1所述的一种制备具有抗肿瘤活性高生物利用度改性果胶的新工艺，其特征在于干燥过程采用喷雾干燥、微波干燥、冷冻干燥工艺中的一种。 

3.根据权利要求1所述的制备具有抗肿瘤活性高生物利用度改性果胶新工艺制备的MPHB，其特征在于MPHB含有同聚半乳糖醛酸和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I组成的骨架和含有末端半乳糖残基的分枝，分子量不大于70000Da且不小于2000Da，酯化度介于0.4％至10％之间。 

4.根据权利要求1所述工艺制备的MPHB，可在口服配方中添加吸收促进剂，其特征在于在口服配方中至少包含中链脂肪酸盐、胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、壳聚糖及其衍生物、卡波姆、十二烷基麦芽糖苷中的一种成分。