CN102277380B

CN102277380B - 一种dhfr互补表达的共转染真核表达载体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102277380B
Application number: CN 201010194400
Authority: CN
Inventors: 王晶翼; 史文龙; 王庆民; 孙丽霞; 阎岩; 张莹宽; 陆贵全
Original assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-06-08
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2030-06-08
Also published as: CN102277380A

Abstract

本发明涉及一种可高表达抗体及其他目的蛋白的高效真核表达载体及其制备方法与应用，属于生物技术技术领域。该载体是在pCI-neo质粒上插入了核基质附着区域、土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列、核糖体进入位点序列、dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段。本发明克服了以往哺乳动物细胞表达、筛选费时费力且目的蛋白表达水平低的缺点，使用本发明的载体转染CHO细胞，可在短时间内获得稳定高表达抗体或融合蛋白的单克隆细胞株，对重组蛋白的高表达和产业化具有很好的应用价值。

Description

一种dhfr互补表达的共转染真核表达载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体，具体涉及一种可高表达抗体及其他目的蛋白的高效真核表达载体及其制备方法与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

目前以哺乳动物为代表的真核细胞表达系统的开发是生物制药产业的发展趋势。相对于大肠杆菌(原核细胞)表达系统，采用哺乳动物细胞表达既能保证重组蛋白质二硫键的正确配对和蛋白质折叠，又能保证蛋白质的糖基化，从而使由哺乳动物细胞表达的重组蛋白与天然蛋白在结构和功能上保持很高的一致性。发达国家药物市场中，通过哺乳类动物细胞培养表达的生物药物已达到各类生物药物总数的60％左右，市场份额已接近70％。哺乳动物细胞高效表达和大规模培养技术已成为当今生物制药领域最重要的关键技术之一。

在哺乳动物细胞中基因的高表达依赖于许多因素，包括转录、翻译控制元件、RNA代谢、基因拷贝数、mRNA稳定性、基因在宿主细胞染色体上的定位等。目前抗体真核表达载体构建主要基于两种策略：一是将轻链和重链分别克隆到两个真核表达载体上，共转染于哺乳动物细胞中，从而表达出完整抗体；二是将重链和轻链分别连接到一个具有双向启动子的真核表达载体的启动子之后，或顺序性连接在同一真核表达载体的一个启动子上，然后再转染到哺乳动物细胞中表达。在真核表达体系中，载体的构建和宿主细胞的选择对于决定表达量的高低是至关重要的。基于对真核表达调控的认识，一个好的真核表达载体至少要具备以下几个特征：①具有一个或多个组成型或诱导型的强启动子，例如cmv5、EF1 α等；②真核细胞选择性的mRNA翻译及翻译后加工信号，包括Kozak序列、翻译终止密码子、mRNA切割及加尾信号、mRNA剪切信号等；③具有转录终止子；④具有原核启动子和筛选标志(如抗生素等)以便于载体在细菌中扩增；⑤必须具备真核表达筛选标志，这些标志包括稳定转染细胞株的筛选标志如G418、Zeocin等，还有基因扩增标志如DHFR(二氢叶酸还原酶)、GS(谷氨酸合成酶)，两者原理相似，都既可以作为转染阳性细胞的筛选标志，又可扩增目的基因。

由于商品化的真核表达载体未能有效整合调控元件，难以获得高表达的细胞株。因此，在表达载体中加入有助于提高表达量的基因元件是必须的。在CHO细胞表达系统中，高水平表达重组蛋白的细胞株的获得常常比较困难。最主要的因素是表达外源蛋白的细胞比率低和细胞培养过程中外源基因不稳定。另外，获得高表达的细胞株往往需要进行大量的细胞筛选工作，其中单克隆的筛选和氨甲喋呤(MTX)加压筛选过程需要耗费大量的时间。

针对哺乳动物细胞表达的这些缺点，选择使用基因表达的调控元件，可以提高抗体表达量并能在短期内完成对重组细胞株的表达评价，获得可高水平表达目的蛋白的细胞株。

将外源蛋白基因整合到细胞染色体上的主要问题是基因整合位点不同，蛋白表达差异很大。事实上，外源蛋白的表达大都受到抑制，这主要是由于其周围染色体结构的影响。真核染色体的结构高度有序，可以将基因组分成不同的区域发挥各自独立的转录功能。这些区域与核骨架联系紧密，是DNA结合位点，称为核基质附着区域(MAR)。MAR序列富含AT碱基(含量约70％)，与拓扑异构酶II多数序列相似。在许多表达体系中将MAR序列与真核启动子连在一起，可以提高基因表达水平并减少位置效应。Jong-Mook Kim等扩增了人β-globinMAR、人干扰素β-SAR、人CSP-BSAR、DHFR内含子SAR、人HPRT MAR、鸡溶菌酶MAR和鸡胚α-globin MAR，并将这些MAR分别构建到质粒上，进行外源蛋白的表达比较。结果显示人β-globin MAR对于外源蛋白的影响效果最好：将表达外源蛋白的细胞比率提高了2.5倍，约75％的单克隆为阳性细胞；提高外源基因拷贝数，从而提高表达水平7.5倍；去除单克隆筛选步骤，通过细胞群落集体两轮MTX加压(50nM、1μM)，即可得到稳定表达目的蛋白的细胞集落，大大缩短实验时间。因此用这种表达系统可以在短时间内获得高表达目的蛋白的细胞株。

通常用于基因扩增的DHFR基因从结构上可分为2个部分：F[1，2]和F[3]，分别编码DHFR1-105aa和DHFR106-187aa。DHFR两部分的N端通过(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)2的10个氨基酸的Linker连接亮氨酸拉链结构(GCN4 Leucine Zipper)，可构建互补表达载体。即一个载体只含有DHFR的一部分(DHFR1-105 aa或DHFR106-187 aa)，与对应的另一个载体形成互补。在细胞基因表达时，DHFR片段通过亮氨酸拉链结构的帮助，重新结合成为完整的DHFR分子，发挥其生物学效应，见附图1。

因此，构建载体时分别将重链基因和轻链基因通过IRES(核糖体进入位点序列)与DHFR的1-105aa和106-187aa的编码基因连接，DHFR的1-105aa和106-187aa的编码基因前均有亮氨酸拉链的(LZ)编码基因。抗体基因在细胞内表达的同时，连接于抗体基因后的LZ-DHFR1-105和LZ-DHFR106-187在IRES的作用下也得到表达，而DHFR在LZ的作用下形成完整的空间构型以发挥效应。已有研究表明，抗体重链和轻链表达产物之间的平衡对完整抗体的表达有重要影响，因此，通过这种方式表达，经MTX筛选后可获得高表达的细胞株，因为如果重链或轻链表达不平衡，DHFR的任一部分是不能发挥生物学效应的，只有两部分组合在一起才能发挥完全的生物学效应。

外源蛋白的表达水平受基因转录前后调节的影响。一般地，构建载体在基因转录前调节通常使用强启动子和增强子提高基因的启动、转录效率，转录后的调节通常包括Kozak序列、mRNA切割及加尾信号、mRNA剪切信号和表达框中加入内含子等。转录后调节的典型例子是在表达框中加入内含子，许多研究证明加入内含子有助于基因的表达，一些内含子具有调节序列可以增强转录和3’端的终止过程。内含子剪切表现出的提高基因表达的原因，可能是促进了mRNA的核稳定性、正确加工和胞质的准确定位。基因转录为mRNA后需转运至胞浆进行进一步加工和蛋白翻译，此时mRNA或RNA-蛋白质复合物的稳定性及有效定位非常关键。此过程主要由3’非翻译区、5’非翻译区及编码区的调控元件调控。

WPRE(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element，土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列)包含顺式作用序列，将WPRE插入到基因的3’非翻译区可显著提高该基因的表达。WPRE可提高mRNA稳定性，有助于RNA-蛋白复合物的形成，保护新合成的转录物不被降解，并在mRNA由胞核至胞质的转运和定位过程中发挥作用。对于不含有内含子的基因或已经剪切加工的mRNA的表达尤其有效。这对于逆转录表达的转基因或不含内含子的蛋白的表达具有重要的应用价值。

发明内容

为了能够更高效地构建、筛选出高水平表达目的蛋白的工程细胞株，本发明提供了一种dhfr互补表达的共转染高效真核表达载体。

一种dhfr互补表达的共转染真核表达载体，其特征在于，在pCI-neo质粒中分别插入了核基质附着区域，土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，核糖体进入位点序列，dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段。

优选的，在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点SacII和BglII之间插入了核基质附着区域；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点SalI和NotI之间插入了土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点MluI和XbaI之间插入了核糖体进入位点序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点XbaI和SalI之间插入了dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段，dhfr1-105aa基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，dhfr106-187aa基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，上述dhfr1-105aa基因片段和dhfr106-187aa基因片段的5’端连接有亮氨酸拉链结构编码基因序列；所述的编码亮氨酸拉链结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述的核基质附着区域为人β-globin核基质附着区域，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述dhfr互补表达的共转染真核表达载体的制备方法，步骤如下：

(1)用限制性内切酶SacII和BglII双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶SacII和BglII双酶切的核基质附着区域(MAR)，构建质粒pCIneo-M；

(2)用限制性内切酶SalI和NotI双酶切步骤(1)制得的质粒pCIneo-M，插入经限制性内切酶SalI和NotI双酶切的土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列(WPRE)，构建质粒pC Ineo-MW；

(3)用限制性内切酶MluI和XbaI双酶切步骤(2)制得的质粒pCIneo-MW，插入经限制性内切酶MluI和XbaI双酶切的核糖体进入位点序列(IRES)，构建质粒pCIneo-MWI；

(4)用限制性内切酶BglII和SalI双酶切dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段，用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切亮氨酸拉链结构编码基因序列，构建LZ-dhfr(1-105aa)或LZ-dhfr(106-187aa)；

(5)用限制性内切酶XbaI和SalI双酶切步骤(3)制得的质粒pCIneo-MWI，插入经限制性内切酶XbaI和SalI双酶切的经步骤(4)构建的LZ-dhfr1-105aa基因片段或经限制性内切酶XbaI和SalI双酶切的经步骤(4)构建的LZ-dhfr106-187aa基因片段，构建共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1或共转染真核表达载体pCIneo-MWLD2。

上述dhfr互补表达的共转染真核表达载体在真核细胞中高水平表达目的蛋白中的应用。

所述的目的蛋白为免疫球蛋白、免疫球蛋白融合蛋白、生长因子、可溶性受体或血液凝集因子之一。

上述应用，步骤如下：

(1)用限制性内切酶NheI和MluI双酶切编码目的蛋白重链的基因片段，插入到经限制性内切酶NheI和MluI双酶切的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1中，得重组质粒pCIneo-MHWLD1，用限制性内切酶NheI和MluI双酶切编码目的蛋白轻链的基因片段，插入到经限制性内切酶NheI和MluI双酶切的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD2中，得重组质粒pCIneo-MLWLD2；

(2)将步骤(1)构建的重组质粒pCIneo-MHWLD1和重组质粒pCIneo-MLWLD2通过脂质体介导法转染CHO细胞进行培养筛选，用ELISA方法检测蛋白表达量，经过一轮MTX加压，筛选得到可稳定高表达目的蛋白的细胞株；

(3)将步骤(2)制得的可稳定高表达目的蛋白的细胞株采用搅拌式生物反应器进行悬浮流加培养。

优选的，步骤(3)中悬浮流加培养的培养条件为：pH6.9～7.1、温度35℃～37℃、溶氧20％～60％、空气通气量0.01～0.2vvm、氧气通气量0.01～0.2vvm、CO₂通气量0.01～0.2vvm、渗透压290～500mOSM，乳酸小于5g/L、氨小于10mmol/L、流加补料培养基体积为总培养基体积的15～30％。经检测，最终的目的蛋白表达可达到1.5-2g/L。

脂质体介导法转染采用本领域常规方法，具体条件设定可参见CHO细胞产品说明书；流加补料培养基本领域技术人员可根据现有技术及具体生产条件进行设定，也可选用CellBoost4(Hyclone公司)。

本发明克服了以往哺乳动物细胞表达、筛选费时费力且目的蛋白表达水平低的缺点，使用本发明的载体转染CHO细胞，可在短时间内获得稳定高表达抗体或融合蛋白的单克隆细胞株，对重组蛋白的高表达和产业化具有很好的应用价值。

附图说明

图1 dhfr分段互补表达图。

图2(a)pCIneo-MWLD1载体图示意图。

图2(b)pCIneo-MWLD2载体图示意图。

图3抗体表达表达量的HPLC检测结果图。

图4融合蛋白表达量的HPLC检测结果图。

图5纯化后抗体表达量的HPLC检测结果图。

图6纯化后融合蛋白表达量的HPLC检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中的大肠杆菌菌株、CHO细胞株为国际标准株购自Invitrogen公司，PCR引物合成和序列测定由博亚生物有限公司完成，T4连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶SacII、BglII、SalI、NotI、MluI、XbaI、BamHI、NheI、MluI均为Promaga公司产品，质粒提取试剂盒为北京博大泰克公司产品，DNA片段回收试剂盒为GE公司产品，载体pCI-neo购自Promega公司，MARs、Leucine-Zipper、WPRE由博亚公司合成，氨甲喋呤(MTX)和胰酶购自上海生工生物技术有限公司，LIPOFECTAMINE 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司，EXCELL-302培养基购自Sigma公司，DMEM培养基购自Gibco公司，dFBS透析胎牛血清购自Gibco公司，流加补料培养基为Hyclone公司产Cell Boost4。实施例中各种酶的使用方法可参见该产品的产品说明书，采用的实验方法如无特别说明，均采用本领域常规方法。

实施例1

pCIneo-MWLD1载体的构建

dhfr互补表达的共转染真核表达载体的制备方法，步骤如下：

(1)用限制性内切酶SacII和BglII双酶切pCI-neo质粒，用T4连接酶插入经限制性内切酶SacII和BglII双酶切的人β-globin核基质附着区域，构建质粒pCIneo-M；

(2)用限制性内切酶SalI和NotI双酶切步骤(1)制得的质粒pCIneo-M，用T4连接酶插入经限制性内切酶SalI和NotI双酶切的土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列(WPRE)，构建质粒pCIneo-MW；

(3)用限制性内切酶MluI和XbaI双酶切步骤(2)制得的质粒pCIneo-MW，用T4连接酶插入经限制性内切酶MluI和XbaI双酶切的核糖体进入位点序列(IRES)，构建质粒pCIneo-MWI；

(4)以dhfr基因片段(序列如SEQ ID NO.11所示)为模板通过PCR法扩增dhfr1-105aa基因片段，得到的dhfr1-105aa基因片段两端的酶切位点为BglII和SalI(5’端引物如SEQID NO.7所示，3’端引物如SEQ ID NO.8所示，PCR反应条件为：94℃ 60s、56℃ 30s、72℃ 60s，30个循环)，用限制性内切酶BglII和SalI双酶切dhfr1-105aa基因片段，用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切亮氨酸拉链结构编码基因序列，通过同尾酶连接，构建LZ-dhfr(1-105aa)基因片段；

(5)用限制性内切酶XbaI和SalI双酶切步骤(3)制得的质粒pCIneo-MWI，用T4连接酶插入经限制性内切酶XbaI和SalI双酶切的经步骤(4)构建的LZ-dhfr(1-105aa)基因片段，构建共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1。

经过上述方法得到的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1，在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点SacII和BglII之间插入了人β-globin核基质附着区域，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点SalI和NotI之间插入了土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点MluI和XbaI之间插入了核糖体进入位点序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点XbaI和SalI之间插入了dhfr1-105aa基因片段，dhfr1-105aa基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；dhfr1-105aa基因片段的5’端连接有亮氨酸拉链结构编码基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

pCIneo-MWLD2载体的构建

dhfr互补表达的共转染真核表达载体的制备方法，步骤如下：

(4)以dhfr基因片段(序列如SEQID NO.11所示)为模板通过PCR法扩增dhfr106-187aa基因片段，得到的dhfr106-187aa基因片段两端的酶切位点为BglII和SalI(5’端引物如SEQ ID NO.9所示，3’端引物如SEQ ID NO.10所示，PCR反应条件为：94℃ 60s、56℃ 30s、72℃ 60s，30个循环)，用限制性内切酶BglII和SalII双酶切dhfr106-187aa基因片段，用限制性内切酶BamHI和SalII双酶切亮氨酸拉链结构编码基因序列，构建LZ-dhfr(106-187aa)；限制性内切酶BglII和BamHI为同尾酶，同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶，它能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来；

(5)用限制性内切酶XbaI和SalI双酶切步骤(3)制得的质粒pCIneo-MWI，用T4连接酶插入经限制性内切酶XbaI和SalI双酶切的经步骤(4)构建的LZ-dhfr106-187aa基因片段，构建共转染真核表达载体pPCIneo-MWLD1或共转染真核表达载体pCIneo-MWLD2。

经过上述方法得到的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD2，在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点SacII和BglII之间插入了人β-globin核基质附着区域，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点SalI和NotI之间插入了土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点MluI和XbaI之间插入了核糖体进入位点序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点XbaI和SalI之间插入了dhfr106-187aa基因片段，dhfr106-187aa基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，上述dhfr106-187aa基因片段的5’端连接有亮氨酸拉链结构编码基因序列；核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例2

表达单抗互补载体的构建

用限制性内切酶NheI和MluI分别双酶切编码抗EGFR2的单抗重链的基因片段(SEQ IDNO.12)和EGFR2的单抗轻链的基因片段(SEQ ID NO.13)，分别插入到经限制性内切酶NheI和MluI双酶切的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1和pCIneo-MWLD2中，构建两个互补的重组质粒pCIneo-MHWLD1和pCIneo-MLWLD2。

免疫球蛋白融合蛋白互补载体的构建

用限制性内切酶NheI和MluI分别双酶切编码TNFR:Fc融合蛋白的基因片段(SEQIDNO.14)，分别插入到经限制性内切酶NheI和MluI双酶切的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1和pCIneo-MWLD2中，构建两个互补的重组质粒pCIneo-MTWLD1和pCIneo-MTWLD2。

实施例3

(一)、共转染互补表达真核载体pCIneo-MHWLD1和pCIneo-MLWLD2筛选工程细胞株

1、细胞培养、转染

转染前一天，用胰酶消化CHO细胞并计数，CHO细胞铺板6孔板，使其在转染日密度达到90％汇合度。CHO细胞铺板在含血清，不含抗生素的DMEM培养基中。对于每孔CHO细胞，使用250μl的OPTI-MEM I培养基稀释5μg实施例2中构建的pCIneo-MHWLD1和pCIneo-MLWLD2质粒；对于每孔CHO细胞，使用250μl OPTI-MEM I培养基稀释10μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。30分钟内稀释的LIPOFECTAMINE 2000与稀释的pCIneo-MHWLD1和pCIneo-MLWLD2质粒混合，混合液室温保温20分钟。将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO₂培养箱中培养4-5小时后更换DMEM培养基，保温24小时。

2、单克隆及亚克隆筛选

转染后24小时取样检测表达情况，挑选表达量高，细胞状态好的转染孔用胰酶消化后合并，接种于10块96孔板中，96孔板每孔加入200ul氨甲喋呤(MTX)进行一轮加压筛选，MTX的终浓度为50uM。静置培养两至三周待克隆细胞株长出。存活的克隆细胞株生长起来后换液吸打，ELISA检测各克隆细胞株24小时表达量进行96孔粗筛。挑选表达量高的克隆细胞株移入24孔扩增传代，ELISA检测各克隆细胞株24小时表达量进行24孔粗筛。挑选24孔定量高表达克隆细胞株扩增液氮冻存保种的同时，进行亚克隆(1cells/孔)。

高表达的克隆细胞株经胰酶消化后取样计数，采用DMEM培养基进行亚克隆，每种细胞株克隆4块96孔板，每块96孔板上接种60个孔，每孔1个细胞；计数后，第一步用DMEM培养基稀释100倍；第二步用DMEM培养基稀释到5cells/ml，混匀后每个孔接种200ul细胞液；四周的孔加入无菌水。测定表达量：当孔中的细胞平铺满孔时，换入200ulDMEM培养基，24h后取样测定表达量。若测定的表达量大于3ug/ml则保留转入24孔板进行后续定量评价。定量测定表达量：24孔板中的克隆铺满孔底后，以1×10⁵cells/ml定量传代测定表达量，根据定量结果，从中挑选高表达克隆细胞株转入6孔板进行扩增。根据细胞株定量检测结果和生长情况，选择合适的克隆细胞株进行悬浮培养驯化。

经过一轮MTX加压的表达单抗亚克隆各阶段筛选结果见表1：

表1 一轮MTX加压后表达单抗的亚克隆个阶段筛选结果

3、无血清悬浮驯化

扩增高表达克隆细胞株至T175方瓶，培养体系为25％(92％DMEM+8％dFBS)培养基+75％EXCELL-302培养基(体积百分比)混合而成，待T175方瓶长满后，轻微消化扩增至两个T175方瓶中，将培养体系中(92％DMEM+8％dFBS)培养基的比例由25％降低至10％，EXCELL-302培养基的比例提高至90％，静置培养一代。待细胞在10％(DMEM+8％dFBS)培养基+90％EXCELL-302培养基中生长起来后收集漂浮细胞，消化贴壁细胞，以不低于3×10⁵cells/ml的接种密度转入100％EXCELL-302培养基静置培养。每三至四天离心传代一次，若出现团块可通过自然沉降的方式去除。连续传代三代至五代时，细胞以3×10⁵cells/ml密度接种，三天密度达到10⁶cells/ml以上时，即进行悬浮培养驯化。

细胞在方瓶里面完全适应无血清培养状态后收集漂浮细胞，以不低于3×10⁵cells/ml的接种密度转入摇瓶培养。每三至四天离心传代一次，若出现团块可通过自然沉降的方式去除。细胞以3×10⁵cells/ml密度接种，培养三天的细胞密度可达10⁶cells/ml以上，连续传3代均能稳定生长且细胞单个均匀，此时细胞已经完全适应无血清悬浮培养，液氮冻存。

4、稳定性实验

考察细胞在传代和扩增过程中单抗的表达稳定性。

复苏液氮冻存的细胞，恢复培养一代。然后将细胞株以3×10⁵cells/ml的细胞密度接种于100ml摇瓶中，培养基体积为30ml，将摇瓶放入CO₂培养摇床上，转速为100rpm；每三天传代一次，传代前取样计数，计算细胞密度和细胞活力。根据传代前的细胞密度以适当的比例补加EXCELL-302培养基至终体积30ml，使细胞密度恢复至3×10⁵cells/ml；样品离心后取上清检测表达量，连续传代24次单抗表达稳定。

连续传代单抗的表达情况见表2：

表2 连续传代的单抗表达量

传代次数	目的蛋白表达量(ug/ml)	传代次数	目的蛋白表达量(ug/ml)
				1	157.8	13	154.9
2	149.0	14	152.1
				3	145.2	15	162.0
4	150.7	16	153.2
				5	156.1	17	153.1
6	153.9	18	150.8
				7	148.2	19	145
8	151.1	20	151.9
				9	159.7	21	158.9
10	156.2	22	151.0
				11	145.2	23	157
12	159.2	24	154

(二)、工程细胞株流加培养发酵

采用流加培养的方式进行单抗发酵的工艺流程包括：种子复苏、细胞扩培、细胞发酵、培养上清的离心收集和目标蛋白的纯化。具体步骤如下：

1、细胞复苏扩培

按常规细胞复苏方法，取出一支细胞株迅速投入到37℃温水中复融；将细胞悬液移至离心管，加入37℃预热的EXCELL-302培养基9ml，800rpm离心5min，弃上清。细胞沉淀中加入新鲜的37℃预热的EXCELL-302培养基10ml，轻轻吹打后，移入已装有50ml EXCELL-302培养基的250ml摇瓶中，混合均匀后取细胞悬液0.5ml，进行细胞计数和细胞活力计算。取样完成后，将摇瓶转入摇床，调节转速为100rpm，于5％CO₂、37℃恒温摇床中培养72小时。

每天进行细胞密度和细胞活性的监测，72hr后进行传代，800rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入新鲜37℃预热的扩培培养基，使细胞密度达到3×10⁵/ml以上，扩大培养体积继续接种转瓶，以此类推进行细胞传代扩增。在细胞扩增过程中，逐级放大培养容器，当细胞总数达到1×10⁹个时，转移到5.0L发酵罐中继续进行种子细胞培养扩增。当5.0L发酵罐中细胞总数达到1×10¹⁰时，即可做为20L发酵罐的种子细胞，进行发酵罐接种和生产。

2、发酵

将种子液在无菌超净台内从摇瓶移入无菌接种瓶；连接接种瓶与发酵罐接种口，通过空气正压将种子液压入发酵罐，发酵罐型号为B.Braun Biostat B 20L。根据哺乳动物细胞生长特性，选择培养温度为35℃～37℃，pH选择与CO₂和NaHCO₃偶联，范围控制在pH6.9～7.1、溶氧选择与O₂偶联，范围控制在20％～60％，既不使细胞的生长代谢受到阻碍，又避免溶氧浓度太高引起的毒性抑制细胞代谢；底部通气选择空气通气量0.01～0.2vvm、氧气通气量0.01～0.2vvm、CO₂通气量0.01～0.2vvm；搅拌是为了使发酵罐中的全部培养液和悬浮细胞达到均质程度，达到最佳的物质传递效果，并促进热交换。搅拌转速过低，将达不到混匀效果，搅拌转速过高，又会产生较大的剪切力，造成细胞损伤。根据罐体和搅拌浆的设计参数，选择搅拌转速75rpm。为使细胞长时间维持较高的活力，发酵过程中渗透压应维持在290～500mOSM的范围内，乳酸浓度小于5g/L、氨浓度小于10mmol/L。

当细胞生长至平台期后，细胞密度增加不再明显，细胞生长和死亡达到一种动态平衡，并且目的蛋白保持比较高的表达水平，通过补加葡萄糖和补料(流加补料培养基体积为总培养基体积的15～30％)等本领域众知的策略以及pH值、温度、溶氧等培养参数的调节维持细胞培养约14天。随着细胞凋亡数量的增加，平台期平衡被打破，死亡的细胞逐渐增加，当发酵罐中的活细胞数低于50％时，蛋白表达量出现明显的下降，此时停止细胞培养进行收液。抗体表达量的检测使用Protein A柱经HPLC检测，14天蛋白表达量达到2g/L。发酵结果见表3。检测结果见附图3。

表3 单抗发酵结果

时间(天)	蛋白表达(mg/l)	活细胞密度(x10⁶cells/mL)	细胞活力(％)
				0.00		0.73	95
1.00	88.3	0.81	97
				2.00	158.86	1.37	98.5
3.00	242.65	2.82	99.1
				4.00	424.55	4.22	98.9
5.00	561.42	4.65	98.3
				6.00	783.54	5.07	98.1
7.00	1014.62	5.87	97.6
				8.00	1369.74	5.27	97.5
9.00	1716.86	5.52	94.2
				10.00	1819.45	4.57	92.1
11.00	1900.78	3.78	88.5
				12.00	1990.69	3.13	83.1
13.00	2051.02	2.74	75.2
				14.00	2063.56	1.89	68.8

3、纯化检测

分离纯化工艺中的主要纯化手段是利用目前国际上广泛采用的，生产治疗用抗体蛋白的rProtein A亲合凝胶，该亲合凝胶能与IgG1Fc段蛋白特异性结合。采用商品化的rProteinA Sepharose^TM Fast Flow填料(Amsham Bioscience提供)对培养液进行初步纯化，通过该初步纯化可以去除培养基中的大部分杂质和细胞代谢副产物，获得纯度大于90％的目的蛋白。然后利用目的蛋白的理化特点，选择两次离子交换层析，去除少量杂质及微量残留的蛋白A，再经过超滤完成抗体的纯化。纯化抗体的检测使用分子筛柱，检测结果见附图4。

实施例4

(一)、共转染互补表达真核载体pCIneo-MTWLD1和pCIneo-MTWLD2筛选工程细胞株

1、细胞培养、转染

转染前一天，用胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度达到90％汇合度。细胞铺板在含血清，不含抗生素的DMEM培养基中。对于每孔细胞，使用250μl的OPTI-MEM

I培养基稀释5μg实施例2中构建的pCIneo-MTWLD1和pCIneo-MTWLD2质粒；对于每孔细胞，使用250μl OPTI-MEM I培养基稀释10μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。30分钟内稀释的LIPOFECTAMINE 2000与稀释的pCIneo-MTWLD1和pCIneo-MTWLD2质粒混合，混合液室温保温20分钟。将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO₂培养箱中培养4-5小时后更换生长培养基，保温24小时。

2、单克隆及亚克隆筛选

步骤同实施例3。

经过一轮MTX加压的免疫球蛋白融合蛋白的亚克隆各阶段筛选结果见表4：

表4 一轮MTX加压后表达免疫球蛋白融合蛋白的亚克隆个阶段筛选结果

3、无血清悬浮驯化

步骤同实施例3。

4、稳定性实验

步骤同实施例3。

连续传代免疫球蛋白融合蛋白的表达情况见表5：

表5 连续传代的免疫球蛋白融合蛋白表达量

传代次数	目的蛋白表达量(ug/ml)	传代次数	目的蛋白表达量(ug/ml)
				1	125.2	13	126.5
2	129.1	14	132.0
				3	126.3	15	131.7
4	121.7	16	124.1
				5	128.2	17	128.2
6	118.6	18	131.4
				7	118.3	19	123.8
8	122.2	20	127.1
				9	126.5	21	122.8
10	124.5	22	118.3

11	122.3	23	121.6
				12	117.6	24	122.8

(二)、工程细胞株流加培养发酵

采用流加培养的方式进行单抗发酵的工艺流程包括：种子复苏、细胞扩培、细胞发酵、培养上清的离心收集和目标蛋白的纯化。具体步骤同实施例3。

融合蛋白表达量的检测使用Protein A柱经HPLC检测，14天蛋白表达量达到1.5g/L。发酵结果见表6，检测结果见附图5。

表6 融合蛋白发酵结果

时间(天)	蛋白表达(mg/l)	活细胞密度(x10⁶cells/mL)	细胞活力(％)
				0.00		0.37	99
1.00	38	0.48	98.5
				2.00	86	1	98
3.00	137	2.8	99
				4.00	205	3.9	99
5.00	277	4.85	99
				6.00	381	6.5	98
7.00	550	6.7	99.2
				8.00	791	6.6	99
9.00	983	6.5	98.5
				10.00	1150	6.3	96.9
11.00	1254	6.0	95
				12.00	1346	5.5	92.7
13.00	1457	5.1	88.9
				14.00	1512	4.6	84.7

纯化融合蛋白的检测使用分子筛柱，检测结果见附图6。

SEQUENCE LISTING

<110>齐鲁制药有限公司

<120>一种dhfr互补表达的共转染真核表达载体及其制备方法与应用

<160>14

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>3020

<212>DNA

<213>人

<400>1

gaatccgcgg aagcttctga caaattattc ttcctcttta ggttctcctt tatggaatct 60

tctgtactga tggccatgtc ctttaactac tatgtagata tctgctacta cctgtattat 120

gcctctacct ttattagcag agttatctgt actgttggca tgacaatcat ttgttaatat 180

gacttgcctt tcctttttct gctattcttg atcaaatggc tcctctttct tgctcctctc 240

atttctcctg ccttcacttg gacgtgcttc acgtagtctg tgcttatgac tggattaaaa 300

attgatatgg acttatccta atgttgttcg tcataatatg ggttttatgg tccattatta 360

tttcctatgc attgatctgg agaaggcttc aatcctttta ctctttgtgg aaaatatctg 420

taaaccttct ggttcactct gctatagcaa tttcagttta ggctagtaag catgaggatg 480

cctccttctc tgatttttcc cacagtctgt tggtcacaga ataacctgag tgattactga 540

tgaaagagtg agaatgttat tgatagtcac aatgacaaaa aacaaacaac tacagtcaaa 600

atgtttctct ttttattagt ggttatattt cctgacctat atctggcagg actctttaga 660

gaggtagctg aagctgctgt tatgaccact agagggaaga agatacctgt ggagctaatg 720

gtccaagatg gtggagcccc aagcaaggaa gttgttaagg agcccttttg attgaaggtg 780

ggtgccccca ccttacaggg acaggacatc tggatactcc tcccagtttc tccagtttcc 840

ctttttccta atatatctcc tgataaaatg tctatactca cttccccatt tctaataata 900

aagcaaaggc tagttagtaa gacatcacct tgcattttga aaatgccata gactttcaaa 960

attatttcat acatcggtct ttctttattt caagagtcca gaaatggcaa cattaccttt 1020

gattcaatgt aatggaaaga gctctttcaa gagacagaga aaagaataat ttaatttctt 1080

tccccacacc tccttccctg tctcttaccc tatcttcctt ccttctaccc tccccatttc 1140

tctctctcat ttctcagaag tatattttga aaggattcat agcagacagc taaggctggt 1200

tttttctaag tgaagaagtg atattgagaa ggtagggttg catgagccct ttcagttttt 1260

tagtttatat acatctgtat tgttagaatg ttttataata taaataaaat tatttctcag 1320

ttatatacta gctatgtaac ctgtggatat ttccttaagt attacaagct atacttaact 1380

cacttggaaa actcaaataa atacctgctt catagttatt aataaggatt aagtgagata 1440

atgccctata agattcctat taataacaga taaatacata cacacacaca cacattgaaa 1500

ggattcttac tttgtgctag gaactataat aagttcattg atgcattata tcattaagtt 1560

ctaatttcaa cactagaagg caggtattat ctaaatttca tactggatac ctccaaactc 1620

ataaagataa ttaaattgcc ttttgtcata tatttattca aaagggtaac tcaaactatg 1680

gcttgtctaattttatatat caccctactg aacatgaccc tattgtgata ttttataaaa 1740

ttatctcaag ttattatgag gatgttgaaa gacagagagg atgggtgcta tgccccaaat 1800

cagcctcaca attaagctaa gcagctaaga gtcttgcagg gtagtgtagg gaccacaggg 1860

ttaagggggc agtagaatta tactcccact ttagtttcat ttcaaacaat ccatacacac 1920

acagccctga gcacttacaa attatactac gctctatact ttttgtttaa atgtataaat 1980

aagtggatga aagaatagat agatagacag atagatgata gatagaataa atgcttgcct 2040

tcatagctgt ctccctacct tgttcaaaat gttcctgtcc agaccaaagt accttgcctt 2100

cacttaagta atcaattcct aggttatatt ctgatgtcaa aggaagtcaa aagatgtgaa 2160

aaacaatttc tgacccacaa ctcatgcttt gtagatgact agatcaaaaa atttcagcca 2220

tatcttaaca gtgagtgaac aggaaatctc ctcttttccc tacatctgag atcccagctt 2280

ctaagacctt caattctcac tcttgatgca acagaccttg gaagtataca ggagagctga 2340

acttggtcaa caaaggagaa aagtttgttg gcctccaaag gcacagctca aacttttcaa 2400

gccttctcta atcttaaagg taaacaaggg tctcatttct ttgagaactt cagggaaaat 2460

agacaaggac ttgcctggtg cttttggtag gggagcttgc actttccccc tttctggagg 2520

aaatatttat ccccaggtag ttcccttttt gcaccagtgg ttctttgaag agacttccac 2580

ctgggaacag ttaaacagca actacagggc cttgaactgc acactttcag tccggtcctc 2640

acagttgaaa agacctaagc ttgtgcctga tttaagcctt tttggtcata aaacattgaa 2700

ttctaatctc cctctcaacc ctacagtcac ccatttggta tattaaagat gtgttgtcta 2760

ctgtctagta tccctcaagc agtgtcagga attagtcatt taaatagtct gcaagccagg 2820

agtggtggct catgtctgta attccagcac ttgagaggta gaagtgggag gactgcttga 2880

gctcaagagt ttgatattat cctggacaac atagcaagac ctcgtctcta cttaaaaaaa 2940

aaaaattagc caggcatgtg atgtacacct gtagtcccag ctactcagga ggccgaaatg 3000

ggaggaccgg tagatctgac 3020

<210>2

<211>623

<212>DNA

<213>Woodchuck hepatitis virus

<400>2

gactctagag tcgacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt 60

cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat 120

gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct 180

ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct 240

gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc 300

gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg 360

acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc 420

tttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac 480

gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg 540

cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc 600

ccgcctggcg gccgcttaag gac 623

<210>3

<211>318

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

atggttcgac cgctgaactg catcgtcgcc gtgtcccaga atatgggcat cggcaagaac 60

ggagaccttc cctggccaat gctcaggaac gaattcaagt acttccaaag aatgaccacc 120

acctcctcag tggaaggtaa acagaacctg gtgattatgg gccggaaaac ctggttctcc 180

attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagagctc 240

aaggaaccac cacaaggagc tcattttctt gccaaaagtc tggacgatgc cttaaaactt 300

attgaacaac cagagtaa 318

<210>4

<211>249

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ttagcagata aagtggacat ggtttggata gttggaggca gttccgttta caaggaagcc 60

atgaatcagc caggccatct cagactcttt gtgacaagga tcatgcagga atttgaaagt 120

gacacgttct tcccagaaat tgatttggag aaatataaac ttctcccaga gtacccaggg 180

gtcctttctg aagtccagga ggaaaaaggc atcaagtata aatttgaagt ctatgagaag 240

aaaggctaa 249

<210>5

<211>144

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

tctagaatgt ctgacagaat gaaacagctg gaaacgaagg ttgaagaact gctgtccaaa 60

aattatcacc tggaaaatga ggttgccaga ctgaagaaac tggttggcga acgcggcagg 120

ggtggctctg gcggtggcgg atcccgggccc gtcgac 156

<210>6

<211>719

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

cgccctctcc gaattccgcc ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc 60

ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt 120

ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt 180

tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg 240

gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca 300

cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg 360

gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc 420

tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct 480

gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaacgtctag 540

gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca 600

accatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa 660

gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac cgttcagcc 719

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

gcagatctat ggttcgaccg ctgaactg 28

<210>8

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

gatgcggccg cgtcgactta ctctggttgt tcaataagtt t 41

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

gcagatcttt agcagataaa gtggacatg 29

<210>10

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

gatgcggccg cgtcgactta gcctttcttc tcatagac 38

<210>11

<211>564

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

atggttcgac cgctgaactg catcgtcgcc gtgtcccaga atatgggcat cggcaagaac 60

ggagaccttc cctggccaat gctcaggaac gaattcaagt acttccaaag aatgaccacc 120

acctcctcag tggaaggtaa acagaacctg gtgattatgg gccggaaaac ctggttctcc 180

attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagagctc 240

aaggaaccac cacaaggagc tcattttctt gccaaaagtc tggacgatgc cttaaaactt 300

attgaacaac cagagttagc agataaagtg gacatggttt ggatagttgg aggcagttcc 360

gtttacaagg aagccatgaa tcagccaggc catctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420

caggaatttg aaagtgacac gttcttccca gaaattgatt tggagaaata taaacttctc 480

ccagagtacc caggggtcct ttctgaagtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataaattt 540

gaagtctatg agaagaaagg ctaa 564

<210>12

<211>1416

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

atgaagcatc tgtggttctt cctgctgatg gtggccaccc ccagatgggt gctgagcgtg 60

gatcagctgg tggtgagcgg cggcggcgag gtgcagcccg gcggcagcct gagactgcgc 120

tgcgccgtca gcggcttcaa catcgaggac acgtatatcc actggctgcg gcagcccccc 180

ggcaagggcc tggaatgggt gggcagactc taccccgcca acggctatac cagatacgcc 240

gacagcgtga agggcagatt cgccatcatc gccgacacca gcaagaacac cgcctacctg 300

caaatgaact ccctgagagc cgataacgcc gccgtgtact actgttctcg ctggggaggc 360

gacggcttct acgctatgga ctattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtccagcgcc 420

agcaccaagg gccccagcgt gttcccccag gccccctcct ccaaatccac ctccggcggc 480

accgccgccc tgggctgcct ggagacggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 540

aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcat accttccccg ccgtcctgca atcctccggc 600

ctgtactccc tgagcagcgt ggtgacagtg cccagcagca gcctgggcac cctgagctac 660

atctgcaacg tgaaccataa gcccacgatc accaaggtcg acaagaaagt ggagcccaag 720

agctgcgaca agacccatac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggaggcccc 780

agcgtgttcc tgttcccccc taaacccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 840

gtgacatgcg tggtggtgga cgagtcccag gaggaccccg aagtcaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag accaagccca gagaggagca gtacaacagc 960

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccaag actggctgaa cagcaacgag 1020

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcacg 1080

gccaagggcc agcccagaga gcctcagggc tacaccctgc ccccctcccg ggacgagctg 1140

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctacccctc cgacatcccc 1200

gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgagctg 1260

gacagcgacg gcagcttctt ccagtattcc aaactgaccg tggacaagag cagatggcag 1320

cagggcaacg tgttcagctg ctccgtgatg catgaggccc tgcataacca ttacacccag 1380

aagagcctga gcctgagccc cggcaagtag acgcgt 1416

<210>13

<211>711

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

atggaggccc ctgcccagct gcagttccag ctgctgctgt ggctgcccga ccccacaggc 60

gacatccaga tgacccagag ccccagatcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagagagacc 120

atcacctgcc gggccagcca agacgtggac agcgccgtgg cctggtatca gcaaaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct ggtctattcc gcctccttcc tgtactcccg cgcgccctcc 240

cggttctccg gctcccggtc cgacaccgac ttcaccctga ccgtctcctc cctgcaaccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcaa cattacacca ccccccccac ctacggacaa 360

ggcaccaaag tggagatcaa gagcaccctg gccgccgcct ccgtgttcat cttccccccc 420

tccgacgagc agctgaagag cggcaccccc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgggagg ccaaagtgca gtggaagctg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 540

gagagcgtga ccgagcagga ccgcgaggac agccccgaca gcctgagcag caccctgacc 600

ctgagcaagg ccgactacga ggagcataac gtgtacgcct gcgaggtgac acatcagggc 660

ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac agaggcgagt gctagacgcg t 711

<210>14

<211>1470

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

atggcccctg tggctgtgtg gtctactctg gccgtgggac tggaactgtg gcccactgct 60

cacgccctgc ctgcccagct gcccttcgcc ccttatgccc ctgagcctag ctccacctgc 120

aggctgcggg agtactacga ccagaccgcc cagatgtgca gctccgagtg ctctcctggc 180

caggacgcca aggtgttctg tgccgagacc tccgacaccg tgtgccacgc ttgcgaggac 240

tccacctaca cccagctgtg gcacagggtg ccccagtgcc tgtcctgcgg ctccagatgt 300

tcctccgacc aggtggagac acaggcctgc acacgggagc agaatcggat ctgcacctgc 360

aggcctggct ggtactgcgc catggccaag caggaaggct gcaggatcag cgcccctctg 420

aggaagtgca gacctggctt cagcgtggct aggcctggca ccgagccatc cgacgtggtg 480

tgcaagcctt gcgcccctgg caccatctcc aacaccacct tctccaccga cctctgccgg 540

cctcatcaga tttgcaacgt gctgaccgtc cctggcaacg cctccatgga ccccctgtgc 600

acatctacct cccccaccag atctctgccc cctggcgccg tgcacctgcc tgagcctgtg 660

tccacccggt cccagcatac ccagcctaca cctgagccct ctaccgcccc ttctacctcc 720

ttcctgctgc ctatgggccc tgctcctcct gctgagggct ctaccggcga cgagcctaag 780

tcctgcgaca agacccacac ctgcccccca tgtcctgctc cagaactgct gggcggtcct 840

tccgtgttcc tgttccctcc tgagcctaag gacaccctga tgatctcccg gacccctgaa 900

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggatcctg aagtgaagtt caattggtac 960

gtggacggcg tggaggtgca cgacgccaag accaagcctc gggaggaaca gtacaactct 1020

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa ccccaaagaa 1080

tacaagtgca aggtgtccaa caaccccctg ccagccccta tcgaaaagac catctccaag 1140

gccaagggcc agactcggca acctcaggtg tacaccctgc ctcctagccg ggaagagatg 1200

accaagaacc aggtgtccct ggcccgcctg gtgaagggct tctacccttc cgatatcgcc 1260

gtggagtggg agtctaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc tcccctgctg 1320

gactccgacg gctccttctt cgtggactcc aagctgaccg tggacaagtc cgggcggcag 1380

cagggcaacg tgttctcctg cgccctgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1440

aagtccctgt ccctgtctcc tggcaagtga 1470

Claims

1.一种dhfr互补表达的共转染真核表达载体，其特征在于，在pCI-neo质粒中分别插入了核基质附着区域，土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，核糖体进入位点序列，dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段；

具体如下：在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点SacII和BglII之间插入了人β-globin 核基质附着区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点SalI和NotI之间插入了土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点MluI和XbaI之间插入了核糖体进入位点序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；在pCI-neo质粒相邻的两个酶切位点XbaI和SalI之间插入了dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段，dhfr1-105aa基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，dhfr106-187aa基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；上述dhfr1-105aa基因片段和dhfr106-187aa基因片段的5’端连接有亮氨酸拉链结构编码基因序列；所述的编码亮氨酸拉链结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.权利要求1所述dhfr互补表达的共转染真核表达载体的制备方法，步骤如下：

（1）用限制性内切酶SacII和BglII双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶SacII和BglII双酶切的核基质附着区域(MAR)，构建质粒pCIneo-M；

（2）用限制性内切酶SalI和NotI双酶切步骤（1）制得的质粒pCIneo-M，插入经限制性内切酶SalI和NotI双酶切的土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列（WPRE），构建质粒pCIneo-MW；

（3）用限制性内切酶MluI和XbaI双酶切步骤（2）制得的质粒pCIneo-MW，插入经限制性内切酶MluI和XbaI双酶切的核糖体进入位点序列（IRES），构建质粒pCIneo-MWI；

（4）用限制性内切酶BglII和SalI双酶切dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段，用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切亮氨酸拉链结构编码基因序列，构建LZ-dhfr1-105aa或LZ-dhfr106-187aa；

（5）用限制性内切酶XbaI和SalI双酶切步骤（3）制得的质粒pCIneo-MWI，插入经限制性内切酶XbaI和SalI双酶切的经步骤（4）构建的LZ-dhfr1-105aa基因片段或经限制性内切酶XbaI和SalI双酶切的经步骤（4）构建的LZ-dhfr106-187aa基因片段，构建共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1或共转染真核表达载体pCIneo-MWLD2。

3、权利要求1所述dhfr互补表达的共转染真核表达载体在真核细胞中高水平表达目的蛋白中的应用。

4、如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的目的蛋白为免疫球蛋白、免疫球蛋白融合蛋白、生长因子、可溶性受体或血液凝集因子之一。

5、如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）用限制性内切酶NheI和MluI双酶切编码目的蛋白重链的基因片段，插入到经限制性内切酶NheI和MluI双酶切的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1中，得重组质粒pCIneo-MHWLD1，用限制性内切酶NheI和MluI双酶切编码目的蛋白轻链的基因片段，插入到经限制性内切酶NheI和MluI双酶切的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD2中，得重组质粒pCIneo-MLWLD2；

（2）将步骤（1）构建的重组质粒pCIneo-MHWLD1和重组质粒pCIneo-MLWLD2通过脂质体介导法转染CHO细胞进行培养筛选，用ELISA方法检测蛋白表达量，经过一轮MTX加压，筛选得到可稳定高表达目的蛋白的细胞株；

（3）将步骤（2）制得的可稳定高表达目的蛋白的细胞株采用搅拌式生物反应器进行悬浮流加培养。

6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（3）中悬浮流加培养的培养条件为：pH6.9～7.1、温度35℃～37℃、溶氧20%～60%、空气通气量0.01～0.2vvm、氧气通气量0.01～0.2vvm、CO₂通气量0.01～0.2vvm、渗透压290～500mOSM，乳酸小于5g/L、氨小于10mmol/L、流加补料培养基体积为总培养基体积的15～30%。