CN102276747B

CN102276747B - 一种伤寒Vi多糖纯化工艺

Info

Publication number: CN102276747B
Application number: CN 201110171746
Authority: CN
Inventors: 曾令冰; 项美娟; 袁军; 杨邦云; 孙晓芳; 朱红伟; 孙建; 薛红钢; 李新国; 陈有喜; 张潇文
Original assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Priority date: 2011-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-06-24
Also published as: CN102276747A

Abstract

本发明提供了一种伤寒Vi多糖纯化工艺，该工艺在纯化过程中不使用苯酚来去除蛋白，避免了苯酚的使用，不需进行酚提后的透析步骤，缩短了生产时间，提高了生产效率。由于工艺过程中不使用苯酚，因此疫苗中不含苯酚，接种疫苗的对象就不会接触苯酚，不会有被苯酚伤害的风险，对接种者健康更有利，也有利于保护生产人员的身体健康和生态环境，克服了传统工艺大量使用苯酚的不足。

Description

一种伤寒Vi多糖纯化工艺

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及伤寒Vi多糖疫苗生产工艺(菌种制备、原液制备、半成品制备、成品制备)中原液制备中的多糖纯化工艺。

背景技术：

伤寒是由伤寒杆菌引起的经消化道传播的严重急性传染病，在发展中国家为常见肠道传染病，尤其在学龄儿童中发病率较高。据2000年数据统计，全球伤寒病人数约为2100万例，21万人死亡，亚洲和非洲南部地区发病率最高¹。近年来中国伤寒总发病数一直居法定报告传染病的前数位，部分省(自治区、直辖市)发病率＞10/10万，成为高发地区。

自19世纪末首次应用伤寒菌体菌苗预防伤寒以来，各国先后研制出10余种伤寒菌苗，其中的多数，由于免疫效果差或副作用大而被淘汰或被限制使用。1984年，美国国立卫生研究院Robbins等在对伤寒杆菌Vi抗原的保护性进行了重新评估后，通过改进提纯方法，采用提纯的Vi荚膜多糖制备了新一代Vi多糖疫苗²。目前，只有Vi多糖疫苗和Ty21a口服减毒活疫苗是安全、有效的，并被WHO推荐使用³。中国药品生物制品检定所和成都、兰州、长春、武汉、北京、上海生物制品研究所共同成立了伤寒Vi多糖菌苗研制协作组。并于1992年研制成功。

传统工艺中用苯酚抽提来达到去除蛋白的目的，但苯酚是一种毒性物质，对人有毒性作用，纯化过程中使用苯酚去除蛋白杂质，在后续处理步骤中采取透析或超滤的方法虽可将苯酚含量降至安全限度内(见中国药典有关多糖类制品规程原液检定项目中苯酚残留检测项)，但在理论上不可能完全将苯酚去除干净，人群接种疫苗时也吸收了苯酚，苯酚含量虽在安全限度内，但对人仍有潜在风险；在生产过程中一般要用苯酚抽提3～4次，生产人员在每批次的生产中长时间会处于苯酚的环境中，虽有保护措施，但苯酚的使用仍对生产人员有伤害的风险；使用后废酚的处理也是高风险环节，将废酚直接排放将严重破坏生态环境，若将废酚回收再利用在运输和蒸馏环节同样有破坏环境的风险。

发明内容

本发明的任务是提供一种伤寒Vi多糖纯化工艺，使其具有生产过程中不使用苯酚，疫苗中不会含苯酚，接种疫苗的对象就不会接触苯酚，不会有被苯酚伤害的风险等特点，以克服现有技术的不足。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种伤寒Vi多糖纯化工艺，包括以下步骤：

步骤一：已杀菌的培养液经离心去菌体收集上清液；

步骤二：向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.06％～0.10％，混匀，2～8℃存放4～24小时，形成沉淀；

步骤三：离心收取沉淀物，用0.5mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌2小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；

步骤四：向解离液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为30％，2～8℃存放3～24小时，离心收集上清液；

步骤五：将上清液经无石棉澄清滤板K700过滤，过滤时压力为0.03～0.05Mpa；

步骤六：将K700滤过液经无石棉除菌滤板EKS过滤，过滤时压力为0.03～0.05MPa；

步骤七：向EKS滤过液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为75％，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后的多糖按200～300毫升/克加入灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖原液。

本发明工艺在纯化过程中不使用苯酚来去除蛋白，避免了苯酚的大量使用，不需进行酚提后的透析步骤，缩短了生产时间，提高了生产效率。由于工艺过程中不使用苯酚，因此疫苗中不含苯酚，接种疫苗的对象就不会接触苯酚，不会有被苯酚伤害的风险，对接种者健康更有利；生产人员不会接触苯酚，生产人员身体健康得到保护，免受苯酚伤害；不使用苯酚同时还可保护环境，避免破坏生态环境。

[实验资料]

实验目的：建立一种伤寒Vi多糖的纯化方法，在该方法中不使用苯酚抽提来去除蛋白，制备合格的多糖。

实验方法设计：

用连续6批伤寒菌培养液(培养批号：20021110、20021111、20021112、20021213、20021214、20021215)，每批培养液，分别经本发明工艺和传统工艺进行多糖原液的制备，共制得12批多糖原液其中传统纯化工艺制备为标记为-1，本发明纯化工艺制备标记为-2。将其中经本发明工艺制备的3批多糖原液(20021110-2、20021111-2、20021112-2)稀释分装，制成成品。

实验步骤：

1.培养和杀菌按《中华人民共和国药典(三部)》中“伤寒Vi多糖疫苗制造检定规程”和本所企业标准规定工艺执行。

2 纯化

2.1 传统工艺

2.1.1 已杀菌的培养液经连续流离心法后收集上清液。

2.1.2 向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.06％～0.10％，混匀，2～8℃存放4～24小时，形成沉淀。

2.1.3 离心收取沉淀物，并用0.5mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌2小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离。

2.1.4 向解离液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为25％，2～8℃存放3～24小时，离心收集上清液。

2.1.5 于上清液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为80％，使多糖沉淀，离心收集沉淀。沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后即为多糖粗制品。

2.1.6 将多糖粗制品溶解于1/10饱和中性乙酸钠溶液中，使其浓度达5～20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和乙酸钠溶液)提取3次，离心收集上清液，并用注射用水透析。

2.1.7 向透析液中加入乙醇至乙醇终浓度为75％，沉淀多糖，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖原液。

2.2 本发明工艺

2.2.1 已杀菌的培养液经连续流离心法后收集上清液。

2.2.2 向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.06％～0.10％，混匀，2～8℃存放4～24小时，形成沉淀。

2.2.3 离心收取沉淀物，并用0.5mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌2小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离。

2.2.4 向解离液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为30％，2～8℃存放3～24小时，离心收集上清液。

2.2.5 将上清液经K700滤板过滤，过滤时压力不超过0.05MPa。

2.2.6 将K700滤过液经EKS滤板过滤，过滤时压力不超过0.05MPa。

2.2.7 向EKS滤过液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为75％，离心收集的沉淀物用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖原液。

2.3 成品制备将经本发明工艺制备的3批伤寒Vi多糖原液(20021110、20021111、20021112)稀释分装为成品。

2.4 原液检定对12批多糖原液依照《中华人民共和国药典(三部)》中伤寒Vi多糖疫苗规程中方法进行蛋白含量、核酸含量、O-乙酰基含量、多糖分子大小测定各项检定。传统工艺及本发明工艺所制备原液检定结果分见表1、表2。

表1 传统工艺制备原液检定结果

表2 本发明工艺制备原液检定结果

由表1、表2数据对比本发明工艺与传统工艺制备原液各项结果，蛋白含量和核酸含量两种工艺间有显著性差异(P＜0.05)，本发明工艺要明显优于传统工艺；O-乙酰基含量和多糖分子大小两种工艺间无显著性差异(P＞0.05)。

2.5多糖收获率传统工艺及本发明工艺制备多糖原液的多糖收率结果见表3。

表3 传统工艺及本发明工艺制备原液多糖收率结果

由表3数据比较两种工艺制备多糖的收获率可见，两组间有显著性差异(P＜0.05)，本发明工艺多糖收获率要高于传统工艺。

2.4 成品检定对经本发明工艺制备的3批成品依照《中华人民共和国药典(三部)》中伤寒Vi多糖疫苗规程中方法进行鉴别试验、外观检查、pH值、多糖含量、无菌试验、热原检查、异常毒性检查、多糖分子大小各项检定。伤寒Vi多糖疫苗成品检定项目及标准见表4。

表4 伤寒Vi多糖疫苗检定项目及标准

*分子大小为原液检测指标，此处将其纳入考察指标，以观察成品稳定性。

本发明工艺制备三批成品全检结果见表5。

表5 本发明工艺制备三批成品全检结果

2.5 对本发明工艺制备原液进行稳定性考察。

将本发明工艺制备的3批伤寒Vi多糖原液(20021110-2、20021111-2、20021112-2)，置于-20℃以下保存66个月，每隔6个月取样，并依照《中华人民共和国药典(三部)》中伤寒Vi多糖疫苗规程中方法进行原液检定，进行原液稳定性考察。原液稳定性结果(数据未付)表明本发明工艺制备多糖原液在各时间点检测结果均符合《中华人民共和国药典(三部)》中伤寒Vi多糖疫苗规程的相关要求。

2.6 对本发明工艺制备原液和成品进行稳定性考察。

将本发明工艺制备的3批伤寒Vi多糖疫苗(20021110-2、20021111-2、20021112-2)，置于2～8℃避光处30个月，于6个月、12个月、18个月、24个月、30个月取样依照《中华人民共和国药典(三部)》中伤寒Vi多糖疫苗规程中方法进行鉴别试验、pH值、多糖含量、多糖分子大小、热原检查各项检定，并汇总0个月检定结果对3批成品进行成品稳定性考察。

本发明工艺制备三批成品0个月、6个月、12个月、18个月、24个月和30个月样品的鉴别试验、pH值、多糖含量、多糖分子大小、热原检查等稳定性考察项目检测结果见表6。

表6

由表6各项检测结果数据可见本发明工艺制备多糖成品在各时间点检测结果均符合《中华人民共和国药典(三部)》中伤寒Vi多糖疫苗规程的相关要求。

从成品检定结果及稳定性研究结果可见，新工艺制备的成品2～8℃避光保存30个月仍能达到药典要求，其中多糖含量和回收率与放置前基本相同，与用传统工艺制备的经张战河等⁵和孙玉杰等⁶研究结果一致，证明新工艺制备的产品在2～8℃避光条件下质量稳定；新工艺制备的原液置于-20℃以下保存66个月仍能达到药典要求，证明新工艺制备的原液在-20℃以下保存条件下质量稳定。

本发明提供了一种新的多糖纯化方法，将伤寒Vi多糖纯化传统工艺中去核酸的乙醇浓度由25％提高到30％，将经离心去除核酸沉淀的上清液依次经K700滤板和EKS滤板过滤后，将EKS滤过液乙醇浓度调至75％沉淀多糖，离心收集沉淀，即可得到合格的多糖。对本产品而言核酸和蛋白为杂质，此项即是对多糖纯度的要求。若多糖纯度不够会降低多糖的免疫原性，对接种人群起不到保护作用；同时核酸和蛋白也是异种抗原，接种疫苗时接受过多的核酸和蛋白同样会引起免疫反应，对接种人群有潜在风险，所以在中国药典要求收获的多糖中所含核酸不超过2％，所含蛋白不超过1％。

本发明提供的这种多糖纯化方法，由于不需进行传统工艺中的多次酚提来去除蛋白杂质，所以在生产过程中不使用苯酚，疫苗中不会含有苯酚，疫苗接种对象在接种疫苗时不会有被苯酚伤害的风险，对接种者健康更有利；生产人员在生产中不会接触苯酚，使其免受苯酚伤害，对其身体健康更有利；不使用苯酚同时还可保护环境，对环保具有积极意义。同时在纯化过程中不使用苯酚，避免了苯酚的大量使用，不需进行酚提后的透析步骤，将多糖纯化的生产时间缩短了72小时，提高了生产效率。通过多批样品制备的实验数据证实本发明工艺的再现性和可重复性，同时也证明新纯化工艺具有独创性和可行性，适合规模化生产。

参考文献：[1]Crump JA.Luby SP，Mintz ED.The global burden of typhiodfever[J].BuIl wHO，2004.82(5)：346-353；[2]Robbins JD，Robinns JB.Reexamination of the protective role of the capsular polysaccharide(Viantigen)of Salmonella typhi[J].J Infect Dis，1984，150(3)：436-449；[3]WHO关于伤寒疫苗的意见书[J].《国外医学》预防、诊断、治疗用生物制品分册，2001，24(1)：7-9；[4]《中华人民共和国药典(三部)》，伤寒Vi多糖疫苗规程；[5]张河战，王斌，计国欣.伤寒Vi多糖菌苗稳定性研究[J].微生物学免疫学进展，2001，29(3)：18-19；[6]孙玉杰，唐巧英.伤寒Vi多糖原液及疫苗的稳定性[J].中国生物制品学杂志，2000，13(3)：178-179。

附图说明

图1：本发明工艺流程图，方框内工艺流程为与传统工艺不同之处。

图2：传统工艺流程图，方框内工艺流程为与本发明不同之处。

具体实施方式：

实施例1

本发明提供的伤寒Vi多糖纯化工艺，包括以下步骤：

步骤一：已杀菌的培养液经离心去菌体收集上清液。

步骤五：将上清液经无石棉澄清滤板(K700)过滤，过滤时压力为0.03～0.05Mpa；

步骤六：将K700滤过液经无石棉除菌滤板(EKS)过滤，过滤时压力为0.03～0.05Mpa；

Claims

1.一种伤寒Vi多糖纯化工艺，包括以下步骤：

步骤一：已杀菌的培养液经离心去菌体收集上清液；