CN102274545A - 生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料，为经氧化海藻酸钠生物交联剂交联处理的、具有空间三维多孔结构的半乳糖化壳聚糖生物材料。其主要制备工序：壳聚糖和乳糖酸按等摩尔比溶于四甲基乙二胺/盐酸混合溶液，加入活性中间体活化反应制备半乳糖化壳聚糖；半乳糖化壳聚糖溶解于乙酸溶液，氧化海藻酸钠溶解于超纯水，将该两种溶液按一定比例混合进行交联反应，反应结束倒入模具成型，经冷冻干燥得到支架材料，再将其浸没在氢氧化钠-乙醇水溶液除去残留的乙酸，再经乙醇水溶液洗涤、二次冻干即制得经氧化海藻酸钠交联处理的半乳糖化壳聚糖支架材料。本发明的半乳糖化壳聚糖支架材料，具有适合肝细胞生长的孔径，良好的生物相容性。

Description

生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖支架生物材料技术，更具体地说，是涉及一种生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料及其制备方法。 

技术背景

肝脏是机体重要的解毒器官，不管什么原因一旦造成肝细胞的大量坏死，并出现肝功能衰竭必将导致机体代谢紊乱和毒性物质的大量堆积，二者的出现又进一步影响肝细胞功能，加剧肝细胞坏死，影响残存肝细胞再生，从而加重肝功能衰竭，形成恶性循环。人工肝研究的出发点就是寄希望采用人工肝解毒、完成生物合成、生物转化等肝脏功能，打破上述恶性循环，稳定肝衰竭患者的内环境，为具有较强再生能力的肝细胞再生或为进一步肝移植而创造条件，争取宝贵时间。 

自1956年Sorrentnin首次提出“人工肝”的概念并开始研究至今，历经几十年研究，人工肝研究取得了很多成果。这些成果大致可分为两大类，一类为早期人工肝支持系统，该系统大多以解毒为主，部分兼有补充生物活性物质的作用；另一类为生物人工肝支持系统，由生物成分和合成材料组成，具有肝特异性解毒和生物合成及转化功能。生物人工肝是80年代后期出现的新型人工肝支持系统，它将肝细胞悬液、培养的肝细胞等与生物合成材料相结合组装成某种形式的系统，不仅具有肝特异性的解毒功能，而且还参与三大物质代谢、具有生物转化功能、可清除毒性物质、能分泌具有促进肝细胞生长活性的物质等。因此以培养肝细胞为基础的体外生物人工肝支持系统已成为目前研究的重点。 

理想的生物人工肝支架材料应具备以下功能：(1)支架材料应为三维多孔网络结构，孔的尺寸能够为肝细胞提供黏附场所，且孔间相互贯通，以便于营养物质和代谢产物的传递；(2)良好的生物相容性，有利于维持肝细胞正常分化、生长及增殖；(3)具有一定的生物力学性能，利于加工成所需的形状和结构，易于重复制备；(4)重要的一点是需要支架材料与细胞之间存在特异性反应，发挥特有的生物合成及转化功 能。现有的生物人工肝系统一般为传统的中空纤维人工肝，其存在一定的缺陷，因为肝细胞是贴壁型的细胞，一般贴壁生长才能有效的发挥其生理功能。而传统的中空纤维不利于管外腔的培养肝细胞生长，上述缺陷是目前生物人工肝治疗不能提高肝功能疗效的原因所在。 

壳聚糖分子结构类似于葡胺聚糖，其葡胺聚糖是肝脏细胞外基质的组成成分，肝细胞是一种依赖贴壁性细胞，其表面存在着ASGPRs受体，而半乳糖则是肝细胞表面ASGPRs的特异性受体，是肝细胞识别的相应位点并能产生特异性相互作用，半乳糖化壳聚糖支架材料有望成为一种具有良好应用前景的生物人工肝支架材料。 

发明内容

针对现有技术的生物人工肝支架材料现状与不足，本发明的目的旨在提供一种具有高的孔隙率结构，适合肝细胞生长的尺寸，良好的溶胀率，可控降解及出色的细胞相容性的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料及其制备方法。 

可实现上述目的的生物人工肝支架材料，为经氧化海藻酸钠生物交联剂交联处理的半乳糖化壳聚糖生物材料，是在壳聚糖上接枝半乳糖，在细胞基质外引入肝细胞特异性相互作用位点的半乳糖化壳聚糖生物材料。该半乳糖化壳聚糖支架材料具有空间三维多孔结构，且孔道之间相互连通。 

作为生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料，即用氧化海藻酸钠生物交联剂交联处理的半乳糖化壳聚糖生物材料，其制备方法主要包括以下加工工序： 

1)将壳聚糖和乳糖酸按等摩尔比溶于pH 4.5～4.8四甲基乙二胺/盐酸混合溶液中，加入活性中间体在5～35℃下活化反应48～96小时制备半乳糖化壳聚糖，反应后用碱溶液调和至pH 7.0～7.2，过滤透析，冷冻干燥得到半乳糖化壳聚糖； 

2)将半乳糖化壳聚糖溶解于体积浓度1％～3％的乙酸溶液中，配制质量浓度为10mg/ml～30mg/ml的半乳糖化壳聚糖的乙酸溶液； 

3)将制得的氧化海藻酸钠溶解于超纯水中，制备质量浓度为10mg/ml～30mg/ml的氧化海藻酸钠水溶液； 

4)将步骤2)和3)中配制的溶液按半乳糖化壳聚糖与氧化海藻酸钠质量比为5∶1～2∶1的比例混合，交联反应10～240分钟，将其倒入模具中进行凝胶，冷冻干燥得到支架材料； 

5)将步骤4)制得的支架材料浸没在pH 8.0～9.0的氢氧化钠-乙醇水溶液12～24小时，除去残留的乙酸，再将其用乙醇水溶液洗涤至中性，二次冻干即获得氧化海藻酸钠交联的半乳糖化壳聚糖支架材料。 

在上述制备方案中，制备半乳糖化壳聚糖用活性中间体为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酸活性酯的混合溶液，两者的摩尔比为(2∶1)～(1∶2)。活性中间体的加入量为足以使壳聚糖溶液与乳糖酸溶液的反应能够顺利进行为准。 

在上述制备方案中，半乳糖化壳聚糖溶液与氧化海藻酸钠水溶液的交联反应，最好是在搅拌条件下进行交联反应，搅拌可以是磁力搅拌，也可以是机械搅拌。磁力搅拌比较温和，优先采用磁力搅拌。 

在上述制备方案中，壳聚糖和乳糖酸溶于四甲基乙二胺/盐酸混合溶液，可采取分别溶于四甲基乙二胺/盐酸混合溶液，然后再混合，也可采取先后溶于四甲基乙二胺/盐酸混合溶液；用于调和的碱溶液可采用mol浓度在0.05～0.2mol/L范围的NaOH、氨水、KOH等溶液。优先选用NaOH溶液。冷冻干燥温度一般在-80～0℃下进行。 

在上述制备方案中，活化反应温度为能使壳聚糖与乳糖酸在不变性的情况下进行反应为准。反应温度过高会使壳聚糖与乳糖酸变性，过低会使反应进行得过于缓慢。活化反应一般是在室温下进行，即反应温度在5～35℃范围内都可。 

在上述制备方案中，所述超纯水为用医用超纯水机按制备操作规程制备的超纯水。 

在上述制备方案中，用乙醇水溶液进行洗涤方式可以是冲洗、浸泡或冲洗加浸泡。任何将支架材料洗涤至中性的方式都可以。 

在上述制备方案中，生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料在使用或者进行活体实验或进行体外细胞相关实验时，还需进行γ射线辐照消毒。 

在制备人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的研究完成过程中，发明人经反复多次试验和对氧化海藻酸钠的深刻理解，选用生物相容性良好的氧化海藻酸钠交联剂作为半乳糖化支架材料的交联剂。氧化海藻酸钠是海藻酸钠的氧化产物，海藻酸钠是一种从褐藻中分离出来的天然多糖，具有可降解性和良好的生物相容性、无任何的免疫原性，并不诱导任何持续性的炎症反应，同时由于其价格相对低廉，被广泛地应用在组 织工程和医药等领域。用高碘酸钠对海藻酸钠进行氧化改性，氧化海藻酸钠不但保留了良好的生物相容性，增加了其生物相容性，还引入了活性基团(-CHO-)，能够与氨基发生反应。 

氧化海藻酸钠作为一种天然生物改性得到的交联剂，具有细胞毒性低、细胞亲和力强及增加支架材料的力学性能等优势。用氧化海藻酸钠处理的支架材料，孔径大小适合细胞生长，抗压缩强度提高，降解速率减慢，细胞相容性良好。 

本发明以生物交联剂氧化海藻酸钠为交联剂，以半乳糖化壳聚糖为基体所制备的生物人工肝用支架材料，具有一定的抗压缩性能，又有适于肝细胞生长的孔径结构，还有良好的溶胀率和热稳定性，最重要的一点，此支架材料促使肝细胞在其表面及三维空间上粘附生长及分化的特点，很适合作为生物人工肝用支架材料。且其制备过程简单，技术要求不高，易于重复以实现产业化。 

附图说明

附图1为支架材料的扫描电镜图(放大100倍)。其中图1-1～1-3为条件1～条件3支架材料表面形貌；图1-4～1-6为条件1～条件3支架材料的横断面形貌。 

附图2为支架材料的体外降解曲线图(60天)。 

附图3为支架材料的肝细胞表面粘附图。其中图3-1～3-3为条件1的粘附情况；图3-4～3-6为条件2的粘附情况；图3-7～3-9为条件3的粘附情况；图3-10～3-12条件4的粘附情况(图3-1，3-4，3-7，3-10放大500倍；图3-2，3-5，3-8，3-11放大2000倍；图3-3，3-6，3-9，3-12放大5000倍)。 

附图4为支架材料上肝细胞三维空间的生长情况(HE染色，放大100倍)。其中图4-1～4-3为条件1的生长情况；图4-4～4-6为条件2的生长情况；图4-7～4-8为条件3的生长情况。 

其中条件1为半乳糖化壳聚糖与氧化海藻酸钠质量比为2∶1制备的支架材料；条件2为半乳糖化壳聚糖与氧化海藻酸钠质量比为3∶1制备的支架材料；条件3为半乳糖化壳聚糖与氧化海藻酸钠质量比为4∶1制备的支架材料；条件4为半乳糖化壳聚糖与氧化海藻酸钠质量比为5∶1制备的支架材料。 

具体实施方式

1、生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料制备实施例 

以下通过实施例描述本发明的具体实施方式，对本发明的内容再作进一步的详细说明。但需要特别说明的是，不应将此理解为本发明的保护范围仅限于实例，相反的是，凡基于本发明的内容所实现的技术应均属于本发明的保护范围。 

在以下各实施例中，除特别说明外，所涉及的百分比均为质量百分比，所涉及的份数均为质量份数。 

实施例1 

将3.24g壳聚糖溶于240ml pH4.5的四甲基乙二胺/盐酸缓冲溶液中，7.16g乳糖酸溶于80ml pH4.5的四甲基乙二胺/盐酸缓冲溶液，两溶液合并加入2.5ml的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酸混合溶液(两者摩尔比为1∶1)活性中间体，在25℃左右下活化反应72小时制备半乳糖化壳聚糖，反应后用0.1M/L的NaOH溶液调和至接近中性(pH7.0左右)，反复过滤透析，冷冻干燥得到纯化的半乳糖化壳聚糖； 

将半乳糖化壳聚糖和氧化海藻酸钠分别配制成2.5％的溶液，按半乳糖化壳聚糖和氧化海藻酸钠干重比例为2∶1将两种溶液混合，25℃下搅拌反应约10min，倒入模具中室温进行凝胶，于冰箱中在-20℃预冻过夜，经冷冻干燥后得到支架材料。 

将制得的支架材料浸没在氢氧化钠-乙醇水溶液(pH8.5)中约24小时，除去残留的乙酸，以有利于Schiff碱反应，再将其用大量的乙醇水溶液反复冲洗浸泡至中性，二次冻干获得氧化海藻酸钠交联的半乳糖化壳聚糖支架材料。 

实施例2 

将1.62g壳聚糖溶于120ml pH4.7的四甲基乙二胺/盐酸缓冲溶液中，3.58g乳糖酸溶于40ml pH4.7的四甲基乙二胺/盐酸缓冲溶液，两溶液合并加入1.0ml的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酸混合溶液(两者摩尔比为1∶2)活性中间体，在20℃左右下活化反应96小时制备半乳糖化壳聚糖，反应后用0.15M/L的氨水溶液调和至接近中性(pH7.2左右)，反复过滤透析，冷冻干燥得到纯化的半乳糖化壳聚糖； 

将半乳糖化壳聚糖和氧化海藻酸钠分别配制成2.5％的溶液，按半乳糖化壳聚糖 和氧化海藻酸钠干重比例为3∶1将两种溶液混合，20℃左右下搅拌反应约20min，倒入模具中室温进行凝胶，于冰箱中在-20℃左右预冻过夜，经冷冻干燥后得到支架材料。 

将制得的支架材料浸没在氢氧化钠-乙醇水溶液(pH8.0)中约24小时，除去残留的乙酸，有利于Schiff碱反应，再将其用大量的乙醇水溶液反复冲洗浸泡至中性，二次冻干获得氧化海藻酸钠交联的半乳糖化壳聚糖支架材料。 

实施例3 

将1.62g壳聚糖溶于120ml pH4.8的四甲基乙二胺/盐酸缓冲溶液中，3.58g乳糖酸溶于40ml pH4.8的四甲基乙二胺/盐酸缓冲溶液，两溶液合并加入1.2ml的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酸混合溶液(两者摩尔比为2∶1)活性中间体，在30℃左右下活化反应约60小时制备半乳糖化壳聚糖，反应后用0.15M/L的KOH溶液调和至接近中性(pH7.1左右)，反复过滤透析，冷冻干燥得到纯化的半乳糖化壳聚糖； 

将半乳糖化壳聚糖和氧化海藻酸钠分别配制成2.5％的溶液，按半乳糖化壳聚糖和氧化海藻酸钠干重比例为4∶1将两种溶液混合，30℃左右下搅拌约8min，倒入模具中室温进行凝胶，在-20℃左右于冰箱中预冻过夜，经冷冻干燥后得到支架材料。 

将制得的支架材料浸没在氢氧化钠-乙醇水溶液(pH9.0)中约24小时，除去残留的乙酸，有利于Schiff碱反应，再将其用大量的乙醇水溶液反复冲洗浸泡至中性，二次冻干获得氧化海藻酸钠交联的半乳糖化壳聚糖支架材料。 

实施例4 

先将4.86g壳聚糖溶于480ml pH4.6的四甲基乙二胺/盐酸缓冲溶液中，再将10.74g乳糖酸溶于其中，加入4.0ml的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酸(两者等摩尔比)活性中间体，在20℃左右下活化反应约96小时制备半乳糖化壳聚糖，反应后用0.1M/L的NaOH溶液调和至接近中性，反复过滤透析，冷冻干燥得到纯化的半乳糖化壳聚糖； 

将半乳糖化壳聚糖和氧化海藻酸钠分别配制成2.5％的溶液，按半乳糖化壳聚糖和氧化海藻酸钠干重比例为5∶1将两种溶液混合，室温下搅拌20min，倒入模具中室温进行凝胶，于冰箱中在-20℃左右预冻过夜，经冷冻干燥后得到支架材料。 

将制得的支架材料浸没在氢氧化钠-乙醇水溶液(pH8.7)中约24小时，除去残留的 乙酸，有利于Schiff碱反应，再将其用大量的乙醇水溶液反复冲洗浸泡至中性，二次冻干获得氧化海藻酸钠交联的半乳糖化壳聚糖支架材料。 

2、生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料性能指标测试实施例 

(1)形貌和孔隙率测试实施例： 

用扫描电镜观察上述实施例制备的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的微观结构，其微观形貌如附图1所示。其中，条件4的支架材料的微观形态与前三种相似。从扫描电镜图上可以看出，支架材料的断面呈现较均匀连续的多孔结构，且有许多通孔，这种微观结构主要是支架材料内部的冰晶通过冷冻干燥法进行升华而得到，类似于其它天然大分子形成的支架体系结构，其平均孔径尺寸在100-250um。另一方面，随着交联剂氧化海藻酸钠含量的增加，支架材料之间的微观结构并没有出现明显的不同。另外，支架材料的孔隙率通过排液法测得空隙率大约为70％，已有研究表明在此孔隙率的支架材料上培养肝细胞，肝细胞聚集形成多层球形聚集体和具有较高的生命力。因此，基于对支架材的SEM观察和孔隙率的测定，AGC支架材料将可能有利于肝细胞的侵入、增殖和功能性表达。 

(2)溶胀率测试实施例： 

支架材料的保水率对于生物人工肝用支架材料来说是一个非常重要的性能。支架材料的这种特征直接影响细胞的黏附、分布和营养代谢废物的传输。对于支架材料来说，交联剂的含量越高，越有利于形成较小的网络空间和较为密实的结构，当与PBS缓冲溶液接触时，支架材料会有更小的溶胀率；如果分子结构中存在大量的亲水基团(如羟基、氨基和羧基等)，交联剂含量较低时，会有较多的分子链暴露于水分子中与水分子结合，增强了吸水性。 

表1-不同条件下半乳糖化壳聚糖支架材料的溶胀率 

从上表可以看出，随着氧化海藻酸钠含量的增加，支架的溶胀率随之减小，统计 学分析得出条件1的溶胀率明显低于其它支架材料。另外，在我们研究的半乳糖化壳聚糖支架材料溶胀率的范围为14.0-19.6，暗示出这种支架材料能够保持比它自身重量更多的水分，形如这种特征更加有利于支架材料的培养肝细胞和实际应用。 

(3)力学性能测试实施例： 

支架材料的力学性能是理想生物人工肝支架材料一个重要因素，具有适度力学性能的支架材料在实际应用时能够保持支架材料结构的稳定和承受一定的外力。另一方面，在生物人工肝系统中，支架材料的力学性能也显著影响细胞特有的生物学功能。 

表2不同条件下半乳糖化壳聚糖支架材料的压缩模量 

通常来说，支架材料的微观结构(孔隙率、孔径尺寸等)、交联剂的特性和多糖本身分子链的刚性等因素直接影响着支架材料的力学性能。从上表可以初步得出，以上诸多因素在半乳糖化壳聚糖支架材料的压缩模量方面都扮演着一定的角色，不能说明某一个因素决定支架材料的压缩模量，它们共同影响着支架材料的压缩模量。因此，在AGC支架材料用于肝细胞培养时，也理应考虑支架材料力学性能对肝细胞的增殖和功能表达的影响。 

(4)体外降解研究实施例： 

生物人工肝支架材料的降解是生物人工肝系统必须考虑的一个重要因素。半乳糖化壳聚糖支架材料的体外降解是以PBS为降解液在37℃的生理条件下进行的。在60天的降解过程中，支架材料的颜色由半透明变为浅黄色，这种颜色的变化正如先前报道，主要是由于聚合物之间发生Schiff反应所致。半乳糖化壳聚糖支架材料的体外降解曲线见附图2。从支架材料的体外降解曲线来看，半乳糖化壳聚糖支架材料在前28天的降解，展现较快的失重，而在后32天的降解过程，AGC支架材料的降解速率明显放慢，几乎没有明显失重。随着交联剂氧化海藻酸钠含量的增加，半乳糖化壳聚糖支架材料的降解速率则随之减小。正如前面溶胀率中分析的一样，交联剂氧化海藻酸钠的含量越高，越有利于形成高交联度的网络结构，当与PBS溶液接触时，会有更 少的降解液侵入支架材料的本体结构进而引起较少的失重。另外，在60天的降解后，半乳糖化壳聚糖支架材料虽然有较大的失重，但仍然保持较完整的宏观结构，并没有出现散落的现象，这种结构的完整性将有利于半乳糖化壳聚糖支架材料的实际应用。 

(5)细胞毒性研究实施例： 

生物人工肝支架材料生物相容性的好坏直接影响着生物人工肝生物反应器的效能，而支架材料的细胞毒性试验是评价生物相容性好坏最基本、最直接的实验方法之一。本实验采用细胞毒性(MTT法)试验、支架材料表面细胞粘附实验及三维空间细胞生长情况对半乳糖化支架材料的生物相容性做最初的评价。 

表3不同条件下半乳糖化壳聚糖支架材料的细胞毒性 

细胞毒性分级为0～1级为合格，故本支架材料的细胞相容性是合格的。 

支架材料表面细胞粘附实验及三维空间细胞生长情况见附图3和4，从扫描电镜和光镜图上可以看出，肝细胞在支架材料表面上粘附生长情况非常良好，且能够通过支架材料的贯通结构生长到支架材料内部，故本半乳糖化壳聚糖支架材料有望成为一种非常具有潜力的生物人工肝用支架材料。 

Claims (10)

1.一种生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料，其特征在于支架材料为经氧化海藻酸钠生物交联剂交联处理的半乳糖化壳聚糖生物材料。

2.根据权利要求1所述的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料，其特征在于，半乳糖化壳聚糖支架材料具有空间三维多孔结构。

3.权利要求1或2所述生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的制备方法，其特征在于包括以下工序：

1)将壳聚糖和乳糖酸按等摩尔比溶于pH 4.5～4.8的四甲基乙二胺与盐酸的混合溶液中，加入活性中间体在5～35℃下活化反应48～96小时制备半乳糖化壳聚糖，反应后用碱溶液调和至pH 7.0～7.2，过滤透析，冷冻干燥得到半乳糖化壳聚糖；

2)将半乳糖化壳聚糖溶解于体积浓度为1％～3％的乙酸溶液中，配制质量浓度为10mg/ml～30mg/ml的半乳糖化壳聚糖的乙酸溶液；

3)将氧化海藻酸钠溶解于超纯水中，制备质量浓度为10mg/ml～30mg/ml的氧化海藻酸钠水溶液；

4)将步骤2)和3)中配制的溶液按半乳糖化壳聚糖与氧化海藻酸钠质量比(5∶1)～(2∶1)的比例混合，交联反应10～240分钟，将其倒入模具中进行凝胶，冷冻干燥得到支架材料；

5)将步骤4)制得的支架材料浸没在pH 8～9的氢氧化钠-乙醇水溶液12～24小时，除去残留的乙酸，再将其用乙醇水溶液洗涤至中性，二次冻干即获得氧化海藻酸钠交联的半乳糖化壳聚糖支架材料。

4.根据权利要求3所述的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的制备方法，其特征在于活性中间体为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酸活性酯的混合溶液，两者的摩尔比为(2∶1)～(1∶2)。

5.根据权利要求3或4所述的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的制备方法，其特征在于碱溶液为mol浓度在0.05～0.2mol/L范围的NaOH、氨水或KOH溶液。

6.根据权利要求3或4所述的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的制备方法，其特征在于半乳糖化壳聚糖溶液与氧化海藻酸钠水溶液在有搅拌的条件下进行交联反应。

7.根据权利要求5所述的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的制备方法，其特征在于半乳糖化壳聚糖溶液与氧化海藻酸钠水溶液的交联反应是在磁力搅拌条件下进行交联反应。

8.根据权利要求3或4所述的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的制备方法，其特征在于氧化海藻酸钠与半乳糖化壳聚糖胶联反应形成的凝胶在-80～0℃下冷冻干燥。

9.根据权利要求6所述的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的制备方法，其特征在于氧化海藻酸钠与半乳糖化壳聚糖胶联反应形成的凝胶在-80～0℃下冷冻干燥。

10.根据权利要求7所述的生物人工肝用半乳糖化壳聚糖支架材料的制备方法，其特征在于氧化海藻酸钠与半乳糖化壳聚糖胶联反应形成的凝胶在-80～0℃下冷冻干燥。

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