CN102274496B

CN102274496B - 一种O/Asia I型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗及制备方法和用途

Info

Publication number: CN102274496B
Application number: CN201010199712.2A
Authority: CN
Inventors: 吴晓琰; 赵泓; 孙玉琨
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-06-12
Filing date: 2010-06-12
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2030-06-12
Also published as: CN102274496A

Abstract

一种O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗及制备方法和用途。选择O型及AsiaⅠ型两种血清型，取VP1的B细胞决定簇及VP4的T-细胞helper15个氨基酸的片段，串联，克隆，不含有载体蛋白，构建O/AsiaⅠ基因工程菌。经过高密度发酵，细胞破碎、包涵体复性，融合蛋白的分离纯化，即可获得抗原蛋白产品，与佐剂匀浆形成O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗。本发明的疫苗含有2^n-1个串连的SEQ ID所示的核酸序列所编码的多肽，其中，n为1-5的整数。本发明的疫苗安全性好，免疫效价高，半年内一次免疫即可；适于大规模生产，保存运输便利；能够有效地防治O型及AsiaⅠ型两种血清型口蹄疫，对于我国适用；不产生口蹄疫病毒非结构蛋白3A.B.，易与感染动物区分。

Description

一种O/Asia I型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新型的口蹄疫疫苗，特别是一种由基因工程方法生产的O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗及其制备方法和用途。

背景技术

国内养殖规模不断扩大，将成为动物疫苗行业持续增长动力源。目前我国的肉类、蛋类产量均列世界第一位，是世界畜产品生产第一大国。2004年我国全年畜牧业产值首次突破1万亿元大关，畜牧业产值占农业总产值的比重在逐步提高。由于世界范围内疫情不断，口蹄疫、禽流感、疯牛病等，给世界各国的动物疫病防治与控制工作提出了挑战。口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是畜牧业中偶蹄类动物(猪、牛、羊及骆驼)的一种急性、热性、高度接触性传染病。迄今为止，世界各国除北美、澳大利亚之外，都曾爆发过口蹄疫的大规模流行。这种疾病的流行曾对德国(1937-1938)、欧洲(1951-1952)、土耳其(1964-1965)、英国(1967-1968)、奥地利(1973)、法国(1974)、韩国(2002)等国家造成巨大的经济损失。

口蹄疫的临床诊断特点为口腔粘膜、蹄部和乳房的皮肤发生水疱和溃烂，由口蹄疫病毒引起，对于畜牧业，猪、牛及羊的饲养及畜产品的贸易危害极大。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)属于细小RNA病毒，对猪、牛及羊传染途径多，毒力强，一头病牛的排毒量可感染100万头牛，1克病猪蹄部水疱皮可使10万头猪感染发病。易于传播，传播迅速，流行面广，生产性能下降，防治费用高，发病率100％，成年畜死亡率一般1-2％，但幼畜高达50％，甚至100％。往往几个省，几大洲甚至全球同时发生。直接接触和间接接触传播均可，主要经消化道传播，还可经呼吸道传播，往往牛、羊、猪在同一时间内发病，具有感染多种动物的能力以及具有多种抗原形式，流行可呈跳跃式传播，一年四季均可发生，每隔1-2年或3-5年就流行一次。近年来，猪发生有扩大的趋势。FMDV的初级复制是在咽部，然后感染邻近的淋巴结并且进入血流，进而扩散到各种器官和组织中。大多数情况下，动物感染2-14天出现临床症状。较年长的动物感染FMDV后很少出现死亡，但动物的生殖能力、生长和健康受到很大影响。国际兽疫局将FMDV列为A类烈性传染病。FMDV一旦发生，难以控制，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”，对于畜牧业是毁灭性打击。根据世界动物卫生组织规定，一旦出现口蹄疫疫情，当事国将自动丧失非口蹄疫疫区资格。

口蹄疫病毒具有显著的抗原多样性，目前发现的FMDV有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。每种血清型还可以继续分成多种亚型。中国原为O型口蹄疫流行区。西北及东北地区的周边国家是O型及AsiaⅠ型口蹄疫流行区。FMDV颗粒中含有一条正链极性的、由8500个核苷酸组成的单链RNA。病毒颗粒的囊膜包括包绕单链RNA的四种结构蛋白VP1(分子量34000)、VP2(分子量30000)、VP3(分子量26000)、VP4(分子量13500)。四种结构蛋白每种60个分子构成一个二十面体病毒粒子。二十面体的顶点由结构蛋白VP1的免疫决定簇区域为141-160区域和200-213区域。

对于FMD，注射疫苗是目前预防口蹄疫的最有效手段。现有疫苗及其存在的问题有：

1、减毒疫苗及灭活疫苗：

传统的减毒疫苗及灭活疫苗是利用大量培养动物细胞，然后感染口蹄疫病毒，经过培养、分离病毒，再用化学试剂使病毒灭活后制备而成。法国Merieux公司是最大的灭活FMDV疫苗生产厂家。但制备灭活FMDV需要特殊严格的隔离封闭的环境进行生产，以防泄露并污染周围环境，安全性要求高，这种潜在的危险限制了这种疫苗必须在偏僻的环境生产；此外，疫苗的贮藏运输保存需要冷链，增加成本；灭活FMDV疫苗的效价变动较大，疫苗还存在复强和残存的痕迹活病毒引起疾病流行和大规模爆发的危险；另外，疫苗的质量还经常会影响奶牛的乳液分泌；使用灭活的FMDV疫苗虽然不常发生过敏性休克或昏迷，但一旦发生就足以造成严重后果；最后，首次免疫要2周至2个月内用二次，以后每隔6个月注射一次。免疫预防工作量非常大。

2、多肽疫苗：

1982年研发出人工合成的多肽苗。合成多肽疫苗能克服常规疫苗的缺点，很早就被认为是动物传染病预防用的终极疫苗。使用大肠杆菌作为寄主细胞发酵培养时间只需20个小时，周期比用动物细胞生产灭活疫苗短得多，基因工程疫苗对环境没有污染，没有泄露的危险，非常安全，且生产出的疫苗在贮藏、运输和使用过程中不需要冷藏，效价稳定。20多年来多肽疫苗的研究多集中在VP1外壳蛋白的B细胞单一免疫决定簇，进一步研究表明结构蛋白VP1的免疫决定簇为141-160区域和200-213区域，这两个区域的多肽片段与载体蛋白经化学联接后产生的抗体能中和病毒粒子(Nature，1982，298：30-33；J.Virology，2000，74：4902-4907；J.Virology，2001，75：3164-3174；J.Virology，2003，77：8633-8640；Vaccine，2002，20：2603-2610；生物工程学报，2009，25(4)514-519)。然而因中和抗体产生较少，合成多肽疫苗免疫动物后所起的免疫保护作用并没有人们当初设想的那么理想，利用价值甚至被否认。在诱导机体产生免疫的过程中，单一的中和抗原表位是远远不够的。而且，目前的FMDV疫苗，不论是灭活FMDV疫苗或者是多肽疫苗，都不能通过血清学实验分辨被免疫动物和已感染动物，而被免疫动物与已感染动物混淆会给市场进出口造成极大影响。因此，制备出免疫效价提高而且可用于分辨被免疫动物和已感染动物的基因工程多价口蹄疫疫苗是我们不断追求的目标。

近年来的研究证明除了VP1的B细胞免疫决定簇之外，需要VP4的T细胞免疫簇协同作用，可获得很好的免疫中和抗体保护效果。

复旦大学等单位研制的Asia1基因工程疫苗含T-helper和VP1免疫决定簇疫苗具有保护效果，能够产生中和抗体。

美国UBI公司合成的多肽疫苗具有T-细胞Helper多肽与VP1的B细胞免疫决定簇多肽，大大增强了中和抗体的作用(10倍左右)，具有明确的免疫保护效果。具有良好的安全性：无发热症状、无过敏反应发生、注射部位无吸收不良现象、对妊娠母猪的健康状况和妊娠没有影响，对产仔成绩也没有影响。

目前需要大量、廉价生产多肽类疫苗。但是，化学合成超过20个氨基酸的肽链非常昂贵。因此，需要发展生物技术通过基因工程大量生产多肽。然而，实际应用还距离很远。根据近20年对多肽的研究报告，除胰岛素外，基因工程并不比化学合成具有优势。根本原因是基因工程的理论发展与实际应用尚有待发展，况且，多肽在体内迅速降解不利于相应抗体的诱导产生。应利用基因工程技术制备FMDV多肽疫苗。与其他基因工程多肽产品一样，生产需解决一系列的上游设计与下游工艺问题。尽管有很多报道，离应用尚远。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的缺陷，提供一种新型O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗。本发明的一种O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其基因工程菌是O/AsiaⅠ，口蹄疫病毒FMDV外壳蛋白有四种即VP1、VP2、VP3、VP4，O/AsiaⅠ基因工程菌是口蹄疫病毒毒株编码VP4的T-细胞helper的15个氨基酸片段的DNA序列连接O型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列连接AsiaⅠ型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列作为1个重复片段，(1个重复片段的核苷酸排列序列为图1)，O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列所编码的蛋白，其中n为1-5的整数。

本发明的又一目的是提供所述口蹄疫疫苗的构建方法。

本发明的O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其基因工程菌中含有串联的基因以大肠杆菌(E.Coli)中携带的Lac质粒进行表达。所述的疫苗还包括药学上可接受的载体、辅料和/或免疫佐剂。

另一方面，本发明还提供了能够表达所述O/AsiaⅠ口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的O/AsiaⅠ基因工程菌株。

该O/AsiaⅠ基因工程菌株，其携带的质粒分别含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列，其中n为1-5的整数。

本发明提供所述O/AsiaⅠ口蹄疫疫苗在防治口蹄疫疾病中的用途以及在区分感染动物和被免疫动物中的用途。

本发明还提供了一种偶蹄类家畜O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗制备方法，包括基因重组、重组融合蛋白的制备，其特征在于：

(1)为合成O/AsiaⅠ基因工程菌，用化学合成的方法合成编码VP4的T-细胞helper的15个氨基酸片段的基因连接O型VP1蛋白中有免疫原性的免疫决定簇区域的DNA序列连接AsiaⅠ型VP1蛋白中有免疫原性的免疫决定簇区域的DNA序列作为1个O/AsiaⅠ重复片段，串联8次；

(2)为合成O/AsiaⅠ基因工程菌，将O/AsiaⅠ的8个重复片段插入Lac质粒载体；

(3)将上述重组质粒转入大肠杆菌进行表达，得到O/AsiaⅠ菌株；

(4)将O/AsiaⅠ菌株置于营养丰富的LB培养基中发酵，发酵温度37℃，发酵时间为12-24小时，发酵液中加入氨苄西林使其最后浓度为50μg/ml，及IPTG，浓度为0.5mM，发酵结束后离心获得菌体，经细胞粉碎，包涵体复性，融合蛋白的分离纯化，与佐剂匀浆形成O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗。

本发明对多肽的基因工程研究包括建立了上游高效表达的设计和密集型高新技术的下游工艺，建立了高收率、低成本的简化工艺。O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗是系列多肽药物之一，可以廉价大量生产。以大肠杆菌为工程菌发酵培养时间只需12个小时，基因工程疫苗对环境没有污染，没有泄露的危险。生产出来的疫苗在贮藏、运输和使用过程中无需冷链。我们根据我国的一些地区发生的疫情及邻近接壤的国家报道的口蹄疫病毒血清型，选择O型、AsiaⅠ型两种血清型，能够有效地防治O型及AsiaⅠ型两种血清型口蹄疫，对于我国适用。我们的基因工程口蹄疫病毒疫苗除免疫效价高外还可分辨被免疫动物及已感染动物。

使用本发明的疫苗具有以下优点：1)安全性好，本发明是基因工程产品，不是灭活疫苗，不存在因痕量活病毒泄露而引起疾病爆发的危险。在实验动物中，以较高剂量的疫苗对小鼠进行皮下注射，在较长的观测期内，实验动物健康存活。

2)本发明的疫苗适用于基因工程的方法大规模生产，降低了成本。

3)利用本发明的疫苗可以区分感染动物和免疫动物。在自然界中，感染A型口蹄疫的动物，其体内会产生A型口蹄疫抗体；感染O型口蹄疫的动物，其体内会产生O型口蹄疫抗体；感染AsiaⅠ型口蹄疫的动物，其体内会产生AsiaⅠ型口蹄疫抗体。本发明的疫苗同时具有O型及AsiaⅠ型两种口蹄疫病毒VP1免疫决定簇，免疫注射后，动物体内产生抗O型及抗AsiaⅠ型两种口蹄疫的抗体，可以藉此区分感染动物和免疫动物，避免给动物进出口造成混乱。

4)本发明的疫苗含有O型及AsiaⅠ型两种口蹄疫病毒VP1免疫决定簇，又含有VP4的T-Helper多肽，大大增强了中和抗体的作用，8个重复片段表达，多肽的分子量大，在体内的半衰期延长，其产生中和抗体的时间也大大延长。

5)本发明的疫苗适用于我国O型及AsiaⅠ型两种口蹄疫病毒流行区。

附图说明

图1是O/AsiaⅠ基因工程菌的表达载体中的结构SEQ ID；

图2是质粒F8的构建过程示意图，图示如何将基因片段串联8次的过程；

图3是含Lac载体的O/AsiaⅠ基因工程菌(E.Coli)在发酵过程中的生长图谱(12hr，发酵罐：瑞士比欧，100L)。

具体实施方式

实施例一：

本发明根据O及AsiaⅠ两种类型FMDV的VP1免疫决定簇及VP4的T-细胞helper的氨基酸序列，设计合成DNA基因片段。其基因工程菌是O/AsiaⅠ。O/AsiaⅠ基因工程菌是口蹄疫病毒毒株编码VP4的T-细胞helper的15个氨基酸片段的DNA序列连接O型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列连接AsiaⅠ型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列作为1个重复片段，1个重复片段的核苷酸排列序列参见图1。

本发明的新型O/AsiaⅠ口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列所编码的多肽，其中n为1-5的整数。SEQ ID含有口蹄疫病毒毒株编码VP4的T-细胞helper的15个氨基酸片段的DNA序列连接A型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列连接AsiaⅠ型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA编码序列，其可以编码正向表达的O型和AsiaⅠ口蹄疫病毒的抗原决定簇，其表达产物可以刺激产生抗O型和AsiaⅠ口蹄疫病毒的抗体。

优选的，本发明的疫苗含有2^n-1个串联的SEQ ID所编码的多肽，其中，n为2-4的整数。

最优选的，本发明的疫苗含有2^n-1个串联的SEQ ID所编码的多肽，其中，n为4。

为提高生物利用率并增强免疫效果，本发明的疫苗还可以含有药学上可以接受的载体、辅料和或免疫佐剂等物质。

免疫佐剂是一种可以增强免疫反应的物质，其能够和抗原混合使用，有助于注射物质的沉积或汇集，还能增强抗体反应。

可作为免疫佐剂的物质有：1)微生物及其产物，如分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物胞壁酰二肽等。2)多聚核苷酸，如多聚肌苷酸、多聚腺苷酸、多聚左旋谷氨酸等。3)福氏佐剂(Freund′sadjuvant)，包括不完全福氏佐剂(将抗原水溶液与油剂(石蜡油或植物油)等量混合，再加乳化剂(羊毛脂或吐温80)制成的油包水抗原乳剂)和完全福氏佐剂(在不完全佐剂中加入分枝杆菌如卡介苗)。4)无机物，如明矾及氢氧化铝等。

近年来，发现以下物质也可作为免疫佐剂，包括：1)细菌毒素，如霍乱毒素(CT)和大肠杆菌热不稳定毒素(LT)。2)CT和LT的减毒衍生物或变异体。3)人内生性免疫调节因子，如IL-2、IL-12、GM-GSF。4)激素。5)脂肽。6)皂角苷，皂角苷衍生物QS-21。7)含有CpG motif的合成的寡核苷酸片段(CpG ODN)。8)类脂A的衍生物，如脂多糖衍生物单磷酰脂A(MPL)。9)胞壁酰二肽(MDP)的衍生物。

此外，某些具有内在的免疫刺激活性的递送系统也可作为免疫佐剂用于疫苗构建，这些递送系统包括但不限于：脂质体、乳剂、螺状体(cochleate)、病毒颗粒、微粒子和免疫刺激复合物(ISCOMs)。

上述各种类型的免疫佐剂均可用于本发明。佐剂可以以合适的剂量与本发明具有免疫源性的多肽配合使用，形成本发明的疫苗。

优选的，本发明的疫苗含有不完全福氏佐剂或氢氧化铝，更优选的，本发明的疫苗含有不完全福氏佐剂作为免疫增强剂。不完全福氏佐剂中羊毛脂和石蜡油的比率随季节的变化略有不同，如，春、夏、秋季羊毛脂和石蜡油的比率约为3∶7，冬季二者的比率约为1.5∶8.5。

本发明的O/AsiaⅠ口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的制备方法，包括将2^n-1个串联的SEQ ID所示的核苷酸序列，可以直接合成，也可先合成若干个DNA片段，连接后产生如SEQ ID所示的DNA序列。为了后续操作的方便，在设计DNA片段时，可以将合适的酶切位点引入序列两端，以便将靶序列克隆入合适的载体。

在本发明的一个优选实施方案中，为合成O/AsiaⅠ基因工程菌的载体，本发明设计合成口蹄疫病毒毒株编码VP4的T-细胞helper的15个氨基酸片段的DNA序列连接O型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列连接AsiaⅠ型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列作为一个重复片段，由10个DNA片段连接产生，每个重复片段F1含有SEQ ID所示的核酸序列和合适的限制性内切酶切点。利用基因工程的方法将F1克隆到载体，然后，通过酶切后具有相互匹配的粘性末端的限制性内切酶，将F2(含有2个串联的F1序列)克隆入载体，表达后的多肽含有2个重复片段(VP4+O型VP1+AsiaⅠ型VP1)。按照类似的方法，可以依次将F4、F8、F16克隆入载体，它们依次含有4个、8个、16个串联的F1序列，在合适的表达系统中进行表达后，得到的多肽分别含有4个、8个、16个串联的重复片段(VP4+O型VP1+AsiaⅠ型 VP1)。

在本发明的制备方法中，用于多肽表达的表达系统可以是原核表达系统，还可以是真核表达系统。表达系统包括合适的宿主细胞，以及能够在宿主细胞中复制并稳定存在的质粒或载体。

可以作为宿主细胞的例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链球菌、鼠伤寒沙门氏菌等；真核细胞，如酵母等。

可以使用的载体可以包括染色体来源的、非染色体来源的及合成的DNA序列。如：噬菌体DNA、杆状病毒、细菌质粒、酵母质粒以及由质粒、噬菌体和病毒DNA组合衍生的载体。

优选的，在原核表达系统中表达本发明的多肽。更优选的，可以将本发明的多肽克隆入高效率的表达载体(如市售的表达载体)与载体蛋白进行融合表达。

本发明还涉及一种O/AsiaⅠ基因工程菌株，其携带的质粒分别含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列，其中n为1-5的整数。

优选的，所述O/AsiaⅠ基因工程菌携带的质粒含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列，，其中n为2-4的整数。

更优选的，所述O/AsiaⅠ基因工程菌携带的质粒含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列，其中n为4。

本发明的O/AsiaⅠ口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗在预防和治疗口蹄疫中的用途。可以将本发明的疫苗注射给动物，刺激动物体内产生特异性的抗O型及抗AsiaⅠ型两种口蹄疫的抗体，故本发明的疫苗可以用于区分免疫接种动物和感染动物。

表1是抗原抗体反应的测定结果，抗体为O型及A型口蹄疫标准血清及O型口蹄疫治疗后牛血清均由上海市农科院畜牧兽医研究所提供，抗原为自行制备的本发明的O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗。

表1：抗原抗体反应

实施例二：

1：构建表达质粒

基因工程菌是O/AsiaⅠ基因工程菌。

为合成O/AsiaⅠ基因工程菌的载体，将口蹄疫病毒毒株编码VP4的T-细胞helper的15个氨基酸片段的DNA序列连接O型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列连接AsiaⅠ型VP1蛋白中有免疫源性的免疫决定簇区域的DNA序列作为1个重复片段F1，由10个DNA片段连接产生，每个重复片段F1含有图1所示的核酸序列和合适的限制性内切酶切点。利用基因工程的方法将F1克隆到Lac启动子表达质粒，然后按照图2的方法，可以依次将F2、F4、F8克隆入Lac启动子表达质粒，它们依次含有2个、4个、8个串联的F1序列(VP4+O型VP1+AsiaⅠ型VP1)。

2：O/AsiaⅠ基因工程菌的F8基因在表达载质粒体Puc18中的克隆

质粒Puc18经过限制性内切酶BamHⅠ/SalⅠ双酶切之后，将基因F8按常规方法克隆到Puc18质粒中，得到表达质粒O/AsiaⅠ。将表达质粒转入大肠杆菌，在37℃培养，以终浓度为0.2-0.5mmol/L的IPTG进行诱导。

3：发酵

250ml种子培养液(1000ml种子培养液含有蛋白胨10g，酵母抽提物5g，0.02mol/L的磷酸缓冲液20ml，pH7.0)置于1000ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，冷却后加入20％的葡萄糖溶液5ml。将1ml低温保存于甘油中的菌株加入上述溶液，加氨苄西林(Ampicillin)使其最后浓度为50μg/ml，37℃，摇床培养12-14小时(150rpm)作为扩大培养的种子菌。

1000ml种子培养液含有蛋白胨20g，酵母抽提物10g，0.2mol/L的磷酸缓冲液20ml，pH7.0，120℃灭菌20分钟，冷却至37℃后加氨苄西林(Ampicillin)使其最后浓度为50μg/ml。加入种子培养液20ml，再加入20％的葡萄糖溶液5ml，及微量元素CaCl2、NiNO3、CoCl3、MgSO4、FeCl3各1mg，维持所列条件进行发酵(发酵罐：100L；温度：37℃；搅拌速度：700rpm；通气量：80L/min；pH7.0-7.5)。间隔一定时间各取1ml发酵液置于2个塑料离心管中，8000rpm离心10min，除去上清液，称取菌体重量为湿重(g/L)。如图3所示，在发酵8-12个小时后，细菌浓度达到峰值。

发酵后，4000rpm离心30min收集菌体。

菌体以1000g/3L的比例悬浮于含1％的氯化钠、1mmol/L的EDTA、20mmol/L的磷酸钾pH7.0的溶液中，在悬浮液中加入1g溶菌酶，室温搅拌1小时，以破碎细胞，菌体悬浮液于10000rpm离心30min，弃上清。

将上述沉淀以250g/L的比例加入8mol/L的尿素溶液。搅拌、抽提过夜，20000rpm 离心30min，取上清，复性后有沉淀产生，以10000rpm离心30min，取沉淀，用无菌水制成匀浆形成O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，备用。

4：O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的检测

1)、试剂

O型及A型口蹄疫标准血清抗体均由上海市农科院畜牧兽医研究所无偿提供。

2)样品

含Puc18的O/AsiaⅠ基因工程菌经发酵后，离心收集菌体，破碎细胞，用8M尿素抽提，离心后收集沉淀，1mg加1ml无菌水备用，上清取1ml。在沉淀溶液加入O型口蹄疫标准血清，摇匀，产生沉淀反应，溶液混浊，加入O型口蹄疫标准血清，摇匀，不产生沉淀反应，溶液清澈；在上清溶液加入O型及A型口蹄疫标准血清，摇匀，无沉淀反应，溶液清澈。

结果：O/AsiaⅠ融合蛋白与O型口蹄疫标准血清产生抗原抗体反应，而上清液中不含融合蛋白，故对O型口蹄疫标准血清不发生反应。

5：O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的抗原抗体反应

利用蛋白质在溶液中，抗原抗体可以反应产生沉淀进行本发明疫苗免疫源性的测定。

1)抗原：测试品为本发明的O/AsiaⅠ基因工程菌表达纯化后得到的蛋白。

2)抗体：O型及A型口蹄疫标准血清抗体均由上海市农科院畜牧兽医研究所无偿提供。

3)抗原抗体反应：O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗中分别加入O型口蹄疫抗体及A型口蹄疫抗体。根据表1的结果，表明O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗与O型抗体有免疫沉淀反应，与A型抗体无免疫交叉反应。

6：O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的安全性实验(小鼠实验)

雄性昆明小鼠20只，每只体重20g左右，购自中科院上海动物中心。分为两组，一组为O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，另一组为对照组。

取1mg纯化的O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗抗原蛋白用1ml无菌水悬浮，对照组注射1ml无菌水，对小鼠进行腹腔注射进行观察24小时。

存活率

O/AsiaⅠ 10/10

对照组 10/10

序列表

Organization Applicant

----------------------

<110>OrganizationName：吴晓琰；赵泓；孙玉琨

Street：凯旋路3500号华苑大厦一号楼21层B座

City：上海

Country：中国

PostalCode：200030

Application Project

-------------------

<120>Title：一种O/AsiaⅠ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗及制备方法和用途

<130>AppFileReference：PCNWX1001462

<140>CurrentAppNumber：

<141>CurrentFilingDate：_____-___-___

Sequence

--------

<213>OrganismName：O/AsiaⅠ口蹄疫病毒

<400>PreSequenceString：

gaattccaga tctatcatca acaactacta catgcagcag taccaggata gccttaaggt 60

ctagatagta gttgttgatg atgtacgtcg tcatggtcct atcgatggat ggtgatacca 120

gcaccgatga tgttcgcggt gatctgcagt acctaccact atggtcgtgg ctactacaag 180

cgccactaga cgtcgttctg gcgcagaaag cggaacgcac cggtgaagaa agcacccgcc 240

aagaccgcgt ctttcgcctt gcgtggccac ttctttcgtg ggcgcgcggt gatttcagcg 300

cgctggcgca gcgcctgagc cgccgcctgg cgccactaaa gtcgcgcgac cgcgtcgcgg 360

actcggcggc ggacccggga tcctagaacg ttaagcctag gatcttgcaa 410

<212>Type：DNA

<211>Length：410

SequenceName：O/AsiaⅠ FMDV多肽疫苗

SequenceDescription：

Claims

1.一种O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其中：O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列所编码的蛋白，其中n为1-5的整数，SEQ ID所示的核酸序列：

Gaattccagatctatcatcaacaactactacatgcagcagtaccaggatagcatggatggtgataccagcaccgatgatgttcgcggtgatctgcaggttctggcgcagaaagcggaacgcaccggtgaagaaagcacccgccgcggtgatttcagcgcgctggcgcagcgcctgagccgccgcctgccgggatcctagaacgtt。

2.如权利要求1所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其中：O/Asia Ⅰ基因工程多肽疫苗含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列所编码的蛋白，其中n为2-4的整数。

3.如权利要求2所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其中：O/Asia Ⅰ基因工程多肽疫苗含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列所编码的蛋白，其中n为4。

4.如权利要求3所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其中：O/Asia Ⅰ基因工程菌中含有串联的基因以大肠杆菌中携带的Lac质粒进行表达。

5.如权利要求1-4任一项所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其中：所述的疫苗还包括药学上可接受的载体、辅料和/或免疫佐剂。

6.如权利要求5所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐剂是福氏不完全佐剂。

7.如权利要求5所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐剂是Al(OH)₃。

8.如权利要求5所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐剂是γ-多聚谷氨酸ploy-γ-glutamic acid。

9.一种制备权利要求1所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的方法，包括将O/Asia Ⅰ基因工程菌的2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列克隆入载体并在表达系统中进行表达的步骤，其中n为1-5的整数。

10.如权利要求9所述的O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的制备方法，包括将O/Asia Ⅰ基因工程菌的2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列克隆入载体并在表达系统中进行表达的步骤，其中n为2-4的整数。

11.如权利要求10所述的制备O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的方法，包括将O/Asia Ⅰ基因工程菌的2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列克隆入载体并在表达系统中进行表达的步骤，其中n为4。

12.如权利要求9-11任一项所述的制备O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的方法，其中所述核酸序列在原核表达系统中进行表达。

13.如权利要求9-11任一项所述的制备O/Asia Ⅰ型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗的方法，其中所述核酸序列在真核表达系统中进行表达。

14.一种O/Asia Ⅰ基因工程菌株，其携带的质粒分别含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列，其中n为1-5的整数，SEQ ID所示的核酸序列：

15.如权利要求14所述O/Asia Ⅰ基因工程菌株，其携带的质粒含有2^n-1个串联的SEQ ID所示的核酸序列，其中n为2-4的整数，SEQ ID所示的核酸序列：

16.如权利要求15所述的O/Asia Ⅰ基因工程菌株，其携带的质粒含有2^n-1个串联的SEQID所示的核酸序列，其中n为4，SEQ ID所示的核酸序列：