CN102268432A

CN102268432A - 乳清酸磷酸核糖转移酶启动子及应用和构建体与载体

Info

Publication number: CN102268432A
Application number: CN 201010189725
Authority: CN
Inventors: 张素芳; 赵宗保; 林心萍
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: CN102268432B

Abstract

通过扩增圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可有效表达目的基因于圆红冬孢酵母，并因此能够用于圆红冬孢酵母遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子。本发明还涉及包含这些元件的DNA构建体和载体。

Description

乳清酸磷酸核糖转移酶启动子及应用和构建体与载体

技术领域

本专利属于基因工程技术领域，具体涉及圆红冬孢酵母启动子、终止子及其用途，包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等。

背景技术

微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有卓越的生物合成能力，几乎能合成地球上所有的有机化学品。微生物的种属多样性和遗传多样性决定了其代谢多样性。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其化合物的生产高效、快捷，并与人类日常生产生活关系密切。

做为某一化学品的天然生产菌株或环境治理应用菌株，其特定的生产性能往往并非最优化。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物技术领域研究的热点和难点。实际上，对微生物油脂代谢过程的理解、开发和利用是否能达到或者超过化学加工水平，也是提高发酵过程经济性的关键。全基因组测序和基因工程技术的进步，为菌株生理学特性的认识和菌株改良提供了比传统诱变技术更为合理的方法。

代谢工程的实质是利用重组DNA技术和其它技术，有目的地改变已有的代谢和表达调控网络，更好地理解和利用细胞的代谢途径。代谢工程可以在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程，其不仅可以解释细胞生理生化特性，而且还可赋于出发菌株新的性状和表型：(1)扩大底物利用范围；(2)生产原来不存在的新化合物；(3)增强对环境中毒害物质的降解能力；(4)提高菌体对环境的适应能力；(5)阻断或降低副产品的生成；(6)代谢产品生产速率和生产性能的提高等(Bailey J E.Toward a science ofmetabolic engineering.Science.1991，252(5013)：1668-1675；Aristidou A，

M.Metabolic engineering applications to renewable resource utilization.Curr.Opin.Biotechnol.2000，11(2)：187-198)。

圆红冬孢酵母属于担子菌门异宗配合型真菌，是发酵工业中一种极为重要的微生物，可利用源于生物质的己糖和戊糖为原料生产重要的生物基产品：微生物油脂，胞内油脂可达细胞干重的60％以上(Ratledge C，WynnJ P.The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Adv.Appl.Microbiol.2002，51：1-51；Li Y，Zhao Z，Bai F.High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture.Enzyme Microb.Technol.2007，41(3)：312-317)；工业用酶或药物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸解氨酶(Hodgins D S.Yeastphenylalanine ammonia-lyase.Purification，properties，and the identification ofcatalytically essential dehydroalanine.J Biol.Chem.1971，246(9)：2977-2985；Gilbert H J，Clarke I N，Gibson R K，et al.Molecular cloning of the phenylalanineammonia lyase gene from Rhodosporidium toruloides in Escherichia coli K-12.JBacteriol.1985，161(1)：314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G Negri A，PiloneM S.Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidasefrom Rhodotorula gracilis.J Biol.Chem.1994，269(27)：17809-17814；Liao G J，Lee Y J，Lee Y H，et al.Structure and expression of the D-amino-acid oxidasegene from the yeast Rhodosporidium toruloides.Biotechnol.Appl.Biochem.1998，27(Pt 1)：55-61)等；β-胡萝卜素和胞外多糖；并在污水处理和生物制药中有较广泛的应用。实验结果表明，该菌可同时利用五碳糖和六碳糖为底物，抗逆性好，能直接以玉米秸秆酸水解液为碳源积累油脂，可实现生物质到生物基产品的高效转化(李永红，刘波，孙艳，等.广谱碳源产油酵母菌的筛选.中国生物工程杂志，2005，25(12)：39-44)。

虽然圆红冬孢酵母具有优良的工业生产性能，同时，圆红冬孢酵母来源的蛋白酶异源表达也获得成功(Pollegioni L，Molla G，Campaner S，Cloning，sequencing and expression in E.coli of a D-amino acid oxidase cDNA fromRhodotorula gracilis active on cephalosporin C.J Biotechnol.1997，58(2)：115-123；Faulkner J D，Anson J G，Tuite M F，et al.High-level expression of thephenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloidesin Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctionalexpression system.Gene.1994，143(1)：13-20)，但圆红冬孢酵母自身缺乏相应的遗传操作系统。以圆红冬孢酵母为宿主菌，无论是基因工程操作还是代谢工程菌株改良，都受到遗传操作系统的制约，难以进行靶向性的菌株改造。

启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此，如果要对圆红冬孢酵母进行遗传操作，获得能在圆红冬孢酵母中起作用的启动子是该工作的关键环节。

发明内容

鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可用于在圆红冬孢酵母中有效表达外源基因，并且可用于通过遗传工程技术进行圆红冬孢酵母菌种改良的启动子和终止子。

为实现本发明的目的，本发明人对圆红冬孢酵母中的基因表达情况进行了深入研究，发现ura5为一个组成型表达基因，其启动子为中强启动子。通过实验设计，结合简并PCR、染色体步移等方法，从圆红冬孢酵母染色体DNA中成功获得了包含有效启动子的DNA片段，由此完成了本发明。

具体讲，本发明包含下述实施方案(A)到(H)

(A)本发明涉及一种具有圆红冬孢酵母转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起800bp以内的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起800bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

(B)本发明涉及一种来自圆红冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段具有如下特征：(1)如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列；(2)或具有可与如(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。

(C)本发明涉及一种可完成靶基因在圆红冬孢酵母中转录起始和转录终止的DNA分子，它同时具有如(A)所述序列和如(B)所述序列，且如(B)所述序列位于如(A)所述序列的下游，与其相邻1-10000个核苷酸的DNA片段。

(D)本发明涉及一种可将靶基因与(A)-(C)所述的任一种DNA分子连接的DNA构建体，以便于靶基因能够在圆红冬孢酵母中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸。

(E)本发明涉及一种携带(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一个的载体。所述载体可以是质粒载体或粘粒载体。

(F)本发明涉及转入了如(D)所述的DNA分子或如(E)所述载体的圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属(Rhodosporidium)真菌。

(G)本发明所涉及的的pRtura5启动子，其特征在于：其来源于圆红冬孢酵母，可启动目的基因在圆红冬孢酵母中的转录和表达。

(H)本发明涉及编码具有乳清酸磷酸核糖转移酶(orotatephosphoribosyl transferase)活性的多肽的DNA片段，其cDNA序列具有如SEQ ID NO：3所示的脱氧核苷酸序列，其基因组DNA具有SEQ ID NO：5所示的脱氧核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

使用本发明中具有启动子活性的DNA分子和具有转录终止子活性的DNA，可实现外源基因或内源基因在圆红冬孢酵母中的表达，本发明提供了用于遗传工程圆红冬孢酵母的启动子、终止子和载体。为圆红冬孢酵母开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型圆红冬孢酵母。

附图说明

图1表示Rtura5简并PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图2表示pRtura5启动子DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图3表示Rtura5t终止子DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图4表示Rtura5启动子-ORF-终止子全长片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图5表示pRtura5启动子启动GFPuv在圆红冬孢酵母ATCC 10788中的整合性表达结果。

图6表示pRtura5启动子启动博来霉素抗性基因ble在红冬孢酵母ATCC10788的抗生表达结果。

图7表示pRtura5启动子启动遗传霉素抗性基因kanmx4在红冬孢酵母ATCC 10788的抗生表达结果。

图8表示重组圆红冬孢酵母在5’-FOA上的培养结果。

图9是质粒pura5gfp的结构图。

图10是质粒pura5ble的结构图。

图11是质粒pura5kan的结构图。

图12是圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的晶体结构模型，其表明三维结构正确。

本明的具体实施方式

在本文中，“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还可理解为：包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。

启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法：将报告基因(如绿色荧光蛋白)连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因表达量。如果人们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。

在本文中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA序列。可以通过诸如Northern杂交或RT-PCR的方法检查所转录RNA的大小而确认终止子的存在。或通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而确定终止子的活性。

本发明中的“圆红冬孢酵母”，包括属于该“物种”的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。本发明中的“红冬孢酵母属真菌”，没有具体限制，其例子包括归属于该属的真菌，除圆红冬孢酵母外，如Rhodosporidium azoricum，Rhodosporidium babjevae，Rhodosporidiumsphaerocarpum。

本发明的“目的基因”，包括能够在圆红冬孢酵母中表达的蛋白编码序列，反义RNA编码序列和核酸酶编码序列。能够在圆红冬孢酵母中表达的蛋白编码序列的例子包括源于圆红冬孢酵母的核酸序列，且并不局限于此。本发明的目的基因还包括来源于其它微生物、植物和动物的蛋白编码序列。

本发明中的启动子具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部或包含该DNA序列3’-末端的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

本发明中的终止子具有如如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列杂交的、且保持转录终止子活性的序列，或对SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：2所示序列具有50％以上同源性、且具有终止子活性的序列。

本发明中的启动子-目的基因的构建体、目的基因-终止子的构建体或启动子-目的基因-终止子的构建体，可以直接或经载体介导转化圆红冬孢酵母，以便于目的基因表达，可以优选质粒载体作为介导载体。

本发明的启动子可以按照以下方面从圆红冬孢酵母中分离。

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作，如无特别说明则均由大连TaKaRa公司完成。

实施例1：圆红冬孢酵母ATCC 10788总RNA的提取

将新鲜圆红冬孢酵母R.toruloides ATCC 10788(购自美国标准生物品收藏中心，ATCC)由斜面接种到50ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养24h，再以1∶50的体积比例将菌液分别转接到100ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养12h达对数生长期。在4℃下，5000rpm离心4min，收集菌体，用液氮迅速冷冻菌体，研磨破壁。使用TaKaRa公司RNAiso试剂盒，并按照其标准步骤提取总RNA。

RNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的两条带。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝2.01，表明总RNA质量很好。总RNA样品冻存于-80℃，备用。

实施例2：圆红冬孢酵母ATCC 10788 cDNA第一链合成和ura5简并PCR

以圆红冬孢酵母R.toruloides ATCC 10788总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。首先，将1.0μl总RNA(约2μg)，1.0μl引物SMART IV：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′和1.0μloligo dT-接头引物CDS III/3′：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)_30N-1N-3′，2.0μl DEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TaKaRa公司)，加入到PCR管中混匀，于72℃保温2min，立即置于冰上冷却2min，将2.0μl 5×first strandbuffer，1.0μl DTT(20mM)，1.0μl dNTP(10mM)，1.0μl powerscript reversetranscriptase(Clontech公司)加入到体系中，混匀。于42℃延伸反应60min，最后4℃结束反应，存于-20℃，备用。

根据NCBI公布的其它物种来源的乳清酸磷酸核糖转移酶氨基酸序列，通过序列比对获得其相对保守区域，并利用此保守区域设计合成两条简并引物，ura5-sense：5′-ATGAG(AGCT)GC(AGCT)AC(AGCT)TCCTA(AGCT)GC-3′和ura5-anti：5′-CTA(AGCT)T(CT)(AG)AC(AG)CC(AGCT)CACT-3′，以反转录合成的cDNA第一链为模板，进行Rtura5基因的简并PCR扩增，10×PCR缓冲液5.0μl，dNTPs(10mM)1.0μl，ura5-sense引物(50mmol/l)1.0μl，ura5-anti引物(50mmol/l)1.0ul，rTaq酶(大连TakaRa)0.5μl，合成的cDNA第一链模板1.0μl，ddH₂O 40.5μl，于94℃保温3min，然后于94℃30s，57℃45s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到0.8kb左右的条带(图1)，利用DNA回收试剂盒(购自碧云天)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照TaKaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T载体(购自TaKaRa)，转化入E.coli DH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，序列结果推测出的氨基酸序列经Blastp分析，证实为乳清酸磷酸核糖转移酶序列，如SEQ ID NO：4序列所示。乳清酸磷酸核糖转移酶cDNA序列如SEQ ID NO：3序列所示。

实施例3：Rtura5基因基因组DNA序列的扩增

1.R.toruloides ATCC 10788(购自美国标准生物品收藏中心，ATCC)的基因组DNA提取采用玻璃珠破壁法(精编分子生物学实验指南第三版第13章，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)。制备好的基因组DNA，利用Nanodrop 1000测定，测得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.85，表明基因组DNA质量很好。浓度为120ng/μl，共500μl，基因组DNA样品冻存于-20℃，备用。

2.根据实施例2中获得的乳清酸磷酸核糖转移酶cDNA序列，设计1对基因特异性引物，ura5-ORF-p1：5’-ATGAGCGCCACGTCCTACGC-3’和ura5-ORF-p2：5’-CTAGTTAACGCCCCACTTTGCG-3’，以圆红冬孢酵母ATCC 10788的基因组DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，得到约0.8kb的PCR产物(图略)。PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤回收、克隆到pMD18-T载体，并进行测序，得到如序列表SEQ ID NO：5所示的DNA序列。经与实施例2中获得的乳清酸磷酸核糖转移酶cDNA序列比对，证实该基因片段为其乳清酸磷酸核糖转移酶基因组DNA序列，无内含子。

实施例4：染色体步移获得Rtura5基因5’翼侧序列(启动子)

本实施例利用Genome Walking Kit(购自TaKaRa)完成。

根据实施例3中得到的ura5基因组DNA序列，设计3条Specific Primer(基因特异性引物)，ura5-SP1：5’-AGCGACGAGGGGGATGCCCTTGT-3’，ura5-SP2：5’-GTTGAAGAAGTAGGGCGAGGAGC-3’和ura5-SP3：5’-GAGAGCGGTCTCGATGATCGAG-3’，做为下游引物，按照试剂盒说明书进行以下操作。

1.1^stPCR反应

以实施例3中精制的基因组DNA为模板，进行第一轮扩增。反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP 1Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，ura5-SP1(10μmol/l)1.0μl，R.toruloides ATCC 10788基因组DNA模板(120ng/μl)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：先进行5个高温退火温度的高特异性反应，然后进行1个极低退火温度的低特异性反应；然后进行热不对称PCR：2个高退火温度(65℃)的高特异性反应和1个低退火温度(44℃)的低特异性反应交替循环，共15次。具体参数如下：94℃1min，98℃1min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，共5个循环；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

2.2^nd巢式PCR反应

反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1 Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，1^stPCR反应产物1.0μl，ura5-SP2(10μmol/l)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

3.3^rd巢式PCR反应

反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1 Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，2^nd巢式PCR反应产物1.0μl，ura5-SP3(10μmol/l)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

3^rd巢式PCR反应产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带，利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，证实为预期的pRtura5基因序列。

序列号：1(SEQ ID NO：1)

序列长度：1000bp

序列类型：DNA

来源：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

1 TGCCGCCTAT CTGTTAAAAC TCAATGGATA CAATGCAAAG TCGGCTCGCG CCCTCTTCTC

61 CCGTTCCCCC GTACCTAGAC ATGCGTCGTG AGTGCTTCCC TCCGTCATGC AACCGTCGCA

121 AGCTCCTCGC TCCGTCGTCG CTGCTGAAGC TGCTCCTGCG CAATCCGCTG CGCGGCGGGT

181 ACCTCGCCTC GCTCCCTTTC CGCCGCCCGA ATCGCCTGTG TGAGCCTGTT CCTCCGAGAC

241 ACGACCATCG TCTTGGGATT GGCTTGTGGT ACGGGCAGAG GGCTGGTCTC TGCAATTGAG

301 CAAGCGAGCC GAGGCAGCGA TGGTCAGTTC CGGTCGCAGA CCGAGGCTCC AGGGAAGGGA

361 CGGCGGGACG CACTGATGAC GCCGGCCTGA ATGAGCAGCT TCTCAAAGCG CTTTGTCGGC

421 AGCGCACCCT GGCTGAGCCA GTACCGGACC CGCTCCAGGT TCCACTCGAC CTTCTTCTGC

481 CCGACCTTGG CGACGCCCGT GTTGGGCGTG TGCTGCCGTG GTCCCCACTC CTTCGGGTCC

541 CTGACCTGAC CGTTTGGCGA GACCGACGGC GCTGGCACGA CGACCGGTCG CGGGTTGTAC

601 GAACCGAGGA GCTCGAGGGG TTTGGCGGTC TGGCGCTGCG GCGCGCGGAT GGCGACGAGC

661 GAGTAGACGG GGTTGTTGCG CGTGCAGTGG TGGCGCGCGA GGCGCAATCG GACCGACATC

721 TCGTGCGCTG GCGGAGAGCG AGTGTGCGAG GACGAGGAAA AGGAGCGGGA GGAGGAGGGT

781 TGGGAGCGAA CCACCTCGTG CAGCTGGACT GGACGCGCTA GACGACTGCC AGACTCGCTA

841 TACTGCTCTT TACATCCGCT AGAATCCTGC ACCCGCTCGA ACCAGCTCCT CCCACCGTCA

901 GTTCGCCTCC CCCTCTCATC CTCATCTCTC AAAGGACTTC CTCGCTCGCA ACTCGCTGGA

961 GGGAGCTGCA AGACTGACAC GAGGTCGAAA ACACCGTCAG

实施例5：染色体步移获得Rtura5基因3’翼侧序列(终止子)

本实施例也是利用Genome Walking Kit(购自TaKaRa)完成。

根据实施例3中得到的ura5DNA序列，设计3条Specific Primer(基因特异性引物)，分别为ura5-SP11：5’-CACGACGAGGACGTGATATCGGCT-3’，ura5-SP22：5’-GAGGGCGGTCAGACGGCGGGTATT-3’和ura5-SP33：5’-CGTCGTCAAGATGCGCGACATCGTT-3’，做为上游引物，按照试剂盒说明书进行3’翼侧染色体步移操作，除Specific Primer分别由ura5-SP1，ura5-SP2，ura5-SP3依次更换为ura5-SP11，ura5-SP22，ura5-SP33外，其它同实施例4。

3^rd巢式PCR反应产物利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化，经TA克隆插入pMD18-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，证实为预期的Rtura5t基因序列。

实施例6：Rtura5启动子-开放阅读框架-终止子全长基因获得

根据实施例4和实施例5中获得的启动子和终止子序列，重新设计一对引物进行Rtura5“启动子-开放阅读框架-终止子”全长基因的扩增。pRtura5t-p1：5’-TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATG-3’，pRtura5t-p2：5’-GCCATTCAATCTGTTCAGCCACCC-3’。以实施例3中制备的R.toruloides基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR体系(50μl)：10×Speed buffer 5.0μl，dNTPs(10mmol/l)1.0μl，上游引物Rtura5-p1(10μmol/l)2.0μl，下游引物Rtura5-p2(10μmol/l)2.0μl，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TaKaRa公司)0.5μl，基因组DNA模板(120ng/μl)2μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃1.0min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：6所示的DNA序列，证实为预期的pRtura5t全长序列，该重组载体命名为T-pRtura5t。

实施例7：圆红冬孢酵母特异性绿色荧光蛋白表达盒ura5gfp的构建

ura5gfp圆红冬孢酵母特异性绿色荧光蛋白表达盒的构建利用的是RF克隆(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：A restriction-free method forinserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67：67-74；Yang F，Zhang S，Tang W，Zhao Z，2008.Identification of theorotidine-5′-monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides.Yeast 25(9)：623-630)的方法。

pRtura5t全长序列扩增和克隆见实施例6。

1.绿色荧光蛋白编码基因GFPuv的获得

以pGFPuv质粒(购自BD Biosciences)为模板，利用一对引物gfp-p1：5’-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3′和gfp-p2：5’-TCATTTGTAGAGCTCATCCAT-3’，进行PCR扩增。体系(50μl)：5×Primebuffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，上游引物gfp-p1(10μmol/l)2.0μl，下游引物gfp-p2(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，pGFPuv质粒(120ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，利用taq DNA聚合酶进行DNA片段3’末端加A，体系(50μl)：10×PCRbuffer 5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，纯化后的GFPuv DNA片段30μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：72℃30min，4℃结束反应。3’末端加A后的GFPuv DNA片段利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，克隆入pMD18-T载体，送TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：7所示的DNA序列，证实为预期的GFPuv基因序列。

2.参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：Arestriction-free method for inserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67：67-74)，设计RF克隆引物：ura5-gfp-p1：5′-CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atgagtaaaggagaagaact-3′和ura5-gfp-p2：5′-GGAACTGCCCAGACGCACTTGTAT ctatttgtagagctcatccat-3′(其中大写字母部分序列与pRtura5t克隆载体中原有的ura5ORF翼侧序列互补，小写字母部分序列与绿色荧光蛋白GFPuv ORF互补)。

3.RF I反应体系及流程：以本实施例操作项1中构建的GFPuvTA克隆载体为模板，利用ura5gfp-p1和ura5gfp-p2为引物，进行RF第一轮扩增。体系(50μl)：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，T-GFPuv质粒(100ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20℃保存备用。

4.RF II反应：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，实施例6中构建的T-pRtura5t质粒(100ng/μl)1.0μl，本实施例前述步骤中RFI反应产物(100ng/μl)5.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，68℃12min，之后95℃30s，65℃45s (-1℃/cyc)，68℃12min，15个循环，接下来再进行一轮：95℃30s，55℃45s，68℃12min，20个循环，72℃10min，4℃结束反应。

5.DpnI消化和电击转化：取8μl RF II反应产物加入1μl DpnI(购自New England Biolabs)和1μl DpnI buffer混匀后在37℃作用120min去除原T-pRtura5t质粒后，分别取2μl电击转化DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura5gfp-p1和ura5gfp-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为ura5启动子和ura5终止子的ura5gfp表达盒，同时，该重组载体命名为pura5gfp。GFPuv ORF序列如SEQ ID NO：7所示；完整的ura5gfp表达盒如SEQ ID NO：8所示。

实施例8：利用ura5gfp表达盒进行Rtura5基因敲除兼绿色荧光蛋白表达

1.Rtura5gfp敲除盒的制备

以实施例7构建的pura5gfp载体为模板，以实施例6中的寡核苷酸序列pRtura5t-p1和pRtura5t-p2为引物，进行Rtura5gfp敲除盒的大量制备。PCR体系(500μl)：10×Speed buffer 50.0μl，dNTPs(10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶(大连TaKaRa公司)5.0μl，基因组DNA模板(120ng/μl)15.0μl，ddH₂O加至500μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在380ng/μl，共50μl，-20℃保存备用。

2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备

R.toruloides np11感受态细胞的制备：R.toruloides ATCC 10788(购自美国标准生物品收藏中心ATCC)菌株挑菌落接种10ml YEPD培养基(葡萄糖20.0g/l，酵母提取物10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，pH 6.0)，30℃，200rpm，培养20h；培养物1∶50比例转接新鲜YEPD培养基，100ml(500ml锥形瓶，装液量100ml)，30℃，200rpm，培养6-9h，OD值达到0.6-1.2；培养物冰浴10-30min，4℃，4000rpm离心5min，弃上清；0℃无菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。

3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定

Rtura5gfp敲除盒的电击转化：取100μl R.toruloides ATCC 10788感受态细胞，加入Rtura5gfp敲除盒5μl(总共2μg)，混匀后冰浴5min，移入预冷至0℃的电击杯中，电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；涂布YEPD平板，10μl/平板，30℃培养28-36h；逐一挑单克隆利用荧光显微镜进行镜检，阳性重组子ATCC 10788Δura5::gfp的荧光相片如图5所示。

3株重组圆红冬孢酵母ATCC 10788Δura5::gfp YEPD培养24h的培养物，利用生理盐水(0.9％NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个稀释度，分别移取10μl菌液于含5’-FOA(5’-氟乳清酸，购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0.2％5’-FOA，葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，pH 6.0)平板，待液体吸收完全，于30℃倒置培养2天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788Δura5::gfp具备5’-FOA抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC 10788则无菌落生长。

以上结果说明，Rtura5gfp敲除盒(表达盒)在启动绿色荧光蛋白在圆红冬孢酵母中的整合性表达的同时，可以灭活整合位置ura5基因编码的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。

实施例9：圆红冬孢酵母特异性博来霉素抗性表达盒ura5ble的构建

ura5ble圆红冬孢酵母特异性博来霉素表达盒的构建，同样是利用RF克隆的方法。pRtura5t全长序列扩增和克隆见实施例6。

1.参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：Arestriction-free method for inserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67：67-74)，设计RF克隆引物：ura5-ble-p1：5′-CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atggccaagttgaccagtgccgtt-3′和ura5-ble-p2：5′-GGAACTGCCCAGACGCACTT GTATctagtcctgctcctcggccacg-3′(其中大写字母部分序列与pRtura5t克隆载体中原有的ura5ORF翼侧序列互补，小写字母部分与博来霉素抗性基因ble ORF互补)。

2.RF I反应体系及流程：以pPICZαA质粒(购自Invitrogen公司)为模板，利用ura5ble-p1和ura5ble-p2为引物，进行RF第一轮扩增。体系(50μl)：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，pPICZαA质粒(100ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20℃保存备用。

3.RF II反应：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，实施例6中构建的T-pRtura5t质粒(100ng/μl)1.0μl，本实施例前述步骤中RFI反应产物(100ng/μl)5.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，68℃12min，之后95℃30s，65℃45s(-1℃/cyc)，68℃12min，15个循环，接下来再进行一轮：95℃30s，55℃45s，68℃12min，20个循环，72℃10min，4℃结束反应。

4.DpnI消化和电击转化：取8μl RF II反应产物加入1μl DpnI(购自New England Biolabs)和1μl DpnI buffer混匀后在37℃作用120min去除原T-pRtura5t质粒后，分别取2μl电击转化DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura5ble-p1和ura5ble-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为ura5启动子和ura5终止子的ura5ble表达盒，同时，该重组载体命名为pura5ble。ble ORF序列如SEQ ID NO：9所示；完整的ura5ble表达盒如SEQ ID NO：10所示。

实施例10：利用ura5ble表达盒进行Rtura5基因敲除兼博来霉素抗性表达

1.Rtura5ble敲除盒的制备

以实施例9构建的pura5ble载体为模板，以实施例6中的寡核苷酸序列pRtura5t-p1和pRtura5t-p2为引物，进行Rtura5ble敲除盒的大量制备。PCR体系(500μl)：10×Speed buffer 50.0μl，dNTPs(10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶(大连TaKaRa公司)5.0μl，基因组DNA模板(120ng/μl)15.0μl，ddH₂O加至500μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在300ng/μl，共50μl，-20℃保存备用。

2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备

R.toruloides np11感受态细胞的制备同实施例8中的操作项3。

3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定

Rtura5ble敲除盒的电击转化：取100μl R.toruloides ATCC 10788感受态细胞，加入Rtura5ble敲除盒10μl(总共3μg)，混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；涂布含20μg/ml Zeocin(购自Invitrogen公司)的YEPD平板，200μl/平板，30℃培养2-10d，约有100个转化子陆续出现。

挑取3个Zeocin抗性转化子于YEPD培养基中培养24h，培养物利用生理盐水(0.9％NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个稀释度，分别移取10μl菌液点样于含5’-FOA(购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0.2％5’-FOA，葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，pH 6.0)平板，待液体吸收完全后，于30℃倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788Δura5::ble具备5’-FOA抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC10788则无菌落生长。

以上结果说明，Rtura5ble敲除盒(表达盒)在启动博来霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中整合性表达的同时，可以灭活整合位置ura5基因编码的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。

实施例11：圆红冬孢酵母特异性遗传霉素抗性表达盒ura5kan的构建

ura5kan圆红冬孢酵母特异性遗传霉素抗性表达盒的构建，同样是利用RF克隆的方法。pRtura5t全长序列扩增和克隆见实施例6。

1.参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：Arestriction-free method for inserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67：67-74)，设计RF克隆引物：ura5-kan-p1：5′-CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atgggtaaggaaaagactcacgt-3′和ura5-kan-p2：5′-GGAACTGCCCAGACGCACTT GTATttagaaaaactcatcgagcatc-3′(其中大写字母部分序列与pRtura5t克隆载体中原有的ura5ORF翼侧序列互补，小写字母部分序列与遗传霉素抗性基因kanmx4ORF互补)。

2.RF I反应体系及流程：以pFA6-kanmx4质粒(购自EUROSCARF)为模板，利用ura5kan-p1和ura5kan-p2为引物，进行RF第一轮扩增。体系(50μl)：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，pFA6-kanmx4质粒(110ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20℃保存备用。

4.DpnI消化和电击转化：取8μl RF II反应产物加入1μl DpnI(购自New England Biolabs)和1μl DpnI buffer混匀后在37℃作用120min去除原T-pRtura5t质粒后，分别取2μl电击转化DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura5kan-p1和ura5kan-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为ura5启动子和ura5终止子的ura5kan表达盒，同时，该重组载体命名为pura5kan。kanmx ORF序列如SEQID NO：11所示；完整的ura5kan表达盒如SEQ ID NO：12所示。

实施例12：利用ura5kan表达盒进行Rtura5基因敲除兼遗传霉素抗性表达

1.Rtura5kan敲除盒的制备

以实施例11构建的pura5kan载体为模板，以实施例6中的寡核苷酸序列pRtura5t-p1和pRtura5t-p2为引物，进行Rtura5kan敲除盒的大量制备。PCR体系(500μl)：10×Speed buffer 50.0μl，dNTPs(10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶(大连TaKaRa公司)5.0μl，基因组DNA模板(120ng/μl)15.0μl，ddH₂O加至500μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在300ng/μl，共40μl，-20℃保存备用。

2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备

R.toruloides np11感受态细胞的制备同实施例8中的操作项3。

3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定

Rtura5kan敲除盒的电击转化：取100μl R.toruloides ATCC 10788感受态细胞，加入Rtura5kan敲除盒10μl(总共3.2μg)，混匀后冰浴5min，移入预冷至0℃的电击杯中，电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；涂布含50μg/mlG418(购自北京舟鼎国)的YEPD平板，200μl/平板，30℃培养2-10d，约有60个转化子陆续出现。

挑取3个G418抗性转化子于YEPD培养基中培养24h，培养物利用生理盐水(0.9％NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个稀释度，分别移取10μl菌液点样于含5’-FOA(购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0.2％5’-FOA，葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，pH 6.0)平板，待液体吸收完全后，于30℃倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788Δura5::kan具备5’-FOA抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC10788则无菌落生长。

以上结果说明，Rtura5kan敲除盒(表达盒)在启动遗传霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中整合性表达的同时，可以灭活整合位置的ura5基因编码的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。

实施例13：pRtura5启动子和Rtura5t终止子的属内(不同种间)活性测定

也即ura5gfp、ura5ble、ura5kan等表达盒在R.babjevae的功能验证。

在此利用26SrDNA基因做为整合位点，通过融合PCR方法使每个整合表达盒5’末端携带有约500bp的26SrDNA基因同源重组臂，分别进行ura5gfp表达盒、ura5ble表达盒、ura5kan表达盒在R.babjevae中的整合性表达。

1.根据NCBI公布的R.babjevae 26SrDNA序列(NO.：EF595746)，设计一对引物：Rb26S-Rtura5-p1：5’-AGCGGCGAGCGAAGCGGTAAG-3’和Rb26S-Rtura5-p2：5’-gagttttaacagataggcggcaACGCTGCGTTCCTCAGTCCCC-3’(其中大写字母部分序列与R.babjevae 26SrDNA序列3’端同源，小写字母部分序列与圆红冬孢酵母pura5启动子5’端互补)。

2.Rb26S-Rtura5gfp、Rb26S-Rtura5ble、Rb26S-Rtura5kan的构建

分别利用实施例5、实施例7和实施例9中的Pura5gfp、Pura5ble和Pura5kan载体为模板，分别进行Rb26S-Rtura5gfp、Rb26S-Rtura5ble、Rb26S-Rtura5kan等3个融合表达盒的构建。PCR体系(各500μl)：10×Speedbuffer 50.0μl，dNTPs(10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶5.0μl，DNA模板质粒Pura5gfp或Pura5ble或Pura5kan(均120ng/μl)15.0μl，ddH₂O加至500μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的Rb26S-Rtura5gfp、Rb26S-Rtura5ble和Rb26S-Rtura5kan表达盒浓度分别为310ng/μl、300ng/μl和270ng/μl，均45μl，-20℃保存备用。

3.R.babjevae ATCC90942感受态细胞制备

R.babjevae ATCC90942购自购自美国标准生物品收藏中心。首先，挑菌落接种10ml YEPD培养基，28℃，200rpm，培养24h；培养物1∶50比例转接新鲜YEPD培养基，100ml(500ml锥形瓶，装液量100ml)，28℃，200rpm，培养7-10h，OD值达到0.6-1.2；培养物冰浴10-30min，4℃，4000rpm离心5min，弃上清；0℃无菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。

4.R.babjevae ATCC90942的电击转化和表达结果观察

取3份100μl R.babjevae ATCC90942感受态细胞，分别加入Rb26S-Rtura5gfp、Rb26S-Rtura5ble和Rb26S-Rtura5kan表达盒各10μl，混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；Rb26S-Rtura5gfp转化液涂布YEPD平板，10μl/平板；Rb26S-Rtura5ble转化液涂布含20μg/mlZeocin(购自Invitrogen公司)的YEPD平板，200μl/平板；Rb26S-Rtura5kan转化液涂布含50μg/ml G418(购自北京舟鼎国)的YEPD平板，200μl/平板；均28℃培养2-10d。

R.babjevae ATCC90942/Rb26S-Rtura5gfp转化子逐一挑单克隆利用荧光显微镜进行镜检，每40个转化子中可有一个荧光表达的阳性重组子，荧光相片略；Rb26S-Rtura5ble转化液涂布含20μg/ml Zeocin的YEPD平板，28℃培养5d时可观察到大小不一的抗性重组子，平均100个/平板，转化重组效率200个重组子/μg表达盒DNA；Rb26S-Rtura5kan转化液涂布含50μg/ml G418的YEPD平板，28℃培养6d时可观察到大小不一的抗性重组子，平均100个/平板，转化重组效率200个重组子/μg表达盒DNA。

各表达盒在R.babjevae ATCC90942的表观转化重组效率，比在R.toruloides ATCC 10788中的高，可能是由于在R.babjevae ATCC90942进行的是单位点同源重组，而在R.toruloides ATCC10788进行的是双位点同源重组的原因。

以上实施例证明，ura5启动子能够启动绿色荧光蛋白基因、博来霉素抗性基因和遗传霉素抗性基因在R.toruloides ATCC 10788中的整合性表达；ura5gfp表达盒、ura5ble表达盒、ura5kan表达盒为基础构建的线性DNA敲除盒，能够敲除圆红冬孢酵母基因组上的ura5靶基因。使用本发明的具有启动子活性的DNA分子和具有转录终止子活性的DNA，可实现外源基因或内源基因在圆红冬孢酵母中的表达，本发明提供了用于遗传工程圆红冬孢酵母的启动子、终止子和一系列DNA构建体。为圆红冬孢酵母开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型圆红冬孢酵母。并为红冬孢酵母属的其它酵母菌的遗传操作提供了方法和平台。

实施例14：圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的结构表征

参考分子克隆实验指南第三版(萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)经分子排阻、离子交换纯化得到圆红冬孢酵母OPRTase。OPRTase晶体在室温下通过悬滴法获得。采用稀疏矩阵采样法，摸索可获得满足高分辨率结构解析要求的晶体的参数。最终的结晶条件如下：RtFBA蛋白溶液(15mg/ml)和等体积的母液(0.1M Tris-HCl(pH 7.4)，0.08M醋酸镁，26％(w/v)聚乙二醇6000)混合，2-3周内出现晶体。用多波长反常散射法(MAD)确定位相，MAD数据在ADSC Quantum-4R CCD探测器上收集，所有数据用DPS软件包进行统一，用CCP4软件包进行坐标修正与处理。模型用XtalView 4.0软件在Silicon Graphics OCTANE上构建和校正，用REFMAC程序进行精化。圆红冬孢酵母OPRTase晶体属于空间群P4₃2₁2，晶格常数为

根据衍射数据得到三维结构模型见图12。

本发明的有益效果是：

为圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属的酵母菌提供了启动子、终止子、选择性标记基因表达盒和遗传转化方法，将有力促进今后的圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属的酵母菌的菌株改良研究，加快圆红冬孢酵母代谢工程研究。

SEQ ID NO：1

TGCCGCCTAT CTGTTAAAAC TCAATGGATA CAATGCAAAG TCGGCTCGCG CCCTCTTCTC 60

CCGTTCCCCC GTACCTAGAC ATGCGTCGTG AGTGCTTCCC TCCGTCATGC AACCGTCGCA 120

AGCTCCTCGC TCCGTCGTCG CTGCTGAAGC TGCTCCTGCG CAATCCGCTG CGCGGCGGGT 180

ACCTCGCCTC GCTCCCTTTC CGCCGCCCGA ATCGCCTGTG TGAGCCTGTT CCTCCGAGAC 240

ACGACCATCG TCTTGGGATT GGCTTGTGGT ACGGGCAGAG GGCTGGTCTC TGCAATTGAG 300

CAAGCGAGCC GAGGCAGCGA TGGTCAGTTC CGGTCGCAGA CCGAGGCTCC AGGGAAGGGA 360

CGGCGGGACG CACTGATGAC GCCGGCCTGA ATGAGCAGCT TCTCAAAGCG CTTTGTCGGC 420

AGCGCACCCT GGCTGAGCCA GTACCGGACC CGCTCCAGGT TCCACTCGAC CTTCTTCTGC 480

CCGACCTTGG CGACGCCCGT GTTGGGCGTG TGCTGCCGTG GTCCCCACTC CTTCGGGTCC 540

CTGACCTGAC CGTTTGGCGA GACCGACGGC GCTGGCACGA CGACCGGTCG CGGGTTGTAC 600

GAACCGAGGA GCTCGAGGGG TTTGGCGGTC TGGCGCTGCG GCGCGCGGAT GGCGACGAGC 660

GAGTAGACGG GGTTGTTGCG CGTGCAGTGG TGGCGCGCGA GGCGCAATCG GACCGACATC 720

TCGTGCGCTG GCGGAGAGCG AGTGTGCGAG GACGAGGAAA AGGAGCGGGA GGAGGAGGGT 780

TGGGAGCGAA CCACCTCGTG CAGCTGGACT GGACGCGCTA GACGACTGCC AGACTCGCTA 840

TACTGCTCTT TACATCCGCT AGAATCCTGC ACCCGCTCGA ACCAGCTCCT CCCACCGTCA 900

GTTCGCCTCC CCCTCTCATC CTCATCTCTC AAAGGACTTC CTCGCTCGCA ACTCGCTGGA 960

GGGAGCTGCA AGACTGACAC GAGGTCGAAA ACACCGTCAG 1000

SEQ ID NO：2

ATACAAGTGC GTCTGGGCAG TTCCCCTCTT TTGCGTAGCG TACCCGCACG ATTTACTGAC 60

GCAACTCGGG CGCTACAGTC CTGTCAATCT ATCGCGATCT TCGCAGCGAC ACTCGCCGCT 120

TCCGATTCCC GACTTTGCGT CCATCTCGCT CGCTTCGATA AGCTTCTTTG GCTGCTACAG 180

ACGGCTCTCA ACTCTGCTGG AAGATGCAGC ATCAGCACTC ACGGGCTCCG CAACAGCTGC 240

TGTCACGCCT CGAGTTCAGT CGGGCAGCTC TCGCCATCTC GCAACCCGTT ATGGCGATGG 300

TCGACCCGTC TCGCGGCTTT CCCAGCGCTG CGTTTCCGCT TCAGCTGTCG CGGTACAAAC 360

TTCATCGCCC CGTAGCGAGC CGTCTCTCGC GCAACGAGGC AATCTCGCGC TTCTCTCCCT 420

AACGCTTTCT ATCGGTCCCG GCCTCTCTCC CGCGGACTCT AAGAGACGTC GACGCAGTTT 480

CGATATCGTC AACAGCGAGC GCAGACGAGC ACTGCCCGAG CAGTGAACGA CGACGAGCTC 540

TGTACGAAGC GATCGGATCC GCCGCCTTCG CTCGCGACAT GCTCGAGCTT TCCTGATCAC 600

CTTGTCTGAG TTGCTCAGGC TCTGCTAAGT CAGTCGTGCG CATCGGAGTT TGCTGAGGCG 660

CGAGAAGGAT ATTACAGCTC GTACGAAGGA CGGCGACTCT GGCTCGCTGT CCGTCACACG 720

AGACAGAGGC CAGCCTCGAC CTCGTCAGCG AGTCGGTCTG TCCATGACGG CTAACTAATG 780

AGGGTGGCTG AACAGATTGA ATGGC 805

SEQ ID NO：3(圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶cDNA序列)

ATGAGCGCCA CGTCCTACGC CGCCTCGATC ATCGAGACCG CTCTCGCGAG CGAGCAGCCC 60

ATCCTCCGCT TCGGCACCTT CACCCTCAAG TCTGGCCGCT CCTCGCCCTA CTTCTTCAAC 120

TTTGGCCTCT TCAACACCGG CTCTCTCCTC CTCGCTCTCG CCTCGGCCTT CGCAGACGCC 180

ATCCTCGACG CCTACCCCGA GATTGGCTCC TCCTCCGCCG GTCCCGACAC GCCCAAAGTC 240

CTCTTCGGAC CCGCCTACAA GGGCATCCCC CTCGTCGCTG CTATCGCATC CGAACTCGCA 300

CGACGAGGAC GTGATATCGG CTACAGCTAC AACCGCAAGG AGAAGAAGGA CCACGGCGAG 360

GGCGGGTCGA TTGTCGGTGC GCCGCTCAAG GGACAGAAGG TCCTCATCGT CGACGACGTG 420

ATCACGGCCG GTACTGCGAT TCGCGAGGCG CACAAGATCG TCGAGTCGGA GGGCGGTCAG 480

ACGGCGGGTA TTGTCGAGGC CCTCGACCGG GAGGAGCGCG GACAGGGCGA GCTCAGTACG 540

GTCCAGGAAG TCGAGAAGGA GCTCGGCGTC AAGGTCACGA GCGTCGTCAA GATGCGCGAC 600

ATCGTTGCGT GGCTCAAAGA GAAGGGCAAG CTCGACGAGA TGAAGGCCAT GGAGGAGTAC 660

CGCGCAAAGT GGGGCGTTAA CTAG 684

SEQ ID NO：4

Met Ser Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Ser Ile Ile Glu Thr Ala Leu

Ala Ser Glu Gln Pro Ile Leu Arg Phe Gly Thr Phe Thr Leu Lys

Ser Gly Arg Ser Ser Pro Tyr Phe Phe Asn Phe Gly Leu Phe Asn

Thr Gly Ser Leu Leu Leu Ala Leu Ala Ser Ala Phe Ala Asp Ala

Ile Leu Asp Ala Tyr Pro Glu Ile Gly Ser Ser Ser Ala Gly Pro

Asp Thr Pro Lys Val Leu Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Ile Pro

Leu Val Ala Ala Ile Ala Ser Glu Leu Ala Arg Arg Gly Arg Asp

Ile Gly Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Lys Lys Asp His Gly Glu

Gly Gly Ser Ile Val Gly Ala Pro Leu Lys Gly Gln Lys Val Leu

Ile Val Asp Asp Val Ile Thr Ala Gly Thr Ala Ile Arg Glu Ala

His Lys Ile Val Glu Ser Glu Gly Gly Gln Thr Ala Gly Ile Val

Glu Ala Leu AsP Arg Glu Glu Arg Gly Gln Gly Glu Leu Ser Thr

Val Gln Glu Val Glu Lys Glu Leu Gly Val Lys Val Thr Ser Val

Val Lys Met Arg Asp Ile Val Ala Trp Leu Lys Glu Lys Gly Lys

Leu Asp Glu Met Lys Ala Met Glu Glu Tyr Arg Ala Lys Trp Gly

Val Asn

SEQ ID NO：5(圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶基因组DNA序列)

ATGAGCGCCA CGTCCTACGC CGCCTCGATC ATCGAGACCG CTCTCGCGAG CGAGCAGCCC 60

ATCCTCCGCT TCGGCACCTT CACCCTCAAG TCTGGCCGCT CCTCGCCCTA CTTCTTCAAC 120

TTTGGCCTCT TCAACACCGG CTCTCTCCTC CTCGCTCTCG CCTCGGCCTT CGCAGACGCC 180

ATCCTCGACG CCTACCCCGA GATTGGCTCC TCCTCCGCCG GTCCCGACAC GCCCAAAGTC 240

CTCTTCGGAC CCGCCTACAA GGGCATCCCC CTCGTCGCTG CTATCGCATC CGAACTCGCA 300

CGACGAGGAC GTGATATCGG CTACAGCTAC AACCGCAAGG AGAAGAAGGA CCACGGCGAG 360

GGCGGGTCGA TTGTCGGTGC GCCGCTCAAG GGACAGAAGG TCCTCATCGT CGACGACGTG 420

ATCACGGCCG GTACTGCGAT TCGCGAGGCG CACAAGATCG TCGAGTCGGA GGGCGGTCAG 480

ACGGCGGGTA TTGTCGAGGC CCTCGACCGG GAGGAGCGCG GACAGGGCGA GCTCAGTACG 540

GTCCAGGAAG TCGAGAAGGA GCTCGGCGTC AAGGTCACGA GCGTCGTCAA GATGCGCGAC 600

ATCGTTGCGT GGCTCAAAGA GAAGGGCAAG CTCGACGAGA TGAAGGCCAT GGAGGAGTAC 660

CGCGCAAAGT GGGGCGTTAA CTAG 684

SEQ ID NO：6

TGCCGCCTAT CTGTTAAAAC TCAATGGATA CAATGCAAAG TCGGCTCGCG CCCTCTTCTC 60

CCGTTCCCCC GTACCTAGAC ATGCGTCGTG AGTGCTTCCC TCCGTCATGC AACCGTCGCA 120

AGCTCCTCGC TCCGTCGTCG CTGCTGAAGC TGCTCCTGCG CAATCCGCTG CGCGGCGGGT 180

ACCTCGCCTC GCTCCCTTTC CGCCGCCCGA ATCGCCTGTG TGAGCCTGTT CCTCCGAGAC 240

ACGACCATCG TCTTGGGATT GGCTTGTGGT ACGGGCAGAG GGCTGGTCTC TGCAATTGAG 300

CAAGCGAGCC GAGGCAGCGA TGGTCAGTTC CGGTCGCAGA CCGAGGCTCC AGGGAAGGGA 360

CGGCGGGACG CACTGATGAC GCCGGCCTGA ATGAGCAGCT TCTCAAAGCG CTTTGTCGGC 420

AGCGCACCCT GGCTGAGCCA GTACCGGACC CGCTCCAGGT TCCACTCGAC CTTCTTCTGC 480

CCGACCTTGG CGACGCCCGT GTTGGGCGTG TGCTGCCGTG GTCCCCACTC CTTCGGGTCC 540

CTGACCTGAC CGTTTGGCGA GACCGACGGC GCTGGCACGA CGACCGGTCG CGGGTTGTAC 600

GAACCGAGGA GCTCGAGGGG TTTGGCGGTC TGGCGCTGCG GCGCGCGGAT GGCGACGAGC 660

GAGTAGACGG GGTTGTTGCG CGTGCAGTGG TGGCGCGCGA GGCGCAATCG GACCGACATC 720

TCGTGCGCTG GCGGAGAGCG AGTGTGCGAG GACGAGGAAA AGGAGCGGGA GGAGGAGGGT 780

TGGGAGCGAA CCACCTCGTG CAGCTGGACT GGACGCGCTA GACGACTGCC AGACTCGCTA 840

TACTGCTCTT TACATCCGCT AGAATCCTGC ACCCGCTCGA ACCAGCTCCT CCCACCGTCA 900

GTTCGCCTCC CCCTCTCATC CTCATCTCTC AAAGGACTTC CTCGCTCGCA ACTCGCTGGA 960

GGGAGCTGCA AGACTGACAC GAGGTCGAAA ACACCGTCAG ATGAGCGCCA CGTCCTACGC 1020

CGCCTCGATC ATCGAGACCG CTCTCGCGAG CGAGCAGCCC ATCCTCCGCT TCGGCACCTT 1080

CACCCTCAAG TCTGGCCGCT CCTCGCCCTA CTTCTTCAAC TTTGGCCTCT TCAACACCGG 1140

CTCTCTCCTC CTCGCTCTCG CCTCGGCCTT CGCAGACGCC ATCCTCGACG CCTACCCCGA 1200

GATTGGCTCC TCCTCCGCCG GTCCCGACAC GCCCAAAGTC CTCTTCGGAC CCGCCTACAA 1260

GGGCATCCCC CTCGTCGCTG CTATCGCATC CGAACTCGCA CGACGAGGAC GTGATATCGG 1320

CTACAGCTAC AACCGCAAGG AGAAGAAGGA CCACGGCGAG GGCGGGTCGA TTGTCGGTGC 1380

GCCGCTCAAG GGACAGAAGG TCCTCATCGT CGACGACGTG ATCACGGCCG GTACTGCGAT 1440

TCGCGAGGCG CACAAGATCG TCGAGTCGGA GGGCGGTCAG ACGGCGGGTA TTGTCGAGGC 1500

CCTCGACCGG GAGGAGCGCG GACAGGGCGA GCTCAGTACG GTCCAGGAAG TCGAGAAGGA 1560

GCTCGGCGTC AAGGTCACGA GCGTCGTCAA GATGCGCGAC ATCGTTGCGT GGCTCAAAGA 1620

GAAGGGCAAG CTCGACGAGA TGAAGGCCAT GGAGGAGTAC CGCGCAAAGT GGGGCGTTAA 1680

CTAGATACAA GTGCGTCTGG GCAGTTCCCC TCTTTTGCGT AGCGTACCCG CACGATTTAC 1740

TGACGCAACT CGGGCGCTAC AGTCCTGTCA ATCTATCGCG ATCTTCGCAG CGACACTCGC 1800

CGCTTCCGAT TCCCGACTTT GCGTCCATCT CGCTCGCTTC GATAAGCTTC TTTGGCTGCT 1860

ACAGACGGCT CTCAACTCTG CTGGAAGATG CAGCATCAGC ACTCACGGGC TCCGCAACAG 1920

CTGCTGTCAC GCCTCGAGTT CAGTCGGGCA GCTCTCGCCA TCTCGCAACC CGTTATGGCG 1980

ATGGTCGACC CGTCTCGCGG CTTTCCCAGC GCTGCGTTTC CGCTTCAGCT GTCGCGGTAC 2040

AAACTTCATC GCCCCGTAGC GAGCCGTCTC TCGCGCAACG AGGCAATCTC GCGCTTCTCT 2100

CCCTAACGCT TTCTATCGGT CCCGGCCTCT CTCCCGCGGA CTCTAAGAGA CGTCGACGCA 2160

GTTTCGATAT CGTCAACAGC GAGCGCAGAC GAGCACTGCC CGAGCAGTGA ACGACGACGA 2220

GCTCTGTACG AAGCGATCGG ATCCGCCGCC TTCGCTCGCG ACATGCTCGA GCTTTCCTGA 2280

TCACCTTGTC TGAGTTGCTC AGGCTCTGCT AAGTCAGTCG TGCGCATCGG AGTTTGCTGA 2340

GGCGCGAGAA GGATATTACA GCTCGTACGA AGGACGGCGA CTCTGGCTCG CTGTCCGTCA 2400

CACGAGACAG AGGCCAGCCT CGACCTCGTC AGCGAGTCGG TCTGTCCATG ACGGCTAACT 2460

AATGAGGGTG GCTGAACAGA TTGAATGGC 2489

SEQ ID NO：7(绿色荧光蛋白编码基因)

ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTCACTGGA GTTGTCCCAA TTCTTGTTGA ATTAGATGGT 60

GATGTTAATG GGCACAAATT TTCTGTCAGT GGAGAGGGTG AAGGTGATGC AACATACGGA 120

AAACTTACCC TTAAATTTAT TTGCACTACT GGAAAACTAC CTGTTCCATG GCCAACACTT 180

GTCACTACTT TCTCTTATGG TGTTCAATGC TTTTCCCGTT ATCCGGATCA TATGAAACGG 240

CATGACTTTT TCAAGAGTGC CATGCCCGAA GGTTATGTAC AGGAACGCAC TATATCTTTC 300

AAAGATGACG GGAACTACAA GACGCGTGCT GAAGTCAAGT TTGAAGGTGA TACCCTTGTT 360

AATCGTATCG AGTTAAAAGG TATTGATTTT AAAGAAGATG GAAACATTCT CGGACACAAA 420

CTCGAGTACA ACTATAACTC ACACAATGTA TACATCACGG CAGACAAACA AAAGAATGGA 480

ATCAAAGCTA ACTTCAAAAT TCGCCACAAC ATTGAAGATG GATCCGTTCA ACTAGCAGAC 540

CATTATCAAC AAAATACTCC AATTGGCGAT GGCCCTGTCC TTTTACCAGA CAACCATTAC 600

CTGTCGACAC AATCTGCCCT TTCGAAAGAT CCCAACGAAA AGCGTGACCA CATGGTCCTT 660

CTTGAGTTTG TAACTGCTGC TGGGATTACA CATGGCATGG ATGAGCTCTA CAAATAA 717

SEQ ID NO：8(绿色荧光蛋白编码基因)

TGCCGCCTAT CTGTTAAAAC TCAATGGATA CAATGCAAAG TCGGCTCGCG CCCTCTTCTC 60

CCGTTCCCCC GTACCTAGAC ATGCGTCGTG AGTGCTTCCC TCCGTCATGC AACCGTCGCA 120

AGCTCCTCGC TCCGTCGTCG CTGCTGAAGC TGCTCCTGCG CAATCCGCTG CGCGGCGGGT 180

ACCTCGCCTC GCTCCCTTTC CGCCGCCCGA ATCGCCTGTG TGAGCCTGTT CCTCCGAGAC 240

ACGACCATCG TCTTGGGATT GGCTTGTGGT ACGGGCAGAG GGCTGGTCTC TGCAATTGAG 300

CAAGCGAGCC GAGGCAGCGA TGGTCAGTTC CGGTCGCAGA CCGAGGCTCC AGGGAAGGGA 360

CGGCGGGACG CACTGATGAC GCCGGCCTGA ATGAGCAGCT TCTCAAAGCG CTTTGTCGGC 420

AGCGCACCCT GGCTGAGCCA GTACCGGACC CGCTCCAGGT TCCACTCGAC CTTCTTCTGC 480

CCGACCTTGG CGACGCCCGT GTTGGGCGTG TGCTGCCGTG GTCCCCACTC CTTCGGGTCC 540

CTGACCTGAC CGTTTGGCGA GACCGACGGC GCTGGCACGA CGACCGGTCG CGGGTTGTAC 600

GAACCGAGGA GCTCGAGGGG TTTGGCGGTC TGGCGCTGCG GCGCGCGGAT GGCGACGAGC 660

GAGTAGACGG GGTTGTTGCG CGTGCAGTGG TGGCGCGCGA GGCGCAATCG GACCGACATC 720

TCGTGCGCTG GCGGAGAGCG AGTGTGCGAG GACGAGGAAA AGGAGCGGGA GGAGGAGGGT 780

TGGGAGCGAA CCACCTCGTG CAGCTGGACT GGACGCGCTA GACGACTGCC AGACTCGCTA 840

TACTGCTCTT TACATCCGCT AGAATCCTGC ACCCGCTCGA ACCAGCTCCT CCCACCGTCA 900

GTTCGCCTCC CCCTCTCATC CTCATCTCTC AAAGGACTTC CTCGCTCGCA ACTCGCTGGA 960

GGGAGCTGCA AGACTGACAC GAGGTCGAAA ACACCGTCAG ATGAGTAAAG GAGAAGAACT 1020

TTTCACTGGA GTTGTCCCAA TTCTTGTTGA ATTAGATGGT GATGTTAATG GGCACAAATT 1080

TTCTGTCAGT GGAGAGGGTG AAGGTGATGC AACATACGGA AAACTTACCC TTAAATTTAT 1140

TTGCACTACT GGAAAACTAC CTGTTCCATG GCCAACACTT GTCACTACTT TCTCTTATGG 1200

TGTTCAATGC TTTTCCCGTT ATCCGGATCA TATGAAACGG CATGACTTTT TCAAGAGTGC 1260

CATGCCCGAA GGTTATGTAC AGGAACGCAC TATATCTTTC AAAGATGACG GGAACTACAA 1320

GACGCGTGCT GAAGTCAAGT TTGAAGGTGA TACCCTTGTT AATCGTATCG AGTTAAAAGG 1380

TATTGATTTT AAAGAAGATG GAAACATTCT CGGACACAAA CTCGAGTACA ACTATAACTC 1440

ACACAATGTA TACATCACGG CAGACAAACA AAAGAATGGA ATCAAAGCTA ACTTCAAAAT 1500

TCGCCACAAC ATTGAAGATG GATCCGTTCA ACTAGCAGAC CATTATCAAC AAAATACTCC 1560

AATTGGCGAT GGCCCTGTCC TTTTACCAGA CAACCATTAC CTGTCGACAC AATCTGCCCT 1620

TTCGAAAGAT CCCAACGAAA AGCGTGACCA CATGGTCCTT CTTGAGTTTG TAACTGCTGC 1680

TGGGATTACA CATGGCATGG ATGAGCTCTA CAAATAGATA CAAGTGCGTC TGGGCAGTTC 1740

CCCTCTTTTG CGTAGCGTAC CCGCACGATT TACTGACGCA ACTCGGGCGC TACAGTCCTG 1800

TCAATCTATC GCGATCTTCG CAGCGACACT CGCCGCTTCC GATTCCCGAC TTTGCGTCCA 1860

TCTCGCTCGC TTCGATAAGC TTCTTTGGCT GCTACAGACG GCTCTCAACT CTGCTGGAAG 1920

ATGCAGCATC AGCACTCACG GGCTCCGCAA CAGCTGCTGT CACGCCTCGA GTTCAGTCGG 1980

GCAGCTCTCG CCATCTCGCA ACCCGTTATG GCGATGGTCG ACCCGTCTCG CGGCTTTCCC 2040

AGCGCTGCGT TTCCGCTTCA GCTGTCGCGG TACAAACTTC ATCGCCCCGT AGCGAGCCGT 2100

CTCTCGCGCA ACGAGGCAAT CTCGCGCTTC TCTCCCTAAC GCTTTCTATC GGTCCCGGCC 2160

TCTCTCCCGC GGACTCTAAG AGACGTCGAC GCAGTTTCGA TATCGTCAAC AGCGAGCGCA 2220

GACGAGCACT GCCCGAGCAG TGAACGACGA CGAGCTCTGT ACGAAGCGAT CGGATCCGCC 2280

GCCTTCGCTC GCGACATGCT CGAGCTTTCC TGATCACCTT GTCTGAGTTG CTCAGGCTCT 2340

GCTAAGTCAG TCGTGCGCAT CGGAGTTTGC TGAGGCGCGA GAAGGATATT ACAGCTCGTA 2400

CGAAGGACGG CGACTCTGGC TCGCTGTCCG TCACACGAGA CAGAGGCCAG CCTCGACCTC 2460

GTCAGCGAGT CGGTCTGTCC ATGACGGCTA ACTAATGAGG GTGGCTGAAC AGATTGAATG 2520

GC 2522

SEQ ID NO：9(博来霉素抗性基因ble)

ATGGCCAAGT TGACCAGTGC CGTTCCGGTG CTCACCGCGC GCGACGTCGC CGGAGCGGTC 60

GAGTTCTGGA CCGACCGGCT CGGGTTCTCC CGGGACTTCG TGGAGGACGA CTTCGCCGGT 120

GTGGTCCGGG ACGACGTGAC CCTGTTCATC AGCGCGGTCC AGGACCAGGT GGTGCCGGAC 180

AACACCCTGG CCTGGGTGTG GGTGCGCGGC CTGGACGAGC TGTACGCCGA GTGGTCGGAG 240

GTCGTGTCCA CGAACTTCCG GGACGCCTCC GGGCCGGCCA TGACCGAGAT CGGCGAGCAG 300

CCGTGGGGGC GGGAGTTCGC CCTGCGCGAC CCGGCCGGCA ACTGCGTGCA CTTCGTGGCC 360

GAGGAGCAGG ACTGA 375

SEQ ID NO：10(博来霉素抗性基因ble)

TGCCGCCTAT CTGTTAAAAC TCAATGGATA CAATGCAAAG TCGGCTCGCG CCCTCTTCTC 60

CCGTTCCCCC GTACCTAGAC ATGCGTCGTG AGTGCTTCCC TCCGTCATGC AACCGTCGCA 120

AGCTCCTCGC TCCGTCGTCG CTGCTGAAGC TGCTCCTGCG CAATCCGCTG CGCGGCGGGT 180

ACCTCGCCTC GCTCCCTTTC CGCCGCCCGA ATCGCCTGTG TGAGCCTGTT CCTCCGAGAC 240

ACGACCATCG TCTTGGGATT GGCTTGTGGT ACGGGCAGAG GGCTGGTCTC TGCAATTGAG 300

CAAGCGAGCC GAGGCAGCGA TGGTCAGTTC CGGTCGCAGA CCGAGGCTCC AGGGAAGGGA 360

CGGCGGGACG CACTGATGAC GCCGGCCTGA ATGAGCAGCT TCTCAAAGCG CTTTGTCGGC 420

AGCGCACCCT GGCTGAGCCA GTACCGGACC CGCTCCAGGT TCCACTCGAC CTTCTTCTGC 480

CCGACCTTGG CGACGCCCGT GTTGGGCGTG TGCTGCCGTG GTCCCCACTC CTTCGGGTCC 540

CTGACCTGAC CGTTTGGCGA GACCGACGGC GCTGGCACGA CGACCGGTCG CGGGTTGTAC 600

GAACCGAGGA GCTCGAGGGG TTTGGCGGTC TGGCGCTGCG GCGCGCGGAT GGCGACGAGC 660

GAGTAGACGG GGTTGTTGCG CGTGCAGTGG TGGCGCGCGA GGCGCAATCG GACCGACATC 720

TCGTGCGCTG GCGGAGAGCG AGTGTGCGAG GACGAGGAAA AGGAGCGGGA GGAGGAGGGT 780

TGGGAGCGAA CCACCTCGTG CAGCTGGACT GGACGCGCTA GACGACTGCC AGACTCGCTA 840

TACTGCTCTT TACATCCGCT AGAATCCTGC ACCCGCTCGA ACCAGCTCCT CCCACCGTCA 900

GTTCGCCTCC CCCTCTCATC CTCATCTCTC AAAGGACTTC CTCGCTCGCA ACTCGCTGGA 960

GGGAGCTGCA AGACTGACAC GAGGTCGAAA ACACCGTCAG ATGGCCAAGT TGACCAGTGC 1020

CGTTCCGGTG CTCACCGCGC GCGACGTCGC CGGAGCGGTC GAGTTCTGGA CCGACCGGCT 1080

CGGGTTCTCC CGGGACTTCG TGGAGGACGA CTTCGCCGGT GTGGTCCGGG ACGACGTGAC 1140

CCTGTTCATC AGCGCGGTCC AGGACCAGGT GGTGCCGGAC AACACCCTGG CCTGGGTGTG 1200

GGTGCGCGGC CTGGACGAGC TGTACGCCGA GTGGTCGGAG GTCGTGTCCA CGAACTTCCG 1260

GGACGCCTCC GGGCCGGCCA TGACCGAGAT CGGCGAGCAG CCGTGGGGGC GGGAGTTCGC 1320

CCTGCGCGAC CCGGCCGGCA ACTGCGTGCA CTTCGTGGCC GAGGAGCAGG ACTGAATACA 1380

AGTGCGTCTG GGCAGTTCCC CTCTTTTGCG TAGCGTACCC GCACGATTTA CTGACGCAAC 1440

TCGGGCGCTA CAGTCCTGTC AATCTATCGC GATCTTCGCA GCGACACTCG CCGCTTCCGA 1500

TTCCCGACTT TGCGTCCATC TCGCTCGCTT CGATAAGCTT CTTTGGCTGC TACAGACGGC 1560

TCTCAACTCT GCTGGAAGAT GCAGCATCAG CACTCACGGG CTCCGCAACA GCTGCTGTCA 1620

CGCCTCGAGT TCAGTCGGGC AGCTCTCGCC ATCTCGCAAC CCGTTATGGC GATGGTCGAC 1680

CCGTCTCGCG GCTTTCCCAG CGCTGCGTTT CCGCTTCAGC TGTCGCGGTA CAAACTTCAT 1740

CGCCCCGTAG CGAGCCGTCT CTCGCGCAAC GAGGCAATCT CGCGCTTCTC TCCCTAACGC 1800

TTTCTATCGG TCCCGGCCTC TCTCCCGCGG ACTCTAAGAG ACGTCGACGC AGTTTCGATA 1860

TCGTCAACAG CGAGCGCAGA CGAGCACTGC CCGAGCAGTG AACGACGACG AGCTCTGTAC 1920

GAAGCGATCG GATCCGCCGC CTTCGCTCGC GACATGCTCG AGCTTTCCTG ATCACCTTGT 1980

CTGAGTTGCT CAGGCTCTGC TAAGTCAGTC GTGCGCATCG GAGTTTGCTG AGGCGCGAGA 2040

AGGATATTAC AGCTCGTACG AAGGACGGCG ACTCTGGCTC GCTGTCCGTC ACACGAGACA 2100

GAGGCCAGCC TCGACCTCGT CAGCGAGTCG GTCTGTCCAT GACGGCTAAC TAATGAGGGT 2160

GGCTGAACAG ATTGAATGGC 2180

SEQ ID NO：11(遗传霉素抗性基因kanmx4)

ATGGGTAAGG AAAAGACTCA CGTTTCGAGG CCGCGATTAA ATTCCAACAT GGATGCTGAT 60

TTATATGGGT ATAAATGGGC TCGCGATAAT GTCGGGCAAT CAGGTGCGAC AATCTATCGA 120

TTGTATGGGA AGCCCGATGC GCCAGAGTTG TTTCTGAAAC ATGGCAAAGG TAGCGTTGCC 180

AATGATGTTA CAGATGAGAT GGTCAGACTA AACTGGCTGA CGGAATTTAT GCCTCTTCCG 240

ACCATCAAGC ATTTTATCCG TACTCCTGAT GATGCATGGT TACTCACCAC TGCGATCCCC 300

GGCAAAACAG CATTCCAGGT ATTAGAAGAA TATCCTGATT CAGGTGAAAA TATTGTTGAT 360

GCGCTGGCAG TGTTCCTGCG CCGGTTGCAT TCGATTCCTG TTTGTAATTG TCCTTTTAAC 420

AGCGATCGCG TATTTCGTCT CGCTCAGGCG CAATCACGAA TGAATAACGG TTTGGTTGAT 480

GCGAGTGATT TTGATGACGA GCGTAATGGC TGGCCTGTTG AACAAGTCTG GAAAGAAATG 540

CATAAGCTTT TGCCATTCTC ACCGGATTCA GTCGTCACTC ATGGTGATTT CTCACTTGAT 600

AACCTTATTT TTGACGAGGG GAAATTAATA GGTTGTATTG ATGTTGGACG AGTCGGAATC 660

GCAGACCGAT ACCAGGATCT TGCCATCCTA TGGAACTGCC TCGGTGAGTT TTCTCCTTCA 720

TTACAGAAAC GGCTTTTTCA AAAATATGGT ATTGATAATC CTGATATGAA TAAATTGCAG 780

TTTCATTTGA TGCTCGATGA GTTTTTCTAA 810

SEQ ID NO：12(遗传霉素抗性基因ble)

TGCCGCCTAT CTGTTAAAAC TCAATGGATA CAATGCAAAG TCGGCTCGCG CCCTCTTCTC 60

CCGTTCCCCC GTACCTAGAC ATGCGTCGTG AGTGCTTCCC TCCGTCATGC AACCGTCGCA 120

AGCTCCTCGC TCCGTCGTCG CTGCTGAAGC TGCTCCTGCG CAATCCGCTG CGCGGCGGGT 180

ACCTCGCCTC GCTCCCTTTC CGCCGCCCGA ATCGCCTGTG TGAGCCTGTT CCTCCGAGAC 240

ACGACCATCG TCTTGGGATT GGCTTGTGGT ACGGGCAGAG GGCTGGTCTC TGCAATTGAG 300

CAAGCGAGCC GAGGCAGCGA TGGTCAGTTC CGGTCGCAGA CCGAGGCTCC AGGGAAGGGA 360

CGGCGGGACG CACTGATGAC GCCGGCCTGA ATGAGCAGCT TCTCAAAGCG CTTTGTCGGC 420

AGCGCACCCT GGCTGAGCCA GTACCGGACC CGCTCCAGGT TCCACTCGAC CTTCTTCTGC 480

CCGACCTTGG CGACGCCCGT GTTGGGCGTG TGCTGCCGTG GTCCCCACTC CTTCGGGTCC 540

CTGACCTGAC CGTTTGGCGA GACCGACGGC GCTGGCACGA CGACCGGTCG CGGGTTGTAC 600

GAACCGAGGA GCTCGAGGGG TTTGGCGGTC TGGCGCTGCG GCGCGCGGAT GGCGACGAGC 660

GAGTAGACGG GGTTGTTGCG CGTGCAGTGG TGGCGCGCGA GGCGCAATCG GACCGACATC 720

TCGTGCGCTG GCGGAGAGCG AGTGTGCGAG GACGAGGAAA AGGAGCGGGA GGAGGAGGGT 780

TGGGAGCGAA CCACCTCGTG CAGCTGGACT GGACGCGCTA GACGACTGCC AGACTCGCTA 840

TACTGCTCTT TACATCCGCT AGAATCCTGC ACCCGCTCGA ACCAGCTCCT CCCACCGTCA 900

GTTCGCCTCC CCCTCTCATC CTCATCTCTC AAAGGACTTC CTCGCTCGCA ACTCGCTGGA 960

GGGAGCTGCA AGACTGACAC GAGGTCGAAA ACACCGTCAG ATGGGTAAGG AAAAGACTCA 1020

CGTTTCGAGG CCGCGATTAA ATTCCAACAT GGATGCTGAT TTATATGGGT ATAAATGGGC 1080

TCGCGATAAT GTCGGGCAAT CAGGTGCGAC AATCTATCGA TTGTATGGGA AGCCCGATGC 1140

GCCAGAGTTG TTTCTGAAAC ATGGCAAAGG TAGCGTTGCC AATGATGTTA CAGATGAGAT 1200

GGTCAGACTA AACTGGCTGA CGGAATTTAT GCCTCTTCCG ACCATCAAGC ATTTTATCCG 1260

TACTCCTGAT GATGCATGGT TACTCACCAC TGCGATCCCC GGCAAAACAG CATTCCAGGT 1320

ATTAGAAGAA TATCCTGATT CAGGTGAAAA TATTGTTGAT GCGCTGGCAG TGTTCCTGCG 1380

CCGGTTGCAT TCGATTCCTG TTTGTAATTG TCCTTTTAAC AGCGATCGCG TATTTCGTCT 1440

CGCTCAGGCG CAATCACGAA TGAATAACGG TTTGGTTGAT GCGAGTGATT TTGATGACGA 1500

GCGTAATGGC TGGCCTGTTG AACAAGTCTG GAAAGAAATG CATAAGCTTT TGCCATTCTC 1560

ACCGGATTCA GTCGTCACTC ATGGTGATTT CTCACTTGAT AACCTTATTT TTGACGAGGG 1620

GAAATTAATA GGTTGTATTG ATGTTGGACG AGTCGGAATC GCAGACCGAT ACCAGGATCT 1680

TGCCATCCTA TGGAACTGCC TCGGTGAGTT TTCTCCTTCA TTACAGAAAC GGCTTTTTCA 1740

AAAATATGGT ATTGATAATC CTGATATGAA TAAATTGCAG TTTCATTTGA TGCTCGATGA 1800

GTTTTTCTAA ATACAAGTGC GTCTGGGCAG TTCCCCTCTT TTGCGTAGCG TACCCGCACG 1860

ATTTACTGAC GCAACTCGGG CGCTACAGTC CTGTCAATCT ATCGCGATCT TCGCAGCGAC 1920

ACTCGCCGCT TCCGATTCCC GACTTTGCGT CCATCTCGCT CGCTTCGATA AGCTTCTTTG 1980

GCTGCTACAG ACGGCTCTCA ACTCTGCTGG AAGATGCAGC ATCAGCACTC ACGGGCTCCG 2040

CAACAGCTGC TGTCACGCCT CGAGTTCAGT CGGGCAGCTC TCGCCATCTC GCAACCCGTT 2100

ATGGCGATGG TCGACCCGTC TCGCGGCTTT CCCAGCGCTG CGTTTCCGCT TCAGCTGTCG 2160

CGGTACAAAC TTCATCGCCC CGTAGCGAGC CGTCTCTCGC GCAACGAGGC AATCTCGCGC 2220

TTCTCTCCCT AACGCTTTCT ATCGGTCCCG GCCTCTCTCC CGCGGACTCT AAGAGACGTC 2280

GACGCAGTTT CGATATCGTC AACAGCGAGC GCAGACGAGC ACTGCCCGAG CAGTGAACGA 2340

CGACGAGCTC TGTACGAAGC GATCGGATCC GCCGCCTTCG CTCGCGACAT GCTCGAGCTT 2400

TCCTGATCAC CTTGTCTGAG TTGCTCAGGC TCTGCTAAGT CAGTCGTGCG CATCGGAGTT 2460

TGCTGAGGCG CGAGAAGGAT ATTACAGCTC GTACGAAGGA CGGCGACTCT GGCTCGCTGT 2520

CCGTCACACG AGACAGAGGC CAGCCTCGAC CTCGTCAGCG AGTCGGTCTG TCCATGACGG 2580

CTAACTAATG AGGGTGGCTG AACAGATTGA ATGGC 2615

乳清.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院大连化学物理研究所

<120>乳清酸磷酸核糖转移酶启动子及应用和构建体与载体

<130>

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1000

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>promoter

<222>(201)..(1000)

<223>

<400>1

tgccgcctat ctgttaaaac tcaatggata caatgcaaag tcggctcgcg ccctcttctc 60

ccgttccccc gtacctagac atgcgtcgtg agtgcttccc tccgtcatgc aaccgtcgca 120

agctcctcgc tccgtcgtcg ctgctgaagc tgctcctgcg caatccgctg cgcggcgggt 180

acctcgcctc gctccctttc cgccgcccga atcgcctgtg tgagcctgtt cctccgagac 240

acgaccatcg tcttgggatt ggcttgtggt acgggcagag ggctggtctc tgcaattgag 300

caagcgagcc gaggcagcga tggtcagttc cggtcgcaga ccgaggctcc agggaaggga 360

cggcgggacg cactgatgac gccggcctga atgagcagct tctcaaagcg ctttgtcggc 420

agcgcaccct ggctgagcca gtaccggacc cgctccaggt tccactcgac cttcttctgc 480

ccgaccttgg cgacgcccgt gttgggcgtg tgctgccgtg gtccccactc cttcgggtcc 540

ctgacctgac cgtttggcga gaccgacggc gctggcacga cgaccggtcg cgggttgtac 600

gaaccgagga gctcgagggg tttggcggtc tggcgctgcg gcgcgcggat ggcgacgagc 660

gagtagacgg ggttgttgcg cgtgcagtgg tggcgcgcga ggcgcaatcg gaccgacatc 720

tcgtgcgctg gcggagagcg agtgtgcgag gacgaggaaa aggagcggga ggaggagggt 780

tgggagcgaa ccacctcgtg cagctggact ggacgcgcta gacgactgcc agactcgcta 840

tactgctctt tacatccgct agaatcctgc acccgctcga accagctcct cccaccgtca 900

gttcgcctcc ccctctcatc ctcatctctc aaaggacttc ctcgctcgca actcgctgga 960

gggagctgca agactgacac gaggtcgaaa acaccgtcag 1000

<210>2

<211>805

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>terminator

<222>(1)..(600)

<223>

<400>2

atacaagtgc gtctgggcag ttcccctctt ttgcgtagcg tacccgcacg atttactgac 60

gcaactcggg cgctacagtc ctgtcaatct atcgcgatct tcgcagcgac actcgccgct 120

tccgattccc gactttgcgt ccatctcgct cgcttcgata agcttctttg gctgctacag 180

acggctctca actctgctgg aagatgcagc atcagcactc acgggctccg caacagctgc 240

tgtcacgcct cgagttcagt cgggcagctc tcgccatctc gcaacccgtt atggcgatgg 300

tcgacccgtc tcgcggcttt cccagcgctg cgtttccgct tcagctgtcg cggtacaaac 360

ttcatcgccc cgtagcgagc cgtctctcgc gcaacgaggc aatctcgcgc ttctctccct 420

aacgctttct atcggtcccg gcctctctcc cgcggactct aagagacgtc gacgcagttt 480

cgatatcgtc aacagcgagc gcagacgagc actgcccgag cagtgaacga cgacgagctc 540

tgtacgaagc gatcggatcc gccgccttcg ctcgcgacat gctcgagctt tcctgatcac 600

cttgtctgag ttgctcaggc tctgctaagt cagtcgtgcg catcggagtt tgctgaggcg 660

cgagaaggat attacagctc gtacgaagga cggcgactct ggctcgctgt ccgtcacacg 720

agacagaggc cagcctcgac ctcgtcagcg agtcggtctg tccatgacgg ctaactaatg 780

agggtggctg aacagattga atggc 805

<210>3

<211>684

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(684)

<223>

<400>3

atg agc gcc acg tcc tac gcc gcc tcg atc atc gag acc gct ctc gcg 48

Met Ser Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Ser Ile Ile Glu Thr Ala Leu Ala

1 5 10 15

agc gag cag ccc atc ctc cgc ttc ggc acc ttc acc ctc aag tct ggc 96

Ser Glu Gln Pro Ile Leu Arg Phe Gly Thr Phe Thr Leu Lys Ser Gly

20 25 30

cgc tcc tcg ccc tac ttc ttc aac ttt ggc ctc ttc aac acc ggc tct 144

Arg Ser Ser Pro Tyr Phe Phe Asn Phe Gly Leu Phe Asn Thr Gly Ser

35 40 45

ctc ctc ctc gct ctc gcc tcg gcc ttc gca gac gcc atc ctc gac gcc 192

Leu Leu Leu Ala Leu Ala Ser Ala Phe Ala Asp Ala Ile Leu Asp Ala

50 55 60

tac ccc gag att ggc tcc tcc tcc gcc ggt ccc gac acg ccc aaa gtc 240

Tyr Pro Glu Ile Gly Ser Ser Ser Ala Gly Pro Asp Thr Pro Lys Val

65 70 75 80

ctc ttc gga ccc gcc tac aag ggc atc ccc ctc gtc gct gct atc gca 288

Leu Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Ile Pro Leu Val Ala Ala Ile Ala

85 90 95

tcc gaa ctc gca cga cga gga cgt gat atc ggc tac agc tac aac cgc 336

Ser Glu Leu Ala Arg Arg Gly Arg Asp Ile Gly Tyr Ser Tyr Asn Arg

100 105 110

aag gag aag aag gac cac ggc gag ggc ggg tcg att gtc ggt gcg ccg 384

Lys Glu Lys Lys Asp His Gly Glu Gly Gly Ser Ile Val Gly Ala Pro

115 120 125

ctc aag gga cag aag gtc ctc atc gtc gac gac gtg atc acg gcc ggt 432

Leu Lys Gly Gln Lys Val Leu Ile Val Asp Asp Val Ile Thr Ala Gly

130 135 140

act gcg att cgc gag gcg cac aag atc gtc gag tcg gag ggc ggt cag 480

Thr Ala Ile Arg Glu Ala His Lys Ile Val Glu Ser Glu Gly Gly Gln

145 150 155 160

acg gcg ggt att gtc gag gcc ctc gac cgg gag gag cgc gga cag ggc 528

Thr Ala Gly Ile Val Glu Ala Leu Asp Arg Glu Glu Arg Gly Gln Gly

165 170 175

gag ctc agt acg gtc cag gaa gtc gag aag gag ctc ggc gtc aag gtc 576

Glu Leu Ser Thr Val Gln Glu Val Glu Lys Glu Leu Gly Val Lys Val

180 185 190

acg agc gtc gtc aag atg cgc gac atc gtt gcg tgg ctc aaa gag aag 624

Thr Ser Val Val Lys Met Arg Asp Ile Val Ala Trp Leu Lys Glu Lys

195 200 205

ggc aag ctc gac gag atg aag gcc atg gag gag tac cgc gca aag tgg 672

Gly Lys Leu Asp Glu Met Lys Ala Met Glu Glu Tyr Arg Ala Lys Trp

210 215 220

ggc gtt aac tag 684

Gly Val Asn

225

<210>4

<211>227

<212>PRT

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<400>4

Met Ser Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Ser Ile Ile Glu Thr Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ser Glu Gln Pro Ile Leu Arg Phe Gly Thr Phe Thr Leu Lys Ser Gly

20 25 30

Arg Ser Ser Pro Tyr Phe Phe Asn Phe Gly Leu Phe Asn Thr Gly Ser

35 40 45

Leu Leu Leu Ala Leu Ala Ser Ala Phe Ala Asp Ala Ile Leu Asp Ala

50 55 60

Tyr Pro Glu Ile Gly Ser Ser Ser Ala Gly Pro Asp Thr Pro Lys Val

65 70 75 80

Leu Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Ile Pro Leu Val Ala Ala Ile Ala

85 90 95

Ser Glu Leu Ala Arg Arg Gly Arg Asp Ile Gly Tyr Ser Tyr Asn Arg

100 105 110

Lys Glu Lys Lys Asp His Gly Glu Gly Gly Ser Ile Val Gly Ala Pro

115 120 125

Leu Lys Gly Gln Lys Val Leu Ile Val Asp Asp Val Ile Thr Ala Gly

130 135 140

Thr Ala Ile Arg Glu Ala His Lys Ile Val Glu Ser Glu Gly Gly Gln

145 150 155 160

Thr Ala Gly Ile Val Glu Ala Leu Asp Arg Glu Glu Arg Gly Gln Gly

165 170 175

Glu Leu Ser Thr Val Gln Glu Val Glu Lys Glu Leu Gly Val Lys Val

180 185 190

Thr Ser Val Val Lys Met Arg Asp Ile Val Ala Trp Leu Lys Glu Lys

195 200 205

Gly Lys Leu Asp Glu Met Lys Ala Met Glu Glu Tyr Arg Ala Lys Trp

210 215 220

Gly Val Asn

225

<210>5

<211>684

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(684)

<223>

<400>5

atgagcgcca cgtcctacgc cgcctcgatc atcgagaccg ctctcgcgag cgagcagccc 60

atcctccgct tcggcacctt caccctcaag tctggccgct cctcgcccta cttcttcaac 120

tttggcctct tcaacaccgg ctctctcctc ctcgctctcg cctcggcctt cgcagacgcc 180

atcctcgacg cctaccccga gattggctcc tcctccgccg gtcccgacac gcccaaagtc 240

ctcttcggac ccgcctacaa gggcatcccc ctcgtcgctg ctatcgcatc cgaactcgca 300

cgacgaggac gtgatatcgg ctacagctac aaccgcaagg agaagaagga ccacggcgag 360

ggcgggtcga ttgtcggtgc gccgctcaag ggacagaagg tcctcatcgt cgacgacgtg 420

atcacggccg gtactgcgat tcgcgaggcg cacaagatcg tcgagtcgga gggcggtcag 480

acggcgggta ttgtcgaggc cctcgaccgg gaggagcgcg gacagggcga gctcagtacg 540

gtccaggaag tcgagaagga gctcggcgtc aaggtcacga gcgtcgtcaa gatgcgcgac 600

atcgttgcgt ggctcaaaga gaagggcaag ctcgacgaga tgaaggccat ggaggagtac 660

cgcgcaaagt ggggcgttaa ctag 684

<210>6

<211>2489

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>promoter

<222>(201)..(1000)

<223>

<220>

<221>terminator

<222>(1685)..(2489)

<223>

<400>6

tgccgcctat ctgttaaaac tcaatggata caatgcaaag tcggctcgcg ccctcttctc 60

ccgttccccc gtacctagac atgcgtcgtg agtgcttccc tccgtcatgc aaccgtcgca 120

agctcctcgc tccgtcgtcg ctgctgaagc tgctcctgcg caatccgctg cgcggcgggt 180

acctcgcctc gctccctttc cgccgcccga atcgcctgtg tgagcctgtt cctccgagac 240

acgaccatcg tcttgggatt ggcttgtggt acgggcagag ggctggtctc tgcaattgag 300

caagcgagcc gaggcagcga tggtcagttc cggtcgcaga ccgaggctcc agggaaggga 360

cggcgggacg cactgatgac gccggcctga atgagcagct tctcaaagcg ctttgtcggc 420

agcgcaccct ggctgagcca gtaccggacc cgctccaggt tccactcgac cttcttctgc 480

ccgaccttgg cgacgcccgt gttgggcgtg tgctgccgtg gtccccactc cttcgggtcc 540

ctgacctgac cgtttggcga gaccgacggc gctggcacga cgaccggtcg cgggttgtac 600

gaaccgagga gctcgagggg tttggcggtc tggcgctgcg gcgcgcggat ggcgacgagc 660

gagtagacgg ggttgttgcg cgtgcagtgg tggcgcgcga ggcgcaatcg gaccgacatc 720

tcgtgcgctg gcggagagcg agtgtgcgag gacgaggaaa aggagcggga ggaggagggt 780

tgggagcgaa ccacctcgtg cagctggact ggacgcgcta gacgactgcc agactcgcta 840

tactgctctt tacatccgct agaatcctgc acccgctcga accagctcct cccaccgtca 900

gttcgcctcc ccctctcatc ctcatctctc aaaggacttc ctcgctcgca actcgctgga 960

gggagctgca agactgacac gaggtcgaaa acaccgtcag atgagcgcca cgtcctacgc 1020

cgcctcgatc atcgagaccg ctctcgcgag cgagcagccc atcctccgct tcggcacctt 1080

caccctcaag tctggccgct cctcgcccta cttcttcaac tttggcctct tcaacaccgg 1140

ctctctcctc ctcgctctcg cctcggcctt cgcagacgcc atcctcgacg cctaccccga 1200

gattggctcc tcctccgccg gtcccgacac gcccaaagtc ctcttcggac ccgcctacaa 1260

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tcgcgaggcg cacaagatcg tcgagtcgga gggcggtcag acggcgggta ttgtcgaggc 1500

cctcgaccgg gaggagcgcg gacagggcga gctcagtacg gtccaggaag tcgagaagga 1560

gctcggcgtc aaggtcacga gcgtcgtcaa gatgcgcgac atcgttgcgt ggctcaaaga 1620

gaagggcaag ctcgacgaga tgaaggccat ggaggagtac cgcgcaaagt ggggcgttaa 1680

ctagatacaa gtgcgtctgg gcagttcccc tcttttgcgt agcgtacccg cacgatttac 1740

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tcaccttgtc tgagttgctc aggctctgct aagtcagtcg tgcgcatcgg agtttgctga 2340

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cacgagacag aggccagcct cgacctcgtc agcgagtcgg tctgtccatg acggctaact 2460

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<210>7

<211>717

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

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<223>

<400>7

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

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gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca tatgaaacgg 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa 420

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<210>8

<211>2522

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>promoter

<222>(201)..(1000)

<223>

<220>

<221>terminator

<222>(1718)..(2522)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1001)..(1717)

<223>

<400>8

tgccgcctat ctgttaaaac tcaatggata caatgcaaag tcggctcgcg ccctcttctc 60

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agcgcaccct ggctgagcca gtaccggacc cgctccaggt tccactcgac cttcttctgc 480

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ctgacctgac cgtttggcga gaccgacggc gctggcacga cgaccggtcg cgggttgtac 600

gaaccgagga gctcgagggg tttggcggtc tggcgctgcg gcgcgcggat ggcgacgagc 660

gagtagacgg ggttgttgcg cgtgcagtgg tggcgcgcga ggcgcaatcg gaccgacatc 720

tcgtgcgctg gcggagagcg agtgtgcgag gacgaggaaa aggagcggga ggaggagggt 780

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gttcgcctcc ccctctcatc ctcatctctc aaaggacttc ctcgctcgca actcgctgga 960

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ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt cttgagtttg taactgctgc 1680

tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaatagata caagtgcgtc tgggcagttc 1740

ccctcttttg cgtagcgtac ccgcacgatt tactgacgca actcgggcgc tacagtcctg 1800

tcaatctatc gcgatcttcg cagcgacact cgccgcttcc gattcccgac tttgcgtcca 1860

tctcgctcgc ttcgataagc ttctttggct gctacagacg gctctcaact ctgctggaag 1920

atgcagcatc agcactcacg ggctccgcaa cagctgctgt cacgcctcga gttcagtcgg 1980

gcagctctcg ccatctcgca acccgttatg gcgatggtcg acccgtctcg cggctttccc 2040

agcgctgcgt ttccgcttca gctgtcgcgg tacaaacttc atcgccccgt agcgagccgt 2100

ctctcgcgca acgaggcaat ctcgcgcttc tctccctaac gctttctatc ggtcccggcc 2160

tctctcccgc ggactctaag agacgtcgac gcagtttcga tatcgtcaac agcgagcgca 2220

gacgagcact gcccgagcag tgaacgacga cgagctctgt acgaagcgat cggatccgcc 2280

gccttcgctc gcgacatgct cgagctttcc tgatcacctt gtctgagttg ctcaggctct 2340

gctaagtcag tcgtgcgcat cggagtttgc tgaggcgcga gaaggatatt acagctcgta 2400

cgaaggacgg cgactctggc tcgctgtccg tcacacgaga cagaggccag cctcgacctc 2460

gtcagcgagt cggtctgtcc atgacggcta actaatgagg gtggctgaac agattgaatg 2520

gc 2522

<210>9

<211>375

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(375)

<223>

<400>9

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60

gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120

gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180

aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360

gaggagcagg actga 375

<210>10

<211>2180

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>promoter

<222>(201)..(1000)

<223>

<220>

<221>terminator

<222>(1376)..(2180)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1001)..(1375)

<223>

<400>10

tgccgcctat ctgttaaaac tcaatggata caatgcaaag tcggctcgcg ccctcttctc 60

ccgttccccc gtacctagac atgcgtcgtg agtgcttccc tccgtcatgc aaccgtcgca 120

agctcctcgc tccgtcgtcg ctgctgaagc tgctcctgcg caatccgctg cgcggcgggt 180

acctcgcctc gctccctttc cgccgcccga atcgcctgtg tgagcctgtt cctccgagac 240

acgaccatcg tcttgggatt ggcttgtggt acgggcagag ggctggtctc tgcaattgag 300

caagcgagcc gaggcagcga tggtcagttc cggtcgcaga ccgaggctcc agggaaggga 360

cggcgggacg cactgatgac gccggcctga atgagcagct tctcaaagcg ctttgtcggc 420

agcgcaccct ggctgagcca gtaccggacc cgctccaggt tccactcgac cttcttctgc 480

ccgaccttgg cgacgcccgt gttgggcgtg tgctgccgtg gtccccactc cttcgggtcc 540

ctgacctgac cgtttggcga gaccgacggc gctggcacga cgaccggtcg cgggttgtac 600

gaaccgagga gctcgagggg tttggcggtc tggcgctgcg gcgcgcggat ggcgacgagc 660

gagtagacgg ggttgttgcg cgtgcagtgg tggcgcgcga ggcgcaatcg gaccgacatc 720

tcgtgcgctg gcggagagcg agtgtgcgag gacgaggaaa aggagcggga ggaggagggt 780

tgggagcgaa ccacctcgtg cagctggact ggacgcgcta gacgactgcc agactcgcta 840

tactgctctt tacatccgct agaatcctgc acccgctcga accagctcct cccaccgtca 900

gttcgcctcc ccctctcatc ctcatctctc aaaggacttc ctcgctcgca actcgctgga 960

gggagctgca agactgacac gaggtcgaaa acaccgtcag atggccaagt tgaccagtgc 1020

cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct 1080

cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt gtggtccggg acgacgtgac 1140

cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac aacaccctgg cctgggtgtg 1200

ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag gtcgtgtcca cgaacttccg 1260

ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag ccgtgggggc gggagttcgc 1320

cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc gaggagcagg actgaataca 1380

agtgcgtctg ggcagttccc ctcttttgcg tagcgtaccc gcacgattta ctgacgcaac 1440

tcgggcgcta cagtcctgtc aatctatcgc gatcttcgca gcgacactcg ccgcttccga 1500

ttcccgactt tgcgtccatc tcgctcgctt cgataagctt ctttggctgc tacagacggc 1560

tctcaactct gctggaagat gcagcatcag cactcacggg ctccgcaaca gctgctgtca 1620

cgcctcgagt tcagtcgggc agctctcgcc atctcgcaac ccgttatggc gatggtcgac 1680

ccgtctcgcg gctttcccag cgctgcgttt ccgcttcagc tgtcgcggta caaacttcat 1740

cgccccgtag cgagccgtct ctcgcgcaac gaggcaatct cgcgcttctc tccctaacgc 1800

tttctatcgg tcccggcctc tctcccgcgg actctaagag acgtcgacgc agtttcgata 1860

tcgtcaacag cgagcgcaga cgagcactgc ccgagcagtg aacgacgacg agctctgtac 1920

gaagcgatcg gatccgccgc cttcgctcgc gacatgctcg agctttcctg atcaccttgt 1980

ctgagttgct caggctctgc taagtcagtc gtgcgcatcg gagtttgctg aggcgcgaga 2040

aggatattac agctcgtacg aaggacggcg actctggctc gctgtccgtc acacgagaca 2100

gaggccagcc tcgacctcgt cagcgagtcg gtctgtccat gacggctaac taatgagggt 2160

ggctgaacag attgaatggc 2180

<210>11

<211>810

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(810)

<223>

<400>11

atgggtaagg aaaagactca cgtttcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat 60

ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga 120

ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc 180

aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg 240

accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc 300

ggcaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat 360

gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac 420

agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat 480

gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg 540

cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat 600

aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc 660

gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca 720

ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 780

tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa 810

<210>12

<211>2615

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>promoter

<222>(201)..(1000)

<223>

<220>

<221>terminator

<222>(1811)..(2615)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1001)..(1810)

<223>

<400>12

tgccgcctat ctgttaaaac tcaatggata caatgcaaag tcggctcgcg ccctcttctc 60

ccgttccccc gtacctagac atgcgtcgtg agtgcttccc tccgtcatgc aaccgtcgca 120

agctcctcgc tccgtcgtcg ctgctgaagc tgctcctgcg caatccgctg cgcggcgggt 180

acctcgcctc gctccctttc cgccgcccga atcgcctgtg tgagcctgtt cctccgagac 240

acgaccatcg tcttgggatt ggcttgtggt acgggcagag ggctggtctc tgcaattgag 300

caagcgagcc gaggcagcga tggtcagttc cggtcgcaga ccgaggctcc agggaaggga 360

cggcgggacg cactgatgac gccggcctga atgagcagct tctcaaagcg ctttgtcggc 420

agcgcaccct ggctgagcca gtaccggacc cgctccaggt tccactcgac cttcttctgc 480

ccgaccttgg cgacgcccgt gttgggcgtg tgctgccgtg gtccccactc cttcgggtcc 540

ctgacctgac cgtttggcga gaccgacggc gctggcacga cgaccggtcg cgggttgtac 600

gaaccgagga gctcgagggg tttggcggtc tggcgctgcg gcgcgcggat ggcgacgagc 660

gagtagacgg ggttgttgcg cgtgcagtgg tggcgcgcga ggcgcaatcg gaccgacatc 720

tcgtgcgctg gcggagagcg agtgtgcgag gacgaggaaa aggagcggga ggaggagggt 780

tgggagcgaa ccacctcgtg cagctggact ggacgcgcta gacgactgcc agactcgcta 840

tactgctctt tacatccgct agaatcctgc acccgctcga accagctcct cccaccgtca 900

gttcgcctcc ccctctcatc ctcatctctc aaaggacttc ctcgctcgca actcgctgga 960

gggagctgca agactgacac gaggtcgaaa acaccgtcag atgggtaagg aaaagactca 1020

cgtttcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 1080

tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 1140

gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 1200

ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 1260

tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggcaaaacag cattccaggt 1320

attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 1380

ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 1440

cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 1500

gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt tgccattctc 1560

accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 1620

gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 1680

tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 1740

aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 1800

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atttactgac gcaactcggg cgctacagtc ctgtcaatct atcgcgatct tcgcagcgac 1920

actcgccgct tccgattccc gactttgcgt ccatctcgct cgcttcgata agcttctttg 1980

gctgctacag acggctctca actctgctgg aagatgcagc atcagcactc acgggctccg 2040

caacagctgc tgtcacgcct cgagttcagt cgggcagctc tcgccatctc gcaacccgtt 2100

atggcgatgg tcgacccgtc tcgcggcttt cccagcgctg cgtttccgct tcagctgtcg 2160

cggtacaaac ttcatcgccc cgtagcgagc cgtctctcgc gcaacgaggc aatctcgcgc 2220

ttctctccct aacgctttct atcggtcccg gcctctctcc cgcggactct aagagacgtc 2280

gacgcagttt cgatatcgtc aacagcgagc gcagacgagc actgcccgag cagtgaacga 2340

cgacgagctc tgtacgaagc gatcggatcc gccgccttcg ctcgcgacat gctcgagctt 2400

tcctgatcac cttgtctgag ttgctcaggc tctgctaagt cagtcgtgcg catcggagtt 2460

tgctgaggcg cgagaaggat attacagctc gtacgaagga cggcgactct ggctcgctgt 2520

ccgtcacacg agacagaggc cagcctcgac ctcgtcagcg agtcggtctg tccatgacgg 2580

ctaactaatg agggtggctg aacagattga atggc 2615

Claims

1.乳清酸磷酸核糖转移酶启动子，简写为pRtura5，其核苷酸序列具有如SEQID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起800bp以内的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起800bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ IDNO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

2.一种权利要求1所述乳清酸磷酸核糖转移酶启动子的应用，其特征在于：SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列可作为启动子用于构建新型酵母遗传操作系统及新的重组工程菌株，所得到的基因工程菌株携带相应的pRtura5序列。

3.按照权利要求2所述乳清酸磷酸核糖转移酶启动子的应用，其特征在于：所述基因工程菌株为红冬孢酵母属(Rhodosporidium)基因工程菌株，所述新型酵母遗传操作系统为圆红冬孢酵母遗传操作系统。

4.一种DNA构建体，含有权利要求1所述SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列，或同时含有权利要求1所述SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列和如SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列，且SEQ ID NO：1所示序列位于SEQ IDNO：2所示序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为一编码基因的开放阅读框架。

5.按照权利要求4构建体，其特征在于：所述的SEQ ID NO：2所示序列为一种乳清酸磷酸核糖转移酶终止子Rtura5t。

6.按照权利要求4构建体，其特征在于：所述开放阅读框架为位于SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2之间的乳清酸磷酸核糖转移酶基因的开放阅读框架，其cDNA序列具有如SEQ ID NO：3所示的脱氧核苷酸序列，其基因组DNA具有SEQID NO：5所示的脱氧核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

7.一种携带权利要求1启动子pRtFBA或权利要求4构建体的载体。

8.按照权利要求7载体，其特征在于：所述载体为质粒载体。