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CN102253204A - 利用hbha来检测肺结核和由结核分枝杆菌引起的感染 - Google Patents

利用hbha来检测肺结核和由结核分枝杆菌引起的感染 Download PDF

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CN102253204A
CN102253204A CN2011100649386A CN201110064938A CN102253204A CN 102253204 A CN102253204 A CN 102253204A CN 2011100649386 A CN2011100649386 A CN 2011100649386A CN 201110064938 A CN201110064938 A CN 201110064938A CN 102253204 A CN102253204 A CN 102253204A
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CN
China
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tuberculosis
hbha
ifn
mammals
mammal
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Pending
Application number
CN2011100649386A
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English (en)
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卡米尔·洛赫特
弗朗索瓦斯·马斯卡尔
斯特凡那·特默尔曼
让-米歇尔·乌加尔迪
萨米·普拉斯
克里斯蒂安·塞尔埃拉尔特
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French National Institute Of Health And Medical Research
Universite Libre de Bruxelles ULB
Universite Lille 2 Droit et Sante
Institut Pasteur
Original Assignee
French National Institute Of Health And Medical Research
Universite Libre de Bruxelles ULB
Universite Lille 2 Droit et Sante
Institut Pasteur
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Abstract

本发明涉及利用HBHA来检测肺结核和由结核分枝杆菌(MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS)引起的感染的方法，以及体外区分明确由结核分枝杆菌引起感染的哺乳动物(主动形式)和被感染但无症状的哺乳动物(潜在形式)的方法，以及体外区分表现主动形式的肺结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜在形式的肺结核的哺乳动物的方法。本发明还涉及用于检测和区分表现肺结核症状的被感染哺乳动物和未发病的被感染哺乳动物的试剂盒，以及区分表现主动形式的肺结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜在形式的肺结核的哺乳动物的试剂盒。

Description

利用HBHA来检测肺结核和由结核分枝杆菌引起的感染
本申请是原申请的申请日为2005年6月30日，申请号为200580022103.7，发明名称为《利用HBHA来检测肺结核和由结核分枝杆菌(MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS)引起的感染》的中国专利申请的分案申请。 
本发明涉及哺乳动物由结核分枝杆菌引起的感染的体外检测方法，以及体外区分明确由结核分枝杆菌引起感染的哺乳动物(主动形式)和被感染但无症状的哺乳动物(潜在形式)的方法，以及体外区分表现主动形式的肺结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜在形式的肺结核的哺乳动物的方法。本发明还涉及用于检测和区分表现肺结核症状的被感染哺乳动物和未发病的被感染哺乳动物的试剂盒，以及区分表现主动形式的肺结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜在形式的肺结核的哺乳动物的试剂盒。 
肺结核是一种主要感染肺的细菌性疾病(肺结核)；身体的其它部分也可能被感染，例如淋巴结、胸膜肋膜的间隔)、关节、骨、生殖泌尿道、脑脊膜腹膜、胃肠道、中枢神经系统、肾上腺或心包(肺外器官结核病)。 
肺结核是在空气中通过暴露于存在于传播疾病或与感染者相接触的哺乳动物的唾液和肺的咳出物(例如当咳嗽或打喷嚏时)中的细菌来传播的。肺结核的症状是发烧、盗汗、疲劳、减重、食欲不振和持续的咳嗽。 
在2004年，肺结核仍然表现为一种主要的公共卫生问题，因为其每年在世界范围内导致超过二百万人死亡，是影响全世界人的第三大责任因素，结核分枝杆菌，通常被称为Koch氏菌或KB。因而，肺结核是由传染病引起的第二大死亡原因，仅排在由艾滋病毒感染之后(1)。因此，世界卫生组织和欧洲共同体都已经在作为其优先发展的该领域中进行了研究。已经定义了三个基本的目标： 
a)通过研制一种提供比现有疫苗BCG(Calmette和Guerin杆菌)更好预防的疫苗来进行预防； 
b)改善肺结核快速诊断的方式；以及 
c)发现便于实施的快速治疗方法，并因此避免多抗性的菌株的发展。 
已经将对于肺结核的新病例的缺乏检测确定为在世界范围内肺结核病例数目增加的一个主要的原因(2)。显微镜检验和对痰的培养被认为是两种诊断肺结核的好方法。但是，分枝杆菌培养的结果只能是在6到8周之后进行解释，并且发展中国家不总是具备该方法所需要的基本设施，其大大地限制了第一个目标诊断试验的培养的应用(3)。因此在痰中的多抗性的细菌鉴定仍然是肺结核的快速诊断的最有效的试验，但不幸的是鉴定仅在50％到60％的肺结核病例中有效，其部分由于这样的事实：需要在每μl痰中5000到10000个细菌该试验才是有效的(3)。对于儿童，诊断肺结核更加困难，当他们年轻时，很少吐痰，通常收集他们胃中的吸出物。但是，在不到20％的被证明有肺结核的孩子中该样品的全面检查是有效的，其比在成年人中所获得的结果要低得多(4)。最后，在儿童中比在成年人中更频繁的额外肺结核诊断仍然难以进行。它常常主要基于活组织的解剖学-病理检查。肺结核的传统的有机状态是存在于干酪样坏死的肉芽肿中。该肉芽肿瘤由组织细胞、上皮样细胞和/或巨大胰岛类细胞所组成。但是，对于淋巴神经节和肺部样品，某些不同的诊断都可以解释为感染性(非结核性的分枝杆菌、霉菌病等)或非感染性疾病(伯克氏肉样瘤、Wegener氏病等)(5)。为了证实肺结核的诊断，必须通过进行专门的染色来完成组织学检查，例如利用分枝杆菌肺结核的酒精-抗酸性的Ziehl-Nielsen染色。但是，每毫米组织106个生物体的数量是获得正的Ziehl-Nielsen染色所必需的。 
最后，诊断仍然常常基于一组临床的或放射性的材料，并且其依赖于对结核菌素(纯化蛋白衍生物或PPD)的迟发过敏性的皮肤试验的结果。但是，该最后试验不能容易地区分通过接种BCG感染结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的个体和与周围的分枝杆菌交叉反应来表现其缺乏特异性。该基于细胞免疫反应的证明的试验也在免疫缺乏个体中具有较低的灵敏度。最后，虽然其能够确定在未进行预防接种的个体的人群中感染结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的人，但是不幸的是其不能从正发病的个体中区分出表现潜在性结核(无症状)的个体。事实上，仅5％到10％的感染结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的个体发病，而其他个体能预防该疾病即使他们受到感染(7)。该测试的实际用途是极为有限的。 
近来，分子生物学技术已经发展到能够利用PCR(聚合酶链反应)技术来表现结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的存在。该方法是灵敏的(95％)，但其对于痰的样品尤其正确，对其的全面检查是正的。相反，其特异性极好(98％)，其使结核分枝杆菌(M.tuberculosis)与其他的肺结核不同。但是，该方法花费较多，限制了其应用。 
因此，它可能是研制快速诊断肺结核的新方法所急需解决的的问题。可能的途径之一包括利用可能存在于未感染对象和感染的取决于其是否患病的个体之间的在免疫应答上的差异。因此，基于用肺结核抗原来诱导在淋巴循环中IFN-γ的分泌的研究的不同的测试已在文献中进行了报道(8)。但是，由结核菌素诱导的IFN-γ的分泌的分析，肺结核抗原的复杂混合物，具有与其用于皮肤试验的相同的限制。事实上，所有活化个体，不论其是否患病，和对于存在于某些非典型分支杆菌或仅在BCG中的抗原敏感的人都将产生应答。该测试相对于皮肤试验的优势在于与正对照(植物凝血素)并列的淋巴应答的分析可以检测到由于严重免疫缺陷而对PPD不作出应答的病人。然后将对于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)特异的抗原分离出来，并用于体外IFN-γ分泌测试，所述测试的特异性明显更加突出。实质上，可能用到抗原ESAT-6和CFP1O，但是必须指出由在患病的或健康的、被感染的对象之间的那些抗原所得到的辨别仍然远远不够完美(9)。 
在人体中涉及“肝素结合血细胞凝集素”的免疫应答的研究显示了在患病的或健康的、被感染的人之间的极好的辨别力。HBHA是一种粘合素，其在细菌的表面上表达，形成分枝杆菌复合体的一部分，而不在非病原菌例如M.smegmatis的表面上表达(10)。该蛋白质由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)所分泌，并引起该感染的传播(11)。HBHA具有甲基化的C末端区域，并在表面上表达，而非甲基化的N末端部分锚定在分枝杆菌细胞壁的粘合素上(12)。甲基化是重要的，不但能诱导人体内的免疫应答，而且能诱导老鼠体内的保护性免疫反应(13)。已经显示了由体外HBHA刺激的IFN-γ诱导分泌的差别取决于感染结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的人是否患病(14)。在大多数的健康病人体内由周边的淋巴细胞分泌IFN-γ来对HBHA应答，而仅有少数的结核病患者通过分泌IFN-γ来对其抗原应答。但是，在基于这些初步结果的这两 组个体之间的辨别力不满足于实施诊断试验。 
本发明的目的在于提供哺乳动物由结核分枝杆菌引起的感染的体外检测方法。 
本发明的目的也在于提供在体外区分明确由结核分枝杆菌引起感染的哺乳动物和被感染但未发肺结核病的哺乳动物的方法，并提供体外在健康群体中鉴定潜在TB病人的方法，并提供体外区分表现主动形式的肺结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜在形式的肺结核的哺乳动物的方法。 
最后，本发明的目的也在于提供包含检测结核分枝杆菌感染所必需的所有成分的试剂盒，其可将表现该疾病(活动性结核)的病人从感染而无症状的病人(潜伏性结核)中辨别出来，并提供区分表现主动形式的肺结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜在形式的肺结核的哺乳动物的试剂盒。 
本发明还涉及通过利用HBHA自身或其在试验中的重组体形式来检测由结核分枝杆菌引起的感染，以及区分表现潜在形式的肺结核的病人和表现肺结核的所有症状且正在发病的病人。这些及其它的目的被概括在本发明中，正如在本发明的概述、描述和优选实施例以及权利要求中所指明的。 
发明的概述 
本发明描述了体外用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物的方法，所述的方法包括：a)从所述的哺乳动物中获得生物样品；b)测定针对HBHA蛋白的两个截然不同的形式、并包含在所述生物样品中的抗体(IgG)的数量；以及c)比较获得自两种形式的HBHA蛋白的抗体的滴度，其中获得自表现潜伏性结核的哺乳动物的抗体的滴度的比较不同于获得自表现活动性结核的哺乳动物的抗体的滴度。 
本发明的范围也包括用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物的试剂盒，所述的试剂盒包含两种截然不同的形式的HBHA蛋白，其选自由以下成分组成的组：a)天然的HBHA和重组HBHA， 或b)HBHA的rHBHAΔC片段和甲基化C末端片段、组成用于在包含于来源于所述哺乳动物的生物样品的抗体和截然不同的形式的HBHA蛋白之间进行免疫反应的介质所需要的试剂，和检测在所述免疫反应中形成免疫学复合物所需要的试剂。 
本发明还涉及体外用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物或用于鉴定在健康的群体内表现潜伏性结核的哺乳动物的方法，所述的方法包括：a)从所述的哺乳动物中获得生物样品；b)用独立的方法，将所述的生物样品与天然形式的HBHA和ESAT-6相接触；c)测定HBHA特异性IFN-γ的分泌和ESAT-6特异性IFN-γ的分泌；以及d)计算HBHA特异性IFN-γ的分泌和ESAT-6特异性IFN-γ的分泌之间的比，其中在表现潜伏性结核的哺乳动物中获得的所述比值要高于在表现活动性结核的哺乳动物或未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的哺乳动物中获得的比值。 
本发明还涉及用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物或用于鉴定在健康的群体内表现潜伏性结核的哺乳动物的试剂盒，所述的试剂盒包含天然形式的HBHA和ESAT-6、组成用独立的方法，将所述的生物样品与天然形式的HBHA和ESAT-6相接触的介质所需要的试剂、以及用于检测接触之后IFN-γ的分泌的试剂。 
本发明还涉及体外用于检测和区分表现活动性结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜伏性结核的哺乳动物的方法，所述的方法包括：a)从所述的哺乳动物的局部感染部位获得生物样品；b)将所述的生物样品与天然或重组体形式的HBHA相接触；以及c)测定所述接触对于HBHA特异性IFN-γ的影响，其中在表现活动性结核的哺乳动物中HBHA特异性IFN-γ的影响要大于在未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的哺乳动物或表现潜伏性结核的哺乳动物中HBHA特异性IFN-γ的影响。 
本发明也阐述了用于检测和区分表现活动性结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜伏性结核的哺乳动物的试剂盒，所述的试剂盒包含天然或重组体形式的HBHA、组成适合于将来自所述的哺乳动物的生物样品中的细胞与HBHA相接触的介质所需要的试剂、以及用于检测接触之后IFN-γ的分泌的试剂。 
附图说明
图1涉及在结核病患者(TB)和在表现潜伏性结核(PI)的对象中的HBHA特异性IgG的滴度。矩形显示了25和75的百分比。铅垂线显示了极限值。在这两个群体之间未观察到显著差异(p＞0.05)。 
图2比较了在结核病患者(TB)和在表现潜伏性结核(PI)的对象中的nHBHA特异性IgG与rHBHA特异性IgG的滴度。 
图2A显示了在表现潜伏性结核的对象中，IgG对于天然的HBHA的甲基化形式的识别比重组体形式(rHBHA)更好(p＞0.05)，而在结核病患者中(图2B)，该差异并不明显(p＞0.05)。 
图3比较了在结核病患者(TB)和在表现潜伏性结核(PI)的对象中的rHBHAΔC特异性IgG与HBHA的C片段(C-肽)特异性IgG的滴度。 
图3A显示了结核病患者具有优先识别缩短的重组体形式(rHBHAΔC)的IgG，而表现潜伏性结核的对象的IgG仅识别该形式(p＝0.0052)。相反地，在图3B中，与表现潜伏性结核的对象相反，来自于结核病患者的IgG不能识别C-肽片段(p＝0.0478)。 
图4显示了在对照的对象中(对照；n＝12)、在表现最近的潜伏性结核的对象中(＜5年)(PI；n＝38)和在结核病患者中(TB；n＝46)应答于nHBHA的IFN-γ的分泌。中值分别在10pg/ml、2040pg/ml和16pg/ml处。**p＜0.001。 
图5显示了在具有潜伏性结核的对象中(PI)和在结核病患者中(TB)应答于ESAT-6的IFN-γ的分泌。 
在具有潜伏性结核的对象中，特定的ESAT-6诱导的IFN-γ的分泌明显比在结核病患者中要少。对于PI患者中值在对应ESAT-6的IFN-γ的42.50pg/ml处，对于TB患者中值在IFN-γ的4072pg/ml处(p＝0.02)。 
图6显示了在结核病患者和表现潜伏性肺结核的对象中nHBHA/ESAT-6的比值。中值分别是0.1pg/ml和146.2pg/ml。该比值实质上有利于表现潜伏性结核的对象(p＝0.001)，并提供了患病的被感染对象和被感染的非患病对象(无症状)之间的良好辨别力。 
图7显示了在结核病患者中由周围血液单核细胞(PBMC)应答于nHBHA的IFN-γ分泌的抗-转化生长因子β1、2、3(抗-TGFβ)区抗体。在上清液中鉴定IFN-γ。二点检验(Wilcoxon-p＝0.0161；n＝15对)。 
图8显示了在由取自表现胸膜腔积液的肺结核患者或其他患者的胸膜液单核细胞应答于nHBHA的IFN-γ分泌和应答于PPD的IFN-γ分泌之间的比较。在上清液中鉴定IFN-γ。横线表示中值。 
图9说明了来自PBMC的CD3+CD4+T淋巴细胞(PBMC nHBHA)与肋膜的CD3+CD4+T淋巴细胞(Lympho.Pleural nHBHA)之间的比例，并包含应答于nHBHA的胞浆内的IFN-γ，表示为：在结核病患者之中，在经HBHA刺激16小时之后表达IFN-γ的细胞的百分数少于未经HBHA刺激产生IFN-γ的细胞的百分数(n＝7)。中值分别在0.04％和1.23％处。(p＝0.0156；Wilcoxon)。 
图10表示包含应答于nHBHA的胞浆内的IFN-γ的CD3+CD4+T淋巴细胞的比例，对于肋膜的肺结核来说(n＝7；中值＝1.23％)，对于胸膜腔积液的非结核性的来源来说(n＝2；中值＝0.18％)。 
图11显示了包含应答于nHBHA刺激的IFN-γ的T淋巴细胞的CD3+CD4+(图11A)和CD3+CD8+(图11B)的比例。 
该图显示了来自于气管气泡洗出液或周围血液单核细胞(血液)的泡状淋巴细胞细胞(蜂窝状小窝)。 
该气管气泡洗出液获得自表现肺结核的病人(TB)或表现非肺结核来源的肺病的对照对象。 
图12显示了能辨别来自nHBHA特异性IFN-γ分泌的潜在TB患者和对照个体(A)，和来自nHBHA特异性IFN-γ分泌的潜在TB和发病TB病人(B)，以及来自PPD特异性IFN-γ分泌的潜在TB和发病TB病人(C)的ROC曲线。 
考虑如上所述的图，NS指差异并不明显，*指差异明显，为0.01＜p＜0.05，以及**指差异很明显，为p＜0.01。 
优选实施例的描述 
在本发明的范围内，术语“哺乳动物”指覆盖有毛或毛皮、给其幼仔哺乳 并生育活的幼仔的任何热血动物。术语″哺乳动物″包括但不局限于人、象、猪、狗、猫、牛、鹿、猴等。 
结核分枝杆菌主要影响人类宿主，而其它哺乳动物也可能受到这种细菌性疾病的影响。在这种情况下，在除了人类的哺乳动物中感染肺结核被称为“反相的动物传染病”，因为结核分枝杆菌可由人类传播给动物。 
缩写“HBHA”的意思是“肝素结合血细胞凝集素”，其为涉及支持上皮细胞的表面蛋白(Genbank登录号AF074390和AAC26052.1)。以其天然形式存在的HBHA蛋白的鉴定已经由Menzozzi等描述了(J Exp Med 184；993-1001(1996))。HBHA是199个氨基酸的蛋白，其C末端富含赖氨酸重复，并包含肝素结合位点。该蛋白对于结核分枝杆菌的膈外传播是必需的(Pethe等，Nature412：190-194(2001))。 
在法国专利申请FR-A-01/14953中描述了重组HBHA(rHBHA)，其中报道说：与天然的蛋白(nHBHA)相反，重组HBHA蛋白在其C末端的赖氨酸残基上并未甲基化。 
在Pethe等(2000，Journal of Biological Chemistry 275(19)：14273-14280)描述了rHBHAΔC片段。该片段起源于重组HBHA，其氨基酸残基第161-199位已被删除。 
该甲基化的C末端片段包含氨基酸残基第161-199位，其具有以下序列：KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK(SEQ ID NO：1)。 
上述引用的所有参考文献都并入本文作为参考。 
在本发明的范围内，术语“PBMC”的意思是“周围血液单核细胞”。此处描述的PBMC可由文献中已知的任何方法来获得。在本发明的一个实施例中，通过密度梯度离心从使用大约9.1％(w/v)的diatriazoate钠和大约5.7％的多聚糖的溶液的静脉血样品中获得。该溶液具有大约1.077±0.001g/ml的密度和280±15mosm的渗透压度。该溶液的商品名为LymphoprepTM。 
在本申请中术语“潜在性结核”或“潜在结核分枝杆菌”或“潜在形式的肺结核”可互换使用，其意思是哺乳动物被结核分枝杆菌复合体的细菌所感染但无症状，即：产生无症状的肺结核。进一步地，被感染的哺乳动物不能将肺 结核传给其它哺乳动物，因为在痰中不存在肺结核细菌。换句话说，哺乳动物被感染但不传播该疾病。 
多种形式的肺结核按如下分类： 
TB0：不暴露于肺结核细菌；没有感染； 
TB1：暴露于结核分枝杆菌，未知程度的感染； 
TB2：由肺结核细菌引起的感染，无症状产生(结核菌素皮肤试验阳性反应：正PPD)； 
TB3：主动形式的肺结核，完整诊断； 
TB4：肺结核的临床上不发病形式，适当地或免除处理；以及 
TB5：可能的肺结核，准备妥当的诊断(“排除”TB)。 
在本发明的范围内，术语“健康群体”指无论其感染状态，均不显示肺结核症状的个体，即：未感染(TBO)或被感染但健康(潜伏性结核；TB2)。 
在本发明的范围内所描述的方法和试剂盒可区分上述分类中的TB3形式与TB2形式、TB2形式与TBO形式、TB3形式与TBO形式。 
缩写PPD的意思是“结核菌素蛋白醇化衍生物”。通常通过包括暴露于PPD的皮内试验来诊断肺结核。如果在PPD暴露点的该皮肤反应超过某一大小，例如10毫米或其以上，则认为该测试为正。 
此处所定义的术语“生物样品”包括呼吸性和非呼吸性样品。“呼吸性样品”包括支气管吸出物、气管气泡洗出液(BAL)、胃洗出液和痰。可能被用于本发明的方法中的非呼吸性样品的例子包括渗出液例如肋膜的、腹的和关节的液体、脑脊髓液、头脊柱液、关节液、腹水、心包液、及其它体液、淋巴结活组织、经支气管的活组织、肋膜和肝脏的活组织、髓质穿刺和腰椎穿刺、尿或血样(PBMC或周围血液单核细胞)和脓液吸出等的样品。 
术语“来自感染部位”包括除掉肺结核感染部位的任何生物样品，也包括如上所述的任何生物样品等。 
本发明的方法可以一方面在被感染的哺乳动物中检测体内的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)HBHA蛋白的免疫反应，另一方面作为现有诊断方法的选择性补充，在体外区分肺结核的潜伏形式与主动形式，换句话说区分各自的非感染形式与感染形式。 
本发明涉及一种体外用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物的方法，所述的方法包括： 
a)从所述的哺乳动物中获得生物样品； 
b)在形成抗体-HBHA相互作用的合适条件下，测定针对HBHA蛋白的两个截然不同的形式、并包含在所述生物样品中的抗体(IgG)的数量；以及 
c)比较获得自两种形式的HBHA蛋白的抗体的滴度，其中获得自表现潜伏性结核的哺乳动物的抗体的滴度的比较不同于获得自表现活动性结核的哺乳动物的抗体的滴度。 
起始于来自哺乳动物的生物样品，并利用针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的HBHA蛋白的免疫反应的特征，其对于各种结核病(发病的对潜在的)，该方法能够区分被感染的患病的哺乳动物和未患病的哺乳动物。因此，表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物具有免疫反应，尤其是由体液引起的反应，其依据HBHA蛋白而不同。 
获得自表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物的抗体，例如免疫球蛋白(IgG)，识别HBHA蛋白的不同部分。因此可能调节HBHA蛋白的结构来获得不同形式的HBHA和辨别各种结核病。术语“不同形式的HBHA”的意思是HBHA蛋白的结构的任何改变，关于其氨基酸残基的数目(减少或增加)和/或性质(具有不同的或相同大小电荷、空间阻碍的氨基酸的取代)，和/或任一翻译后修饰，例如乙酰化、酰胺化、生物素化、羧化、羟基化、甲基化、磷酸化或硫酸盐化或通过增加脂类(异戊二烯化、棕榈酰化和豆蔻酰化)、糖类(糖基化作用)或多肽(泛素化)。在本发明的范围内，当两种形式以不同的方式识别来自表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物的抗体时，两者被成为是不同的。 
以独立的方式进行滴定，即：确定识别每种形式的HBHA的抗体(血清学测试)的数量，使用对于本领域技术人员所知的任何技术，例如直接的或间接的ELISA，(酶联免疫测试)或用放射免疫检定(RIA)，允许与包含在具有不同形式的HBHA的生物样品中的抗体相接触。“以独立的方式”指将样品的一部分与HBHA蛋白的一种形式接触，并将样品的另一部分与HBHA蛋白的第二种形式接触。将存在于样品中的抗体与允许其相互作用的HBHA的形式相接 触，所述相互作用的测定在本领域技术人员所知的适当的条件下进行。因此，举例来说，下列可被改进：用于将抗原(HBHA)耦联到支持物上的技术、生物样品稀释、不同形式的HBHA的浓度、温度和接触时间以及如果需要的话，第二种抗体的性质和浓度、以及允许测定相互作用的参数，例如本底噪声的降低、标记物(放射物、荧光染料)的选择或测定信号的采集时间。 
例如ELISA方案，用适当的缓冲液(涂料)将不同形式的HBHA稀释至1到10μg/ml的浓度范围，并在室温下(RT)1到6小时或在4℃下过夜在酶标板中孵育(50到200μl)。通常使用的缓冲溶液是50mM碳酸钠、pH6.9；20mMTris-HCl，pH8.5或10mM PBS，pH7.2-7.4。然后将该板用包含0.1M PBS或TBS，pH7.4的洗液来洗涤，再用例如Triton或Tween 20(终浓度0.01％到0.05％)的洗液来洗涤。然后将一种饱和溶液(200到300μl)，例如包含脱脂奶粉、酪素或胶的PBS，在37℃或室温下应用于阻碍非特异性相互作用30到60分钟，然后在几次洗涤之后去除剩余物。 
在几次洗涤之后，将稀释的(l/10th到l/1000th)生物样品(100到200μl)在37℃或室温下孵育30分钟到2小时或在4℃下过夜。然后加入在饱和溶液中烯释的第二种抗体(大约100μl)在室温或37℃下反应30分钟到2小时。在几次洗涤之后去除剩余物。如果必要的话，在加入终止液之后，加入基质(100μl)在黑暗中在室温下反应1到5分钟。 
滴定的结果能够使由两种不同形式得到的两个值对于同一哺乳动物进行比较。这种在表现潜伏性结核的一个或多个哺乳动物和表现活动性结核的一个或多个哺乳动物中同时进行的比较产生了悬殊的结果，因为存在于被感染哺乳动物中的免疫反应的特异性质。 
法国专利(FR-A-01/14953)在以前已经说明了：天然的HBHA蛋白(nHBHA)在其C末端部分的赖氨酸残基上甲基化。相反地，重组HBHA蛋白(rHBHA)具有不同的甲基化程度，因为其不具有这种翻译后修饰。 
因此，天然或重组体形式的使用已经显示了来自具有活动性结核的哺乳动物的生物样品包含比较大量的针对活动性的抗体；重组体形式显示了在那些哺乳动物中，该蛋白的相同部分(N末端)被识别了。相反地，来自具有活动性结核的哺乳动物的生物样品显示了针对天然形式的抗体的滴度，其高于针 对重组体形式的抗体的滴度，表明在那些哺乳动物中存在对天然形式甲基化的优先识别。因此，这些结果能够通过比较针对天然形式和重组体形式的HBHA的抗体的滴度来区分潜伏性和活动性形式的结核病。 
用于本发明的范围内的两种其它不同形式的HBHA是代表该蛋白的N末端部分(氨基酸第1到160位)的rHBHAΔC片段和甲基化C末端部分。来源于该生物样品的抗体的滴度的比较显示在表现潜伏性结核的哺乳动物中，观测到识别甲基化C末端片段的抗体占优势，而在表现活动性结核的哺乳动物中，观测到识别rHBHAΔC片段的抗体占优势。 
这种包含抗体滴定的方法可在任何包含IgG的生物样品上进行。在本发明的进一步方面，所述方法在血样上进行。 
本发明也提供了一种用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物的试剂盒，所述的试剂盒包含： 
·两种不同形式的HBHA蛋白，如上所定义，一种是天然的HBHA和重组HBHA，另一种是HBHA的rHBHAΔC片段和甲基化C末端片段； 
·组成适合于在包含于来源于所述哺乳动物的生物样品的抗体和不同形式的HBHA蛋白之间进行免疫反应的介质所需要的试剂；所述试剂包含在抗体和HBHA的不同形式之间相互作用所必需的所有化合物，以及可增加或促进所述相互作用或使其更具特异性的任何化合物； 
·检测在所述免疫反应中形成免疫学复合物所需要的试剂。所述试剂包含可显示或探测在抗体和上述HBHA的不同形式之间的反应的任何化合物。该试剂包括第二种抗体、选择性的放射性标记物或耦联荧光染料，以及可增强或调节探测信号的任何分子。 
该试剂盒选择性地包含一种或多种对照组织或生物样品，其可用作负对照(取自未感染哺乳动物的样品；TBO期)或正对照(TB2期和/或TB3期)。 
如图12的ROC曲线所示，目前基于HBHA特异性IFN-γ分泌的习惯方法似乎足以在健康的对照人群中识别TB潜在的病人，并区分TB潜在的和TB活动的病人。但是，通过考虑ESAT-6特异性的IFN-γ分泌，可大大改进这些方法。因此，本发明描述了这些习惯方法的替代方法，即其基于HBHA特异性和ESAT-6特异性的IFN-γ分泌。 
本发明涉及第二种体外用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物或用于鉴定在健康的群体内表现潜伏性结核的哺乳动物的方法，所述的方法包括： 
a)从所述的哺乳动物中获得生物样品； 
b)用独立的方法，在允许IFN-γ分泌的条件下，将所述的生物样品与天然形式的HBHA和ESAT-6相接触； 
c)测定HBHA特异性IFN-γ的分泌和ESAT-6特异性IFN-γ的分泌；以及 
d)计算HBHA特异性IFN-γ的分泌和ESAT-6特异性IFN-γ的分泌之间的比，其中在表现潜伏性结核的哺乳动物中获得的所述比值要高于在表现活动性结核的哺乳动物或未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的哺乳动物中获得的比值。 
在步骤a)中，生物样品获得自健康的群体，即来自不表现结核病症状的个体，或获得自被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的群体。在健康的群体内，该方法的目的是在不具有结核病症状的个体中识别被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染但不表现症状的个体(潜在的TB)，相反地，在被感染的病人的群体内，该方法的目的是区分具有活动性结核的病人和具有潜伏性结核的病人。 
该方法包含将生物样品与天然形式的HBHA相接触，并独立地与ESAT-6(提前分泌的抗原靶6)相接触。短语“用独立的方法”的意思是将生物样品与HBHA相接触，在空间上分开地与ESAT-6相接触。向生物样品中加入这两种分子能刺激存在于所述样品中的细胞，并引起细胞活素，例如IFN-γ的分泌。 
将样品与HBHA和ESAT-6接触是在允许IFN-γ分泌的条件下进行的。因此，本领域技术人员可以根据样品的性质来改进介质、用于接触的介质的pH和温度、接触时间、生物样品的稀释、HBHA蛋白的浓度的选择。 
使用本领域技术人员所知的任何技术来测定IFN-γ的分泌，例如ELISA、ELISPOT、流细胞计数法(FACS)、定量RT-PCR，在将样品与HBHA接触之后，相应地被称为HBHA特异性IFN-γ，并在将样品与ESAT-6接触之后，相应地被称为HBHA特异性ESAT-6。本领域技术人员可对涉及能测定IFN-γ 分泌的参数，例如抗体、其标记物和相互作用条件进行改进。ELISA条件与如上所述的条件相同，缓冲溶液包含抗IFN-γ的抗体，而不是与HBHA不同的蛋白。也使用针对于IFN-γ的第二种抗体。 
计算HBHA特异性IFN-γ的分泌和ESAT-6特异性IFN-γ的分泌之间的比值能够使潜在性结核区别于活动性结核。因此，在具有潜伏性结核的哺乳动物中，得到了非常高的比值，其大于1，大于50，大于100，大于1，大于200或大于300。因此，在100到400范围内确定为潜在形式的结核病，相反地，在具有活动性结核的哺乳动物或未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的哺乳动物中，该比值极低，并且小于1，小于0.75或小于0.5。因此，0或小于0.5的比值确定为在一群被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的病人中的具有活动的TB形式的病人(例如具有正的结核菌素试验)或者在健康的群体中未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的病人(无结核病症状)。 
第二种方法是在通常用于结核病诊断的任何生物样品上进行的，例如支气管吸出物、气管气泡洗出液(BAL)、胃洗出液、痰、渗出液例如肋膜的、腹的和关节的液体、脑脊髓液、头脊柱液、关节液、腹水、心包液、及其它体液、淋巴结活组织、经支气管的活组织、肋膜和肝脏的活组织、髓质穿刺和腰椎穿刺、尿或血样和脓液吸出的样品。在本发明的一个实施例中，可对通过本领域技术人员所知的任何方法从血样中分离的淋巴细胞应用本方法。在进一步的实施例中，从周围血液中分离了PBMC。 
在进一步的实施例中，在获得生物样品之后和在将所述样品进行接触之前，如上所述的方法包含培养生物样品的附加步骤。培养适应于该生物样品的性质。 
本发明还涉及一种用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物或用于鉴定在健康的群体内表现潜伏性结核的哺乳动物的试剂盒，所述的试剂盒包含： 
·天然形式的HBHA和ESAT-6； 
·组成用独立的方法，将存在于来自所述的哺乳动物的生物样品中的细胞与天然形式的HBHA和ESAT-6相接触的介质所需要的试剂；该试剂包括用于前面的试剂盒的如上所述的试剂； 
·用于检测接触之后IFN-γ的分泌的试剂。使用任何已知技术来测定分泌的IFN-γ，在该试剂盒中可包含特异于IFN-γ的主抗体、选择性标记、或第二抗体、能识别主抗体的选择性标记，以及可增强或调节探测信号的任何分子。 
该试剂盒选择性地包含一种或多种对照组织或生物样品，其可用作负对照(取自未感染哺乳动物的样品；TBO期)或正对照(TB2期和/或TB3期)。 
在进一步的实施例中，该试剂盒包含在与天然的HBHA或ESAT-6接触之前，参与其样品培养的培养基和任何化合物。 
本发明还涉及第三种体外用于检测和区分表现活动性结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜伏性结核的哺乳动物的方法，所述的方法包括： 
a)从所述的哺乳动物的局部感染部位获得生物样品； 
b)在能获得对IFN-γ的影响的适当条件下，将所述的生物样品与天然或重组体形式的HBHA相接触；以及 
c)测定所述接触对于HBHA特异性IFN-γ的影响； 
其中在表现活动性结核的哺乳动物中HBHA特异性IFN-γ的影响要大于在未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的哺乳动物或表现潜伏性结核的哺乳动物中的影响。 
在本发明的范围内，短语“局部感染部位”包括形成致病菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和已经发生感染的任何部位。因此，该定义包括肺、淋巴结、肋隔(肋膜的空间)、关节、骨、生殖泌尿道、脑膜、腹膜、胃肠道、中枢神经系统、肾上腺或心包膜。在该方法中，所有包括PBMC的血液来源的样品都被除去了。 
该方法包含将生物样品与天然的或重组体形式的HBHA相接触，造成对所述样品的细胞的刺激。用于第三种方法的短语“重组体形式的HBHA”指全部未甲基化形式的HBHA，例如从E.coli菌株(BL21(DE3)(pET-HBHA))中纯化的。 
然后测定所述刺激对于IFN-γ的效果。术语“对于IFN-γ的效果”指对于IFN-γ表达的任何改变，在转录(mRNA)或翻译(蛋白质)水平上，关于IFN-γ 的降解、成熟(例如糖基化)或分泌。 
将来源于局部感染部位的样品在适合于获得对IFN-γ影响的条件下与HBHA接触，该条件可由本领域技术人员来改进，例如对于介质、用于接触的介质的pH和温度、接触时间、生物样品的稀释、HBHA蛋白的浓度的选择。 
在本发明的一个实施例中，使用任何已知的用于测定化合物数量的技术来测定分泌IFN-γ的数量，例如ELISA、ELISPOT、流细胞计数法(FACS)、定量RT-PCR。 
从来自表现活动性结核的哺乳动物的生物样品中分泌的HBHA特异性IFN-γ的数量大于1000、大于2000pg/ml、大于5000pg/ml或大于10000pg/ml。因此，5000到45000pg/ml的范围或10000到45000pg/ml的范围内的量确定为活动性结核病，相反地，从生物样品中分泌的HBHA特异性IFN-γ的数量等于或小于100、400或1000pg/ml确定为未感染结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或潜伏性结核病。 
在进一步的实施例中，对于IFN-γ标记物为正的细胞的比例是这样测定的：计算在与HBHA刺激16小时后表达IFN-γ的细胞的百分比，与未刺激而产生IFN-γ(自生分泌)的细胞的百分比的差值。在对于定量实验方案的靶生物样品的细胞上进行该计算，例如淋巴细胞、CD4+细胞、或任何其它的淋巴细胞亚群。 
用任何已知的方式来标记，用于化合物的胞内标记，其可使用透化剂，例如皂荚苷(0.01％到0.1％)、triton(0.1％)、毛地黄皂苷和/或细胞固色剂，例如2％仲甲醛、或抗体、选择性的放射性标记物或耦联荧光染料。 
将样品与HBHA接触之后，将布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(10μg/ml)加入到样品中，在37℃或室温下反映3到5小时来阻碍样品中所含有的细胞的任何分泌。然后，将细胞用固色剂，例如如上所述的试剂，在4℃下固定15到30分钟，然后用透化剂，例如如上所述的试剂，在黑暗中在室温下固定15到30分钟。在透化剂溶液(10mg/ml)中稀释主要抗体和第二抗体，并加入在40℃下来孵育15到30分钟。在用固色剂固定之前标记表面抗原，例如CD4或CD8，其是灵敏的；或在透化之后标记那些抗固定的表面抗原。然 后用流细胞计数法来分析标记的细胞。 
因此，从来自表现活动性结核的哺乳动物的生物样品中获得的细胞的比例大于0.3％、大于0.5％、大于0.75％或大于1％。可获得5％、10％和高达15％。相反地，在未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的哺乳动物或表现潜伏性结核的哺乳动物中获得的细胞的比例是0或小于0.2％到0.3％。 
该方法可证实在哺乳动物中的活动性结核。相反地，以上引用的值中IFN-γ的低分泌或少量的胞浆内IFN-γ显示非活动性结核，并可解释为未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或潜伏性结核。 
在该方法中的获得生物样品和将其与样品接触之间，可选择性地加入一个步骤，该步骤包括培养所述的生物样品。 
在一个实施例中，生物样品选自由以下成分组成的组：支气管吸出物、气管气泡洗出液(BAL)、胃洗出液、痰、渗出液例如肋膜的、腹的和关节的液体、脑脊髓液、头脊柱液、关节液、腹水、心包液、及其它体液、淋巴结活组织、经支气管的活组织、肋膜和肝脏的活组织、髓质穿刺和腰椎穿刺、尿样和脓液吸出的样品。 
在本发明进一步的实施例中，用于所述方法的细胞是T淋巴细胞，例如CD3+CD4+T淋巴细胞。 
本发明还涉及一种用于检测和区分表现活动性结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染或表现潜伏性结核的哺乳动物的试剂盒，所述的试剂盒包含： 
·天然或重组体形式的HBHA； 
·组成适合于将来自所述的哺乳动物的生物样品中的细胞与天然或重组体形式的HBHA相接触的介质所需要的试剂；该试剂包括用于前面的试剂盒的如上所述的试剂； 
·用于检测接触之后的IFN-γ的试剂。使用任何已知技术来测定分泌的或在胞浆内的IFN-γ，在该试剂盒中可包含特异于IFN-γ的主抗体，其可被标记，第二抗体，其可被标记，能识别主抗体，以及可增强或调节探测信号的任何分子。 
该试剂盒选择性地包含一种或多种对照组织或生物样品，其可用作对照： 取自未感染哺乳动物的样品(TBO期)，取自TB2期的样品和/或取自TB3期的样品。 
在进一步的实施例中，该试剂盒包含在与HBHA接触之前，参与其样品培养的培养基和任何化合物。 
给出下列实施例来说明本发明，而不限制本发明的范围。 
实施例
实施例1：血样的来源 
在获得患者同意后，从结核病患者和具有潜在的结核病的患者处获得血样。基于正的直接检查和/或对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的正培养来选择结核病患者。在治疗的第一个三周末之前登记所有的对象。基于对于结核菌素(在诊断时硬结的直径超过18mm)的正的迟发过敏性试验来选择具有潜在形式的结核病的对象。基于通常的胸透照片排除活动形式的结核病。所有的病人都是HIV血清反应阴性的，并没有接受过免疫抑制剂治疗。在招募时，所有的对象都生活在欧洲。 
实施例2：其它样品 
在注射了大约200ml的生理盐水后，通过食道硬化治疗，将气管气泡洗出液(BAL)去除。然后将去除的液体(大约10ml)进行离心。 
将肋膜的、腹的和关节的、头脊柱的及其它液体集中于无菌炮弹管中，并当它们一到达实验室就进行离心。 
对于神经节或其它可疑的集结，进行手术上的切除术。当它到达实验室，就将收集的组织片段切碎，并在培养基中孵育来使细胞从组织中逐步解离下来。 
实施例3：抗原 
利用如其它地方(14)所述的肝素-琼脂糖凝胶色谱法，接着进行高压液相色谱法(HPLC)，将天然形式的HBHA(nHBHA)从M.bovis BCG上纯化出来。在用考马斯亮蓝染色之后的HPLC色谱图和SDS-PAGE分析证明以上准备没有蛋白质污染。使用气相色谱法发现来源不明的糖脂。鲎试验显示脂多糖浓度小于10pg/ml。 
从E.coli菌株(BL21(DE3)(pET-HBHA))中纯化出未甲基化的重组体形式 (rHBHA)。在法国专利FR-A-01/14953中比较了重组体蛋白的甲基化程度与天然蛋白的甲基化程度相比的情况。
从E.coli菌株(BL21(DE3)(pET-rHBHAΔC))中纯化出缩短的重组体形式的C末端部分(rHBHAΔC)。在Pethe等(2000 Journal of Biological Chemistry 275(19)：14273-14280，并入本说明书作为参考)中描述了缩短的形式rHBHAΔC，其来自于氨基酸第161到199位被删除的重组HBHA蛋白。 
用前甲基化氨基酸合成的分离的C末端肽，相应于HBHA蛋白的氨基酸第161到199位，并具有下列序列：KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK(SEQ ID NO：1)(12，13)。Pethe等(Proc Natl Acad Sci 2002；99：10759-10764)和Temmerman等(Nat.Med.2004Sep，10(9)：935-941)并入此处作为参考。 
实施例4：HBHA的特异性IgG的测定 
使用ELISA来测定抗-nHBHA、-rHBHA、-rHBHAΔC和-C肽(分离的C末端肽)的IgG。详细地，在4℃下用96-孔聚苯乙烯板(Maxisorp Nunc)孵育过夜，其中50μl/孔的PBS稀释的1.5μg/l的抗原溶液(nHBHA、rHBHA、rHBHAΔC或C-肽)。用PBS-Tween 20(0.05％)将板洗涤三次，在37℃下用溶于PBS中的1％酪素溶液浸透1小时。在洗涤之后，在室温下在孔中将来自病人的血清稀释于PBS-Tween 20溶液(0.05％)中(1∶50到1∶12800的稀释)处理30分钟，并进行搅拌。在PBS-Tween 20(0.05％)中稀释250倍的与生物素耦合的山羊的抗-人体IgG抗体是使用的第二种抗体(biotinylated goat anti-human IgG-Southern Biotechnologies Associates，Birmingham，USA 2040-08)，通过50μl/孔的用1∶1000稀释(0.5％casein)的过氧物酶溶液(extravidin过氧物酶-共轭E2886-Sigma)显示了它们的存在。在黑暗中洗涤10到30分钟的时间之后，加入50μl的基质溶液(在0.1M柠檬酸钠中0.1mg/ml的3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯和1μl/ml的30％过氧化氢，pH5)。该反应用25μl/孔的氢氯酸(2mMol/L)来终止。抗体滴度可以表示为最后的血清稀释度，其相对于孔中负的血清被认为是正的。 
实施例5：通过应答于nHBHA/ESAT-6的PBMC的γ干扰素的分泌(ELISA) 
用周围血液样品(lymphoprep-Nycomed Pharma)的密度梯度离心来获得 PBMC。所述的PBMC再悬浮于2倍浓度的106细胞/ml的培养基中(完全RPMI：RPMI 1640(BioWhittaker)补充有40μg/ml的庆大霉素、50μM的2-巯基乙醇、1倍的非必需氨基酸(Life Technologies)和10％的胎儿小牛血清(FCS))。在37℃下在含有5％CO2的大气中用2μg/ml的nHBHA和5μg/ml的提前的分泌物抗原靶6(ESAT-6)(Statens Serum Institut，Denmark)刺激细胞96小时的时间。在一些试验中，以5μg/ml的浓度加入阻遏抗体：抗-TGF-β1，2，3(鼠IgG1，R&D系统)。在培养4天之后，使用ELISA(IFN-γ Cytoset，Biosource)收集上清液来测定分泌的IFN-γ。 
实施例6：局部的γ干扰素应答 
实施例6a：生物学液体和生理部分 
分析的生物学液体是肋膜的、关节的和腹的液体。分析的生理部分是从神经节或其它可疑的集结中切除的活组织。通过第一次过滤(细胞筛，Nylon100μmFalcon &reg；352360)，接着以2300rpm离心15分钟，从生物学液体中分离成核成分。如果需要的话，将存在于细胞残留物中的红色小球溶解。然后将细胞再悬浮于完全的RPMI溶液中。通过切碎各部分来分离来自组织样品的成核成分，并在37℃、5％CO2的大气中在完全的RPMI溶液中孵育过夜。回收上清液，冲洗各部分来回收仍然易得到的任何细胞。然后将得到的液体以2300rpm离心15分钟。如果需要的话，将红色小球溶解。将细胞残留物再悬浮于完全的RPMI溶液中。 
实施例6b：抗原刺激 
当分离的细胞的数目足够时(胸膜液)，PBMC在体外以同样的方式刺激这些细胞，在体外用HBHA刺激96小时之后测定培养的上清液中分泌的IFN-γ的浓度。至于PBMC，如下所述在体外用HBHA短暂刺激气管气泡洗出液、关节液或腹膜液、神经节等之后，也可以用流细胞计数法来进行利用这些细胞的IFN-γ合成的分析。在体外用10μg/ml浓度的HBHA刺激分离的细胞(2x106/ml)16到18小时的时间。然后在存在布雷菲德菌素A(10μg/ml-Brefeldin A-Sigma)的条件下，通过孵育4小时来阻碍从细胞中细胞活素的分泌，并在标记细胞之后，用流细胞计数法来分析细胞中IFN-γ的存在。在固定细胞之后，将其透性化(固定并加热；细胞透性化试剂盒-Caltag Laboratories)、洗涤，然后在 黑暗中在存在与荧光染料相耦联的抗体(抗-CD3PerCP、抗-CD4APC、抗-IFN-γPE，所有的都获得自Becton，Dickinson)的条件下孵育30分钟。然后用FACSCalibur细胞计分析正的细胞的百分比，最初基于大小和颗粒度来把淋巴细胞作为目标，然后淋巴细胞子群的不同与其表面标志的表达有关。 
实施例7：统计分析 
对于未配对的数据，在使用Dunn试验来进行后试验比较之后，进行Mann-Whitney无参数试验或无参数Kruskall-Wallis试验。使用Wilcoxon或Friedman试验来分析配对数据。 
接受器操作曲线(ROC)分析：在曲线(图12)上的每个点对应于具有灵敏性和特异性的特定一对。根据表1、2或3给出的值来计算。完整的曲线(及特别是在其下面的面积)给出了整个试验的概括。令人满意的曲线接近左上角，而在最坏情况下获得了对角线(虚线)。 
在ROC曲线之下的总面积是诊断试验性能的尺度，因为起反映了在所有的截止水平上该试验的性能。该面积在[0.5-1]之间，并且面积越大，该试验的性能就越好。按照曲线下的面积，将该试验的精确性进行分类，如下所示：[0.9-1]：优秀的；[0.8-0.9]：好的；[0.7-0.8]：普通的；[0.6-0.7]：不良的和[0.5-0.6]：失败的。 
用到如下定义： 
-灵敏性：在具有阳性诊断的病人中有正试验的概率：真阳性(TP)； 
-特异性：在具有阴性诊断的病人中有负试验的概率：真阴性(TN)； 
-(1-特异性)：在具有阴性诊断的病人中有正试验的概率：假阳性(FP)； 
-(1-灵敏性)：在具有阳性诊断的病人中有负试验的概率：假阴性(FN)； 
ROC试验能够发现最佳的截止值，其灵敏性和特异性都较高。 
结果： 
1.由体液引起的应答 
从大约40％的感染了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)对象的血清中发现了nHBHA-特异性IgG，不论其身体健康(首次被传染对象或潜在的形式)还是其患病和表现结核病(活动形式)。在这两个组中得到的抗体滴度是不同的(图1)。 
但是，针对天然甲基化形式的HBHA(nHBHA)的抗体的滴度与针对非甲基化的重组体形式(rHBHA)的抗体的滴度相比，支持了这种假说：抗体的差异取决于感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的病人是患病的(活动形式)还是未患病的(潜在形式)。如在图2中可以看到的，在首次被传染对象中，抗-nHBHA IgG的滴度明显比抗-rHBHA IgG的滴度要高(p＝0.0015)(图2A)，而在结核病患者中该差异并不明显(图2B)。然后，我们一方面分析针对由该分子的N末端区域(rHBHAΔC)单独组成的缩短的重组体形式的HBHA的IgG，另一方面分析针对甲基化的C末端肽的IgG。如图3所示，这些结果说明存在于来自结核病患者的血清中的抗-HBHA IgG识别rHBHAΔC(图3A)，而来自首次被传染对象的抗体识别甲基化C末端肽(图3B)。因此，根据存在于来自感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的对象的血清中的抗体的种类，其可被分为两组，首次被传染的或患病的，这取决于IgG是针对HBHA的未甲基化N末端部分，还是针对甲基化的N末端部分。 
2.通过淋巴循环的IFN-γ分泌 
a.之前我们已经显示了在首次被传染对象中，通过PBMC应答于天然形式的HBHA的IFN-γ的分泌明显要大于在结核病患者中的分泌。但是，获得的差别不足以用于诊断目的。试验对象数目上的增加使得其在推测感染日期小于五年的首次被传染对象中进行选择。图4所示的结果显示了在两组之间的差别稍微更好，但仍然不够。 
b.为了更好地评估由天然HBHA诱导的IFN-γ来诊断结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的潜伏性感染的潜在价值，绘制ROC(接受器操作曲线)来建立IFN-γ的浓度(最佳的截止值)，其给出了对于提出的问题来说，最好的灵敏性/特异性配对。 
1)在健康群体中潜在的TB患者的诊断(在潜在的TB患者与非感染者之间的差别) 
因为表现潜在的TB的人(IP)不是患病的，但其表现为Koch氏菌散布的潜在病源，所以该试验必须能在健康群体中识别这样的人。因此，根据HBHA所诱导的、来自对照对象(未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染-n＝14)或表现潜在TB的人(n＝46)的PBMC所分泌的IFN-γ的浓度来绘制ROC曲线，其中表现潜在TB的人是基于对结核菌素阳性PPD皮内反应的结果来定义的，其为 参考的特征性判据(表1)。 
表1：在潜在的TB患者和对照(健康的)个体中nHBHA特异性IFNγ的值 
在这样的试验中，“阳性的”和“阴性的”人按照如下定义： 
-TP：在对于结核菌素具有阳性皮内反应的病人中有正试验(超过最佳的截止值)的概率； 
-FP：在对于结核菌素具有阴性皮内反应的病人中有负试验(低于最佳的截止值)的概率； 
-FN：在对于结核菌素具有阴性皮内反应的病人中有正试验(超过最佳的截止值)的概率； 
-TN：在对于结核菌素具有阳性皮内反应的病人中有负试验(低于最佳的截止值)的概率； 
下面的图12A所示的ROC曲线是优秀的，因为在该曲线下的面积是0.95(95％可靠区间：0.90-1.00；P＜0.0001)。对于超过110pg/ml(最佳的截止值)的IFN-γ的浓度，该试验对于诊断潜在的TB的灵敏性是89.13％(CI95：76.43-96.38)，而具有100％的特异性(CI95：76.84-100)。 
值得注意的是：在ROC试验中的对照是未进行结核病接种疫苗(卡介苗(BCG))的人。之前已经校正了卡介苗接种的可能的干扰，并在2002年报道过了(Masungi等J.Inf.Dis.2002；185：513-20)。初步试验显示，来自15个接种卡介苗的人(在采血前接种卡介苗超过10年)的淋巴循环不分泌应答于HBHA的IFNγ，而其应答于PPD。 
但是，因为关于在健康的成年群体中TB的差别的研究，以及在大多数国家在儿童期就进行了预防接种，似乎适合于对预防接种超过10年的人进行试验。在这些人中，5人给出了对于结核菌素的阳性皮内反应，3人给出了可疑的结果。另外，来自这些健康接种卡介苗的人中的10个人的淋巴循环分泌应答于PPD的IFNγ。 
总之，接种卡介苗似乎并不干扰对于在健康群体中区分潜在的TB患者的可能的诊断结果，该诊断是基于体外由HBHA诱导IFN-γ的。 
2)在潜在的TB和活动的TB患者之间诊断的差别 
当病人表现出和结核病相适合的病历，并且他的或她的对结核菌素皮内反应是阳性时，将结核病与另一种可能发生在也有潜在的TB的病人身上的疾病相区别是很重要的。因此，该试验必须在被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的病人的群体中识别潜在的TB病人。因此，根据HBHA所诱导的、一方面来自表现潜在TB的对象、另一方面来自表现未处理的活动TB的对象(n＝50)的PBMC所分泌的IFN-γ的浓度来绘制ROC曲线(表2)，其中表现潜在TB的人是基于对结核菌素皮内反应的结果来定义的，其为临界的诊断参考(n＝46)。 
Figure BSA00000453357300241
表2：在潜在的TB患者和活动的TB患者中nHBHA特异性IFNγ的值 
在这样的试验中，阳性的和阴性的人按照如下定义： 
-TP：在具有结核病症状的病人中有正试验(超过最佳的截止值)的概率； 
-FP：在具有结核病症状的病人中有负试验(低于最佳的截止值)的概率； 
-FN：在具有结核病症状的病人中有正试验(超过最佳的截止值)的概率； 
-TN：在具有结核病症状的病人中有负试验(低于最佳的截止值)的概率； 
获得的ROC曲线(图12B)是好的，因为在该曲线下生成的面积是0.855(CI95：0.777-0.932)。对于480pg/ml的IFN-γγ∏浓度(最佳的截止值)，该试验对于诊断潜在的TB的灵敏性是76.09％(CI95：61.23-87.41)，而具有82％的特异性(CI95：68.56-91.42)。 
值得注意的是：当考虑到在PBMC中PPD诱导的IFN-γ的浓度时，ROC曲线的结果基本上是不良的。基于由31个潜在的TB和47活动的TB(表3)获得的结果来计算出的该曲线(图12C)具有曲线下面积仅0.73(CI95：0.62-0.84)。 
Figure BSA00000453357300261
表3：在潜在的TB患者和活动的TB患者中PPD特异性IFNγ的值 
考虑到上述结果，因此似乎由HBHA诱导的IFN-γ的分泌使latent TB患者与未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的个体以及活动的TB患者区分开，而其用其它的标准试验，不论是基于对结核菌素的皮内反应试验，还是基于由PPD或由ESAT-6诱导的IFN-γ的分泌都不可能实现。其似乎是主要由于患者更好的临床上的选择。 
c.文献报道说结核病患者应答于ESAT-6分泌IFN-γ，与首次被感染对象相反，但差别并不足够好，如图5所示。 
d.我们将显示：nHBHA特异性IFN-γ的分泌与由ESAT-6诱导的IFN-γ的分泌之间的比值的计算能够提供用于区分未患病的首次被感染对象与结核病患者的优秀的途径(p＝0.0003；n＝8)(图6)。实际上，该比值对于活动的TB患者是大约0.1pg/ml，而对于潜在的TB患者是大约146.2pg/ml，没有重叠值。 
这些结论也适用于在健康的群体中鉴定TB潜在的病人，因为未被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的病人不分泌IFN-γ，应答于ESAT-6或在极低的浓 度(数据未显示)。 
在很多情况下，加入阻碍抗-TGF-β的抗体能够显示出：在患病的病人中，应答于由HBHA刺激淋巴细胞的外部的IFN-γ的分泌的缺乏明显地由被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染所引起，而不是由于没有被感染。如图7所示，当存在抗-TGF-β时，在来自结核病的患者的PBMC中IFN-γ的分泌明显增加(p＝0.01)。这在首次被感染的病人中没有观察到。 
3.应答于nHBHA的IFN-γ的局部分泌 
在结核病患者中，与应答于nHBHA的通过PBMC的IFN-γ分泌的缺少相反，对来源于局部感染部位，例如肋膜的、肺泡的、腹的和关节的液体的细胞进行刺激，使得可以观察到应答于由nHBHA或rHBHA的刺激的主要的IFN-γ反应，相反的是未被结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染但表现临床上的和放射性的标记的对照的对象，其比得上结核病的对象。当局部的样品的量允许足够数量的淋巴细胞的分离时，用天然的HBHA刺激这些细胞，并用ELISA测定存在于培养的上清液中的IFN-γ的量。 
如图8所示的结果显示了在由HBHA刺激之后肋膜的细胞分泌的IFN-γ的浓度大大高于来自对照、首次被感染或其它对象的细胞分泌的IFN-γ的浓度。 
如果另一个抗原，例如PPD，被用于刺激体外的肋膜细胞，则在结核病患者和对照之间的差别是很小的(图8)。 
通过具有结核病来源的胸膜积液的患者的肋膜细胞的由HBHA诱导的IFN-γ的合成也可能通过使用流细胞计数法分析淋巴细胞来证明。该技术能测定包含胞内IFN-γ的淋巴细胞的百分比，其合成由HBHA体外短暂刺激来诱导。该技术胜过非常快的技术，其HBHA刺激时间是过夜的，只要结果能够在24小时内提供。图9和10所示的结果表明在HBHA刺激之后，来自胸膜液的大部分CD4+淋巴细胞包含IFN-γ，对于不是结核病起源的来自流出物的肋膜细胞，情况不是这样，即：未被结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染的个体(图10)。HBHA诱导的IFN-γ的分泌的研究结果可通过限制对于基于其大小和颗粒度进行选择的淋巴细胞窗的分析来简化。 
对于肺结核(没有肋膜的患病)，可通过研究来自气管气泡洗出液的淋巴细胞来作出诊断。实际上，由HBHA体外短暂刺激(过夜)之后，高比例的局部 CD4+淋巴细胞(来自局部感染部位)包含胞内IFN-γ，与来自对照患者的淋巴细胞相反(图11)。当局部CD4+细胞作为靶细胞，而非局部CD8+细胞时，结核病与非结核病的患者的差别更加明显(图11)，该分析还可以限于淋巴细胞窗。 
在关节的结核病中，在HBHA体外短暂刺激之后，分离自流出液(在液体中阳性的KB培养)的高比例的淋巴细胞合成IFN-γ，与从具有非结核病来源的流出液的对照个体中去除的局部淋巴细胞相反(表4)。 
最后，对于腹膜炎的结核病来源，在HBHA体外短暂刺激之后，存在于该液体中的31％的淋巴细胞包含胞内IFN-γ。在一个结核病来源的腺病的例子中，1.8％的淋巴细胞通过合成IFN-γ来应答HBHA，其允许结核病来源的疾病在小于24小时内的再次诊断(表4)。 
表4：在从结核病感染部位分离的淋巴细胞的nHBHA刺激之后，包含IFN-γ的CD4+CD3+T淋巴细胞与对照的百分比；-：无刺激；Nd：未确定；KB+：对Koch菌阳性。 
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Figure ISA00000453357500011

Claims (15)

1.天然形式的HBHA和天然形式的ESAT-6在制备用于在体外检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物或用于鉴定在健康的群体内表现潜伏性结核的哺乳动物的标记物中的应用，所述检测和区分或者所述鉴定通过如下步骤获得：
a)从所述的哺乳动物中获得生物样品；
b)在允许IFN-γ的分泌的条件下，以独立的方式，将所述的生物样品与天然形式的HBHA和ESAT-6相接触；
c)测定HBHA特异性IFN-γ分泌和ESAT-6特异性IFN-γ分泌；以及
d)计算HBHA特异性IFN-γ分泌和ESAT-6特异性IFN-γ分泌之间的比，
其中在来自表现潜伏性结核的哺乳动物或未被结核分枝杆菌感染的哺乳动物的样品中获得的分泌比值大于1，而在来自表现活动性结核的哺乳动物的样品中获得的分泌比值小于1。
2.根据权利要求1的应用，其中在来自表现潜伏性结核的哺乳动物或未被结核分枝杆菌感染的哺乳动物的样品中获得的分泌比值在100到400的范围内。
3.根据权利要求1所述的应用，其中在来自表现活动性结核的哺乳动物的样品中获得的分泌比值小于0.5。
4.根据权利要求1～3中任何一项所述的应用，其中生物样品选自由以下成分组成的组：支气管吸出物；支气管气肺泡灌洗液(BAL)；胃洗出液；痰；渗出液例如肋膜的、腹的和关节的液体；脑脊髓液；头脊柱液；关节液；腹水；心包液及其它体液；淋巴结活组织；经支气管的活组织；肋膜和肝脏的活组织；髓质穿刺和腰椎穿刺；尿或血样；和脓液吸出的样品。
5.根据权利要求1～4中任何一项所述的应用，其中步骤b)包含以独立的方式将天然形式的HBHA和ESAT-6与PBMC相接触。
6.根据权利要求1～5中任何一项所述的应用，其包含先于步骤b)的培养生物样品的附加步骤。
7.一种用于检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物或用于鉴定在健康的群体内表现潜伏性结核的哺乳动物的试剂盒，所述的试剂盒包含：
·天然形式的HBHA和ESAT-6；
·组成用于以独立的方式将存在于来自所述的哺乳动物的生物样品中的细胞与天然形式的HBHA和ESAT-6相接触的介质所需要的试剂；以及
·用于检测接触之后IFN-γ分泌的试剂。
8.天然形式的HBHA或重组体形式的HBHA在制备用于在体外检测和区分表现潜伏性结核的哺乳动物和表现活动性结核的哺乳动物或用于鉴定在健康的群体内表现潜伏性结核的哺乳动物的标记物中的应用，所述检测和区分或者所述鉴定通过如下步骤获得：
a)从所述的哺乳动物的局部感染部位获得生物样品；
b)在允许获得对IFN-γ的影响的条件下，将所述的生物样品与天然形式的HBHA或重组体形式的HBHA相接触；以及
c)通过如下步骤测定所述哺乳动物的状态：
c1)在将细胞与天然的或重组体形式的HBHA接触之后检测IFN-γ的分泌量，其中在表现活动性结核的哺乳动物中HBHA特异性IFN-γ的分泌量要大于1000pg/ml，而在未被结核分枝杆菌感染的哺乳动物或表现潜伏性结核的哺乳动物中HBHA特异性IFN-γ的分泌量要小于1000pg/ml；
或者
c2)在淋巴细胞群或其子群内将所述细胞与HBHA相接触之后，计算包含胞浆内IFN-γ的细胞的比例，其中在表现活动性结核的哺乳动物中包含胞浆内IFN-γ的细胞的比例大于0.3％，而在未被结核分枝杆菌感染的哺乳动物或表现潜伏性结核的哺乳动物中包含胞浆内IFN-γ的细胞的比例小于0.3％。
9.根据权利要求8所述的应用，其中由来自表现活动性结核的哺乳动物的生物样品所分泌的HBHA特异性IFN-γ的量要大于5000pg/ml。
10.根据权利要求8所述的应用，其中由来自未被结核分枝杆菌感染的哺乳动物或表现潜伏性结核的哺乳动物的生物样品所分泌的HBHA特异性IFN-γ的量要小于100pg/ml。
11.根据权利要求8所述的应用，其中由来自表现活动性结核的哺乳动物的生物样品所获得的细胞的所述比例大于0.5％。
12.根据权利要求8～11中任何一项所述的应用，其包含先于步骤b)的培养生物样品的附加步骤。
13.根据权利要求8～12中任何一项所述的应用，其中生物样品选自由以下成分组成的组：支气管吸出物；支气管气肺泡灌洗液(BAL)；胃洗出液；痰；渗出液例如肋膜的、腹的和关节的液体；脑脊髓液；头脊柱液；关节液；腹水；心包液及其它体液；淋巴结活组织；经支气管的活组织；肋膜和肝脏的活组织；髓质穿刺和腰椎穿刺；尿样；和脓液吸出的样品。
14.根据权利要求8～13中任何一项所述所述的应用，其中细胞是CD3+CD4+T淋巴细胞。
15.一种用于检测和区分表现活动性结核的哺乳动物和未被结核分枝杆菌感染或表现潜伏性结核的哺乳动物的试剂盒，所述的试剂盒包含：
·天然或重组体形式的HBHA；
·组成适合于将来自所述的哺乳动物的生物样品中的细胞与HBHA相接触的介质所需要的试剂；
·用于定量接触之后的IFN-γ分泌和胞浆内的IFN-γ的试剂。
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