CN102250251A - 一种脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，其制备方法，含它们的组合物。本发明的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物由脑啡肽类似物和与脑啡肽类似物C端共价连接的聚乙二醇组成，其中脑啡肽类似物具有下式结构：X-Tyr-Y₁-Gly-Phe-Y₂-Y₃-Z其中，X是H或Ac；Y₁是D-Ala或Gly；Y₂是D-Ala或Met或Leu；Y₃是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH₂。本发明给出的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物可用于制备镇痛药物或药物的前体化合物。

Description

一种脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物

技术领域

本发明涉及一种脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，属于医药技术领域。

背景技术

脑啡肽(Enkephalin，ENK)是20世纪70年代中期发现的一种内源性镇痛物质，包括亮氨酸脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu，LEK)和甲硫氨酸脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，MEK)两种类型，主要作用于δ型阿片受体，镇痛活性是吗啡的2-3倍，成瘾作用明显弱于吗啡。脑啡肽肽链较短、结构简单，化学合成容易实现。但由于未能解决其体内半衰期短和难以通过血脑屏障两大障碍，至今尚未能开发成为药物。

本世纪初，Arizona大学的一个研究小组取得了一些令人鼓舞的结果。他们将单糖连结到脑啡肽上，发现由葡萄糖、麦芽糖或者麦芽三糖这样的糖类与神经肽结合形成的糖基化脑啡肽能通过血脑屏障。糖基化脑啡肽不仅能够与大脑内的疼痛受体相结合，还能与μ和δ受体相结合，而吗啡只能够与μ受体相结合，这一点能够解释这些化合物镇痛效果增强的原因。动物实验的结果显示，这类化合物并不会造成吗啡使用后的欣快感，但是它的镇痛效果却是吗啡的2到3倍(J.Pharm.Exp.Ther.2001，299：967-972)。Arizona大学的研究工作提示，无关化合物的引入可能对改变脑啡肽的性质、克服其弱点具有积极意义。

生物偶联化学(bioconjugate chemistry)已经成为近年生物制药研究的热点之一。在常用的右旋糖酐、葡聚糖、环糊精、乙酰咪唑、N-乙基马来酰亚胺、清蛋白等修饰剂中，以聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰技术研究最为成功，应用范围最广。药物的聚乙二醇修饰即PEG化，是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体上。由于具有无毒特性及良好的生物相容性，聚乙二醇成为被FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一，已经有多个聚乙二醇修饰的蛋白类药物经FDA批准上市。一系列研究表明，蛋白质和多肽类药物经聚乙二醇修饰后，能提高此类药物的水溶性、稳定性、降低免疫原性、延长药物的代谢时间。

2005年，Arizona大学药学院进行了mPEG₂₀₀₀修饰脑啡肽类似物DPDPE([D-Pen²，D-Pen⁵]-ENK)的研究(The AAPS Journal.Accepted：April 19，2005)。药效和药代实验表明，PEG修饰的DPDPE明显提高了镇痛作用，并且在30min内脑组织中58.9％的¹²⁵I标记PEG修饰的DPDPE未被酶解破坏。

根据已知蛋白类药物的PEG修饰研究和Arizona大学药学院的实验结论分析，脑啡肽经PEG化修饰后可以降低体内酶降解、延长半衰期；并且根据聚乙二醇独特的双亲理化性质，经适当分子量PEG修饰的脑啡肽可能通过血脑屏障。

分析蛋白类药物PEG修饰的既往研究资料，对同一被修饰对象，PEG修饰位点、共价连接PEG的数量及PEG的种类，都可能对修饰产物活性产生较大影响。并且，在被修饰物和PEG之间，PEG分子量越大，可能引起修饰产物的活性下降越多，被修饰物分子量越小则其活性部位被屏蔽的可能性越大。

根据以上分析，适当分子量PEG及种类的选择是保证有效延长被修饰物半衰期，增加被修饰物生物活性，同时避免被修饰物活性部位被较多屏蔽的首要因素。另一方面，Arizona大学药学院以脑啡肽类似物DPDPE氨基基团作为修饰位点的PEG修饰方案仍存在反应条件不易控制，以及影响修饰产物产率及纯度、增加合成(生产)成本等不利因素。

发明内容

本发明的目的是提供一种脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，为科学研究和临床治疗提供一种新的结构简单，合成反应条件温和、简便、可控的药物分子或前体化合物，也为肽类药物的改造和聚乙二醇化修饰研究提供新的方法和思路。

本发明的技术解决方案是，对采用化学合成和基因重组方法制备的脑啡肽类似物进行C末端的聚乙二醇定点修饰，获得具有较长体内半衰期、提高脑啡肽或类似物分子通过血脑屏障进入脑组织的能力并具有良好镇痛活性的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物。

本发明的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物由脑啡肽类似物和与脑啡肽类似物C端共价连接的聚乙二醇组成，其中的脑啡肽类似物具有下式结构：

X-Tyr-Y₁-Gly-Phe-Y₂-Y₃-Z

其中，X是H或Ac；Y₁是D-Ala或Gly；Y₂是D-Ala或Met或Leu；Y₃是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH₂。

本发明的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，脑啡肽类似物的C端连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。

本发明的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物的制备方法，包括以下步骤：

用化学合成方法或基因工程方法制备供修饰的脑啡肽类似物；脑啡肽类似物C端与聚乙二醇进行共价连接。

本发明中的脑啡肽类似物的制备方法可使用本领域公知的任何方法进行制备，此制备方法优选为固相和液相化学合成法。固相方法包括使用Fmoc或Boc保护的氨基酸，用多肽合成仪或手工合成法进行氨基酸序列的合成，再经切除，经高效液相(HPLC)分离纯化，冻干，所得肽段为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。

本发明中的脑啡肽类似物也可用基因工程法制备，其步骤包括：

(1)按脑啡肽类似物的氨基酸序列合成基因片段。

(2)基因片段经连接，转化，筛选得到阳性菌株。

(3)菌株经发酵，收集菌体，破壁，抽提得到包涵体。

(4)包涵体裂解，分离得到粗品，经HPLC分离纯化，冻干，所得肽段为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。

本发明的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，该聚乙二醇在脑啡肽类似物的C端进行修饰，其特点是脑啡肽类似物的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。聚乙二醇的分子量范围为2000Da-80000Da，优选为5000Da-40000Da。

本发明所说的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备或获得含迈克尔加成反应(Michael addition reaction)受体的聚乙二醇与含迈克尔加成反应给体的脑啡肽类似物；或含迈克尔加成反应给体的聚乙二醇与含迈克尔加成反应受体的脑啡肽类似物。

(2)进行迈克尔加成反应，用其受体或给体的聚乙二醇和脑啡肽类似物进行反应，形成脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，如含马来酰亚胺衍生的聚乙二醇与含半胱氨酸的脑啡肽类似物反应而形成产品。

如果如本发明所述脑啡肽类似物结构中Y₃是Cys或高Cys，则聚乙二醇是用硫醚键或双硫键共价结合；如果Y₃是Lys，则聚乙二醇是用酰胺键或二级胺而共价结合；如果Y₃是His，则聚乙二醇是用组氨酸的咪唑环而共价结合；如果Y₃是Arg，则聚乙二醇是通过杂环而连接的。

本发明的化合物是脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，亦包括为进行聚乙二醇修饰而产生的新的中间体，是用于制备镇痛药物或药物的前体化合物。

药效实验证明，本发明提供的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，其镇痛药效优于未经聚乙二醇修饰的前体脑啡肽或脑啡肽类似物、镇痛药效维持时间长于未经聚乙二醇修饰的前体脑啡肽或脑啡肽类似物。并且，在作为本发明迈克尔加成反应受体或给体的聚乙二醇分子量为2000Da-40000Da范围内，随着聚乙二醇分子量的增大，脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物的镇痛药效和维持时间有不同程度的延长。药代动力学实验证明，本发明经¹²⁵I标记的前体脑啡肽与聚乙二醇化修饰衍生物体内分布有较大差异，其中经聚乙二醇修饰的脑啡肽在血液和脑组织中的放射性清除时间明显延长，经PEG修饰的脑啡肽在血液和组织中的半衰期延长，并且增强了前体脑啡肽分子通过血脑屏障的能力。

本发明取得了以下技术进步：

与未经聚乙二醇修饰的脑啡肽及其类似物前体比较，适当分子量的聚乙二醇修饰提高了脑啡肽及其类似物前体的体内半衰期、通过血脑屏障进入脑组织的能力和镇痛活性。

不同PEG修饰方法研究发现，与例如Arizona大学药学院进行的脑啡肽类似物DPDPE的氨基修饰、以及其它不确定位点的聚乙二醇修饰技术(含氨基、羧基和巯基修饰)比较，本发明所提供的在C端巯基修饰的脑啡肽类似物的聚乙二醇衍生物，反应条件便于控制，合成修饰产物产率和纯度较高。如本发明提供的优选实施例中，在被修饰的脑啡肽类似物DADAE的C端加入带巯基的Cys，采用Rink树脂合成后，用活化的mPEG-MAL进行巯基修饰，与N端氨基修饰比较，反应条件便于控制，合成修饰产物产率和纯度较高。并且本发明所提供的在C端的定点修饰，可克服不确定位点聚乙二醇修饰可能屏蔽前体化合物、尤其是分子量较小的肽类化合物活性部位的缺点。

具体实施方式

除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可以一般的按照本领域公知的技术和方法进行。

除非特殊定义，本发明所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。

除非特殊指明，本发明中所用氨基酸为L-氨基酸。

本发明中的缩写词具有下面的含义：

ENK：脑啡肽

LEK：亮氨酸脑啡肽，氨基酸序列：Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

MEK：甲硫氨酸(蛋氨酸)脑啡肽，氨基酸序列：Tyr-Gly-Gly-Phe-Met

DADAE：[D-Ala²，D-Ala⁵]-ENK，为脑啡肽类似物，氨基酸序列：Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Ala

DPDPE：[D-Pen²，D-Pen⁵]-ENK，为脑啡肽类似物，氨基酸序列：Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen

Fmoc：芴甲氧羰基

Boc：叔丁氧羰基

PEG：聚乙二醇

mPEG：单甲氧基聚乙二醇

PEG-MAL：酰亚胺基聚乙二醇

Tyr：酪氨酸

Gly：甘氨酸

Phe：苯丙氨酸

Ala：丙氨酸

Pen：二甲基半胱氨酸

Met：甲硫氨酸(蛋氨酸)

Leu：亮氨酸

Cys：半胱氨酸

Lys：赖氨酸

Arg：精氨酸

His：组氨酸

DCC：二环己基碳二亚胺

HOBT：1-羟基苯并三氮唑

HBTU：2-(1H-1-羟基苯并三氮唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸

NMM：N-甲基吗啡啉

TFA：三氟乙酸

TMBS：三甲基溴硅烷

Ts-Cl：对甲苯磺酰氯

EDT：1，2-乙二硫醇

Et₃N：三乙胺

HPLC：高效液相色谱

RP-HPLC：反相高效液相色谱

MS：质谱

MALDI-TOF-MS：基质辅助激光吸离子化飞行时间质谱

下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。

在本发明优选的实施例中，PEG化试剂为Fluka产品，Wang树脂、Rink树脂、DCC、HOBT、HBTU、TFA、NMM、Fmoc-保护氨基酸为上海吉尔生化产品，Ts-Cl、EDT、Et₃N为常规购置的分析纯试剂。

实施例1 固相化学合成法制备供聚乙二醇修饰的前体-C端半胱氨酸MEK(MEK-Cys-NH₂)和C端半胱氨酸DADAE(DADAE-Cys-NH₂)：

所采用的氨基酸包括Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH；其中tBu为叔丁基(tert-butyl)、Trt为三苯甲基(trityl)。多肽序列的合成采用手工方法进行。固相多肽合成玻璃反应器为定制，上下室间隔为G2滤板，使用前经硅烷试剂处理。

操作步骤：

1、MEK-Cys-NH₂和DADAE-Cys-NH₂的合成：

(1)Rink Amide-AM树脂，0.160g(0.1mmol)，DMF中溶胀10min，20％哌啶/DMF1×10ml，脱Fmoc保护30min；

(2)CH₂Cl₂2×10ml，洗涤1min，包括瓶盖；

(3)DMF1×10ml，洗涤1min；

(4)CH₃OH1×10ml，洗涤1min；

(5)DMF1×10ml，洗涤1min；

(6)CH₃OH1×10ml，洗涤1min；

(7)DMF1×10ml，洗涤1min；

(8)乙醚2×10ml，洗涤1min，取少量树脂，检测；

(9)称取Fmoc-Cys(Trt)-OH，234.3mg，HOBT 54mg，以DMF溶之，DCC82.2mg，以DMF/CH₂Cl₂溶之，室温下搅拌反应过夜；

(10)CH₂Cl₂2×10ml，洗涤1min，包括瓶盖；

(11)DMF1×10ml，洗涤1min；

(12)CH₃OH1×10ml，洗涤1min；

(13)DMF1×10ml，洗涤1min；

(14)CH₃OH1×10ml，洗涤1min；

(15)DMF1×10ml，洗涤1min；

(16)乙醚2×10ml，洗涤1min，取少量树脂，检测；

(17)20％哌啶/DMF1×10ml，脱Fmoc保护30min，取少量树脂检测；

(18)CH₂Cl₂2×10ml，洗涤1min，包括瓶盖；

(19)DMF1×10ml，洗涤1min；

(20)CH₃OH1×10ml，洗涤1min；

(21)DMF1×10ml，洗涤1min；

(22)CH₃OH1×10ml，洗涤1min；

(23)DMF1×10ml，洗涤1min；

(24)乙醚2×10ml，洗涤1min，取少量树脂，检测；

依次接上Fmoc-氨基酸。参照Kziser法用茚三酮试剂检测反应是否完全。将茚三酮试剂与树脂上的氨基酸或肽(取10mg左右肽-树脂)100℃反应5min，每克树脂上有5μmol的氨基酸残基就可给出轻微蓝色。得Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Cys-NH₂和Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Ala-Cys-NH₂两个短肽序列。

2、Rink Amide-AM树脂的切割：

将脱掉Fmoc的肽树脂置于50ml茄型瓶中，加入三氟乙酸(7.5ml)，间甲酚(0.1ml)，1，2-乙二硫醇0℃，搅拌反应90min。G₃漏斗过滤，取滤液，旋转蒸发至不在有液体蒸出为止。向瓶中加入无水乙醚，见白色沉淀析出，再旋转蒸发，反复三次。再加入乙醚，沉淀出白色物质，G₄漏斗过滤，弃滤液，以水溶白色物质，然后冷冻干燥，得粗肽。

3、脱盐：

将以上合成产物溶于2ml水中，用Sephadex G-25进行脱盐，以水作为洗脱液，流速1ml/min，紫外检测仪(波长214nm)进行检测，分离冷冻干燥后得到合成产物粗品。

4、纯化：

采用C₁₈色谱柱，流动相为A液(0.05％TFA水溶液)和B液(含0.05％TFA和70％乙腈的水溶液)，采用线性梯度，B液由0至100％，流动相流速为2ml/min，检测波长为214nm。

5、合成产物的分析和鉴定

(1)HPLC分析鉴定

采用Kr100-5 C₁₈分析型色谱柱。检测条件：流动相为A液(0.05％TFA水溶液)和B液(含0.05％TFA和70％乙腈的水溶液)，采用线性梯度，B液由0至100％(30min)，流动相流速为1ml/min；检测波长为214nm。

检测结果：纯化后的合成及修饰产物MEK-Cys-NH₂、DADAE-Cys-NH₂，纯度为别为95.27％、93.89％，收率分别为70％、74％。

(2)MS分析鉴定

采用基质辅助激光吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，委托首都师范大学化学系和ChinaTech Peptide Co.，Ltd进行。

检测结果：MEK-Cys-NH₂分子量677，DADAE-Cys-NH₂分子量631，与预期相符。

实施例2 脑啡肽类似物与聚乙二醇反应，合成脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物：

操作步骤：

1、mPEG₅₀₀₀-MAL的生成

(1)称取mPEG₅₀₀₀-OH40.0g(8mmol)，溶于100ml CH₂Cl₂中，搅拌溶解后加入15ml三乙胺和19g对甲基苯磺酰氯，室温下搅拌反应大约6小时，以TLC检测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加入100ml无水乙醚沉淀出固体，得到mPEG₅₀₀₀-OTs。

(2)对得到的mPEG₅₀₀₀-OTs进行纯化。将粗品mPEG₅₀₀₀-OTs溶于水，先使用分液漏斗用乙醚萃取对甲基苯磺酰氯，弃去乙醚层，再用CH₂Cl₂提取水中的mPEG₅₀₀₀-OTs，弃去水层，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，加乙醚沉淀出mPEG₅₀₀₀-OTs，滤去乙醚，五氧化二磷真空干燥。产物不纯时可多次提纯。

(3)取18.0g mPEG₅₀₀₀-OTs溶于50mlDMF，加入5g(27mol)邻苯二甲酰亚胺钾盐，120℃反应4h。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml无水乙醇，然后加入13.5ml水合肼，回流反应4小时。旋转蒸发出去溶剂，将残余物溶于CH₂Cl₂，再用无水乙醚沉淀出固体。再以无水乙醇乙醚重结晶。得14.2gmPEG₅₀₀₀-NH₂。

(4)5.0g mPEG₅₀₀₀-NH₂溶于10ml二氧六环，加入马来酸酐2.0g，80℃搅拌反应30min。减压蒸去溶剂，加入50ml无水乙醚，冷却沉淀出固体，过滤掉乙醚，干燥后得所得固体溶于15ml乙酸酐，加入5.0g乙酸钠，100℃搅拌反应45min。减压蒸去溶剂，将残余物用CH₂Cl₂溶解，滤去不溶物，在滤液中加入适量活性炭，放置30min，滤去活性炭，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，加入无水乙醚，沉淀出mPEG₅₀₀₀-MAL滤去乙醚，五氧化二磷真空干燥。产物不纯时可多次提纯。最终得到纯化的mPEG₅₀₀₀-MAL。

2、MEK-Cys-NH₂和DADAE-Cys-NH₂的PEG修饰

将合成所得MEK-Cys-NH₂和DADAE-Cys-NH₂用RP-HPLC纯化后，溶于水中，用碳酸氢钠调pH至7-8，分别加入2-3当量的mPEG₅₀₀₀-MAL，室温反应，用RP-HPLC监测反应进程和分离产物，得粗品MEK-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂和DADAE-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂。

3、脱盐和纯化

方法同实施例一。

4、修饰产物的分析和鉴定

(1)HPLC分析鉴定

检测条件同实施例一。

检测结果：

纯化后的修饰产物MEK-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂、DADAE-Cys(mPEG_{5 000}-MAL)-NH₂，纯度为别为91.73％、90.59％，收率分别为62％、58％。

(2)MS分析鉴定

检测条件同实施例一。

检测结果：MEK-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂在5708附近、DADAE-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂在5662附近有一组相差44的峰，与预期相符。

实施例3 药效实验-合成肽的镇痛药理活性检测：

本实施例测定了4种脑啡肽类似物及聚乙二醇修饰物的镇痛活性，具体包括：MEK-Cys-NH₂、DADAE-Cys-NH₂、MEK-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂、DADAE-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂(本发明实施例一、二制备)。使用时分别按对照药吗啡的等摩尔浓度，以生理盐水溶解，0.45μm滤膜过滤除菌，尾静脉或侧脑室注射给药。

本实施例的对照药物为盐酸吗啡(Dexamethasone，Mor；东北第六制药厂生产，批号：001009，规格10mg/ml)。使用时按动物与人公斤体重折算的临床等效剂量(10mg/kg)，以无菌生理盐水稀释，尾静脉或侧脑室注射给药。

本实施例使用的实验动物为昆明小鼠(清洁级，体重18-22g，由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供，合格证号SCXK(京)2004-0001)。

本实施例采用了3种试验方法测定受试物的镇痛药理活性。

实验1-合成产物侧脑室给药对小鼠热刺激所致疼痛反应的影响：

雌性KM小鼠，实验前一天在局部消毒条件下剪去小鼠头顶部注射部位(bregma点后1mm，中线旁开2mm)直径0.5-0.8CM皮肤，并预防性肌肉注射青霉素1次。实验当日，在20±1℃室温条件下，至小鼠于55±0.5℃热板(成都泰盟科技有限公司生产的RB-200型智能热板仪)，以接触热板至舔后足所经历的时间为痛阈值；剔除痛阈值小于3s和大于30s小鼠；合格小鼠分层随机方法分为6组，每组7-8只以上小鼠；各小鼠给药前间隔5min测量痛阈值2次，取平均值作为药前(基础)痛阈值。MEK-Cys-NH₂、DADAE-Cys-NH₂、MEK-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂和DADAE-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂组分别侧脑室注射3.1μmol/kg受试药物，空白和阳性药物对照组小鼠分别侧脑室注射生理盐水或吗啡1.0mg/kg，注射受试物容积4μl，进针深度2mm。分别观察记录给药后15-120min各小鼠的痛阈值。检测数据以均数±标准差表示，计算各小鼠给药前后痛阈值的差值，使用SPSS软件进行t检验，比较各组小鼠与空白对照组给药前后痛阈差值的显著性，以P＜0.05为有统计学意义。实验结果见表1。

表1.脑啡肽类似物及PEG衍生物侧脑室给药对热刺激小鼠所致疼痛反应的影响

注：1、剂量：3.1μmol/kg，N.S为0.4μl/只；2、与N.S组比较^＊＊P≤0.01；^＊P≤0.05。

表1可见，阳性对照药吗啡表现了明显镇痛活性，峰值在药后15min，并持续至120min；ENK-Cys-NH₂在药后15min表现镇痛活性，30min后镇痛活性下降至消失；DADAE-Cys-NH₂和各PEG修饰物镇痛活性均可持续至药后120min，峰值多数在15-60min，且多数与对照组差异有显著性；总体趋势，DADAE-Cys-NH₂作用优于ENK-Cys-NH₂，PEG修饰产物作用优于未修饰物，mPEG修饰DADAE-Cys-NH₂多数时间点镇痛活性强于吗啡。

实验2-合成产物静脉给药对小鼠热刺激所致疼痛反应的影响：

雌性KM小鼠，同上(实验1)方法处理并分组。各受试物分别按31μmol/kg尾静脉注射给药，容积0.2ml/10g体重。分别观察记录给药后15-120min各小鼠的痛阈值。同上(实验1)方法进行统计学处理。实验结果见表2。

表2.脑啡肽类似物及PEG衍生物静脉给药对热刺激小鼠所致疼痛反应的影响

注：1、剂量；31μmol/kg，N.S为0.2ml/10g体重；2、与N.S组比较^**P≤0.01；^＊P≤0.05。

表2可见，阳性对照药吗啡的镇痛活性维持至药后60min，以30min内作用明显；NEK-Cys-NH₂的明显镇痛活性在药后15min；DADAE-Cys-NH₂等其余受试物的明显镇痛活性至药后30min；各受试物作用弱于吗啡；总体趋势，DADAE-Cys-NH₂作用优于ENK-Cys-NH₂，PEG修饰产物作用优于未修饰物。

实验3-合成产物静脉给药对小鼠醋酸刺激所致疼痛反应的影响：

KM小鼠，每组8只以上，雌雄兼用。分组和给药方法同实验1、2。给药后30分钟，各小鼠腹腔注射0.1mol/L冰乙酸(AA)0.2ml致痛，以小鼠出现腹部肌肉反复收缩、拱背、臀部扭转、后肢伸展为扭体阳性反应，记数15min内扭体次数。检测数据以均数±标准差表示，使用SPSS软件进行t检验，比较各组小鼠与空白对照组扭体次数差异的显著性(以P＜0.05为有统计学意义)，并计算各受试物组的疼痛抑制百分率。

疼痛抑制率(％)＝(对照组扭体次数-实验组扭体次数)/对照组扭体次数×100％

实验结果见表3。

表3.脑啡肽类似物及PEG衍生物静脉给药对化学刺激小鼠所致疼痛反应的影响

注：1、剂量：31μmol/kg，N.S为0.2ml/10g体重；2、与N.S组比较^**P≤0.01。

表3结果，各受试物均表现明显镇痛活性；其中，吗啡疼痛抑制率达99.59％，其余受试物作用弱于吗啡；总体趋势，mPEG₅₀₀₀修饰产物作用优于未修饰物，DADAE-Cys-NH₂作用未明显优于MEK-Cys-NH₂。

本实施例以上3种试验方法的实验结论是：

1、D-Ala对ENK2、5位氨基酸的替代合成提高了ENK的酶解稳定性，增强了合成产物的镇痛活性；实验结果与预期相符。

2、PEG修饰未屏蔽原型化合物的生物活性部位。

3、经PEG修饰的脑啡肽类似物可能提高了原型化合物分子通过血脑屏障的能力；实验结果与预期相符，但进一步的结论尚需药代动力学(体内药物分布)实验证实。

4、在本实验条件下，较大分子量的PEG修饰有利于提高被修饰物的酶解稳定性、延长其体内半衰期、增强其药理活性，但进一步的结论尚需药代动力学实验证实。

实施例4 药代动力学实验：

本实施例对2种合成产物进行了体内药代动力学的分析比较，具体合成物为MEK和mPEG₂₀₀₀-MEK。实验目的是初步分析PEG修饰脑啡肽与被修饰的前体脑啡肽的药代动力学特征和二者之间的差异。

本实施例所试的MEK合成使用的固相载体为Wang树脂，参照实施例1方法依次接上Fmoc-氨基酸，制备获得Tyr-Gly-Gly-Phe-Met。以mPEG₂₀₀₀-OH制备mPEG₂₀₀₀-NHCOCH₂CH₂COOH，在MEK的N端进行PEG修饰，纯化获得mPEG₂₀₀₀-NHCOCH₂CH₂CO-MEK(简写为mPEG₂₀₀₀-MEK或PEG-MEK)。本实施例使用的MEK经MS检测分子量为573，mPEG₂₀₀₀-NHCOCH₂CH₂CO-MEK经MS检测在分子量2604附近有一组相差44的峰，与预期相符；标记用合成产物纯度均在90％以上。

本实施例实验委托中国原子能研究院同位素研究所采用氯胺T法对MEK和mPEG₂₀₀₀-ENK进行¹²⁵I标记。经PR-HPLC分离纯化，标记物放射性比活性分别为MEK 40μCi/μg、mPEG₂₀₀₀-ENK 65μCi/μg。放射性同位素测定使用的是西安凯普公司生产的MF-1000型γ计数器。

取昆明种小鼠，每组4-6只，随机分为10组，各鼠分别尾静脉注射¹²⁵I标记的MEK和mPEG₂₀₀₀-ENK 0.2ml/10g体重，标记物溶液分别为MEK 150μCi/ml和mPEG₂₀₀₀-ENK 200μCi/ml。分别于注射后10、30、60、120、240min眼球取血后脱颈椎处死小鼠，取心、肝、肺、脑、肾和肌肉等器官(组织)，称重并以γ计数器测定cpm值，计算不同时相的放射性摄取量(％ID/g)，并计算主要药代动力学参数。实验结果见表4、5。

表4.¹²⁵I标记MEK和mPEG₂₀₀₀-ENK的正常小鼠体内分布

注：表内括号内数据为例数。

表5.¹²⁵I标记MEK和mPEG₂₀₀₀-ENK的小鼠体内代谢动力学参数

实验结果，¹²⁵I标记MEK和mPEG₂₀₀₀-ENK体内分布有较大差异。其中mPEG₂₀₀₀-ENK较MEK的血液和脑组织放射性清除时间延长。

本实施例的实验结论是：

PEG修饰的脑啡肽体内半衰期和相对生物利用度提高，尤其脑组织中的PEG修饰产物比未经PEG修饰的前体脑啡肽存在时间延长，说明在本实验条件下PEG修饰的脑啡肽在一定程度上改善了未经PEG修饰的前体(原型)脑啡肽通过血脑屏障困难的缺点。

Claims (5)

1.一种脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，其特征在于：由脑啡肽类似物和与脑啡肽类似物共价连接的聚乙二醇组成，其中的脑啡肽类似物具有下式结构：

X-Tyr-Y₁-Gly-Phe-Y₂-Y₃-Z

其中，X是H或Ac；Y₁是D-Ala或Gly；Y₂是D-Ala或Met或Leu；Y₃是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH₂。

2.根据权利要求1所述的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，其特征在于聚乙二醇在脑啡肽类似物的C端进行修饰。

3.根据权利要求1或2所述的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，其特征在于聚乙二醇的分子量范围是大于2000Da至小于或等于80000Da。

4.根据权利要求1或2或3所述的脑啡肽类似物的聚乙二醇化衍生物，其特征在于脑啡肽类似物的C端连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的化合物或含该化合物的组合物的应用，其特征在于用于制备镇痛药物或药物的前体化合物。