CN102242128A

CN102242128A - 拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102242128A
Application number: CN2011101986298A
Authority: CN
Inventors: 刘海鹏; 陈荣元; 王克坚
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2011-11-16

Abstract

拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制备方法与应用，涉及一种抗病毒型抗脂多糖因子。提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列、氨基酸序列、拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法以及拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子的应用。构建拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重组表达载体；将重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化后产物，获得重组蛋白，即Sp-ALF2。所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2对WSSV和多种病原菌具有明显抑制作用和杀伤作用，在制备抗病新药和作为动物抗病饲料添加剂中具有广泛应用价值。

Description

拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种抗病毒型抗脂多糖因子，尤其是涉及一种拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制备方法与应用。

背景技术

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)不仅是危害对虾的主要病毒性病原，而且能够感染其他许多甲壳类十足目动物，而这其中包括许多重要水产经济养殖品种。WSSV病害自1993年发生以来，给全球水产养殖业造成了巨大经济损失，近20年来，国内外学者在WSSV侵染和水生甲壳动物抗WSSV免疫研究方面取得了一些关键性进展，遗憾的是，至今尚无针对此病毒的有效防治方法。

众所周知，与脊椎动物相比，虾、蟹等无脊椎甲壳动物缺乏后天免疫应答系统，它们仅依靠非特异性免疫来抵御微生物入侵感染。已有研究表明：病毒感染对虾、蟹后能够激活宿主的免疫识别信号传导通路，如NF-kappaB信号通路^[1，2]、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)信号通路^[3]和STAT信号通路^[4]等，从而引发一系列免疫应答反应，包括抗菌肽的合成与释放^[3，5]、细胞吞噬^[6]和细胞凋亡^[7]等，这些免疫应答反应在甲壳类动物抵御外界病原微生物感染过程中发挥重要作用。值得一提的是，近年来陆续有一些抗病毒活性物质得以分离鉴定，诸如：血蓝蛋白^[8]、溶菌酶^[9]、抗菌肽^[5，10-13]等，这些研究报道为虾、蟹等水产养殖病毒病的有效防治提供了重要理论依据。

抗脂多糖因子首次发现于鲎^[14，15]体内，该因子具有抗凝血作用，能够抑制细菌脂多糖(LPS)引发的凝集反应，故命名为抗脂多糖因子。研究表明，ALF对LPS具有高亲和力，能够结合LPS的类脂A部位并中和其生物学活性，对于抵抗内毒素血症和内毒素休克具有重要作用；此外，ALF对R-型革兰氏阴性菌生长具有强烈抑制作用^[15]。ALF在其他多种甲壳动物体内也相继得以分离鉴定，并且ALF在LPS^[16-18]、细菌、真菌^[19-22]和WSSV^[23]刺激后均有不同程度的上调表达，而体外重组表达的ALF蛋白也表现出广谱抗菌活性，包括对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑制与杀伤作用^{[16，20，24]}。近期研究表明，螯虾Pl-ALF具有显著的抗WSSV活性^[13]，而对虾Pm-ALF3^[11]亦显示出抗WSSV活性。综上所述，ALF是水生甲壳类动物的重要免疫因子，对其功能的深入鉴定研究不仅在抗微生物感染理论研究方面具有重要意义，而且在生产实践中亦具有广泛应用前景。

拟穴青蟹Scylla paramamosain与基因工程，特别涉及拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor)，即Sp-ALF2基因克隆、重组表达产物及其制备方法，尤其是利用红螯螯虾造血组织干细胞作为细胞模型进行Sp-ALF2产品抗WSSV感染的抗病毒实验技术。

参考文献如下：

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发明内容

本发明的目的在于提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列。

本发明的第二目的在于提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列。

本发明的第三目的在于提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法。

本发明的第四目的在于提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子的应用。

为区别与本申请人之前已经克隆的抗菌型抗脂多糖因子Sp-ALF，特将所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子命名为Sp-ALF2。

所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列为：

cagtatgaaa ctctgatagc ctccgttctt ggaaaactca ctggactgtg gcacaacaac 60

tcagtggact tcatgggcca cacctgtcac ttccgccgcc gtcctaaggt caggaaattc 120

aagctgtacc acgagggcaa gttttggtgt cctggctggg cgccttttga gggcaggtcg 180

aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaagccatca aggacttcgt gcgcaaagct 240

ttacagaacg gactcatcac acagcaggac gctacggtgt gggtgaataa ttaa 294

所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列为：

Gln Tyr Glu Thr Leu Ile Ala Ser Val Leu Gly Lys Leu Thr Gly Leu

1 5 10 15

Trp His Asn Asn Ser Val Asp Phe Met Gly His Thr Cys His Phe Arg

20 25 30

Arg Arg Pro Lys Val Arg Lys Phe Lys Leu Tyr His Glu Gly Lys Phe

35 40 45

Trp Cys Pro Gly Trp Ala Pro Phe Glu Gly Arg Ser Arg Thr Lys Ser

50 55 60

Arg Ser Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ile Lys Asp Phe Val Arg Lys Ala

65 70 75 80

Leu Gln Asn Gly Leu Ile Thr Gln Gln Asp Ala Thr Val Trp Val Asn

85 90 95

Asn

所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法包括以下步骤：

1)构建拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重组表达载体；

2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即Sp-ALF2。

在步骤1)中，所述表达载体可选用pPIC9k等。

在步骤2)中，所述宿主细胞可为毕赤酵母等。

在步骤3)中，所述分离纯化步骤2)所得的表达产物的方法可先将表达产物进行透析，再进行亲和层析。

所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2对WSSV和多种病原菌具有明显抑制作用和杀伤作用，在制备抗病毒类新药和作为动物抗病饲料添加剂中具有广泛应用价值。

本发明在分离出拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基础上，根据Sp-ALF2基因序列特征成功构建重组表达载体并在毕赤酵母系统中表达并纯化获得Sp-ALF2蛋白，该重组蛋白具有较强的抗WSSV活性及广谱抗菌活性。研究结果表明，Sp-ALF2可能广泛参与了拟穴青蟹抗微生物感染反应，是一种重要的先天免疫因子，因此，重组基因工程产品Sp-ALF2蛋白在抗微生物感染，特别是抗病毒类新药开发应用中显示出非常诱人的应用前景。

附图说明

图1为pPIC9k载体双酶切前后电泳图谱。1为酶切前的pPIC9k载体；2为酶切后pPIC9k载体；M为DS2000DNA Marker。

图2为表达载体pPIC9k和pPIC9k/Sp-ALF2Sal I线性化前后电泳图谱。1为pPIC9k，2为酶切后pPIC9k，3为pPIC9k/Sp-ALF2，4为酶切后的pPIC9k/Sp-ALF2，M为DS2000DNAMarker。

图3为pPIC9k/Sp-ALF2重组毕赤酵母克隆子甲醇诱导表达检测SDS-PAGE电泳图谱。1为诱导前表达情况；2～4分别为甲醇诱导12h、24h、48h的表达产物；M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，重组蛋白Sp-ALF2的大小为13kDa，与Marker的14kDa条带位置一致。

图4为pPIC9k/Sp-ALF2重组毕赤酵母甲醇诱导表达产物纯化检测电泳图谱。1～2为透析样品离心后的沉淀和上清；3为穿过峰；4为溶液C洗脱峰；5～9为溶液D洗脱峰；M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker。

图5为重组蛋白rSp-ALF2的抗病毒实验检测电泳图谱：分别检测内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因(1～6)和WSSV极早期基因IE1(7～12)的表达。1、7为正常细胞对照；2、8为5μMrSp-ALF2孵育组；3、9为10μM rSp-ALF2孵育组；4、10为5μMr Sp-ALF孵育组；5、11为10μMr Sp-ALF孵育组；6、12为WSSV感染对照组。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2真核重组表达载体的构建

根据pPIC9k载体多克隆位点，设计扩增编码拟穴青蟹Sp-ALF2(cDNA)基因ORF的特异性上游引物F1和下游引物R1。在上游引物F1的5′端添加SnaB I酶切位点和编码His-tag的碱基；在下游引物R1的5′端添加终止密码子和Avr II酶切位点。上游引物F1：5′-CGTACGTACACCATCATCATCATCATCAGTATGAAGCTCTGGTAGC-3′，下游引物R1：5′-AACCTAGGTTA CCCCTTCAGCCAGGCGGCC-3′，扩增Sp-ALF2的编码区片段。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，重复30个循环；72℃延伸10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收，回收的PCR产物经SnaB I和Avr II酶切后纯化回收，与SnaB I和Avr II双酶切线性化pPIC9k载体连接，构建好酵母表达重组载体pPIC9k/Sp-ALF1，测序鉴定读码框正确无误。

pPIC9k载体双酶切前后电泳图谱参见图1。

实施例2pPIC9k/Sp-ALF2重组质粒在毕赤酵母GS 115中的诱导表达

测序正确质粒pPIC9k/Sp-ALF2经Sal I酶切线性化(参见图2)，以电击法转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，并诱导表达。

以pPIC9k空质粒转化的毕赤酵母GS115为对照，以pPIC9k/Sp-ALF2重组质粒转化的毕赤酵母GS115为实验组，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白的表达。

结果显示，以pPIC9k/Sp-ALF2重组质粒转化的毕赤酵母GS115诱导后与诱导前相比具有明显的重组蛋白诱导表达，蛋白条带在14kDa左右(参见图3)，与计算的理论分子量相似，后经质谱鉴定无误，确定为Sp-ALF2。

实施例3pPIC9k/Sp-ALF2重组质粒在毕赤酵母GS115中诱导表达产物的纯化、抗病毒活性及抗菌活性鉴定

1、亲和层析法纯化目的蛋白

将重组阳性毕赤酵母GS115菌株大量诱导表达后，离心去除菌体收集培养基上清1L，PBS透析两次(12h换一次新透析液)后，4℃，12000rpm离心35min，取上清，得上柱样品。随后采用金属鏊合层析柱对透析后蛋白进行亲和层析。收集溶液D洗脱峰，经SDS-PAGE电泳分析及质谱鉴定为Sp-ALF2重组蛋白(参见图4)。

2、Sp-ALF2重组蛋白抗WSSV活性鉴定

应用Bradford法测定BSA标准品得到蛋白浓度标准曲线。根据公式可计算出Sp-ALF2重组蛋白浓度。

Sp-ALF2重组蛋白抗WSSV活性鉴定：将目的蛋白稀释至5μM和10μM，与WSSV混匀；孵育30min后，加至螯虾造血组织干细胞(Hpt)体外培养细胞中，混匀；孵育1小时，随后移走全部培养基，加入新鲜培养基，混匀；继续孵育3小时后，收集培养孔中细胞，提取Hpt细胞总RNA，取1μg DNaseI处理后总RNA反转录成cDNA。

用东盛公司HS^TM Taq Mix试剂盒做RT-PCR，检测WSSV在Hpt细胞中的复制：检测病毒复制极早期基因IE1，以GAPDH基因作为内参，GAPDH引物为：

F：AATGCTTCTTGCACCACCAAC；

R：AGGTCTTGCTCAGCTGGATACC；

IE1引物为：

F：GGTATTGAGGTGATGAAGAGGCG；

R：TGACATGGGAACCACTGTTGAG)。

PCR反应体系如表1所示：

表1

混合均匀，在热循环仪上按以下程序进行PCR反应：

PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，GAPDH基因循环数33，IE1基因循环数37；72℃延伸7min。之后取5μl进行琼脂糖凝胶电泳。

结果表明：与rSp-ALF相比，rSp-ALF2对WSSV在Hpt细胞中的感染复制具有更强的抑制作用，而且该抑制作用随蛋白浓度提高而增强，因此，rSp-ALF2具有较强的抗WSSV活性，可作为一潜在的抗病毒因子制剂予以开发应用。

2、Sp-ALF2重组蛋白抗菌活性鉴定

Sp-ALF2重组蛋白抗菌活性的测定：按照MIC(Minimum Inhibitory Concentration，最低抑菌浓度)设定浓度来稀释目的蛋白，以μM为单位进行稀释配比，如分别采用25、12.5、6.25、3.12和1.6μM为稀释梯度，在96孔微量培养板上进行。蛋白样品经0.22μm滤膜过滤除菌后再进行稀释配比，每个浓度设置2个平行孔。取被测细菌，在MH或2216平板上划线，倒置培养12～16h；挑取单克隆接种于MH或2216斜面，继续培养过夜达到中期对数生长阶段；用DPBS(1.58mMNaH₂PO₄，8.42mMNa₂HPO₄，pH 7.2～7.4)清洗斜面培养物，调整稀释至OD₆₀₀＝0.1，取18μl OD₆₀₀＝0.1的稀释菌加入终体积为1ml的MH稀释培养基(DPBS：600μl，MH：400μl)中，该菌浓度则为MIC工作浓度。其中大肠杆菌模式株、谷氨酸棒杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和弗氏志贺氏菌培养温度为37℃，副溶血性弧菌、解藻朊酸弧菌、荧光假单胞菌和施氏假单胞菌培养温度为28℃。

MIC在96孔细胞培养板上进行，每种被测细菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样，加样体系分别为：

①空白对照组：加50μl蛋白样品和50μl DPBS；

②阴性对照组：加50μl菌悬液和50μl DPBS；

③样品实验组：加50μl待测各浓度蛋白样品和50μl菌悬液。

28℃培养24h后，判定Sp-ALF2重组蛋白对细菌的MIC，判定标准为该浓度细菌数少于或等于对照(未添加抗菌肽)中的一半。

利用测定MIC以上各孔培养物，分别吸取5μl，移种在琼脂培养基上，经孵育过夜，判定Sp-ALF2重组蛋白对细菌的MBC(Minimum Bactericidal Concentration，最低杀菌浓度)，即杀死某种细菌的最低药物浓度。

结果显示，真核表达Sp-ALF2蛋白产物对受试菌：大肠杆菌模式株、弗氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、解藻朊酸弧菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌，谷氨酸棒杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌(均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)均具有较强杀伤作用(参见表2)。

表2

a：MIC(Minimum Inhibitory Concentration，最低抑菌浓度)

b：：MBC(Minimum Bactericidal Concentration，最低杀菌浓度)

图5给出重组蛋白rSp-ALF2的抗病毒实验检测电泳图谱：分别检测内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因(1～6)和WSSV极早期基因IE1(7～12)的表达。

本发明旨在获得拟穴青蟹抗WSSV的Sp-ALF2基因工程表达产品，并对其抗病毒、抗微生物活性进行鉴定，以期开发高效复合型抗病原微生物的新药物。本发明获得了拟穴青蟹Sp-ALF2基因工程表达重组质粒pPIC9k/Sp-ALF2，并在毕赤酵母成功重组表达获得Sp-ALF2基因工程产品，确认了Sp-ALF2的抗WSSV活性和广谱抗菌活性，为其作为动物饲料添加剂和抗病原微生物新药物的开发奠定了良好的前期基础。

本发明根据拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2基因序列特征，构建真核重组表达载体、转化毕赤酵母诱导表达并纯化获得Sp-ALF2重组蛋白，鉴定重组蛋白抗微生物活性，研究发现Sp-ALF2重组蛋白具有高效抗微生物活性：对白斑综合征病毒和多种病原菌均具有明显抑制作用和杀伤作用。

Claims

1.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列为：

cagtatgaaa ctctgatagc ctccgttctt ggaaaactca ctggactgtg gcacaacaac 60

tcagtggact tcatgggcca cacctgtcac ttccgccgcc gtcctaaggt caggaaattc 120

aagctgtacc acgagggcaa gttttggtgt cctggctggg cgccttttga gggcaggtcg 180

aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaagccatca aggacttcgt gcgcaaagct 240

ttacagaacg gactcatcac acagcaggac gctacggtgt gggtgaataa ttaa 294。

2.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列为：

Gln Tyr Glu Thr Leu Ile Ala Ser Val Leu Gly Lys Leu Thr Gly Leu

1 5 10 15

Trp His Asn Asn Ser Val Asp Phe Met Gly His Thr Cys His Phe Arg

20 25 30

Arg Arg Pro Lys Val Arg Lys Phe Lys Leu Tyr His Glu Gly Lys Phe

35 40 45

Trp Cys Pro Gly Trp Ala Pro Phe Glu Gly Arg Ser Arg Thr Lys Ser

50 55 60

Arg Ser Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ile Lys Asp Phe Val Arg Lys Ala

65 70 75 80

Leu Gln Asn Gly Leu Ile Thr Gln Gln Asp Ala Thr Val Trp Val Asn

85 90 95

Asn。

3.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)构建拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重组表达载体；

4.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表达载体选用pPIC9k。

5.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述宿主细胞为毕赤酵母。

6.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述分离纯化步骤2)所得的表达产物的方法是先将表达产物进行透析，再进行亲和层析。

7.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2在制备抗病毒药中的应用。

8.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2在制备动物抗病饲料添加剂中的应用。