CN102240405A - ApoA-Ⅰmilano基因药物 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种ApoA-Ⅰmilano基因药物。本发明公开了一种ApoA-Ⅰmilano基因药物，其特征在于其包含表达如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒载体。本发明利用腺病毒载体感染效率高，宿主范围广及安全性较好等特点，构建含有ApoA-Ⅰmilano基因重组腺病毒载体，可为治疗糖尿病及其粥样硬化的药物提供新的药物，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

Description

ApoA-Ⅰmilano基因药物

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种ApoA-Ⅰmilano基因药物。

背景技术

随着经济的发展，糖尿病发生率逐年上升，而冠心病是糖尿病的主要死因，几乎90%的糖尿病人死于动脉粥样硬化（尤其是冠脉）并发症。已知HDL（高密度脂蛋白）是一种未来心血管事件的逆指标，提高血浆HDL水平可减轻动脉粥样硬化并逆转病变。

ApoA -Ⅰ是HDL的主要载脂蛋白，HDL的一些功能主要是有ApoA -Ⅰ执行的。在人类中，胰岛素抵抗和血液中高密度脂蛋白(HDL)及其主要成分载脂蛋白A(ApoA-I)含量的降低密切相关。最近研究表明ApoA-I基因敲除小鼠出现了高血糖及高胰岛素症，葡萄糖耐受实验也显示ApoA-I基因敲除小鼠葡萄糖代谢受到的损害，出现了Ⅱ型糖尿病的早期病症，ApoA-I通过与脂联素受体的胞内部分结合激活AMPK信号通路，改善体内的血糖平衡，从而在Ⅱ型糖尿病中发挥了保护作用。这一研究结果提示apoA-I与糖代谢及机体的胰岛素敏感性直接相关，提高机体中apoA-I的浓度对于缓解糖尿病的病理生理过程可能具有重要意义。

ApoA -Ⅰmilano是野生型ApoA -Ⅰ的遗传突变体，其中第173号丝氨酸被精氨酸取代，并形成同源二聚体和杂合子二聚体ApoA -Ⅱ。携有ApoA -Ⅰmilano的HDL代谢更快，且研究发现ApoA -Ⅰmilano具有抑制主动脉粥样硬化，减少内膜增厚等作用，与磷酯结合可抑制血小板聚集，促进纤溶，推迟动脉血栓形成等。故ApoA -Ⅰmilano可能成为非常适合治疗糖尿病及其粥样硬化的药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种ApoA-Ⅰmilano基因药物，为治疗糖尿病及其粥样硬化的药物提供新的药物。

为此，本发明公开了一种ApoA-Ⅰmilano基因药物，其特征在于其包含表达如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒载体。

在一实施例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一实施例中，所述腺病毒载体为pShuttle CMV。

本发明利用腺病毒载体感染效率高，宿主范围广及安全性较好等特点，构建含有ApoA -Ⅰmilano基因重组腺病毒载体，可为治疗糖尿病及其粥样硬化的药物提供新的药物，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

附图说明

图1 为EcoR I酶切鉴定pShuttle CMV-AⅠmilano电泳图；

图2为Hind Ⅲ 酶切鉴定pAd CMV-AⅠmilano电泳图；

图3为Not I 和EcoR I酶切鉴定pShuttle CMV-GFP电泳图；

图4为Hind Ⅲ 酶切鉴定pAd CMV-GFP电泳图；

图5 为人ApoA -Ⅰmilano Western blotting图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1.ApoA-I milano质粒构建

人血总RNA逆转录，采用RT-PCR扩增人载脂蛋白A I（ApoA I）cDNA，测序证实后用Stratagene QuikChange定点突变试剂盒将ApoA I-cDNA突变成ApoA I milano-cDNA。

突变引物序列见下

上游：5’-CTGGGCGAGGAGATGTGCGACCGCGCGCGC-3’

下游：5’-GCGCGCGCGGTCGCACATCTCCTCGCCCAG-3’

突变后cDNA双酶切，连入pDNR-LIB-PA，转化大肠杆菌、挑克隆、测序鉴定为pDNR-LIB-ApoA-I milano-PA质粒用于后续试验。

实施例2.含目的基因pShuttle质粒的制备

2.1 含ApoA -Ⅰmilano表达框的pShuttle CMV-AⅠmilano质粒的制备

pDNR-LIB-apoAⅠmilano-PA质粒经限制性内切酶SalⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒收集纯化含ApoA Ⅰmilano基因的片断。pShuttle CMV用限制性内切酶Sal Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，回收质粒载体片断，与ApoA -Ⅰmilano片断进行连接反应。连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌中，转化菌用卡那霉素筛选，并进行EcoR Ⅰ酶切鉴定。对酶切鉴定正确的菌种进行保存，并大量制备pShuttle CMV-AⅠmilano质粒。

2.2含绿色荧光蛋白表达框pShuttle CMV-GFP质粒的制备

pAAV-EFla-GFP-PA质粒经限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ进行双酶切后，纯化回收含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因目的片断。将pShuttle CMV用限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ进行双酶切后，纯化回收质粒载体片段，与GFP片段进行连接反应。将连接产物转化入感受态DH5α大肠杆菌中，转化菌用卡那霉素筛选单克隆菌落，小量培养提取质粒DNA用限制性内切酶Hind Ⅲ进行酶切鉴定。对酶切鉴定正确的菌种进行保存，并大量制备pShuttle CMV-GFP质粒。

实施例3.含目的基因pAd质粒的制备

pShuttle质粒（pShuttle CMV-AⅠmilano和pShuttle CMV-GFP）经Pme Ⅰ酶切线性化后和pAdeasy-1质粒在感受态BJ5183大肠杆菌中进行重组，得到对应的pAd质粒（pAd CMV-AⅠmilano和pAd CMV-GFP）。将酶切鉴定正确的质粒转入DH5α细菌进行大量制备和储存。

实施例4.含目的基因腺病毒毒种的制备

含目的基因的pAd质粒（pAd CMV-AⅠmilano和pAd CMV-GFP）经Pac Ⅰ酶切线性化后，转染入低代次的HEK293细胞中，培养8-12天后，出现明显的细胞病变效应后收集细胞及其上清，得到对应含目的基因的腺病毒毒种（AdV-AⅠmilano和AdV-GFP）。

实施例5.含ApoAⅠmilano基因的腺病毒载体的鉴定

从pDNR-LIB-apoAⅠmilano-PA质粒获得含有载脂蛋白AⅠmilano编码基因，插入pShuttle CMV穿梭质粒，获得pShuttle CMV- AⅠmilano。该质粒与pAdeasy-1质粒重组得到pAd CMV-AⅠmilano。利用质粒序列作图，构建的pShuttle CMV- AⅠmilano经EcoR I酶切后获得4921bp和3486bp两个目的片断段（图１中1为EcoR I酶切pShuttleCMV-AⅠmilano；2为DNA marker），pAd CMV- AⅠmilano酶切后获得8010bp、5913bp、5322bp、4597bp、3010bp、2985bp、2945bp、2081bp和75bp目的片段（图2中1为Hind Ⅲ 酶切pAd CMV-AⅠmilano；2为 DNA marker）。

实施例6.含绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体的鉴定

从pAAV-EFla-GFP-PA质粒获得含有GFP编码基因，插入pShuttle CMV穿梭质粒，获得pShuttle CMV-GFP，该质粒与pAdeasy-1质粒重组得到pAd CMV-GFP。利用质粒序列作图，pShuttle CMV-GFP酶切后获得1864bp和747bp两个目的片段，pAd CMV-GFP酶切后获得8010bp、5322bp、4932bp、4597bp、3010bp、2980bp、2945bp、2081bp和1964bp目的片段（图3中1为Not I 和EcoR I双酶切pShuttle CMV-GFP；2为DNA marker、图4中1为Hind Ⅲ 酶切鉴定pAd CMV-GFP；2为DNA marker）。

实施例7.重组病毒的鉴定

构建成功的重组病毒质粒pAd CMV- AⅠmilano和pAd CMV-GFP分别用PacⅠ酶切水解，得到线性化双链核酸，转染HEK293细胞即可包装成为腺病毒AdV-AⅠmilano和AdV-GFP。转染成功的HEK293细胞可出现CPE，证明病毒已在细胞内包装成功。经扩大培养后，收集病毒裂解液离心获得纯化的重组腺病毒。将纯化后腺病毒AdV-AⅠ病毒注入小鼠体内1天后,通过Western blotting监测在血清中能检测到人载脂蛋白AⅠmilano(图5中1为空载病毒质粒；2为ApoA -Ⅰmilano腺病毒）。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  上海市第十人民医院

 

<120>  说明书序列表

 

<130>  一种ApoA-Ⅰmilano基因药物

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  267

<212>  PRT

<213>  Homo sapiens

 

 

<220>

<221>  MUTAGEN

<222>  (173)..(173)

 

<400>  1

 

Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp

            20                  25                  30         

 

 

Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp

        35                  40                  45             

 

 

Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp

                85                  90                  95     

 

 

Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys

            100                 105                 110        

 

 

Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe

        115                 120                 125             

 

 

Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu

    130                 135                 140                

 

 

Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala

                165                 170                 175    

 

 

Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp

            180                 185                 190        

 

 

Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn

        195                 200                 205            

 

 

Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu

    210                 215                 220                

 

 

Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln

225                 230                 235                 240

 

 

Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala

                245                 250                 255    

 

 

Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

            260                 265        

 

 

<210>  2

<211>  897

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<400>  2

agagactgcg agaaggaggt cccccacggc ccttcaggat gaaagctgcg gtgctgacct     60

 

tggccgtgct cttcctgacg gggagccagg ctcggcattt ctggcagcaa gatgaacccc    120

 

cccagagccc ctgggatcga gtgaaggacc tggccactgt gtacgtggat gtgctcaaag    180

 

acagcggcag agactatgtg tcccagtttg aaggctccgc cttgggaaaa cagctaaacc    240

 

taaagctcct tgacaactgg gacagcgtga cctccacctt cagcaagctg cgcgaacagc    300

 

tcggccctgt gacccaggag ttctgggata acctggaaaa ggagacagag ggcctgaggc    360

 

aggagatgag caaggatctg gaggaggtga aggccaaggt gcagccctac ctggacgact    420

 

tccagaagaa gtggcaggag gagatggagc tctaccgcca gaaggtggag ccgctgcgcg    480

 

cagagctcca agagggcgcg cgccagaagc tgcacgagct gcaagagaag ctgagcccac    540

 

tgggcgagga gatgcgcgac cgcgcgcgcg cccatgtgga cgcgctgcgc acgcatctgg    600

 

ccccctacag cgacgagctg cgccagcgct tggccgcgcg ccttgaggct ctcaaggaga    660

 

acggcggcgc cagactggcc gagtaccacg ccaaggccac cgagcatctg agcacgctca    720

 

gcgagaaggc caagcccgcg ctcgaggacc tccgccaagg cctgctgccc gtgctggaga    780

 

gcttcaaggt cagcttcctg agcgctctcg aggagtacac taagaagctc aacacccagt    840

 

gaggcgcccg ccgccgcccc ccttcccggt gctcagaata aacgtttcca aagtggg       897

 

 

Claims (3)

1.一种ApoA-Ⅰmilano基因药物，其特征在于其包含表达如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒载体。

2.根据权利要求1所述的ApoA-Ⅰmilano基因药物，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的ApoA-Ⅰmilano基因药物，其特征在于所述腺病毒载体为pAd CMV。

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