CN102234688A - 一种哺乳动物细胞dna快速定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种哺乳动物细胞DNA定量检测方法，用于以哺乳动物细胞为基质的生物制品中残留宿主细胞DNA检测。采用哺乳动物细胞基因组中多拷贝基因为检测标志序列模板，以及DNA聚合酶、分子标记引物、和分子标记脱氧核糖核酸合成检测目的序列，并对其进行定量分析。与分子杂交方法比较具有检测时间短(可在2小时内完成)、检测结果稳定、灵敏度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型基因组DNA定量检测用方法及试剂盒，属于生物技术领域。
发明背景
随着生物技术发展和健康水平提高，对各种病毒性疫苗和治疗性抗体需求增加，其中以哺乳动物细胞培养所产生的各种产物逐渐增加，由于各种细胞系如VERO、CHO、MDCK、PER.C6等在高代次培养时有致肿瘤的担忧，所以根据中华人民共和国药典(二○○五年版)要求，各种属此类细胞生产的产物，其宿主细胞DNA残留量都有具体规定，如纯化狂犬疫苗每剂不超过100pg，所以在生产、研发、质量检定过程中都需要进行宿主细胞DNA含量检测。
目前所用的检测方法为随机引物，DNA聚合酶合成随机探针，在生产实践中我们发现，这种探针检测方法在杂交温度提高，即特异性提高时，灵敏度下降，常常不能达到应用目的，检测限在纳克级，只好增加探针使用量、降低杂交温度，结果，灵敏度提高了，但特异性下降，且成本提高；另一个方面，从合成探针到杂交显色完成需2.5天时间，时间太长。
Alu重复序列是哺乳动物基因组中SINE家族的一员，约有50万份拷贝。也就是说平均4～6kb中就有一个Alu序列，约占人基因组序列10.7％。由于这种DNA序列中有限制性内切核酸酶Alu的识别序列AGCT，所以称为Alu重复序列。典型的人基因组Alu序列长约300bp，由两个同源但有差别的亚基构成。限制性内切酶AluI可将其剪切成130bp和170bp两段，因此将其定名为Alu序列。亚基来源于有缺失突变和点突变的7SLRNA基因。两个亚基间由腺嘌呤核苷酸密集的序列连接。右边的亚基中有无关的31bp插入片段，称为IH。Alu序列两端各有一个正向重复序列，末端有一个poly(A)尾。
Alu序列一般散在分布，少数呈簇状分布。在细胞遗传学水平上观察，Alu重复序列集中在基因转录最活跃的染色体区段内。在所有已知的基因内含子中，几乎都发现了Alu序列。
Alu家族不同成员之间的一致序列(consensus sequence)的同一性平均达87％。小鼠基因组内约有5万份拷贝的B1重复序列，长130bp，与Alu的一个亚基的同源性达70％-80％。
Alu序列的这些特点使得其成为替代随机探针杂交方法进行基因组DNA定量检测的最佳选择之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于哺乳动物基因组DNA分子定量检测方法及试剂盒。
本发明中检测目的序列是在基因组中拷贝数高于1000的重复序列，其中最优选人Alu重复序列及其同源的重复序列。
本发明的实现方法是：
获得所检测宿主细胞的重复序列，设计并合成分子标记引物，通过掺入标记碱基，以样本中DNA为模板，按本专业人员熟知的DNA聚合酶方法合成含有2种以上分子标记的目的序列。例如引物以生物素标记，掺入地高辛或荧光素标记的脱氧核苷酸，如此目的序列即含生物素-地高辛标记或地高辛-荧光素标记，由于其中标记1(生物素)与标记2(如地高辛或荧光素)在目的序列中是1对多的关系，信号可因此放大。
标记1用于固定在固相载体上，如表面包被标记1配体(如亲和素)的塑料、聚酯、尼龙、玻璃、云母等材料。
而对于标记2可通过酶标记的抗体进行检测，如标记2为地高辛，则可通过酶标记地高辛抗体，或者地高辛抗体+酶标记二抗进行检测。如果标记2为荧光素，则可通过荧光检测设备直接进行检测，或者化学发光物质激活，其信号可反应出样本中DNA量，通过制备标准曲线对样本中DNA含量进行定量检测。
将引物、DNA聚合酶、缓冲液、(标记的)脱氧核糖核酸混合液，标记物抗体或二抗，酶学方法检测底物，固定用配体包被孔板制备成试剂盒进行检测。
附图说明
图1目的序列合成；
图2检测方法；
图3与随机探针检测限比较(VERO细胞DNA分析)
具体实施例
以下实例是进一步详述本发明，但本发明内容并非限定于此。
1、引物合成
从GENBANK中查取非洲绿猴Alu序列，合成引物：
PBIOALU1：5’-BIOTIN-AGGCCGGGCGCAGTGGCTCA-3’
PBIOALU2：5’-BIOTIN-GGACTGCAGTGGCGCAATCTC-3’
2、样本DNA提取
取VERO细胞狂犬疫苗，按标定量加入1倍体积提取液(0.1mol/L NaOH，0.1mol/LNaCl，5g/L SDS)，再行酚-氯仿抽提，DNA沉淀后，溶于50μl TE缓冲液中。
3、目的序列合成
取2μl实例2产物作为模板，取引物稀释成10μM，按PBALU15μl，Taq酶5U，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs(10mMol/L)4μl，地高辛标记dig-11-Dutp(1mMol/L)40μl，模板100ng，纯水加至50μl。按95℃5分钟，然后95℃30秒、54℃30秒、72℃10分钟，然后加入100mM EDTA 5μl终止反应。
4、目的序列检测
实例3反应溶液1μl加入有45μl杂交液的微孔中，于37℃放置10min，然后用37℃的PBS/T洗板3次，加入50μl(1×105U/L)的抗地高辛过氧化物酶酶联物，37℃放置10min，然后弃去孔中液体，用PBS/T洗-板3次，再另入1滴TMB溶液和1滴0.3ml/L H2O2，避光放置10min，加入0.5mol/L H2SO4终止显色反应，测定A450nm。
Claims (7)
1.一种哺乳动物细胞DNA定量检测方法，用于以哺乳动物细胞为基质的生物制品中残留宿主细胞DNA检测。采用哺乳动物细胞基因组中多拷贝基因为检测标志序列模板，以及DNA聚合酶、分子标志物标记引物、和分子标记脱氧核糖核酸合成检测目的核酸序列，并对其进行标志物定量分析。
2.根据权利要求1所述多拷贝基因指这些基因序列在基因组序列中多于1000拷贝，优选为Alu超家族基因序列，或1种以上该类基因的组合。
3.根据权利要求1所述检测目的核酸序列特征为同时具有2种以上的分子标志物组合，其中一种用于把分子标志物固定在固相载体上，另一种用于信号放大检测。
4.根据权利要求3所述分子标志物具体为生物素、地高辛、荧光素、化学发光物质、可用于标记碱基的抗原；这些标志物之间的组合优选为生物素-地高辛、生物素-荧光素组合。
5.根据权利要求3所述固定指通过分子标志物-配体之间的分子作用力把目的核酸序列连接到固相载体，以便于去除未标记序列。
6.根据权利要求3所述信号放大检测指把用于固定外的另一标志物结合于带有可检测标记的配体，具体为酶标记抗体，通过对底物的催化转换成可检测产物，便于检测。
7.一种试剂盒，包含权利要求1所述的目的核酸序列和合成条件，以及权利要求6所述的检测条件。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111109 |