CN102229934A - 猪小肠抗菌肽pr-39在毕赤酵母中的高效生产方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法及应用。本发明根据毕赤酵母的偏嗜性合成编码PR-39的DNA序列，连接表达载体pGAPZαA，构建pGAPZαA-PR-39真核表达载体；转化重组表达载体至宿主细胞，构建表达工程菌；发酵培养重组酵母菌，进行表达。本发明应用基因工程技术在毕赤酵母宿主细胞中高效表达了抗菌肽PR-39，表达效率高，分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产，在制备抗菌药物、饲料添加剂或食品防腐剂方面具有广阔的应用前景。

Description

猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及抗菌肽的表达，尤其是涉及猪小肠抗菌肽PR-39的高效生产方法。

背景技术

目前，几乎所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌

的耐药性问题已经日益严重地威胁着动物和人类的健康，同时生物安全和食品安全已经引起人类的重视，寻找全新类型的抗菌剂是解决抗药性问题的一条有效途径。

抗菌肽是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，是一种由微生物、植物、无脊椎动物和各种动物的细胞和组织产生的一种抗菌活性多肽，也是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分。现在发现抗菌肽广泛分布于细菌、昆虫、植物、两栖动物和哺乳动物中，它具有广谱抗菌、抗病毒、杀肿瘤细胞、热稳定、强碱性、易溶于水和带正电荷等特点，相对分子质量低及对真核细胞几乎没有毒不良反应。并且抗菌肽的抗菌浓度小，抗菌浓度单位一般在μmol/ L水平，可作为传统抗生素的替代品，是一种具有巨大发展前景的新型抗菌剂。

PR-39是1991年Agerberth.B 等人从猪小肠组织中分离纯化出来，在骨髓原代细胞中合成，以前肽形式储存在中性粒细胞中，成熟肽含有39个氨基酸残基，其中22个脯氨酸(P)，11个精氨酸(R)，故称其为PR-39，分子量约为4.7kD 。其前体是一条编码173 个氨基酸残基的基因，其基因结构相当紧凑，仅由1784bp 组成，具有4个外显子和3个内含子，1993年Storici.P 等首次从猪骨髓细胞中克隆到PR-39的cDNA。PR-39 具有广谱抗菌活性、抗癌抗肿瘤作用、嗜中性粒细胞趋化作用以及较强血管生成和组织修复作用，且无不良反应，是一种具有预防和治疗疾病潜能的肽类抗生素。

但是，直接从猪的组织中提取天然PR-39，分离纯化存在一定的困难，而且产量低，不能满足生产需求。化学合成和基因工程法是获得猪小肠抗菌肽PR-39的主要手段，但化学合成PR-39成本高，而通过基因工程在微生物中表达抗菌肽基因是获得PR-39的有效途径。目前，PR-39基因在大肠杆菌、兔骨髓介质干细胞和293T细胞中获得表达，但是表达量低、难纯化、生产工艺复杂。

发明内容

本发明的目的在于针对现有PR-39基因表达量低、难纯化、生产工艺复杂等缺陷，提供一种采用毕赤酵母表达系统高效表达猪小肠抗菌肽PR-39的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种采用毕赤酵母表达系统高效表达猪小肠抗菌肽PR-39的方法，包括以下步骤：

（1）根据GenBank [GI:242304] 上发表的抗菌肽PR39 氨基酸序列，选用毕赤酵母偏嗜性密码子，设计4条互为模板的引物，PCR合成编码PR-39的DNA序列，连接表达载体pGAPZα-A，构建pGAPZα-A-PR-39真核表达载体；所述引物P1、p2、P3和P4分别具有SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列；

（2）重组表达载体pGAPZα-A-PR-39转化宿主细胞毕赤酵母，构建表达工程菌；

具体是将感受态P.pastoris SMD1168（80μL）与Avr II线性化的pGAPZα-A-PR-39（10 μg）相混合，1.5 kV、200Ω电击5 毫秒（ms）。将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板（含100 μg/ml Zeocin）上，将平板倒置，于30℃温箱中培养至单菌落出现（需要3~5 天）。采用100℃煮（10min）—-20℃冻（10min）—-20℃煮（10min）和细胞壁破碎法制备PCR 模板分析P.pastoris转化子，以P1、P4为引物进行PCR，PCR反应条件：94℃ 预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，25个循环之后，72℃再延伸10min；扩增出142 bp 的克隆的菌株定为阳性转化子。再经不同浓度（100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml）Zeocin 的YPD平板挑选高拷贝克隆，以用于高效表达目的蛋白。

（3）发酵培养重组酵母菌，进行表达；

具体是用灭菌牙签细挑筛选到的具有Zeocin 抗性的单菌落，挑于5 mL 的YPD 液体培养基中进行一级培养，30℃，200 r/min 振荡过夜，至OD600=2~6，此时细胞处于对数生长期。取1 mL一级培养液，重悬于30 mL 的YPD 中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时；

（4）表达产物纯化得到猪小肠抗菌肽PR-39。

具体是将表达产物3000 r/min 离心5min，取上清液即为抗菌肽PR-39。

本发明方法制备得到的抗菌肽PR-39可以应用于制备抗菌药物。

本发明的有益效果是：

本发明创造性地选择了毕赤酵母菌作为猪小肠抗菌肽PR-39真核表达宿主，获得较高的表达量，具有比大肠杆菌等其他表达系统更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，且不会产生内毒素；本发明进一步采用pGAPZα-A真核表达载体和蛋白酶缺陷型菌株SMD1168构建表达工程菌，有效避免产物被蛋白酶降解，不需甲醇诱导，所表达异源蛋白直接分泌到培养基中，大大减少了对培养基中的外源基因表达产物的纯化工作（简单离心处理即可），且显著提高表达量。

本发明方法简单易行，采用的培养基等材料价格低廉，更利于实现工业化推广生产。

本发明应用基因工程技术在真核宿舍细胞中高效表达了抗菌肽PR-39，经实验验证该抗菌肽对多种革兰氏阳性菌有杀菌作用，且本发明表达效率高，分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产。因此，本发明在制备新型抗菌药物具有广阔的应用前景。

附图说明

图 1猪小肠抗菌肽PR-39对金黄色葡萄球菌的抑菌作用：其中1为空载体表达上清液阴性对照，2为氨苄青霉素（Amp）阳性对照，3、4为抑菌圈；

图2猪小肠抗菌肽PR-39对猪水肿病大肠杆菌的抑菌作用：其中1为空载体表达上清液阴性对照，2为Amp阳性对照，3、4为抑菌圈；

图3猪小肠抗菌肽PR-39表达上清蛋白的SDS-PAGE电泳图：其中M为超低分子量蛋白marker，1、2为表达上清。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明实施例采用的试剂、原料等均为常规的试剂、原料等，实施例采用的方法特别说明，皆为本技术领域常规方法。

实施例1

（1）构建表达载体：GenBank [GI:242304] 上发表的抗菌肽PR39 氨基酸序列，选用毕赤酵母偏嗜性密码子，设计4条互为模板的引物，通过两轮PCR，以P2、P3引物进行第一轮PCR扩增，PCR反应条件：94℃ 预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环之后，72℃再延伸10min；以回收的第一轮PCR产物为模板，以P1、P4为引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应条件同第一轮相同，产物即为目的基因。获得的PR-39的基因连接到表达载体上，获得重组表达载体所述引物的核苷酸序列如下：

P1:

5’- CCCTCGAGAAGAGA AGA AGAAGACCAAGACCACCATACTTGCCAAGACC -3'，

p2:

5’- CA A TCT TGG TGGGAA GAATGGTGGTGGTCT TGGTCT TGGCA AGTATGGT -3'，

P3:

5’- TTCTTCCCACCA AGATTGCCACCA AGA ATC CCA CCA GGT TTC CCA CCA A -3'，

P4:

5’- GCTCTAGATTATGG GAA TCT TGG TGGGAA TCT TGG TGG GAA ACCTGGTG -3'。

酶切位点为XhoⅠ和XbaⅠ（下划线所示），表达载体为pGAPZα-A。

构建好的表达载体经PCR鉴定和核苷酸测序后表明与我们设计的序列一致，结果如下：

PR39基因核苷酸序列测序结果：5 ’-AGA AGA AGA CCA AGA CCA CCA TAC TTG CCA AGA CCA AGA CCA CCA CCA TTC TTC CCA CCA AGA TTG CCA CCA AGA ATC CCA CCA GGT TTC CCA CCA AGA TTC CCA CCA AGA TTC CCA-3’

PR39基因氨基酸序列：RRRPRPPYLP RPRPP PFFPPRLPPRIPPGF PPRFPPRFP

（2）构建基因工程菌：用上述重组表达载体转化宿主菌，宿主菌为毕赤酵母SMD1168；

具体是将感受态P.pastoris SMD1168 (80μL)与Avr II线性化的pGAPZα-A-PR-39 (10 μg)相混合，1.5 kV、200Ω电击5 毫秒（ms）。将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板（含100μg/ml Zeocin）上，将平板倒置，于30℃温箱中培养至单菌落出现（需要3~5 天）。采用煮—冻—煮和细胞壁破碎法制备PCR 模板分析P.pastoris 转化子，以P1、P4为引物能扩增出142 bp 的克隆定为阳性转化子。再经不同浓度（100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）Zeocin 的YPD平板挑选高拷贝克隆，以用于高效表达目的蛋白；

（3）发酵培养重组酵母菌，进行表达：用灭菌牙签细挑筛选到的具有Zeocin 抗性的单菌落，挑于5mL 的YPD 液体培养基中进行一级培养，30℃，200 r/min 振荡过夜，至OD₆₀₀=2~6，此时细胞处于对数生长期。取1 mL一级培养液，重悬于30 mL 的YPD 中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时得表达产物；

（4）纯化：将步骤（3）所述表达产物3 000 r/min 离心5 min，取上清即得。猪小肠抗菌肽PR-39表达上清蛋白的SDS-PAGE电泳图见附图3所示，附图3中， M为超低分子量蛋白marker，1、2为表达上清。

（5）表达上清蛋白浓度测定：收集96h表达的蛋白上清液，用DNA/RNA 微量定量法测定蛋白浓度，用GeneRAY UV-Photometer核酸蛋白质分光光度计分别测出波长A260nm和A280nm处的值，根据公式：蛋白质浓度(mg/mL)=1.45×A280nm-0.76×A260nm，计算蛋白浓度可达284μg/ml.

实施例2

（1）通过琼脂糖扩散抗菌鉴定（参照Agarose diffusion antimicrobial assay，美国专利6，337，314，2002年1月8日）。

按照实施例1的方法得到基因工程表达的猪小肠抗菌肽PR-39，对标准金黄色葡萄球菌S.aureus和猪水肿病大肠杆菌的抗菌活性进行鉴定实验。将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌和猪水肿病大肠杆菌悬浮液（OD₆₀₀≈0.5）各15μL，与55℃的LB 固体培养基30 mL 混匀后铺平板，等其凝固后，用灭菌的打孔器（直径3 mm）打孔，滴加50 μL 待测PR-39 样品，以同体积的pGAPZα-A 空载体转化酵母表达蛋白为阴性对照，100μg/mL的氨苄青霉素1μL为阳性对照，37℃培养16小时，实验结果见附图1、附图2所示，附图 1为猪小肠抗菌肽PR-39对金黄色葡萄球菌的抑菌作用实验结果，其中1为空载体表达上清液阴性对照，2为氨苄青霉素阳性对照，3、4为抑菌圈；附图2猪小肠抗菌肽PR-39对猪水肿病大肠杆菌的抑菌作用实验结果，其中1为空载体表达上清液阴性对照，2为氨苄青霉素阳性对照，3、4为抑菌圈。抑菌圈明显，表明上述菌株对抗菌肽PR-39敏感。

（2）PR-39对金黄色葡萄球菌和猪水肿病大肠杆菌最小抑菌（MIC）浓度测定

最低抑菌浓度(MIC)测定：用液体生长抑制法测定抗菌肽PR-39对金黄色葡萄球菌和猪水肿病大肠杆菌的MIC，将能完全抑制菌体生长的最低蛋白浓度确定为MIC。将活化培养的菌液用LB 培养基稀释至10⁶ CFU/mL， 分别取50μL 加到96 孔培养板上，然后分别加入稀释的PR-39 (浓度分别为284μg/mL，142 μg/mL，71μg/mL， 35.5 μg/mL， 17.75 μg/mL，8.87μg/mL，4.44 μg/mL，2.2 μg/mL，1.1 μg/mL，0.55μg/mL)的溶液50 μL，混匀，设只加LB培养液的孔为阴性对照，接种细菌而不加抗菌肽的LB培养液为阳性对照。置37℃培养箱孵育20h后取出，用紫外分光光度计测量培养液的OD值，结果判断以无OD值变化的孔中抗菌肽的浓度(终浓度)即为最小抑菌浓度。结果为PR-39对金黄色葡萄球菌和猪水肿病大肠杆菌最小抑菌（MIC）浓度分别为8.87μg/mL和4.44μg/mL。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 猪小肠抗菌肽PR-39高效表达方法及应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物P1

<400> 1

ccctcgagaa gagaagaaga agaccaagac caccatactt gccaagacc 49

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物P2

<400> 2

caatcttggt gggaagaatg gtggtggtct tggtcttggc aagtatggt 49

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物P3

<400> 3

ttcttcccac caagattgcc accaagaatc ccaccaggtt tcccaccaa 49

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物P4

<400> 4

gctctagatt atgggaatct tggtgggaat cttggtggga aacctggtg 49

Claims (6)

1.一种猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据GenBank [GI:242304] 上发表的抗菌肽PR39 氨基酸序列，选用毕赤酵母偏嗜性密码子，设计4条互为模板的引物，PCR合成编码PR-39的DNA序列，连接表达载体pGAPZα-A，构建pGAPZα-A-PR-39真核表达载体；所述引物P1、p2、P3和P4分别具有SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列；

（2）重组表达载体pGAPZα-A-PR-39转化宿主细胞毕赤酵母，构建表达工程菌；

（3）发酵培养重组酵母菌，进行表达，得表达产物；

（4）将步骤（3）所述表达产物离心处理得到纯化的猪小肠抗菌肽PR-39。

2.根据权利要求1所述猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于步骤（2）是将80μL的感受态P.pastoris SMD1168与10 μg的 Avr II线性化的pGAPZα-A-PR-39相混合，电击，将转化后的酵母细胞培养至单菌落出现，制备PCR 模板分析P.pastoris转化子，以P1、P4为引物扩增出142 bp 的克隆定为阳性转化子，筛选具有Zeocin 抗性的单菌落。

3.根据权利要求1所述猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于步骤（3）是挑选具有Zeocin 抗性的单菌落，挑于YPD 液体培养基中进行一级培养至OD₆₀₀=2~6；取所述一级培养液重悬于YPD 中继续振荡培养得表达产物。

4.根据权利要求1所述猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于步骤（4）所述离心处理是将表达产物于3000 r/min 离心5min。

5.一种权利要求1、2、3或4所述方法制备得到的猪小肠抗菌肽PR-39。

6.一种权利要求1、2、3或4所述方法制备得到的猪小肠抗菌肽PR-39的应用，其特征在于应用于制备抗菌药物。

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