CN102212513B - 由冬虫夏草菌中分离得到的蛋白水解酶及其纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由冬虫夏草菌中分离得到的蛋白水解酶及其纯化方法，所述蛋白水解酶是由冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)中分离得到的。所述蛋白水解酶的分子量为43kDa，最适温度为30℃，最适pH为9.5。本发明分离纯化得到的蛋白质是一个全新的蛋白水解酶，属于碱性蛋白水解酶，最适pH 9.5，最适温度30℃，酶切基序-/-/-/K+-/-/PK/-，比较专一，而且对多种蛋白酶抑制剂、金属离子、氧化剂、表面活性剂等有耐受力，非常适合实验室及工业应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的蛋白水解酶及其纯化方法，特别是涉及一种由冬虫夏草菌中分离得到的蛋白水解酶及其纯化方法。
背景技术
酶是生物体组织或细胞内具有特殊催化活性的一类蛋白质。其中蛋白水解酶是水解蛋白质肽键的一类酶，在生物体内发挥着重要的生理功能，例如血液凝固、血纤维溶解、补体激活、多肽和蛋白激素或组织激肽的释放，细胞的融合与分化以及大分子的装配等等。蛋白水解酶也被广泛地应用于生产和生活的各个方面。全球60％以上的商业或工业用酶都是蛋白水解酶(Rao MB et al.，Microbiol Mol Biol Rev1998；62：597-634.)。
目前，全球生产的酶中有大约40％来自微生物，其中很大一部分来自于细菌，尤其是杆菌属。由于对蛋白水解酶，特别是具有特殊性质的蛋白水解酶的需求不断增加，使人们开始寻找新的蛋白水解酶来源。真菌由于其含有大量蛋白水解酶，易于培养，液体培养基过滤方便等原因成为备受关注的新的蛋白水解酶来源(Phadatare SU et al.，Enz Microb Technol 1993；15：72-76)。
冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)是麦角科虫草属的真菌，在自然界中寄生于虫草蝙蝠蛾(Hepialusarm oricanus)等昆虫幼虫体内形成复合体，被称为冬虫夏草，具有补肺益肾、止血化痰之功效，可主治气短喘咳，自汗盗汗，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后久虚不复等症，是中国传统的珍贵中药。冬虫夏草菌与冬虫夏草的功效相似，富含虫草素、虫草酸、虫草多糖等多种有效生物活性成分(Noh EM et al.，Rheumatology 2009；48：45-48)。目前的研究发现冬虫夏草菌具有肿瘤抑制、免疫激活、抗辐射等作用(Wu JY et al.，Phytomedicine2007；14：43-49)，是一种非常具有药用价值的真菌。
发明内容
本发明的目的在于从冬虫夏草菌中纯化出一种具有特异酶切位点的全新的蛋白水解酶，其可以很好地应用于实验室及工业生产。
本发明的一种蛋白水解酶，是由冬虫夏草菌(CordycepsSinensis)中分离得到的。进一步，所述蛋白水解酶的分子量为43kDa，最适温度为30℃，最适pH为9.5。
本发明的另一目的是提供上述蛋白水解酶的纯化方法：
一种蛋白水解酶的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：(1)将冬虫夏草菌破碎，并用Tris-HCl缓冲液浸泡；(2)将所述步骤(1)中所得到的浸泡液在18000rpm下离心30分钟；(3)将所述步骤(2)中所得到的离心上清使用HiTrap Q XL离子交换柱进行离子交换层析；(4)将步骤(3)中所得到收集液使用Superdex 200 prep grade分子筛层析柱进行分子筛层析；(5)对步骤(4)所得收集液进行浓缩；(6)对步骤(5)所得收集液进行自然胶电泳，并电洗脱回收蛋白；(7)对步骤(6)所得收集液进行脱盐，冻干；(8)对步骤(7)所得干粉溶解并使用SOURCE 15RPC反相层析柱进行反向层析。
优选地，在所述步骤(1)中，将冬虫夏草菌粉碎后采用以10倍的质量/体积比加入20mM Tris-HCl，PH7.4，4℃搅拌24小时。
优选地，在所述步骤(3)中，先将浸泡液调节为20mM Tris-HClPH7.4，并在离子交换层析前再次调节PH到7.4。
优选地，在所述步骤(3)中，先用平衡缓冲液20mM Tris-HCl，PH 7.4洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用含0-1M NaCl的20mM Tris-HCl，PH 7.4进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰。
优选地，在所述步骤(4)中，进行分子筛层析的洗脱剂是含500mMNaCl的20mM Tris-HCl，PH 7.4。
优选地，在所述步骤(6)中所用的自然胶电泳胶是12％的分离胶和4％的浓缩胶，电泳缓冲液和电洗脱缓冲液为Tris-Gly。
优选地，在所述步骤(8)中，先用2％乙腈洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用2％-70％的乙腈进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰。
本发明的优点是：
本发明首先用离子交换柱HiTrap Q XL进行粗提，除去大部分杂蛋白，使后面的纯化更加简便有效。最后一步采用反向层析，使蛋白纯度大大增加，并且不会破坏蛋白活性。最后所得纯品经SDS-PAGE电泳检测呈单一条带。本发明分离纯化得到的蛋白质是一个全新的蛋白水解酶，属于碱性蛋白水解酶，最适pH 9.5，最适温度30℃，酶切基序-/-/-/K+-/-/PK/-，比较专一，而且对多种蛋白酶抑制剂、金属离子、氧化剂、表面活性剂等有耐受力，非常适合实验室及工业应用。
附图说明
图1为经纯化的蛋白质SDS聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。泳道1为蛋白质分子量标准(72，55，43，34，26kDa)，泳道2为纯化的蛋白质；
图2为最适温度图；
图3为最适pH图；
图4A～4F为定向多肽库测定酶切基序图；其中，图4D、4E、4F为多肽库1酶切后N段测序结果，图4A、4B、4C为多肽库2酶切后N端测序结果。
具体实施方式
实施例1：蛋白酶的纯化
1.原料破碎和浸泡
将冬虫夏草菌粉碎后，以10倍的质量/体积比加入20mMTris-HCl，调至PH 7.4，4℃搅拌24h。
2.离心
浸泡液4℃，18000rpm离心30min，收集上清。上清经0.22mm滤膜过滤。
3.离子交换层析
选用HiTrap Q XL离子交换柱，用10个柱体积平衡缓冲液(20mMTris-HCl，PH 7.4)平衡。待层析柱充分平衡后，将步骤2所得的过滤上清上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280稳定到基线附近。用洗脱液(1M NaCl，20mM Tris-HCl，PH 7.4)进行梯度洗脱(0-100％)，收集洗脱峰，并充分流洗至基线平稳。色谱柱使用完毕后，用0.1M NaOH流洗2倍柱体积，去离子水充分流洗使柱再生，并以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
4.分子筛层析
选用Superdex 200prep grade分子筛层析柱，用5个柱体积平衡缓冲液(500mM NaCl，20mM Tris-HCl，PH 7.4)平衡。待层析柱充分平衡后，将步骤3所得的收集液4℃，12000rpm离心30min，离心上清上样。上样结束后继续以缓冲体系进行流洗，分别收集色谱峰。色谱柱使用完毕后，用去离子水充分流洗，并以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
5.浓缩
步骤4所得的收集液经5kDa超滤浓缩离心管4℃，12000rpm离心浓缩。
6.自然胶电泳并回收
步骤5所得浓缩液在4℃进行自然胶电泳，电泳凝胶及缓冲液的配制如下：
电泳凝胶配制：
1×电泳缓冲液配制：
上样后，固定电压80V，30min，120V，90min进行电泳。自然胶电泳完成后，使用迷你整胶电洗脱仪(bio-rad mini whole gel eluter)进行电洗脱，固定电流75mA，20min，回收并浓缩。
7.脱盐，浓缩
选用GE的desalting脱盐柱进行脱盐。用去离子水平衡5个柱体积，将步骤6所得收集液上样，去离子水流洗，收集色谱峰，冻干。脱盐柱使用完毕后，用去离子水充分流洗，并以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
8.反向层析
选用SOURCE 15RPC反相层析柱，用10个柱体积2％乙腈平衡，待层析柱充分平衡后，将步骤7所得干粉用2％乙腈溶解并上样。上样结束后用2％乙腈流洗色谱柱，直至A280稳定到基线附近。用洗脱液(70％乙腈)进行梯度洗脱(0-100％)，收集洗脱峰，并充分流洗至基线平稳。色谱柱使用完毕后，用0.5M NaOH流洗15ml，0.5MNaOH到50％异丙醇梯度洗脱5ml，50％异丙醇流洗15ml，去离子水洗脱5ml，然后将层析柱保存在20％乙醇中。
纯化过程收益如下：
一个单位的蛋白酶量相当于在标准测定条件下能水解1μM/ml/mim多肽(ARKQYP)的酶量。
实施例2蛋白酶鉴定
纯化终产物经SDS聚丙烯胺凝胶电泳分析，如图1，泳道1：蛋白质分子量标准，130、95、72、55、43、34和26kDa；泳道2，纯化的蛋白酶。蛋白酶的分子量约为43kDa。
纯化的蛋白质通过N端测序、串联质谱(MS-MS)，衬质辅助激光解析与电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和从头测序(De novoSequencing)分析，结果如下：
实施例3蛋白酶性质测定
1.最适温度
酶与蛋白质(或多肽ARKQYP)在pH9.5的磷酸盐缓冲液中，分别在0、10、20、30、40、50、60℃混合孵育30min，加入0.02M NaOH终止反应，反应物经反相柱SOURCE 15RPC(或SOURCE 5RPC)分析，得出酶切产物量，最后得到最适反应温度为30℃。如图2所示。
2.最适pH
酶与蛋白质(或多肽ARKQYP)在30℃，分别在pH5、6、7、8、9、9.5、10、11、12混合孵育30min，加入0.02M NaOH终止反应，反应物经反相柱SOURCE 15RPC(或SOURCE 5RPC)分析，得出酶切产物量，最后得到最适pH为9.5。如图3所示。
3.蛋白酶抑制剂对活性影响
酶分别与蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、二异丙基氟磷酸(DFP)、抑蛋白酶肽(Aprotinin)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、胃蛋白酶抑制剂A(Pepstatin A)、亮抑酶肽(Leupeptin)、Na-对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐(TAME)、乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)在30℃，20mM Tris-HCl，pH9.0的条件下孵育15min，然后与蛋白质(或多肽ARKQYP)混合孵育30min，加入0.02M NaOH终止反应，反应物经反相柱SOURCE 15RPC(或SOURCE 5RPC)分析，得出蛋白酶抑制剂对该蛋白酶活性的影响，如下：
4.金属离子对活性影响
酶分别与金属离子Ca2+(CaCl2)、Mn2+(MnCl2)、Mg2+(MgCl2)、Zn2+(ZnSO4)在30℃，20mM Tris-HCl，pH9.0的条件下孵育15min，然后与蛋白质(或多肽ARKQYP)混合孵育30min，加入0.02M NaOH终止反应，反应物经反相柱SOURCE 15RPC(或SOURCE 5RPC)分析，得出金属离子对该蛋白酶活性的影响，如下：
5.氧化剂和表面活性剂等抑制剂对活性影响
酶分别与β-巯基乙醇、吐温80(Tween 80)、辛基苯氧基聚乙氧乙醇(Triton X-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)和过氧化氢(H2O2)在30℃，20mM Tris-HCl，pH9.0的条件下孵育15min，然后与蛋白质(或多肽ARKQYP)混合孵育30min，加入0.02M NaOH终止反应，反应物经反相柱SOURCE 15RPC(或SOURCE 5RPC)分析，得出抑制剂对该蛋白酶活性的影响，如下：
实施例4蛋白酶切基序测定
1.合成多肽库1
合成随机十二肽库Ac-XXXXXXXXXXXX，N端封闭。
2.酶切
对步骤1所合成的随机多肽库进行酶切，酶切条件：30℃，pH9.5，酶与多肽库孵育30min。
3.N端测序
对步骤2所得的酶切产物进行N端测序，使用方法为Edman降解法。
4.合成多肽库2
根据步骤3测序结果，设计多肽库2：MXXXQYPKHK(生物素)，N端不封闭，C端连接生物素。
5.酶切
对步骤4所合成的随机多肽库进行酶切，酶切条件：30℃，pH9.5，酶与多肽库孵育30min。
6.N端测序
对步骤5所得的酶切产物进行N端测序，使用方法为Edman降解法。
7.酶切基序确定
根据步骤3和6的测定结果，确定酶切基序为-/-/-/K+-/-/PK/-。当P1位点为赖氨酸，P3′位点为脯氨酸或赖氨酸时，蛋白能够被酶切开。此外，P2和P1′位点也存在一定选择性，当P2位点为精氨酸或赖氨酸，P3′位点为丙氨酸时，酶切可能更加容易。图4所示为定向多肽库测定酶切基序结果。其中图4D、4E、4F为多肽库1酶切后N段测序结果，图4A、4B、4C为多肽库2酶切后N端测序结果。
Claims (8)
1.一种蛋白水解酶，其特征在于：该蛋白水解酶是由冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)中分离得到的，所述蛋白水解酶的分子量为43kDa，最适温度为30℃，最适pH为9.5，所述蛋白水解酶是经由以下步骤的纯化方法得到的，
(1)将冬虫夏草菌粉碎后采用以10倍的质量/体积比加入20mM Tris-HCl缓冲液浸泡，pH7.4，4℃搅拌24小时；
(2)将所述步骤(1)中所得到的浸泡液在18000rpm下离心30分钟；
(3)将所述步骤(2)中所得到的离心上清使用HiTrap Q XL离子交换柱进行离子交换层析，先将浸泡液调节为20mM Tris-HCl pH7.4，并在离子交换层析前再次调节pH到7.4，先用平衡缓冲液20mM Tris-HCl，pH 7.4洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用含0-1M NaCl的20mM Tris-HCl，pH 7.4进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰；
(4)将步骤(3)中所得到收集液使用Superdex 200 prep grade分子筛层析柱进行分子筛层析，进行分子筛层析的洗脱剂是含500mM NaCl的20mM Tris-HCl，pH7.4；
(5)对步骤(4)所得收集液进行浓缩；
(6)对步骤(5)所得收集液进行自然胶电泳，并电洗脱回收蛋白；
(7)对步骤(6)所得收集液进行脱盐，冻干；
(8)对步骤(7)所得干粉溶解并使用SOURCE 15RPC反相层析柱进行反向层析，收集目的蛋白峰。
2.一种根据权利要求1中所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：所述纯化方法包括以下步骤：
(1)将冬虫夏草菌破碎，并用Tris-HCl缓冲液浸泡；
(2)将所述步骤(1)中所得到的浸泡液在18000rpm下离心30分钟；
(3)将所述步骤(2)中所得到的离心上清使用HiTrap Q XL离子交换柱进行离子交换层析；
(4)将步骤(3)中所得到收集液使用Superdex 200 prep grade分子筛层析柱进行分子筛层析；
(5)对步骤(4)所得收集液进行浓缩；
(6)对步骤(5)所得收集液进行自然胶电泳，并电洗脱回收蛋白；
(7)对步骤(6)所得收集液进行脱盐，冻干；
(8)对步骤(7)所得干粉溶解并使用SOURCE 15RPC反相层析柱进行反向层析，收集目的蛋白峰。
3.根据权利要求2所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，将冬虫夏草菌粉碎后采用以10倍的质量/体积比加入20mM Tris-HCl，pH7.4，4℃搅拌24小时。
4.根据权利要求2或3所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，先将浸泡液调节为20mM Tris-HCl pH7.4，并在离子交换层析前再次调节pH到7.4。
5.根据权利要求4所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，先用平衡缓冲液20mM Tris-HCl，pH 7.4洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用含0-1M NaCl的20mM Tris-HCl，pH 7.4进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰。
6.根据权利要求2所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，进行分子筛层析的洗脱剂是含500mM NaCl的20mM Tris-HCl，pH7.4。
7.根据权利要求2所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(6)中所用的自然胶电泳胶是12％的分离胶和4％的浓缩胶，电泳缓冲液和电洗脱缓冲液为Tris-Gly。
8.根据权利要求2所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于： 在所述步骤(8)中，先用2％乙腈洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用2％-70％的乙腈进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰。
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