CN102206607B - 肠出血性大肠杆菌o157:h7三基因缺失菌株 - Google Patents
肠出血性大肠杆菌o157:h7三基因缺失菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7三基因缺失菌株，属于生物技术领域。①抗性诱导，获得具有链霉素抗性的EHECO157:H7菌株。②缺失株构建，首先EHECO157:H7（△hly），而后依次构建EHECO157:H7（△hly△stx）和EHECO157:H7（△hly△stx△toxB）。EHECO157:H7（△hly△stx△toxB）致病性和小鼠体内定植能力较亲本菌株有明显降低而免疫原性良好。本发明构建了EHECO157:H7（△hly△stx△toxB），并明确了致病性和定植特性。本发明构建的缺失菌株EHECO157:H7（△hly△stx△toxB），可用于研制EHEC基因缺失活疫苗，免疫接种动物以减少EHECO157:H7在肠道内的定植，进而降低人类感染EHECO157:H7的机会，保障人类身心健康。
Description
一、技术领域
本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7三基因缺失菌株，具体涉及肠出血性大肠杆菌（enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157:H7溶血素（Hly）、志贺毒素（Stx）和ToxB缺失菌株的构建和特性研究，属于生物技术领域。
二、背景技术
肠出血性大肠杆菌（enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157:H7，是重要的食源性人兽共患病原。近20余年来，EHEC O157:H7引发的食物中毒在世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染患者和无症状携带者可作为传染源。在动物宿主范围非常广泛，其中反刍动物带菌率较高。相对来讲，动物作为传染源要比人类更为重要，它往往是动物源食品污染的根源。EHEC O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗会加剧病情等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。目前对其感染缺乏有效的防治方法，对其致病机理尚需要深入研究。
研究表明，EHEC O157:H7粘附和致病相关因子有（Locus of enterocyte effacement，LEE）毒力岛编码的Ⅲ型分泌系统蛋白，前噬菌体编码的志贺毒素Ⅰ和Ⅱ（StxⅠ和Ⅱ），大质粒pO157编码的诸如溶血素（Hly）和ToxB等一些毒力因子。在细菌体内，StxⅡ为分泌型表达，StxⅠ为胞内表达。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与28S rRNA作用导致蛋白质合成停止，是EHEC O157:H7引起临床表现的病理基础；B亚单位具有细胞结合特性，能与具有特定受体（Gb3）的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用。Stx能引起被感染的人腹泻，并可能出现出血性结肠炎（Hc）或溶血性尿路综合症（Hus）等全身性并发症。几乎所有O157菌株都编码EHEC溶血素蛋白，而EHEC O157:H7可以以血红蛋白和血红素为原料，快速生长繁殖产生更多的毒素引起病变。Hly产生需要4种相连的基因HlyC、A、B、D的产物，其中HlyA是结构基因。Hly与大肠杆菌α-溶血素（α-Hly）同属RTX（Repeat toxin）毒素家族，碱基序列有60% 的相似性。由EHEC O157:H7大质粒pO157编码，因与艰难梭状芽胞杆菌（Clostridium difficile）毒素B有同源性，命名为ToxB，整个阅读框9501bp。ToxB通过某些机制间接的影响LEE毒力岛编码蛋白的合成和分泌，从而降低EHEC O157:H7的粘附定植作用。
以EHEC O157:H7（stx1- stx2+hly+toxB+）为亲本株，针对stx2A，hly和toxB三个全基因上下游序列分别设计特异性引物对，扩增上下游同源臂，同时选取壮观霉素，庆大霉素和卡那霉素基因表达盒作为筛选标记，先后构建三个基因缺失株，最终获得三基因缺失菌株，即O157:H7（△hly△stx△toxB）基因缺失株。选取HEp-2细胞和链霉素处理的Balb/c小鼠分别从体外和体内两个方面评价缺失株对粘附和定植的影响，为研制用于防控EHEC O157:H7的基因缺失疫苗奠定基础和提供技术平台。
三、发现内容
技术问题 本发明目的在于构建肠出血性大肠杆菌（enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157:H7的hly、stx和toxB三基因缺失株，研究其在肠道内定植的能力及其致病性，进而为研制EHEC O157:H7基因缺失疫苗奠定基础，降低动物带菌率，进而减少人类感染EHEC的机会，保障人类身心健康。
技术方案 本发明的具体实施方案如下：
肠出血性大肠杆菌O157:H7缺失菌株，其特征在于，所说的细菌缺失hly的整个A基因，stx2的整个A基因，以及toxB整个基因。
构建上述缺失菌株的方法，包括：
（1）构建EHEC O157:H7 hlyA基因缺失株，即EHEC O157:H7（△hly）的构建
①获取hly的HN和HC及Spc基因，并串联克隆入pGEM-T载体
根据GenBank登陆的hly序列，序列号为NC_007414，设计两对特异性引物，以EHEC O157:H7菌株制备的DNA为模板，分别扩增hly基因5’端上游和3’端下游655bp和834bp序列，其中hly-NR包括hly基因5’端起始3个碱基，hly-CF包括hly 3’端末尾3个碱基：
hly-NF：5-tcgggatcctctaatgcttttgacgtc-3
hly-NR：5-gccgaattcgtcatattagttttctttc-3
hly-CF：5- gctgaattcgagactaaaagaggaggt-3
hly-CR：5-aatgcatgctagcacccagttcgacgt-3
hly-NF和hly-CR引物两端分别加限制性酶切位点BamHⅠ和SphⅠ及保护性碱基，hly-NR和hly-CF引物两端加同样的限制性酶切位点EcoRⅠ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，以双蒸水为阴性对照；
根据GenBank登陆的pSET4s序列，序列号为AB055650，设计一对特异性引物Spc-F和Spc-R，以pSET4s质粒为模板扩增整个的Spc表达盒：
Spc-F：5-cgtgaattccgttcgtgaatacatgttat-3
Spc-R：5- atggaattcgcgcttaccaattagaatga-3
Spc-F和Spc-R引物两端加同样的限制性酶切位点EcoRⅠ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，54℃ 30s，72℃ 1.2min，共30个循环，最后72℃延伸7min，以双蒸水和EHEC O157:H7 DNA为阴性对照；
hly-NF和hly-NR、hly-CF和hly-CR、Spc-F和Spc-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带655bp、834bp和1137bp，并分别用1%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE-A 缓冲液 后75℃作用10min，而后加入0.5倍体积 DE-A 缓冲液的DE-B 缓冲液，颠倒混匀，转移液体于微型柱子，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅰ500ul，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅱ750 ul，12000g离心1min，弃液体，重复洗涤 缓冲液Ⅱ洗涤一次，而后空管12000g离心1min，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入60ul 洗脱缓冲液，12000g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的655bp、834bp和1137bp片段，命名为HN、HC和Spc片段；
将EcoR Ⅰ酶切HN和HC片段各3ul（6ng/ul），T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶（350U/ul）各1.0ul，双蒸水2.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜；取HN-HC的过夜连接产物3.5ul（4ng/ul）与pGEM-T 1.0ul（50ng/ul），T4 DNA 2×连接缓冲液 5.0 ul和T4 DNA连接酶0.5ul（350U/ul）一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHⅠ和SphⅠ双酶切，37℃水浴3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条1489bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEM-T-HN-HC重组质粒，胶回收Spc片段4.5ul（3.6ng/ul），与pMD18-T 0.5ul和溶液Ⅰ 4.5ul一同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I单酶切，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，看到一条1137bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-spc重组质粒；
② pMEG-375-HSH重组敲除质粒的构建
pGEM-T-HN-HC重组质粒和pMD18-T-Spc重组质粒分别用EcoRⅠ单酶切，碱性磷酸酶去磷酸化处理，4℃连接，转化Top10感受态细胞，经过EcoRⅠ酶切获得阳性重组质粒pGEM-T-HN-Spc-HC，pGEM-T-HN-Spc-HC与自杀性温敏质粒pMEG375用BamHⅠ和SphⅠ双酶切，各取2ul（7.1ng/ul），与T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶（350U/ul）各1.0ul，双蒸水4.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化sm10感受态细胞，用氯霉素板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pMEG375-HN-Spc-HC，即为获得的阳性基因敲除质粒pHSH；
③ 细菌固相交配
采用固相滤膜杂交方法，分别接种受体菌EHEC O157:H7和含pHSH的供体菌sm10到5mL LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，然后按4:1比例分别取sm10和EHEC O157:H7的过夜培养物，混匀，用滤器过滤，细菌被收集到滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂平板上，滤膜有细菌的一面向上，于37℃培养过夜，然后用生理盐水洗下滤膜上的细菌， 1000倍稀释后，分别涂布于具有链霉素和氯霉素抗性StrepRCmRLB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于StrepRCmR液体LB中增菌，而后对菌液进行O157血清型编码基因rfbE和Spc基因扩增，获得能够同时编码二者的菌落，即rfbE+ Spc +；
④ 氯霉素富集法
接种上述筛选的氯霉素耐药性的杂交株于LB液体培养基中，37℃培养过夜，以体积比2%接种量转接新鲜LB液体培养基中，37℃培养1-2h，加入氯霉素继续培养1-2h，按1mg/mL加入D-环丝氨酸，再迅速置37℃继续培养1-2h，8000r/min离心收集菌体，用生理盐水洗一次，100倍稀释后涂布于含有100ug/ml Spc的10%蔗糖平板上，30℃培养16-20h，长出的菌落分别接种含氯霉素的LB平板及普通LB平板，筛选氯霉素敏感株；
⑤ EHEC O157:H7（△hly）的筛选和获得
氯霉素敏感单菌落培养物离心收集菌体，重悬，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备EHEC O157:H7的模板上清，用Spc-F和Spc-R，设计hly-F和hly-R一对引物：hly-F：5-cacacggagcttataatattctgtca-3 hly-R：5-aatgttatcccattgacatcatttgact-3
分别进行PCR扩增，筛选出重组有Spc基因的EHEC O157:H7，即EHEC O157:H7（△hly）；用全菌多克隆抗血清分别与EHEC O157:H7和EHEC O157:H7（△hly）进行蛋白质免疫印迹检测，经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得Hly缺失的EHEC O157:H7菌株，即EHEC O157:H7（△hly）菌株；
⑥EHEC O157:H7全菌多克隆抗血清制备
EHEC O157:H7 接种LB液体培养基3mL，37℃培养8h，取1mL培养物，离心收集菌体，用生理盐水洗涤2次，10倍稀释后，与等体积福氏完全佐剂进行乳化，皮下多点注射家兔；3周后，与等体积福氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射家兔；2周后，心脏采血，收集血清，即为EHEC O157:H7全菌多克隆抗血清；
（2）EHEC O157:H7（△hly△stx）的构建
① 首先获取stx2A的SN和SC及Gm基因，并串联克隆入pGEM-T载体
根据GenBank登陆的stx2A序列，序列号为NC_007414，设计两对特异性引物，以EHEC O157:H7菌株制备的DNA为模板，分别扩增stx2A基因5’端上游和3’端下游397bp和229bp序列，其中stx2A-NR包括stx2A基因5’端起始3个碱基，stx2A-CF包括stx2A3’端末尾3个碱基：
stx2A-NF：5-aatggatcctacaaatccagcaagggcc-3
stx2A-NR：5-gccgaattccgaaaagtctatcgtaaac-3
stx2A-CF：5-ttagaattcgcggcggattgtgctaaag-3
stx2A-CR：5-cccgcatgccattattaaactgcacttca-3
stx2A-NF和stx2A-CR引物两端分别加限制性酶切位点BamHⅠ和SphⅠ及保护性碱基，stx2A-NR和stx2A-CF引物两端加同样的限制性酶切位点EcoRⅠ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，最后72℃延伸5min，以双蒸水为阴性对照；
根据GeneBank登陆的序列号为AY598466.1的FastbacTM1序列，设计一对特异性引物Gm-F和Gm-R，扩增整个Gm表达盒，811bp；
Gm-F：5-gaattcaccgtggaaacgcatgaag-3
Gm-R：5-gaattcacggcttgaacgaattgtt-3
Gm-F和Gm-R引物两端加限制性酶切位点EcoR Ⅰ，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃ 1 min，56℃ 30s，72℃ 50s，共30个循环，最后72℃延伸5 min，以双蒸水为阴性对照；
Gm-F和Gm-R引物两端加同样的限制性酶切位点EcoRⅠ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.0min，共30个循环，最后72℃延伸7min，以双蒸水和EHEC O157:H7 DNA为阴性对照；
stx2A-NF和stx2A-NR、stx2A-CF和stx2A-CR、Gm-F和Gm-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带397bp、229bp和811bp，并分别用1%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE-A 缓冲液 后75℃作用10min，而后加入0.5倍体积 DE-A 缓冲液的DE-B 缓冲液，颠倒混匀，转移液体于微型柱子，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅰ500ul，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅱ750 ul，12000g离心1min，弃液体，重复洗涤缓冲液Ⅱ洗涤一次，而后空管12000g离心1min，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入60ul 洗脱缓冲液，12000g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的397bp、229bp和811bp片段，命名为SN、SC和Gm片段；
将EcoR Ⅰ酶切SN和SC片段各3ul(4ng/ul)，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶（350U/ul）各1.0 ul，双蒸水2.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜；取SN-SC的过夜连接产物3.5ul(2.7ng/ul)与pGEM-T 1.0ul(50ng/ul)，T4 DNA 2×连接缓冲液 5.0 ul和T4 DNA连接酶0.5ul（350U/ul）一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHⅠ和SphⅠ双酶切，37℃水浴3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条626bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEM-T-SN-SC重组质粒，胶回收Gm片段4.5ul（5ng/ul），与pMD18-T0.5ul(50ng/ul)和溶液 Ⅰ 4.5ul一同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR Ⅰ单酶切，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条811bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-Gm重组质粒；
② pMEG-375-SGS重组敲除质粒的构建
pGEM-T-SN-SC重组质粒和pMD18-T-Gm重组质粒分别用EcoRⅠ单酶切，碱性磷酸酶去磷酸化，4℃连接，转化Top10感受态细胞，经过EcoRⅠ酶切获得阳性重组质粒pGEM-T-SN-Gm-SC，pGEM-T- SN-Gm-SC与自杀性温敏质粒pMEG375用BamHⅠ和SphⅠ双酶切各2ul（11ng/ul），与T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶（350U/ul）各1.0ul，双蒸水4.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化sm10感受态细胞，用氯霉素板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pMEG375- SN-Gm-SC，即为获得的阳性基因敲除质粒pSGS；
③ 细菌固相交配
采用固相滤膜杂交方法，分别接种受体菌EHEC O157:H7（△hly）和含pSGS的供体菌sm10到5mL LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，然后按体积比4:1比例分别取含pSGS的sm10和EHEC O157:H7（△hly）的过夜培养物，混匀，用滤器过滤，细菌被收集到滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂平板上，滤膜有细菌的一面向上，于37℃培养过夜，然后用生理盐水洗下滤膜上的细菌进行1000倍稀释后，分别涂布于具有链霉素和氯霉素抗性StrepRCmRLB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于StrepRCmR液体LB中增菌，而后对菌液进行O157血清型编码基因rfbE和Gm基因扩增，获得能够同时编码二者的菌落，即rfbE+ Gm+；
④ 氯霉素富集法
接种上述筛选的氯霉素耐药性的杂交株于LB液体培养基中，37℃培养过夜，以2%接种量转接新鲜LB液体培养基中，37℃培养1-2h，加入氯霉素继续培养1-2h，按1mg/mL加入D-环丝氨酸 ，再迅速置37℃继续培养1-2h，8000r/min离心收集菌体，用生理盐水洗一次， 100倍稀释后，涂布于含有50ug/ml Gm的10%蔗糖平板上，30℃培养16-20h，长出的菌落分别接种含氯霉素的LB平板及普通LB平板，筛选氯霉素敏感株；
⑤ EHEC O157:H7（△hly△stx2A）的筛选和获得
氯霉素敏感单菌落培养物离心收集菌体，重悬，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备EHEC O157:H7的模板上清，用Gm-F和Gm-R，设计stx2A-F和stx2A-R一对引物：stx2A-F：5-gcgttaatggagttcagtggt-3stx2A-R：5-cttaactcctttatttacccgttgt-3
分别进行PCR扩增，筛选出重组有Gm基因的EHEC O157:H7，即EHEC O157:H7（△hly△stx2A）；用全菌多克隆抗血清分别与EHEC O157:H7（△hly）和EHEC O157:H7（△hly△stx2A）进行蛋白质免疫印迹检测，经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得Hly和Stx2A缺失的EHEC O157:H7菌株，即EHEC O157:H7（△hly△stx2A）菌株；
（3）EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）的构建
①首先获取toxB的BN和BC及Kan基因，并串联克隆入pET32载体
根据GenBank登陆的toxB序列，序列号为NC_007414，设计两对特异性引物，以EHEC O157:H7菌株制备的DNA为模板，分别扩增toxB基因5’端上游和3’端下游831bp和863bp序列，其中toxB-NR为toxB基因5′端上游36-54个碱基，toxB-CF为toxB基因3′端下游32-50个碱基；
toxB-NF：5-ttaggatccatccatcaggcgttgtgc-3
toxB-NR：5-ggggaattctttgattagcgacaacct-3
toxB-CF：5-gccgtcgactaatcttacccagcatca-3
toxB-CR：5-attgcggccgcgagttatcagcccgtcat-3
toxB-NF、toxB-NR、toxB-CF和toxB-CR引物两端分别加限制性酶切位点BamH Ⅰ、 EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ和Not Ⅰ和及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃ 1 min，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，最后72℃延伸5 min，以双蒸水为阴性对照；
根据GeneBank登陆的序列号为EF442785.1的pET28序列，设计一对特异性引物Kan-F和Kan-R，扩增整个Kan表达盒，1192bp；
Kan-F：5-ccggaattcacggctacactagaaggac-3
Kan-R：5- agagtcgacaaatgtgcgcggaaccccta-3
Kan-F和Kan-R引物两端加限制性酶切位点EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃ 1 min，56℃ 30s，72℃ 1.2 min，共30个循环，最后72℃延伸7 min，以双蒸水为阴性对照；
toxB-NF和toxB-NR、toxB-CF和toxB-CR、Kan-F和Kan-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带831bp、863bp和1192bp，并分别用1%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE-A 缓冲液 后75℃作用10min，而后加入0.5倍体积 DE-A 缓冲液的DE-B 缓冲液，颠倒混匀，转移液体于微型柱子，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅰ500ul，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅱ750 ul，12000g离心1min，弃液体，重复洗涤缓冲液Ⅱ洗涤一次，而后空管12000g离心1min，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入60ul 洗脱缓冲液，12000g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的831bp、863bp和1192bp片段，命名为BN、BC和Kan片段；
将BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切BN片段3ul(9.6ng/ul)和pET32a载体4ul(10ng/ul)，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶(350U/ul)各1.0ul，双蒸水1.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，37℃水浴3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条831bp的条带出现，获得pET32a-BN重组质粒，而后将EcoRⅠ和Sal Ⅰ酶切的Kan与pET32a-BN重组质粒连接，获得pET32a-BN-Kan，最后将Sal Ⅰ和Not Ⅰ酶切的BC与pET32a-BN-Kan重组质粒连接，获得pET32a-BN-Kan-BC，转化Top10感受态细胞，37℃培养16h，挑取平板单菌落进行鉴定。将鉴定阳性的重组质粒和pMEG375载体分别用BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切后，4℃连接过夜，转化感受态细胞 sm10，用氯霉素板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pMEG375-BN-Kan-BC，即为获得的阳性基因敲除质粒pBKB；
② 细菌固相交配
采用固相滤膜杂交方法，分别接种受体菌EHEC O157:H7（△hly△stx）和含pBKB的供体菌sm10到5mL LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，然后按4:1比例分别取含pBKB的sm10和EHEC O157:H7（△hly△stx）的过夜培养物，混匀，用滤器过滤，细菌被收集到滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂平板上，滤膜有细菌的一面向上，于37℃培养过夜，然后用生理盐水洗下滤膜上的细菌，1000倍稀释后，分别涂布于具有链霉素和氯霉素抗性StrepRCmRLB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于StrepRCmR液体LB中增菌，而后对菌液进行O157血清型编码基因rfbE和Kan基因扩增，获得能够同时编码二者的菌落，即rfbE+ Kan+；
③ 氯霉素富集法
接种上述筛选的氯霉素耐药性的杂交株于LB液体培养基中，37℃培养过夜，以2%接种量转接新鲜LB液体培养基中，37℃培养1-2h，加入氯霉素继续培养1-2h，按1mg/mL加入D-环丝氨酸 ，再迅速置37℃继续培养1-2h，8000r/min离心收集菌体，用生理盐水洗一次，100倍稀释后，涂布于含有100ug/ml 卡那霉素10%蔗糖平板上，30℃培养16-20h，长出的菌落分别接种含氯霉素的LB平板及普通LB平板，筛选氯霉素敏感株；
④ EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）的筛选和获得
氯霉素敏感单菌落培养物离心收集菌体，重悬，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备EHEC O157:H7的模板上清，用Kan-F和Kan-R，设计toxB-F和toxB-R一对引物：toxB-F：5-aattcaatggaattatcagaat-3 toxB-R：5-taaacgattttctacctctgg-3
分别进行PCR扩增，筛选出重组有Kan基因的EHEC O157:H7，即EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）；用全菌多克隆抗血清分别与EHEC O157:H7（△hly△stx2A）和EHEC O157:H7（△hly△stx2A△toxB）进行蛋白质免疫印迹检测，经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得Hly、Stx和ToxB缺失的EHEC O157:H7菌株，即EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）菌株。
有益效果 本发明的特点和优点如下：
1、本发明针对EHEC O157:H7的主要毒素基因（stx和hly）和具有调控能力的toxB基因，构建了三基因缺失菌株。利用PCR技术，分别获得hly、stx和toxB三个基因的上下游同源臂，并依次串连，最终克隆入自杀性质粒pMEG375，成功构建了三个基因敲除质粒，分别为pMEG375-HN-Spc-HC、 pMEG375-SN-Gm-SC 和pMEG375-BN-Kan-BC，即命名为pHSH、pSGS和 pBKB。
2、本发明成功获得EHEC O157:H7（△hly△stx2A△toxB）菌株。pHSH、pSGS和 pBKB基因敲除质粒与相应的亲本株杂交，通过同源重组、蔗糖板筛选依次获得基因缺失菌株，经基因水平和蛋白水平筛选和鉴定，成功得到缺失hly、stx和toxB三个基因的EHEC O157:H7菌株，即EHEC O157:H7（△hly△stx2A△toxB）菌株。
3、本发明对EHEC O157:H7（△hly△stx2A△toxB）缺失株培养特性、细胞粘附能力和小鼠致病性及定植能力进行了分析，并对其免疫免疫原性做了初步的研究。该缺失菌株对HEp-2细胞的粘附能力和在小鼠体内定植能力明显降低，可作为研制EHEC O157:H7基因缺失疫苗的候选菌株之一。
四、附图说明
图1：EHEC O157:H7（△hly△stx2A△toxB）构建图谱
基因敲除质粒pBKB（图上部）与EHEC O157:H7染色体（图中间）通过同源重组，获得缺失hly、stx2A和toxB的EHEC O157:H7（△hly△stx2A△toxB）染色体（图下部）。图中黑色长方形图标代表卡那霉素（Kan基因），箭头空白部分和空白箭头代表toxB基因。点状箭头和黑白方相间的箭头分别代表pMEG375复制起始点和氯霉素（Cat基因）代表。黑色加粗线条代表toxB基因两侧序列。
图2：pMEG375-HN-Spc-HC的BamHⅠ/Sph Ⅰ双酶切鉴定图
泳道1, DL-15000Marker；泳道2~3, pMEG375-HN-Spc-HC
图3：pMEG375-SN-Gm-SC的BamHⅠ/Sph Ⅰ双酶切鉴定图
泳道1, DL-15000Marker；泳道2~3, pMEG375-SN-Gm-SC
图4：pMEG375-BN-Kan-BC的BamHⅠ/NotⅠ双酶切鉴定图
泳道1, DL-2000Marker；泳道2~3, pMEG375-BN-Kan-BC
泳道1~2,O157:H7；泳道3,O157:H7(△hly△stx)
图5：EHEC O157:H7与缺失株EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）生长特性比较
图6：EHEC O157:H7与EHEC O157:H7（△hly△stxΔtoxB）粘附能力比较
图7：EHEC O157:H7与EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）排菌检测
五、具体实施方式
肠出血性大肠杆菌O157:H7缺失菌株的构建，包括hly的整个A基因，stx2的整个A基因，以及toxB整个基因的敲除，因此，依次构建了EHEC O157:H7（△hly）、EHEC O157:H7（△hly△stx）和EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB），共分三个步骤完成。
、EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）缺失菌株的构建如下：
（1）构建EHEC O157:H7 hlyA基因缺失株，即EHEC O157:H7（△hly）的构建
①获取hly的HN和HC及Spc基因，并串联克隆入pGEM-T载体
根据GenBank登陆的hly序列，序列号为NC_007414，设计两对特异性引物，以EHEC O157:H7菌株制备的DNA为模板，分别扩增hly基因5’端上游和3’端下游655bp和834bp序列，其中hly-NR包括hly基因5’端起始3个碱基，hly-CF包括hly 3’端末尾3个碱基：
hly-NF：5-tcgggatcctctaatgcttttgacgtc-3
hly-NR：5-gccgaattcgtcatattagttttctttc-3
hly-CF：5- gctgaattcgagactaaaagaggaggt-3
hly-CR：5-aatgcatgctagcacccagttcgacgt-3
hly-NF和hly-CR引物两端分别加限制性酶切位点BamHⅠ和SphⅠ及保护性碱基，hly-NR和hly-CF引物两端加同样的限制性酶切位点EcoRⅠ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，以双蒸水为阴性对照；
根据GenBank登陆的pSET4s序列，序列号为AB055650，设计一对特异性引物Spc-F和Spc-R，以pSET4s质粒为模板扩增整个的Spc表达盒：
Spc-F：5-cgtgaattccgttcgtgaatacatgttat-3
Spc-R：5- atggaattcgcgcttaccaattagaatga-3
Spc-F和Spc-R引物两端加同样的限制性酶切位点EcoRⅠ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，54℃ 30s，72℃ 1.2min，共30个循环，最后72℃延伸7min，以双蒸水和EHEC O157:H7 DNA为阴性对照；
hly-NF和hly-NR、hly-CF和hly-CR、Spc-F和Spc-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带655bp、834bp和1137bp，并分别用1%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE-A 缓冲液 后75℃作用10min，而后加入0.5倍体积 DE-A 缓冲液的DE-B 缓冲液，颠倒混匀，转移液体于微型柱子，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅰ500ul，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅱ750 ul，12000g离心1min，弃液体，重复洗涤 缓冲液Ⅱ洗涤一次，而后空管12000g离心1min，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入60ul 洗脱缓冲液，12000g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的655bp、834bp和1137bp片段，命名为HN、HC和Spc片段；
将EcoR Ⅰ酶切HN和HC片段各3ul（6ng/ul），T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶（350U/ul）各1.0ul，双蒸水2.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜；取HN-HC的过夜连接产物3.5ul（4ng/ul）与pGEM-T 1.0ul（50ng/ul），T4 DNA 2×连接缓冲液 5.0 ul和T4 DNA连接酶0.5ul（350U/ul）一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHⅠ和SphⅠ双酶切，37℃水浴3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条1489bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEM-T-HN-HC重组质粒，胶回收Spc片段4.5ul（3.6ng/ul），与pMD18-T 0.5ul和溶液Ⅰ 4.5ul一同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I单酶切，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，看到一条1137bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-spc重组质粒；
② pMEG-375-HSH重组敲除质粒的构建
pGEM-T-HN-HC重组质粒和pMD18-T-Spc重组质粒分别用EcoRⅠ单酶切，碱性磷酸酶去磷酸化处理，4℃连接，转化Top10感受态细胞，经过EcoRⅠ酶切获得阳性重组质粒pGEM-T-HN-Spc-HC，pGEM-T-HN-Spc-HC与自杀性温敏质粒pMEG375用BamHⅠ和SphⅠ双酶切，各取2ul（7.1ng/ul），与T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶（350U/ul）各1.0ul，双蒸水4.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化sm10感受态细胞，用氯霉素板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pMEG375-HN-Spc-HC，即为获得的阳性基因敲除质粒pHSH；
③ 细菌固相交配
采用固相滤膜杂交方法，分别接种受体菌EHEC O157:H7和含pHSH的供体菌sm10到5mL LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，然后按4:1比例分别取sm10和EHEC O157:H7的过夜培养物，混匀，用滤器过滤，细菌被收集到滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂平板上，滤膜有细菌的一面向上，于37℃培养过夜，然后用生理盐水洗下滤膜上的细菌， 1000倍稀释后，分别涂布于具有链霉素和氯霉素抗性StrepRCmRLB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于StrepRCmR液体LB中增菌，而后对菌液进行O157血清型编码基因rfbE和Spc基因扩增，获得能够同时编码二者的菌落，即rfbE+ Spc +；
④ 氯霉素富集法
接种上述筛选的氯霉素耐药性的杂交株于LB液体培养基中，37℃培养过夜，以体积比2%接种量转接新鲜LB液体培养基中，37℃培养1-2h，加入氯霉素继续培养1-2h，按1mg/mL加入D-环丝氨酸，再迅速置37℃继续培养1-2h，8000r/min离心收集菌体，用生理盐水洗一次，100倍稀释后涂布于含有100ug/ml Spc的10%蔗糖平板上，30℃培养16-20h，长出的菌落分别接种含氯霉素的LB平板及普通LB平板，筛选氯霉素敏感株；
⑤ EHEC O157:H7（△hly）的筛选和获得
氯霉素敏感单菌落培养物离心收集菌体，重悬，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备EHEC O157:H7的模板上清，用Spc-F和Spc-R，设计hly-F和hly-R一对引物：hly-F：5-cacacggagcttataatattctgtca-3 hly-R：5-aatgttatcccattgacatcatttgact-3
分别进行PCR扩增，筛选出重组有Spc基因的EHEC O157:H7，即EHEC O157:H7（△hly）；用全菌多克隆抗血清分别与EHEC O157:H7和EHEC O157:H7（△hly）进行蛋白质免疫印迹检测，经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得Hly缺失的EHEC O157:H7菌株，即EHEC O157:H7（△hly）菌株；
⑥EHEC O157:H7全菌多克隆抗血清制备
EHEC O157:H7 接种LB液体培养基3mL，37℃培养8h，取1mL培养物，离心收集菌体，用生理盐水洗涤2次，10倍稀释后，与等体积福氏完全佐剂进行乳化，皮下多点注射家兔；3周后，与等体积福氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射家兔；2周后，心脏采血，收集血清，即为EHEC O157:H7全菌多克隆抗血清；
（2）EHEC O157:H7（△hly△stx）的构建
① 首先获取stx2A的SN和SC及Gm基因，并串联克隆入pGEM-T载体
根据GenBank登陆的stx2A序列，序列号为NC_007414，设计两对特异性引物，以EHEC O157:H7菌株制备的DNA为模板，分别扩增stx2A基因5’端上游和3’端下游397bp和229bp序列，其中stx2A-NR包括stx2A基因5’端起始3个碱基，stx2A-CF包括stx2A3’端末尾3个碱基：
stx2A-NF：5-aatggatcctacaaatccagcaagggcc-3
stx2A-NR：5-gccgaattccgaaaagtctatcgtaaac-3
stx2A-CF：5-ttagaattcgcggcggattgtgctaaag-3
stx2A-CR：5-cccgcatgccattattaaactgcacttca-3
stx2A-NF和stx2A-CR引物两端分别加限制性酶切位点BamHⅠ和SphⅠ及保护性碱基，stx2A-NR和stx2A-CF引物两端加同样的限制性酶切位点EcoRⅠ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，最后72℃延伸5min，以双蒸水为阴性对照；
根据GeneBank登陆的序列号为AY598466.1的FastbacTM1序列，设计一对特异性引物Gm-F和Gm-R，扩增整个Gm表达盒，811bp；
Gm-F：5-gaattcaccgtggaaacgcatgaag-3
Gm-R：5-gaattcacggcttgaacgaattgtt-3
Gm-F和Gm-R引物两端加限制性酶切位点EcoR Ⅰ，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃ 1 min，56℃ 30s，72℃ 50s，共30个循环，最后72℃延伸5 min，以双蒸水为阴性对照；
Gm-F和Gm-R引物两端加同样的限制性酶切位点EcoRⅠ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.0min，共30个循环，最后72℃延伸7min，以双蒸水和EHEC O157:H7 DNA为阴性对照；
stx2A-NF和stx2A-NR、stx2A-CF和stx2A-CR、Gm-F和Gm-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带397bp、229bp和811bp，并分别用1%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE-A 缓冲液 后75℃作用10min，而后加入0.5倍体积 DE-A 缓冲液的DE-B 缓冲液，颠倒混匀，转移液体于微型柱子，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅰ500ul，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅱ750 ul，12000g离心1min，弃液体，重复洗涤缓冲液Ⅱ洗涤一次，而后空管12000g离心1min，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入60ul 洗脱缓冲液，12000g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的397bp、229bp和811bp片段，命名为SN、SC和Gm片段；
将EcoR Ⅰ酶切SN和SC片段各3ul(4ng/ul)，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶（350U/ul）各1.0 ul，双蒸水2.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜；取SN-SC的过夜连接产物3.5ul(2.7ng/ul)与pGEM-T 1.0ul(50ng/ul)，T4 DNA 2×连接缓冲液 5.0 ul和T4 DNA连接酶0.5ul（350U/ul）一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHⅠ和SphⅠ双酶切，37℃水浴3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条626bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEM-T-SN-SC重组质粒，胶回收Gm片段4.5ul（5ng/ul），与pMD18-T0.5ul(50ng/ul)和溶液 Ⅰ 4.5ul一同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR Ⅰ单酶切，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条811bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pMD18-T-Gm重组质粒；
② pMEG-375-SGS重组敲除质粒的构建
pGEM-T-SN-SC重组质粒和pMD18-T-Gm重组质粒分别用EcoRⅠ单酶切，碱性磷酸酶去磷酸化，4℃连接，转化Top10感受态细胞，经过EcoRⅠ酶切获得阳性重组质粒pGEM-T-SN-Gm-SC，pGEM-T- SN-Gm-SC与自杀性温敏质粒pMEG375用BamHⅠ和SphⅠ双酶切各2ul（11ng/ul），与T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶（350U/ul）各1.0ul，双蒸水4.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化sm10感受态细胞，用氯霉素板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pMEG375- SN-Gm-SC，即为获得的阳性基因敲除质粒pSGS；
③ 细菌固相交配
采用固相滤膜杂交方法，分别接种受体菌EHEC O157:H7（△hly）和含pSGS的供体菌sm10到5mL LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，然后按体积比4:1比例分别取含pSGS的sm10和EHEC O157:H7（△hly）的过夜培养物，混匀，用滤器过滤，细菌被收集到滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂平板上，滤膜有细菌的一面向上，于37℃培养过夜，然后用生理盐水洗下滤膜上的细菌进行1000倍稀释后，分别涂布于具有链霉素和氯霉素抗性StrepRCmRLB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于StrepRCmR液体LB中增菌，而后对菌液进行O157血清型编码基因rfbE和Gm基因扩增，获得能够同时编码二者的菌落，即rfbE+ Gm+；
④ 氯霉素富集法
接种上述筛选的氯霉素耐药性的杂交株于LB液体培养基中，37℃培养过夜，以2%接种量转接新鲜LB液体培养基中，37℃培养1-2h，加入氯霉素继续培养1-2h，按1mg/mL加入D-环丝氨酸 ，再迅速置37℃继续培养1-2h，8000r/min离心收集菌体，用生理盐水洗一次， 100倍稀释后，涂布于含有50ug/ml Gm的10%蔗糖平板上，30℃培养16-20h，长出的菌落分别接种含氯霉素的LB平板及普通LB平板，筛选氯霉素敏感株；
⑤ EHEC O157:H7（△hly△stx2A）的筛选和获得
氯霉素敏感单菌落培养物离心收集菌体，重悬，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备EHEC O157:H7的模板上清，用Gm-F和Gm-R，设计stx2A-F和stx2A-R一对引物：stx2A-F：5-gcgttaatggagttcagtggt-3stx2A-R：5-cttaactcctttatttacccgttgt-3
分别进行PCR扩增，筛选出重组有Gm基因的EHEC O157:H7，即EHEC O157:H7（△hly△stx2A）；用全菌多克隆抗血清分别与EHEC O157:H7（△hly）和EHEC O157:H7（△hly△stx2A）进行蛋白质免疫印迹检测，经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得Hly和Stx2A缺失的EHEC O157:H7菌株，即EHEC O157:H7（△hly△stx2A）菌株；
（3）EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）的构建
①首先获取toxB的BN和BC及Kan基因，并串联克隆入pET32载体
根据GenBank登陆的toxB序列，序列号为NC_007414，设计两对特异性引物，以EHEC O157:H7菌株制备的DNA为模板，分别扩增toxB基因5’端上游和3’端下游831bp和863bp序列，其中toxB-NR为toxB基因5′端上游36-54个碱基，toxB-CF为toxB基因3′端下游32-50个碱基；
toxB-NF：5-ttaggatccatccatcaggcgttgtgc-3
toxB-NR：5-ggggaattctttgattagcgacaacct-3
toxB-CF：5-gccgtcgactaatcttacccagcatca-3
toxB-CR：5-attgcggccgcgagttatcagcccgtcat-3
toxB-NF、toxB-NR、toxB-CF和toxB-CR引物两端分别加限制性酶切位点BamH Ⅰ、 EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ和Not Ⅰ和及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃ 1 min，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，最后72℃延伸5 min，以双蒸水为阴性对照；
根据GeneBank登陆的序列号为EF442785.1的pET28序列，设计一对特异性引物Kan-F和Kan-R，扩增整个Kan表达盒，1192bp；
Kan-F：5-ccggaattcacggctacactagaaggac-3
Kan-R：5- agagtcgacaaatgtgcgcggaaccccta-3
Kan-F和Kan-R引物两端加限制性酶切位点EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃ 1 min，56℃ 30s，72℃ 1.2 min，共30个循环，最后72℃延伸7 min，以双蒸水为阴性对照；
toxB-NF和toxB-NR、toxB-CF和toxB-CR、Kan-F和Kan-R三对引物扩增获得相应大小的目的条带831bp、863bp和1192bp，并分别用1%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE-A 缓冲液 后75℃作用10min，而后加入0.5倍体积 DE-A 缓冲液的DE-B 缓冲液，颠倒混匀，转移液体于微型柱子，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅰ500ul，并12000g离心1min，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅱ750 ul，12000g离心1min，弃液体，重复洗涤缓冲液Ⅱ洗涤一次，而后空管12000g离心1min，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入60ul 洗脱缓冲液，12000g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的831bp、863bp和1192bp片段，命名为BN、BC和Kan片段；
将BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切BN片段3ul(9.6ng/ul)和pET32a载体4ul(10ng/ul)，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶(350U/ul)各1.0ul，双蒸水1.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，37℃水浴3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条831bp的条带出现，获得pET32a-BN重组质粒，而后将EcoRⅠ和Sal Ⅰ酶切的Kan与pET32a-BN重组质粒连接，获得pET32a-BN-Kan，最后将Sal Ⅰ和Not Ⅰ酶切的BC与pET32a-BN-Kan重组质粒连接，获得pET32a-BN-Kan-BC，转化Top10感受态细胞，37℃培养16h，挑取平板单菌落进行鉴定。将鉴定阳性的重组质粒和pMEG375载体分别用BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切后，4℃连接过夜，转化感受态细胞 sm10，用氯霉素板筛选，获得阳性重组质粒，命名为pMEG375-BN-Kan-BC，即为获得的阳性基因敲除质粒pBKB；
② 细菌固相交配
采用固相滤膜杂交方法，分别接种受体菌EHEC O157:H7（△hly△stx）和含pBKB的供体菌sm10到5mL LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，然后按4:1比例分别取含pBKB的sm10和EHEC O157:H7（△hly△stx）的过夜培养物，混匀，用滤器过滤，细菌被收集到滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂平板上，滤膜有细菌的一面向上，于37℃培养过夜，然后用生理盐水洗下滤膜上的细菌，1000倍稀释后，分别涂布于具有链霉素和氯霉素抗性StrepRCmRLB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于StrepRCmR液体LB中增菌，而后对菌液进行O157血清型编码基因rfbE和Kan基因扩增，获得能够同时编码二者的菌落，即rfbE+ Kan+；
③ 氯霉素富集法
接种上述筛选的氯霉素耐药性的杂交株于LB液体培养基中，37℃培养过夜，以2%接种量转接新鲜LB液体培养基中，37℃培养1-2h，加入氯霉素继续培养1-2h，按1mg/mL加入D-环丝氨酸 ，再迅速置37℃继续培养1-2h，8000r/min离心收集菌体，用生理盐水洗一次，100倍稀释后，涂布于含有100ug/ml 卡那霉素10%蔗糖平板上，30℃培养16-20h，长出的菌落分别接种含氯霉素的LB平板及普通LB平板，筛选氯霉素敏感株；
④ EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）的筛选和获得
氯霉素敏感单菌落培养物离心收集菌体，重悬，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备EHEC O157:H7的模板上清，用Kan-F和Kan-R，设计toxB-F和toxB-R一对引物：toxB-F：5-aattcaatggaattatcagaat-3 toxB-R：5-taaacgattttctacctctgg-3
分别进行PCR扩增，筛选出重组有Kan基因的EHEC O157:H7，即EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）；用全菌多克隆抗血清分别与EHEC O157:H7（△hly△stx2A）和EHEC O157:H7（△hly△stx2A△toxB）进行蛋白质免疫印迹检测，经过基因水平和蛋白水平的鉴定，成功获得Hly、Stx和ToxB缺失的EHEC O157:H7菌株，即EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）菌株。
、EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）的培养特性研究，如下所述：
EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB） 单菌落接种于5ml LB培养液中，过夜培养。而后取16h培养物以1％的比例（约1.5×109CFU）再次接种于100ml的新鲜LB中，培养30h，分别于2h，4h，6h，8h，10h，12h，16h，20h，24h和30h取1ml菌液测定OD600，以监测细菌的生长曲线（图5）。EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）与亲本株EHEC O157:H7生长速度和细菌浓度没有明显差异。
、EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）的细胞粘附能力研究，如下所述：
EHEC O157:H7预先接种于3mL LB培养基（含NaI 150 mg/L）中，于37℃振荡培养16-20h。取该适量培养物加到细胞粘附培养液（1%D-甘露糖、不含抗生素的DMEM细胞培养液）中，调节细菌数为2×107 CFU·mL-1，37℃静止培养30min。将上述处理的EHEC O157:H7细菌培养液1ml加入到含有HEp-2细胞的24孔板中，37℃、5%CO2条件下孵育2h后，吸出培养液，弃去，用Hank′s液洗涤1次，加入新的无菌DMEM培养液，再次孵育2h后，弃液，用Hank′s液洗涤4次，每次洗涤要动作轻。用胰酶消化细胞15min，进行适当稀释后涂布于麦康凯培养板上，计算粘附的菌数，求三个重复的平均值和标准差。EHEC O157:H7（△hly△stxΔtoxB）相比亲本株EHEC O157:H7对HEp-2细胞的粘附能力有着明显的降低（P=0.0002）（图6）。
、EHEC O157:H7（△hly△stx△toxB）对小鼠的致病性研究，如下所述：
40只Balb/C小鼠，随机分成2个大组。Ⅰ组接种EHEC O157:H7亲本株；Ⅱ组接种EHEC O157:H7缺失株（△hly△stx△toxB），两组分别设置1010CFU/只、109 CFU/只、108 CFU/只和107CFU/只四个梯度。选取攻毒剂量为109 CFU/只的小鼠，从粪便中检测带菌和排菌。攻毒前所有小鼠均给予5g/L链霉素溶液饮用3d，3d后粪检肠道排菌少于103 CFU/g，灌胃攻菌后全部给予0.5g/L的链霉素溶液饮用。以排除肠道正常菌群，为EHEC O157:H7在小鼠体内驯化一个定居和生长的环境，在肠道中成为优势菌群，增加小鼠的易感性。并在攻毒前断水断食12h，攻毒后6h恢复饮水饮食，防止攻毒后细菌快速排出动物肠道，延长在其体内作用时间。
EHEC O157:H7（△hly△stxΔtoxB）缺失株对小鼠致死能力有一定减弱（表1），在小鼠体内定植的能力有较为明显的降低，排菌量少，排菌时间缩短（图7）。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 肠出血性大肠杆菌O157:H7三基因缺失菌株
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taaacgattt tctacctctg g 21
Claims (1)
1.肠出血性大肠杆菌O157:H7三基因缺失菌株，其特征在于，所说的肠出血性大肠杆菌O157:H7三基因缺失菌株为肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7细菌缺失hly的整个A基因，stx2的整个A基因，以及toxB整个基因。
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| 张雪寒 等.出血性大肠杆菌O157∶ H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究.《华北农学报》.2010,第24卷(第4期),全文. |
| 潘劲草 等.肠出血性大肠埃希菌O157毒力因子研究进展.《预防医学情报杂志》.2000,第16卷(第2期),全文. |
| 肠出血性大肠埃希菌O157毒力因子研究进展;潘劲草 等;《预防医学情报杂志》;20001231;第16卷(第2期);全文 * |
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