CN102204946B - 从半边莲中提取的半边莲多糖及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的涉及从半边莲中提取的半边莲多糖及其应用，其解决的技术方案是：取半边莲药材，加水，水浴提取2～3次，过滤，合并滤液，浓缩至药材重量体积的1-2倍，再加入质量浓度为90%以上的乙醇至含醇量达到80%，静置12～24h，离心得多糖沉淀物，该沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚作洗涤液进行洗涤，每1-5g沉淀物，无水乙醇、丙酮、乙醚用量均为80-150ml，对洗涤后的沉淀物进行干燥，得米白色、粉末状的半边莲多糖，有效用于制备增强人体免疫功能的药物，实现半边莲在制备增强人体免疫功能的药物中的应用，开辟半边莲药材的应用新前景，本发明半边莲提取物还可用于制备保健品，实现半边莲在制备保健品中的应用，有巨大的社会、经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种从半边莲中提取的半边莲多糖及其应用。
背景技术
随着对中药综合研究的深入，原生药中的活性成分被分别提取、开发出来并逐见成效，为天然药物化学的发展注入生机，其中多糖类成分就是极其重要的一部分。近年来，各国学者对多糖的研究发展很快，已由最初仅对菌类多糖探讨发展到对高等植物多科属、多组织、多器官的研究。其中以其促进和恢复机体的免疫功能的研究尤为突出。研究表明，多糖作为一种免疫促进和调节剂，是许多天然药物的主要免疫活性物质，普遍具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老且对正常细胞无毒副作用的优点，因而基于各种药用植物中多糖类成分活性的报道屡见不鲜。
半边莲始载于《滇南本草》，后李时珍在《本草纲目》中亦有记载[1]，具有清热解毒，利尿消肿之功效。临床主要用于治疗面足浮肿，痈肿疔疮，蛇虫咬伤，晚期血吸虫病腹水[2]等症。目前，对于中药半边莲的研究仍止步于其所含生物碱、黄酮甙、皂甙及氨基酸成分，对其含量丰富的多糖类成分的提取分离以及增强人体免疫功能未见公开报道。
发明内容
基于上述情况，为进一步开发半边莲药材的药用、经济价值，填补这方面的研究空白，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就是提供一种从半边莲中提取的半边莲多糖及其应用。
本发明解决的技术方案是：取半边莲药材，按药材重量计，加入药材重量20-40倍的水，70～90℃水浴提取2～3次，每次1～3h，过滤，合并滤液，浓缩至药材重量体积的1-2倍，得多糖浓缩液，重量体积是指固体药材以g计，液体水以ml计（重量体积表示为：W/V），再加入质量浓度为90%以上的乙醇至含醇量达到80%，静置12～24h，离心得多糖沉淀物，该沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚作洗涤液进行洗涤，每1-5g沉淀物，无水乙醇、丙酮、乙醚用量均为80-150ml，对洗涤后的沉淀物进行干燥，得米白色、粉末状的半边莲多糖，有效用于制备增强人体免疫功能的药物，实现半边莲在制备增强人体免疫功能的药物中的应用，开辟半边莲药材的应用新前景。本发明半边莲提取物还可用于制备保健品，实现半边莲在制备保健品中的应用，有巨大的社会、经济效益。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
按上述发明内容给出，将半边莲药材粉碎成半边莲药材粉末，取半边莲药材粉末，按药材粉末与水，料液重量体积比1:20-40的比例,在药材粉末中加入水，搅匀；70～90℃水浴提取1～3次，每次1～3h，过滤；合并滤液，浓缩滤液至半边莲药樯重量体积的1-2倍，得多糖浓缩液；在多糖浓缩液中缓慢加入质量浓度为90%以上的乙醇并充分搅拌，直至含醇量达到80%，密封，4℃冷藏静置；12～24h后离心得多糖沉淀物，所述沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，洗涤1～5g沉淀物无水乙醇、丙酮、乙醚用量均为80ml～150ml，至离心上清液澄清透明，达到除去部分杂质，对洗涤后的沉淀物进行干燥，得米白色、粉末状半边莲多糖，多糖得率为20.28%～22.78%，经苯酚-硫酸法（常规测定方法，是公知技术）测定糖含量为72.78%～77.41%。
所述半边莲药材粉末是指粉碎后过2号药典筛的粉末。
下面通过实施例来对本发明作进一步描述。
实施例1
将半边莲药材粉碎成半边莲药材粉末，取半边莲药材粉末，按药材粉末与水料液重量体积比1:20的比例，在药材粉末中加入水，搅匀；70℃水浴提取3次，每次1h，过滤；合并滤液，浓缩滤液至半边莲药樯重量体积的1倍，得多糖浓缩液；在多糖浓缩液中缓慢加入质量浓度为90%乙醇并充分搅拌，直至含醇量达到80%，密封，4℃冷藏静置；12h后离心得多糖沉淀物，所述沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，洗涤1g沉淀物无水乙醇、丙酮、乙醚用量均为80ml，至离心上清液澄清透明，达到除去部分杂质，对洗涤后的沉淀物进行干燥，得米白色、粉末状半边莲多糖，多糖得率为21.38%，经苯酚-硫酸法测定糖含量为75.23%。
实施例2
将半边莲药材粉碎成半边莲药材粉末，取半边莲药材粉末，按药材粉末与水料液重量体积比1:30的比例，在药材粉末中加入水，搅匀；80℃水浴提取2次，每次1.5h，过滤；合并滤液，浓缩滤液至半边莲药樯重量体积的1.5倍，得多糖浓缩液；在多糖浓缩液中缓慢加入质量浓度为95%乙醇并充分搅拌，直至含醇量达到80%，密封，4℃冷藏静置；24h后离心得多糖沉淀物，所述沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，洗涤3g沉淀物无水乙醇、丙酮、乙醚用量均为100ml，至离心上清液澄清透明，达到除去部分杂质，对洗涤后的沉淀物进行干燥，得米白色、粉末状半边莲多糖，多糖得率为22.01%，经苯酚-硫酸法测定糖含量为74.57%。
实施例3
将半边莲药材粉碎成半边莲药材粉末，取半边莲药材粉末，按药材粉末与水料液重量体积比1:40的比例，在药材粉末中加入水，搅匀；90℃水浴提取3次，每次3h，过滤；合并滤液，浓缩滤液至半边莲药樯重量体积的2倍，得多糖浓缩液；在多糖浓缩液中缓慢加入质量浓度为95%乙醇并充分搅拌，直至含醇量达到80%，密封，4℃冷藏静置；20h后离心得多糖沉淀物，所述沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，洗涤5g沉淀物无水乙醇、丙酮、乙醚用量均为150ml，至离心上清液澄清透明，达到除去部分杂质，对洗涤后的沉淀物进行干燥，得米白色、粉末状半边莲多糖，多糖得率为22.32%，经苯酚-硫酸法测定糖含量为76.26%。
上述仅是给出的几个实施例，在研制中，发明人经反复多次，每次至少重复3次，均取得了相同或相近似的结果，提取物稳定，方法可靠，并对提取物进行反复的试验均取得了满意的技术效果，充分表明半边莲多糖具有增强免疫的作用，已经为动物实验充分证明，具体实验情况如下：
一.试验材料
1. 试验动物：18～22g昆明种清洁剂小鼠，雌雄各半。由河北省实验动物中心提供。
2. 实验试药：半边莲多糖，瑞士染液，香菇多糖（湖北广仁药业有限公司），环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），枸橼酸钠，氯化钙，氯化钠，酒石酸钾钠，氯化钾，葡萄糖，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，酚红。
二.试验方法
1.半边莲多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的半边莲多糖水溶液（10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g），香菇多糖混悬液（5mg/ml；0.2ml/10g）及同体积的生理盐水（0.2ml/10g）。每天给药1次，连续给药7天。于7天早上各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml。于第7天灌胃给药后2h，注射5%鸡红细胞4h后，脱颈椎处死小鼠，腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部；然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干；显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表1 腹腔巨噬细胞吞噬功能结果（±s）
| 组别 | 动物数（只） | 剂量（g/kg） | 吞噬百分率（%） | 吞噬指数 |
| 空白对照组 | 10 | 31.0±4.0 | 0.323±0.005 | |
| 香菇多糖组 | 10 | 0.1 | 54.7±7.4** | 0.614±0.004** |
| 小剂量多糖组 | 10 | 0.2 | 62.1±5.9** | 0.711±0.007** |
| 中剂量多糖组 | 10 | 0.4 | 58.5±5.4** | 0.692±0.009** |
| 大剂量多糖组 | 10 | 0.8 | 50.1±4.9* | 0.578±0.010* |
**表示与空白组比P<0.01，*表示与空白组比P<0.05
从表1可以看出，与空白对照组比，大剂量组可提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率，可提高腹腔巨噬细胞的吞噬指数（P<0.05）；小、中剂量组及香菇多糖组均能显著提高吞噬百分率及吞噬指数（P<0.01），其中尤以小剂量半边莲多糖组作用为最强。
2.半边莲多糖对正常小鼠溶血素形成的影响
取小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的半边莲多糖水溶液（10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g），香菇多糖混悬液（5mg/ml；0.2ml/10g）及同体积的生理盐水（0.2ml/10g）。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5%鸡红细胞混悬液0.5ml、10%补体0.5ml（豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h）混匀，37℃孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-2201型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。
3.半边莲多糖对正常小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的半边莲多糖水溶液（10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g），香菇多糖混悬液（5mg/ml；0.2ml/10g）及同体积的生理盐水（0.2ml/10g）。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组两个小鼠脾脏为一例；匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2%鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2201型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。
表2 溶血素、溶血空斑形成结果（±s）
| 组别 | 动物数（只） | 剂量(g/kg) | 溶血素形成 | 例数 | 溶血空斑形成 |
| 空白对照组 | 10 | 0.5366±0.0004 | 5 | 0.5874±0.0294 | |
| 香菇多糖组 | 10 | 0.1 | 0.719±0.003** | 5 | 0.6628±0.0222* |
| 小剂量多糖组 | 10 | 0.2 | 0.744±0.0007** | 5 | 0.7093±0.02008** |
| 中剂量多糖组 | 10 | 0.4 | 0.731±0.001* | 5 | 0.6873±0.01794* |
| 大剂量多糖组 | 10 | 0.8 | 0.705±0.0006* | 5 | 0.6537±0.02308* |
**表示与空白组比P<0.01，*表示与空白组比P<0.05
从表2可以看出，与空白对照组比，中、大剂量组溶血空斑均升高（P<0.05），小剂量组和香菇多糖组溶血素和溶血空斑均显著提高（P<0.01）。其中尤以小剂量半边莲多糖组作用为最优。
4.半边莲多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠60只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组（剂量为8 mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射），模型组建立完成后，分别灌服半边莲多糖水溶液（5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g），香菇多糖混悬液（5mg/ml，0.2ml/10g）及同体积的生理盐水（0.2ml/10g）。每天给药1次，连续给药7天。于给药最后一天早上各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用移液枪吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表3 腹腔巨噬细胞吞噬功能结果（±s）
| 组别 | 动物数（只） | 剂量（g/kg） | 吞噬百分率（%） | 吞噬指数 |
| 空白对照组 | 10 | 50.3±2.0 | 0.523±0.007 | |
| 模型组 | 10 | 31.7±9.3 | 0.323±0.002 | |
| 香菇多糖组 | 10 | 0.1 | 56.3±7.4** | 0.571±0.011** |
| 5mg/ml半边莲多糖组 | 10 | 0.1 | 61.5±3.2** | 0.632±0.009** |
| 10mg/ml半边莲多糖组 | 10 | 0.2 | 59.1±2.8** | 0.618±0.004** |
| 20mg/ml半边莲多糖组 | 10 | 0.4 | 57.2±4.1** | 0.601±0.005** |
**表示与模型组比P<0.01
从表3可以看出，与空白组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低（P<0.01），说明造模成功。与模型组相比，大剂量多糖组和香菇多糖组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率（P<0.01）。
5.半边莲多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血素形成的影响
取小鼠60只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组（剂量为8 mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射）；模型组建立完成后，各组小鼠（含空白组）均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服半边莲多糖水溶液（5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g）、香菇多糖混悬液（5mg/ml，0.2ml/10g）及同体积的生理盐水（0.2ml/10g），每天给药1次，连续给药7天。最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清；以生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5%鸡红细胞混悬液0.5ml、10%补体0.5ml（豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h）混匀；37℃孵育30min，冰水中终止反应，另设不加补体的空白管作对照；吸取各管上清液于UV-2201型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。
6.半边莲多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠60只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组（剂量为8 mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射）；模型组建立完成后，各组小鼠（含空白组）均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服半边莲多糖水溶液（5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g）、香菇多糖混悬液（5mg/ml，0.2ml/10g）及同体积的生理盐水（0.2ml/10g），每天给药1次，连续给药7天。于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组中两个小鼠脾脏为一例，匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2%鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2201型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。
表4 溶血素、溶血空斑形成结果（±s）
| 组别 | 动物数（只） | 剂量(g/kg) | 溶血素形成 | 例数 | 溶血空斑形成 |
| 空白对照组 | 10 | 0.552±0.013 | 5 | 0.573±0.021 | |
| 模型组 | 10 | 0.401±0.0087 | 5 | 0.408±0.019 | |
| 香菇多糖组 | 10 | 0.1 | 0.656±0.0064** | 5 | 0.639±0.014** |
| 5mg/ml半边莲组 | 10 | 0.1 | 0.727±0.0037** | 5 | 0.7041±0.0103** |
| 10mg/ml半边莲组 | 10 | 0.2 | 0.680±0.0018** | 5 | 0.6404±0.0115** |
| 20mg/ml半边莲组 | 10 | 0.4 | 0.653±0.0036** | 5 | 0.6241±0.0213** |
**表示与模型组比P<0.01
从上表可看出，与空白对照组比，模型组溶血素和溶血空斑均显著降低（P<0.01），说明造免疫抑制模型成功。与模型组比，各个剂量半边莲多糖组及香菇多糖组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成（P<0.01）。其中，尤以0.1 g/kg剂量半边莲多糖组为最佳。
经动物实验验证，本发明中提取的半边莲多糖类成分具有很好的增强机体免疫力的作用，完全具备开发为保健类食品和免疫增强药的潜力及实际推广价值，该类成分可用于由营养不全、生活无序、过度疲劳、肿瘤病人放化疗等多种原因导致的免疫力低下的症状。开发研究半边莲多糖不仅可拓宽中药半边莲应用的新前景，更是紧随时代步伐对中医药的创造性贡献，具有巨大的经济及社会效益。
Claims (2)
1.一种从半边莲中提取的半边莲多糖在制备增强免疫功能药物中的应用。
2.一种从半边莲中提取的半边莲多糖在制备增强免疫功能保健品中的应用。
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