CN102199613A - 感染性丙型肝炎病毒高生产hcv突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供在细胞培养系统中显示出病毒高生产能的HCV株。本发明提供核酸，该核酸编码包含1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，上述前体多聚蛋白中至少第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。

Description

感染性丙型肝炎病毒高生产HCV突变体及其应用

技术领域

本发明涉及感染性丙型肝炎病毒高生产HCV突变体、其基因组核酸和导入有其基因组核酸的细胞。本发明还涉及生产感染性HCV颗粒的方法、抗HCV药物的筛选方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus；HCV)于1989年由Choo等人发现并确定为非甲非乙型肝炎的病因病毒(非专利文献1)。在感染HCV形成慢性肝炎后，HCV仍持续感染向肝硬化、甚至肝癌转变。据报道，全球有约1亿7千万HCV感染者，日本就存在约200万HCV感染者。HCV的主要感染途径为血液感染。自从可以进行输血用血液的筛选后，新的感染者锐减，但仍然存在许多病毒携带者(virus carrier)。

目前，慢性丙型肝炎的治疗方法主要是给予PEG化干扰素、或者将PEG化干扰素与抗病毒药利巴韦林结合使用。迄今为止，人们将HCV分为6个基因型，在日本主要是基因型1b和2a的HCV感染病例。特别是基因型1b的HCV，其现实状况是：通过给予干扰素和利巴韦林并不能将病毒从体内完全去除、治疗效果并不充分(非专利文献2和3)。因此，人们希望开发以预防丙型肝炎发病或消除HCV病毒为目的的、新的抗病毒药或疫苗。

病毒疫苗的种类有：使用病毒蛋白作为抗原的成分疫苗、使用病毒颗粒作为抗原的疫苗、以及使用编码病毒蛋白的基因作为抗原的DNA疫苗。以病毒颗粒作为抗原的疫苗有：减毒活疫苗和灭活疫苗。制造以病毒颗粒作为抗原的疫苗时，必需有制造高纯度的病毒颗粒的系统，在该系统中必需有病毒颗粒的高生产培养系统。

丙型肝炎病毒(HCV)是具有约9.6kb+链的单链RNA作为基因组的病毒。HCV的单链RNA基因组编码包含10种蛋白(核心蛋白、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的单根多聚蛋白(前体多聚蛋白(polyprotein precursor))。由HCV RNA基因组翻译的前体多聚蛋白被切成各个蛋白，发挥病毒蛋白的功能。

有人开发了利用培养细胞系统自主复制HCV RNA的复制子系统，并在多种HCV研究中使用。典型的亚基因组复制子为：将HCV基因组的结构蛋白区重组到耐药基因等标记基因中、并在其下游插入有EMCV(脑心肌炎病毒)的IRES的复制子。在导入有该亚基因组复制子RNA的培养细胞内确认到HCV RNA的复制(专利文献1)。通过研究HCV亚基因组复制子的复制，表明HCV基因组的遗传突变有时会显示出提高复制子的复制效率的效果，这种遗传突变被称作适应性突变(adaptive mutation)(专利文献1)。

有资料显示：来自基因型1b的Con1株的亚基因组复制子pFK-I389neo/NS3-39/wt(Con1/wt)的突变体、即在NS3-NS5A区具有适应性突变的NK5.1株(Con1/NK5.1)与野生型Con1/wt相比具有约10倍的增殖能力(非专利文献4)。另一方面，在分析具有来自JFH1的亚基因组复制子的复制子复制细胞中所含的复制子的核苷酸序列的论文(非专利文献5)中记载着：6个克隆中，有5个克隆虽然在各自的来自HCV基因组的区中确认到若干个突变，但在这些突变中并没有确认到共同的突变，而剩下的1个克隆是没有发生氨基酸突变的碱基突变，这表明：尽管JFH1株在Huh7细胞中没有适应性突变，但仍可增殖。

关于细胞培养系统中的HCV生产，Wakita等人研究表明：将从重症肝炎患者中分离的、属于基因型2a的来自HCV株JFH1的全长基因组HCV复制子导入Huh-7细胞中，可以生产感染性HCV颗粒(专利文献2和3、以及非专利文献6)。另外，Kaul等人报道了：JFH1株的NS5A蛋白的突变会带来较野生型JFH1株高约10倍的病毒生产量(非专利文献7)。

有报道称：在细胞培养系统中HCV JFH1株病毒的病毒颗粒生产能力为4.6×10⁴FFU/mL(非专利文献8)，这与所报道的、在细胞培养系统中流感病毒的病毒颗粒生产能力为约4×10⁹PFU/mL(非专利文献9)相比是非常低的。为了制造使用HCV颗粒作为抗原的疫苗，人们要求开发病毒颗粒生产能力更高的HCV株。

专利文献1：国际公开WO2004/104198

专利文献2：国际公开WO2005/080575

专利文献3：国际公开WO2006/22422

非专利文献1：Choo等人，Science(1989)244(4902)第359-362页

非专利文献2：Fried等人，N.Engl.J.Med.(2002)第347卷，No.13第975-982页

非专利文献3：Lusida等人，J.Clin.Microbiol.(2001)39(11)第3858-3864页

非专利文献4：Krieger等人，J.Virol.(2001)70：4614-4624

非专利文献5：Kato等人，Gastroenterology(2003)125：1808-1817

非专利文献6：Wakita等人，Nat Med.(2005)11(7)第791-796页

非专利文献7：Kaul等人，J.Virol.(2007)81(23)第13168-13179页

非专利文献8：Zhong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2005)102(26)第9294-9299页

非专利文献9：Tree等人，Vaccine(2001)19(25-26)第3444-3450页

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供：在细胞培养系统中显示出病毒高生产能的HCV株。

解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现：若干个氨基酸突变会显著提高JFH1株的病毒生产能力，从而完成了本发明。

即，本发明包含下述[1]～[14]。

[1]核酸，该核酸编码包含1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，上述前体多聚蛋白中至少第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。

[2]上述[1]所述的核酸，其中，上述前体多聚蛋白为选自下述(a)～(f)的前体多聚蛋白。

(a)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第297位的酪氨酸被取代成组氨酸、第330位的丙氨酸被取代成苏氨酸、第395位的丝氨酸被取代成脯氨酸、第417位的天冬酰胺被取代成丝氨酸、第483位的天冬氨酸被取代成甘氨酸、第501位的丙氨酸被取代成苏氨酸、第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸、第931位的谷氨酰胺被取代成精氨酸、以及第961位的丝氨酸被取代成丙氨酸；

(b)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；

(c)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；

(d)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；

(e)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；

(f)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，仅第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。

[3]上述[2]所述的核酸，该核酸包含序列表的SEQ ID NO：3、SEQID NO：4或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

[4]上述[1]或[2]所述的核酸，其中，编码报道蛋白的核酸被插入在编码上述前体多聚蛋白的NS5A蛋白的区内。

[5]上述[4]所述的核酸，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，上述报道蛋白被整合到第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间，作为融合蛋白被翻译。

[6]上述[5]所述的核酸，该核酸包含序列表的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

[7]丙型肝炎病毒颗粒，该病毒颗粒包含上述[1]或[2]所述的核酸。

[8]培养细胞，该培养细胞生产上述[7]所述的丙型肝炎病毒颗粒。

[9]丙型肝炎病毒疫苗，该疫苗是将上述[7]所述的丙型肝炎病毒颗粒灭活而得到的。

本发明还包含以下发明。

[10]丙型肝炎病毒颗粒，该病毒颗粒包含上述[4]所述的核酸。

[11]培养细胞，该培养细胞生产上述[10]所述的丙型肝炎病毒颗粒。

[12]载体，该载体包含上述[1]～[6]中任一项所述的核酸。

[13]筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：在受检物质的存在下，培养生产包含上述[4]或[5]所述的核酸的丙型肝炎病毒颗粒的培养细胞的步骤；以及检测所得培养物中的上述报道蛋白，当上述报道蛋白的表达量低时，判定为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性的步骤。

[14]抗丙型肝炎病毒抗体，该抗体将上述[7]所述的丙型肝炎病毒颗粒识别为抗原。

发明效果

通过本发明，能够提供感染性HCV颗粒的高产生株。通过使用该感染性HCV颗粒的高产生株，可以提供高HCV产生系统。

附图说明

图1显示为了获得JFH1适应突变体而进行的实验流程。图中，“C”表示编码核心(core)蛋白的区、“E1”表示编码E1蛋白的区、“E2”表示编码E2蛋白的区、“p7”表示编码p7蛋白的区、“2”表示编码NS2蛋白的区、“3”表示编码NS3蛋白的区、“4A”表示编码NS4A蛋白的区、“4B”表示编码NS4B蛋白的区、“5A”表示编码NS5A蛋白的区、“5B”表示编码NS5B蛋白的区，另外，与C(核心)相邻的5’末端部分表示5非翻译区，与5B(NS5B)相邻的3’末端部分表示3’非翻译区(图9、10和15中亦同)。

图2显示将JFH1病毒感染细胞继代培养2年而得到的JFH1适应突变体(JFH1a)的复制能力。

图3显示JFH1a与JFH1wt的性状比较。纵轴为与未添加IFN的对照进行比较的相对复制率(relative replication)(％)。“o”为JFH1wt的数据，“■”为JFH1a的数据。

图4显示通过解析6个克隆的序列发现的JFH1a中的氨基酸突变。

图4中，在6个克隆中的2个以上克隆中发现的氨基酸突变上注上“*”。

图5是显示用于解析复制能力和感染性的野生型JFH1wt和HCV突变体的前体多聚蛋白编码区的结构和突变导入位点的概略图。进行了突变解析的区(AgeI-SpeI片段)以灰色显示。突变导入位点以星号显示。

图6显示野生型JFH1wt与突变体的感染性比较结果。WT表示JFH1wt、A/WT表示JFH1-A/WT、B/WT表示JFH1-B/WT、Mut5表示JFH1-mut5(本申请说明书和附图的其他部分亦同)。A：转染后的细胞内核心蛋白量的比较，B：释放到培养上清中的核心蛋白量的比较，C：培养上清的感染滴度的比较，D：比活性(相对比感染滴度。比活性＝(培养上清的感染滴度)/培养上清中的核心蛋白量))的比较。棒图A～C从左到右分别显示24小时后、48小时后、72小时后和96小时后的数据。

图7显示转染后的JFH1wt及其突变体的感染滴度在长期感染系统中的时间变化。*：JFH1a、△：JFH1-B/WT、×：JFH1-Mut5、□：JFH1-A/WT、◇：JFH1wt。

图8是显示JFH1wt和JFH1突变体在细胞感染的72小时后形成的转化灶(フォ一カス，focus)的大小的照片。转化灶的大小表示感染的传播能力。A：JFH1-A/WT，B：JFH1-B/WT，C：JFH1a，D：JFH1-Mut5，E：JFH1wt。

图9显示在JFH1-B/WT的6个位置氨基酸突变中仅1个位置氨基酸突变恢复成野生型氨基酸的6种突变体的前体多聚蛋白编码区的结构图。星号显示保持JFH1-B/WT的氨基酸突变的位点。

图10显示将在JFH1-B/WT的6个位置见到的氨基酸突变各1个导入野生型JFH1wt中的突变体的前体多聚蛋白编码区的结构图。星号显示导入有来自JFH1-B/WT的氨基酸突变的位点。

图11显示图9所示的突变体HCV(克隆)的感染滴度和病毒生产量。A：显示各突变体的培养上清中的感染滴度，这代表感染性的细胞外释放水平。B：显示各突变体的释放到培养上清中的细胞外核心蛋白量。31-、74-、451-、756-、786-、862-、451+、WT、B/WT分别表示31-(A31V)、74-(T74K)、451-(R451G)、756-(A756V)、786-(A786V)、862-(R862Q)、451+(G451R)、JFH1wt和JFH1-B/WT(本申请说明书和附图的其他部分亦同)。

图12显示图10所示的突变体HCV(克隆)的感染滴度和病毒生产量。A：显示各突变体的培养上清中的感染滴度，这表示感染性的细胞外释放水平。B：显示各突变体的释放到培养上清中的细胞外核心蛋白量。31+、74+、451+、756+、786+、862+、WT、B/WT分别表示31+(V31A)、74+(K74T)、451+(G451R)、756+(V756A)、786+(V786A)、862+(Q862R)、JFH1wt和JFH1-B/WT(本申请说明书和附图的其他部分亦同)。

图13显示图9所示的突变体HCV(克隆)在长期培养(长期感染)中其细胞外核心蛋白量和感染滴度随时间的变化。这还显示各克隆在长期感染中的增殖曲线。A：显示各突变体的培养上清中的细胞外核心蛋白量。B：显示各突变体的培养上清中的细胞外感染滴度。

图14显示图10所示的突变体HCV(克隆)在长期培养(长期感染)中其细胞外核心蛋白量和感染滴度随时间的变化。这还显示各克隆在长期感染中的增殖曲线。A：显示各突变体的培养上清中的细胞外核心蛋白量。B：显示各突变体的培养上清中的细胞外感染滴度。

图15显示在全长基因组HCV序列中整合有报道基因的复制子的结构图。报道基因(Rluc)被插入在复制子的前体多聚蛋白编码区(核心～NS5B)内的第2394位氨基酸与第2395位氨基酸之间。

图16显示整合有报道基因的野生型JFH1wt、突变体JFH1-A/WT-Rlu和JFH1-B/WT-Rluc的培养上清中的感染滴度。图中，WT表示JFH1wt，WT-Rluc、A/WT-Rluc和B/WT-Rluc表示分别整合有Rluc基因的JFH1wt、JFH1-A/WT和JFH1-B/WT。

图17显示使JFH-A/WT-Rluc(图17A)和JFH-B/WT-Rluc(图17B)以100FFU、50FFU、25FFU、12FFU、6FFU、3FFU和0FFU感染Huh7.5.1细胞，并于72小时后测定萤光素酶活性的结果、以及检测依赖于病毒量的萤光素酶活性。

图18显示使用JFH1-A/WT-Rluc和JFH1-B/WT-Rluc病毒的培养细胞感染增殖系统研究干扰素的抗HCV作用的结果。纵轴显示由感染滴度算出的感染抑制率(％)。IFN-α的用量(浓度)从左起依次为100U/ml(白棒)、20、4、1、0U/ml。A：通过萤光素酶分析得到的、干扰素存在下的萤光素酶活性(RLU)的抑制率。B：干扰素存在下的感染滴度(FFU/ml)的抑制率。

具体实施方式

本发明人等通过用JFH1株的HCV全长复制子复制系统进行长达2年的培养，从这些培养细胞中筛选病毒颗粒的增殖能力有所提高的适应突变体，发现了JFH1病毒高生产株，并制作了带有表达报道基因的全长HCV基因组的高感染性病毒颗粒，从而完成了本发明。

本发明涉及高产生性HCV JFH1突变体，该HCV JFH1突变体能够从包含HCV的全长基因组序列、持续复制全长基因组序列、并产生感染性病毒的Huh7细胞中分离。

本发明可以采用该领域技术范围内的分子生物学和病毒学的现有技术来实施。上述技术在文献中已作了充分说明。例如参照Sambrook等人、Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory(第3版，2001)和Mahy等人、Virology：a practicalapproach(1985，IRL PRESS)。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，其全部内容均通过引用而援用在本说明书中。

(1)来自HCV JFH1基因组序列的突变体核酸

本发明涉及核酸，该核酸具有HCV JFH1突变体病毒的基因组序列，所述HCV JFH1突变体在其基因组中导入有使其病毒颗粒生产能力显著提高的适应性突变。本发明的核酸优选包含HCV全长基因组序列。

更具体而言，本发明的核酸是编码在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白(优选包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的前体多聚蛋白)中导入有氨基酸突变的前体多聚蛋白的核酸；进一步具体而言，本发明的核酸是编码在前体多聚蛋白的从核心到NS2的区包含1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的核酸。

本发明的核酸所编码的前体多聚蛋白包含HCV的结构蛋白和非结构蛋白。HCV的结构蛋白是指核心、E1、E2和p7，它们构成HCV的病毒颗粒部分。核心是指核心蛋白，E1和E2是包膜蛋白，p7是形成在宿主细胞膜上发挥作用的离子通道的蛋白。HCV的非结构蛋白是指NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它们是具有参与病毒基因组的复制或HCV蛋白加工的活性的酶蛋白。已知HCV中有各种基因型，但已知各种基因型的HCV的基因组具有同样的基因结构(例如可参照图1)。由本发明的核酸编码的前体多聚蛋白优选从N末端到C末端依次包含核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白部分。由本发明的核酸编码的前体多聚蛋白可以进一步包含选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白。

本发明的核酸中所含的全长基因组序列在5’末端包含5’非翻译区、在其3’侧包含前体多聚蛋白编码区、在其3’侧以及3’末端包含3’非翻译区。全长基因组序列可以是从5’侧到3’侧依次包含5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列以及3’非翻译区的序列。

HCV的5’非翻译区(还称作5’UTR或5’NTR)是提供用于蛋白翻译的内部核糖体进入位点(IRES)和复制所必需的元件的、从全长HCV基因组的N末端起约340个核苷酸的区域。

HCV的3’非翻译区(还称作3’UTR或3’NTR)具有辅助HCV复制的功能，除包含polyU区外，还包含约100个核苷酸的附加区(追加領域)。

在本发明中，“复制子RNA”是指具有在细胞内进行自身复制(自主复制)的能力的RNA。由于被导入细胞中的复制子RNA进行自身复制、且其RNA拷贝在细胞分裂后被分配到子细胞中，所以如果使用复制子RNA则可以稳定地导入到细胞中。当本发明的核酸是包含在5’末端含有5’非翻译区、在其3’侧含有前体多聚蛋白编码区、在其3’侧及3’末端含有3’非翻译区的全长基因组序列的RNA(全长基因组RNA)时，本发明的核酸是复制子RNA。

在本发明中，“核酸”中包含RNA和DNA。在本说明书中，“蛋白编码区”、“编码蛋白的序列”是指编码预定蛋白的氨基酸序列、可以包含也可以不包含起始密码子和终止密码子的核苷酸序列。“前体多聚蛋白编码区”、“编码前体多聚蛋白的序列”也同样理解。

本说明书中，在核酸为RNA的情况下，引用序列表的SEQ ID NO来确定RNA的核苷酸序列或碱基时，该SEQ ID NO所示的核苷酸序列中的“T”(胸腺嘧啶)被读作“U”(尿嘧啶)。

本说明书中，“以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时第“Y”位的(氨基酸)”是指在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，以N末端的第1氨基酸(甲硫氨酸)作为第1位时，该氨基酸是位于第“Y”位的氨基酸残基。

本发明中，丙型肝炎病毒的JFH1株是指由Wakita等人从重症肝炎患者中分离的、属于基因型2a的HCV株(例如WO2005/080575)。HCV的“基因型”是指由Simmonds等人按照国际分类进行分类的基因型。丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列优选为由GenBank Accession No.AB047639中公开的全长基因组序列所编码的序列(SEQ ID NO：2)。JFH1株的全长基因组序列优选为GenBankAccession No.AB047639中公开的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

本发明的核酸的优选方式为：编码包含1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的核酸，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，上述1个以上氨基酸取代包含至少一个第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。即，本发明的核酸优选为：编码包含1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的核酸，其特征在于：当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，上述前体多聚蛋白的第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。该核酸更优选：在5’末端包含5’非翻译区、在其3’侧包含前体多聚蛋白编码区、在其3’侧及3’末端包含3’非翻译区。该前体多聚蛋白编码序列可以进一步包含编码选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白的核苷酸序列。

导入到该前体多聚蛋白中的1个以上的氨基酸取代至少包含上述第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸(Q862R)，还优选进一步附加包含下述(1)-(13)中的1个以上的氨基酸取代：

(1)第31位的缬氨酸取代成丙氨酸(V31A)、

(2)第74位的赖氨酸取代成苏氨酸(K47T)、

(3)第297位的酪氨酸取代成组氨酸(Y297H)、

(4)第330位的丙氨酸取代成苏氨酸(A330T)、

(5)第395位的丝氨酸取代成脯氨酸(S395P)、

(6)第417位的天冬酰胺取代成丝氨酸(N417S)、

(7)第451位的甘氨酸取代成精氨酸(G451R)、

(8)第483位的天冬氨酸取代成甘氨酸(D483G)、

(9)第501位的丙氨酸取代成苏氨酸(A501T)、

(10)第756位的缬氨酸取代成丙氨酸(V756A)、

(11)第786位的缬氨酸取代成丙氨酸(V786A)、

(12)第931位的谷氨酰胺取代成精氨酸(Q931R)、以及

(13)第961位的丝氨酸取代成丙氨酸(S961A)。

在本说明书中，例如氨基酸突变Q862R是指第862位的氨基酸残基从Q(谷氨酰胺)取代成R(精氨酸)的突变。其他表示氨基酸突变的书写也同样理解。需要说明的是，其中，氨基酸按照生物学领域中通常使用的氨基酸的单字母符号(Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual Second Edition，1989)来记载。

在本说明书中，氨基酸或氨基酸残基以生物学领域通常使用的氨基酸的单字母符号或三字母符号来记载，这也包含进行了氢氧化、糖链加成、硫酸化等翻译后修饰的氨基酸。

如果使用本发明的核酸，则可以制作能够生产病毒颗粒生产能力已显著提高的JFH1突变体病毒的复制子RNA。

本发明核酸的优选例子有：编码前体多聚蛋白的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第297位的酪氨酸取代成组氨酸、第330位的丙氨酸取代成苏氨酸、第395位的丝氨酸取代成脯氨酸、第417位的天冬酰胺取代成丝氨酸、第483位的天冬氨酸取代成甘氨酸、第501位的丙氨酸取代成苏氨酸、第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸、第931位的谷氨酰胺取代成精氨酸、以及第961位的丝氨酸取代成丙氨酸。该核酸的优选例子见SEQID NO：3。

本发明核酸的另一优选例子有：编码前体多聚蛋白的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸取代成精氨酸、第756位的缬氨酸取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。该核酸的优选例子见SEQID NO：4。

本发明核酸的另一优选例子有：编码前体多聚蛋白的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。该核酸的优选例子见SEQ ID NO：5。

本发明核酸的另一优选例子有：编码前体多聚蛋白的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸取代成精氨酸、第756位的缬氨酸取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸取代成丙氨酸、第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。

本发明核酸的另一优选例子有：编码前体多聚蛋白的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸取代成精氨酸、第786位的缬氨酸取代成丙氨酸、第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。

本发明核酸的另一优选例子有：编码前体多聚蛋白的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸取代成精氨酸、第756位的缬氨酸取代成丙氨酸、第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。

上述作为本发明的核酸的复制子RNA、或由该核酸制作的复制子RNA、特别是全长基因组复制子RNA(全长基因组HCV RNA)，与野生型JFH1株的复制子RNA相比具有显著提高的病毒生产能力。在本说明书中，病毒生产能力优选为培养细胞系统中的病毒颗粒生产能力(优选感染性病毒颗粒生产能力)。本发明的核酸或由该核酸制作的复制子RNA例如与野生型JFH1株的全长基因组复制子RNA相比，具有2倍以上、优选10倍以上、典型的是10倍～10,000倍、例如10倍～1,000倍的病毒生产能力。作为本发明的核酸的全长基因组复制子RNA与来自JFH1株的全长基因组复制子RNA相比，具有2倍以上、优选10倍以上的病毒生产能力，所述JFH1株编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第2440位的缬氨酸被取代成亮氨酸的前体多聚蛋白。野生型JFH1株的全长基因组序列见SEQ ID NO：1。SEQ ID NO：2所示的序列是根据SEQ ID NO：1所示的野生型JFH1株的全长基因组序列编码的前体多聚蛋白的氨基酸序列。

病毒生产能力可以通过测定培养上清的感染滴度来确定。感染滴度的测定可以按照任意的方法进行，但在本说明书中，以通过转化灶法测定的培养上清的感染滴度为基准。具体可以按照后述实施例中记载的方法确定感染滴度。

本发明的核酸或由该核酸制作的复制子RNA显示出高病毒颗粒形成效率。该性质对用于病毒疫苗制造等所必需的病毒蛋白的大量生产也有利。该病毒颗粒形成效率还可以以算出的比活性(＝(培养上清中的感染滴度)/(培养上清中的核心蛋白量)；相对比感染滴度)的值为指标。具体可以按照后述实施例中所述的方法来确定比活性。

在本发明的核酸中，包含SEQ ID NO：3～5所示的核苷酸序列的核酸(全长基因组复制子RNA)在病毒生产能力方面特别优异。另外，含有包含JFH1株的5’非翻译区、编码根据SEQ ID NO：3～5所示的核苷酸序列编码的突变型前体多聚蛋白的序列和JFH1株的3’非翻译区的全长基因组序列的核酸(全长基因组复制子RNA)也具有高病毒生产能力。

本发明的核酸可以包含编码选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白的核苷酸序列、例如标记基因。标记基因包含：可以赋予细胞只选择表达该基因的细胞的选择性的选择标记基因(编码选择标记蛋白的核苷酸序列)和编码成为其基因表达指标的基因产物的报道基因(编码报道蛋白的核苷酸序列)。在本发明中，对优选的选择标记基因的例子没有限定，可以列举新霉素耐性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素耐性基因、吡啶硫胺素耐性基因、腺苷酰基转移酶基因、Zeocin耐性基因、嘌呤霉素耐性基因等。本发明中，对优选的报道基因的例子没有限定，可以列举来自转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自大肠杆菌的β葡糖醛酸酶或β半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因、绿色萤光蛋白基因、来自水母的水母素(ィクリォン，aequorin)基因、分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因等。

本发明的核酸在前体多聚蛋白编码区内可以包含编码选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白的核苷酸序列、例如标记基因。该情况下，对插入在前体多聚蛋白内的选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白没有限定，但优选报道蛋白，更优选萤光素酶，进一步优选海肾萤光素酶(ゥミシィタケルシフェラ一ゼ)。编码海肾萤光素酶的基因的核苷酸序列的例子见SEQ ID NO：9。

以该海肾萤光素酶为代表的选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白(优选报道蛋白、更优选萤光素酶)被插入前体多聚蛋白内时，优选插入在以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时的第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间。具有包含编码如此操作插入有异种蛋白的前体多聚蛋白的序列的全长基因组核酸的病毒颗粒与野生型JFH1株的病毒颗粒相比，感染性(感染滴度)高达5倍以上、优选10倍或10倍以上。编码在第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间插入有异种蛋白的前体多聚蛋白的HCV全长基因组序列的优选例子有：SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

本发明的核酸还优选进一步包含IRES序列。本发明中的“IRES序列”是指可以使核糖体结合在RNA内部并开始翻译的内部核糖体进入位点。以下，对本发明中的IRES序列的优选例子没有限定，可以列举EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)、FMDVIRES、HCV IRES等。当本发明的核酸包含IRES序列时，优选在HCV基因组序列的5’非翻译区(5’NTR)与编码核心蛋白的核酸序列之间依次插入报道基因(编码报道蛋白的核酸序列)和IRES序列。

本发明的核酸可以通过采用本领域技术人员所公知的基因工程学技术将上述引起1个以上氨基酸取代的碱基取代导入编码HCVJFH1株的前体多聚蛋白的核酸中来制作。对编码HCV JFH1株的前体多聚蛋白的核酸没有限定，例如可以是包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA、或包含该DNA的重组载体(例如重组质粒载体)。

关于上述引起氨基酸取代的碱基取代，当根据在生物学领域周知的遗传密码表比较取代部位的氨基酸密码子与取代前的氨基酸密码子时可以容易地进行确定。

本发明还提供包含本发明的核酸的载体。包含本发明的核酸的载体可以是重组载体，但更优选为表达载体。本发明的核酸优选插入在载体中的转录启动子的下游。本发明的核酸通过与转录启动子进行功能性连接，在转录启动子的控制下被整合。对转录启动子没有限定，可以列举T7启动子、SP6启动子、T3启动子等，但特别优选T7启动子。对载体没有限定，可以使用pUC19(TaKaRa社)、pBR322(TaKaRa社)、pGEM-T、pGEM-T Easy、pGEM-3Z(均由Promega社制)、pSP72(Promega社)、pCRII(Invitrogen社)、pT7Blue(Novagen社)等。来自表达载体的HCV复制子RNA的合成例如可以使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion社)等来进行。制作的HCV复制子RNA可以利用本领域技术人员所周知的RNA提取法或纯化法等进行提取、纯化。

(2)产生感染性HCV颗粒的细胞的制作

本发明还涉及使用(1)中记载的本发明的突变体核酸生产的丙型肝炎病毒颗粒。该丙型肝炎病毒颗粒优选为感染性病毒颗粒。

本发明的HCV颗粒(优选感染性HCV颗粒)可以通过将包含上述(1)的核酸的全长基因组RNA导入到细胞中进行培养来制作。即，本发明还提供包含上述(1)中记载的本发明的核酸的丙型肝炎病毒颗粒。

导入RNA的细胞只要是允许HCV颗粒形成的细胞即可，但优选为培养细胞。上述细胞的例子有：Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、293细胞等或它们的派生株等培养细胞。更优选的例子有：Huh7细胞等来自肝脏的培养细胞，进一步优选Huh7细胞和Huh7细胞的派生株(例如Huh7.5细胞、Huh7.5.1细胞等)。另外，还可以列举使CD81基因和/或Claudin1基因在Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞中表达的细胞，其中优选使用Huh7细胞或Huh7细胞的派生株。在本发明中，“派生株”是指由该细胞衍生的细胞株，通常是指该细胞的亚克隆株。

作为将RNA导入到细胞中的方法，可以使用公知的任意方法。上述方法的例子有：磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、微量注射法、电穿孔法，但优选脂质转染法和电穿孔法，进一步优选电穿孔法。

细胞的病毒颗粒产生能力还可以使用抗释放到培养液中的构成HCV病毒颗粒的要素(例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白)的抗体来测定。另外，通过使用了特异性引物的RT-PCR法扩增、测定培养液中的HCV病毒颗粒所含有的HCV基因组RNA，也可以间接检测HCV病毒颗粒的存在。

所制作的病毒是否具有感染能力，这可如下判断：培养通过上述方法导入有HCV RNA的细胞，将所得上清添加在HCV容许性细胞(例如Huh7)中，例如在48小时后将细胞用抗核心抗体进行免疫染色，数出感染细胞数，或者使细胞提取物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，利用蛋白质印迹检测核心(core)蛋白，即可判断是否具有感染能力。需要说明的是，此处也将由导入有JFH1株的基因组RNA的细胞生成的感染性HCV颗粒称作JFH1病毒。

通过将如上制作的、导入有全长基因组RNA的细胞进行定期继代培养，可以得到持续产生感染性HCV颗粒的细胞。这种细胞株可以长期培养。

本发明还涉及生产如上制作的JFH1突变体的丙型肝炎病毒颗粒的细胞、优选培养细胞。

(3)适应性突变的解析

通过将由上述(2)制作的、持续生产HCV颗粒的细胞株继续进行继代培养，在HCV基因组中引起适应性突变，期待HCV颗粒生产显著提高。继代培养通常要进行十几次(1～2个月)，但在本发明中，由于适应性突变的导入，继续继代培养1年、进一步优选2年。

需要说明的是，分析表明：利用适应性突变的组合，RNA复制效率达到200倍以上，反之，被抑制在1/5以下，只增加适应性突变的数目未必就好，呈现出复杂的情况(Lohmann V等人.J Virol 77：3007-3019，2003.)。另外，若HCV株不同，则适应性突变的效果也不同，所以适应性突变通过何种理由影响HCV基因组的复制效率，其细节尚不清楚。(1)的本发明核酸可以是通过导入该适应性突变而得到的适应突变体。

(4)HCV颗粒的应用

(2)中得到的HCV颗粒适合用作疫苗、用作用于制作抗HCV抗体的抗原。

具体而言，还可以将HCV颗粒直接用作疫苗，但也可以利用该领域已知的方法将其毒性减弱或灭活后使用。病毒的灭活可以通过将福尔马林、β-丙内酯、戊二醛等灭活剂例如添加混合在病毒悬浮液中，使其与病毒反应而达成(Appaiahgari，M.B. & Vrati，S.，Vaccine，22：3669-3675，2004)。因此，本发明还涉及将(2)中得到的HCV颗粒灭活而得到的丙型肝炎病毒疫苗。

本发明的疫苗通常可以制成溶液或悬浮液的任一种形式进行给药。本发明的疫苗还可以制成适合溶解或悬浮于液体中的固体的形态。制备物以乳浊液的形式进行制备、或者可以在脂质体中胶囊化。HCV颗粒等活性免疫原性成分经常与药学上可接受的、适合于活性成分的赋形剂混合。在适当的赋形剂中，例如有水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的混合物。并且，根据需要，疫苗可以含有少量的助剂(例如加湿剂或乳化剂)、pH缓冲剂和/或提高疫苗效能的佐剂。对有效的佐剂的例子没有限定，包含下述佐剂：氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637、称作nor-MDP)、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A、称作MTP-PE)和RIBI。RIBI是在2％角鲨烯/Tween(注册商标)80乳剂中含有从细菌中提取的3种成分、即单磷脂A、海藻糖二霉菌酸和细胞壁骨架(HPL+TDM+CWS)的佐剂。佐剂的效能通过测定通过给予由HCV颗粒制成的疫苗而产生的抗体量即可确定。

本发明的疫苗通常是通过胃肠外给药、例如通过皮下注射或肌内注射等注射进行给药。适合于其他给药方式的其他剂型有：栓剂和根据情况进行口服给药的处方药。

根据需要，可以在HCV疫苗中加入具有佐剂活性的一种以上的化合物。佐剂是该免疫系统的非特异性刺激因子。佐剂增强宿主对HCV疫苗的免疫应答。该技术领域中公知的佐剂的具体例子有：弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油和卡波普(Carbopol)。特别适合粘膜使用的佐剂例如有：大肠杆菌(E.coli)易热性毒素(LT)或霍乱(Cholera)毒素(CT)。其他适当的佐剂例如有：氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油性乳剂(例如Bayol(注册商标)或Marcol 52(注册商标))、皂苷或维生素E增溶剂。因此，在优选方式中本发明的疫苗包含佐剂。

例如在皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药的注射剂中，本发明的HCV疫苗和医药上可接受的载体或稀释剂的其他具体例子中，稳定化剂、碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、白蛋白或酪蛋白等蛋白、牛血清或脱脂乳等含蛋白的物质、以及缓冲液(例如磷酸缓冲液)等可以一起给药。

栓剂中使用的现有粘合剂和载体中，例如可以包含聚亚烷基二醇或三甘油。这种栓剂可以由含有0.5％～50％范围、优选1％～20％范围的活性成分的混合物形成。口服处方药含有通常使用的赋形剂。该赋形剂例如有：药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

本发明的疫苗制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释处方剂或粉末剂的形态，含有10％～95％、优选25％～70％的活性成分(病毒颗粒或其一部分)。

本发明的疫苗以适于给药剂型的方法、以及具有预防和/或治疗效果的量进行给药。适合的给药量通常为每次给予0.01μg～100,000μg范围的抗原，这取决于所处置的患者、该患者免疫系统中的抗体合成能力和期望的防御程度，还取决于口服、皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药途径等给药途径。

本发明的疫苗可以按照单独给药时间表进行给药、或者优选按照联合给药时间表进行给药。按照联合给药时间表进行给药时，接种开始时分别给予1～10种物质，接着按照维持和/或强化免疫应答所必需的时间间隔进行给药，例如第2次给药可在1～4个月后进行分别的给药。根据需要，几个月后可以继续给药。给药的要旨也至少部分性地根据个体的必要性来决定，取决于医生的判断。

并且，本发明的含有HCV颗粒的疫苗可以和其他免疫控制剂(例如免疫球蛋白、)同时给药。

本发明的疫苗还有以下使用方法：将疫苗给予健康人，在健康人体内诱导对HCV的免疫应答，对于新的HCV感染则预防性使用。并且，还有下述使用方法：将疫苗给予感染了HCV的患者，在机体内诱导对HCV的强免疫反应，从而用作消除HCV的治疗性疫苗。

本发明的HCV颗粒可用作用于制作抗体的抗原。通过将本发明的HCV颗粒给予哺乳类或鸟类，可以制作抗体。哺乳类动物有：小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、豚鼠、单峰驼、双峰驼、美洲驼等。单峰驼、双峰驼和大羊驼(Lama)适合制作仅包含H链的抗体。鸟类动物的例子有：鸡、鹅、鸵鸟等。采取给予了本发明HCV颗粒的动物的血清，按照已知方法可以获得抗体。

使用经本发明的HCV颗粒免疫的动物的细胞，可以制作产生单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。杂交瘤的制造方法是周知的，可以采用Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1988)中记载的方法。

单克隆抗体产生细胞可以通过细胞融合而生成，还可以利用通过导入癌基因DNA或感染Epstein-Barr病毒使B淋巴细胞不死化等其他方法而生成。

通过上述方法得到的单克隆抗体或多克隆抗体对HCV的诊断或治疗、预防有用。因此，将本发明的HCV颗粒识别为抗原的抗丙型肝炎病毒抗体也包含在本发明范围内。

使用本发明的已附加表位的HCV颗粒制作的抗体可与医药上可接受的溶解剂、添加剂、稳定剂、缓冲液等同时给药。给药途径可以是任一种的给药途径，但优选为皮下、皮内、肌肉内给药，更优选静脉内给药。

(5)在筛选抗HCV药物中的应用

在进行HCV治疗药的开发时，除黑猩猩外，不存在反映病毒感染的有效动物、也不存在高效的体外病毒培养系统，所以无法充分进行药物评价成为障害。但近年来有人开发了可以评价HCV-RNA的复制的亚基因组HCV复制子系统(Lohmann，V.等人，Science，285：110-113，1999)，作为与抑制病毒复制有关的HCV抑制剂的筛选系统取得了重要进步。

但是，上述亚基因组HCV复制子系统中存在无法评价HCV结构蛋白的功能的问题。实际上，已知作为HCV结构蛋白之一的核心蛋白会影响宿主的转录因子。因此，评价HCV感染的细胞中发出的现象时，仅凭亚基因组HCV复制子系统是不够的。在使用亚基因组HCV复制子系统进行筛选而选择的药物中，预测有时也无法充分抑制HCV的复制。

因此，为了解决上述亚基因组HCV复制子系统的问题，人们使用HCV N株(基因型1b)、HCV Con-1(基因型1b)、HCV H77株(基因型1a)开发了全长基因组HCV复制子系统(Ikeda，M等人，J.Virol.，76：2997-3006，2002；Pietschmann，T等人，J.Virol.76：4008-4021，2002；Blight，KJ等人，J.Virol.77：3181-3190，2003)。但是，即使将包含上述HCV株的结构蛋白的全长RNA导入细胞中，也没有确认到病毒颗粒释放到培养液中(Blight，KJ等人，J.Virol.77：3181-3190，2003)。因此，在该全长基因组HCV复制子系统中，出现了无法筛选在病毒的释放、感染过程中起作用的治疗药的问题。

使用HCV复制子来筛选抗HCV药物时，在受检物质的存在下培养感染性HCV颗粒和HCV感染容许细胞、例如Huh7细胞，测定HCV的复制和/或颗粒产生，从而评价受检物质的抗HCV效果。为了监测HCV的复制和颗粒产生，必需采用PCR或RNA印迹法测定HCV基因组量、或者通过EIA法或细胞免疫染色来检出测定核心蛋白或非结构蛋白(例如NS3蛋白)(Aoyagi，K.等人，J.Clin.Microbiol.，37：1802-1808，1999)。但是，由于上述测定方法的操作繁杂、难以高流通量化、成本增加，所以在抗HCV药物的筛选中人们希望开发简便且廉价的评价方法。因此，有人想出了下述方法：制作将报道基因整合到全长基因组HCV中的复制子，该复制子进行自身复制，监测由其基因组中的报道基因翻译的报道蛋白。例如，制作在JFH-1、J6CF/JFH1(Jc-1)和Con1/JFH1的5’NTR与编码核心蛋白的基因之间插入有萤光素酶基因和EMCV IRES作为报道基因的载体、Luc-JFH1、Luc-Jc1和Luc-Con1，研究其功能(Koutsoudakis，G.等人，J.Virol.80：5308-5320，2006)。制作带有上述报道选择性全长基因组HCV复制子的病毒，使其感染Huh7细胞时，则在感染细胞中作为报道基因的萤光素酶基因表达，合成萤光素酶。因此，通过测定萤光素酶活性，可以测定感染的效果，所以省去了测定HCV的基因组量或蛋白的时间，非常方便。

但是，报道基因等外来基因的插入使基因组长度增加，所以复制效率容易大幅降低。实际上，Luc-JFH1与JFH1的相比结果是，其复制能力低5倍，而且感染滴度也低3～10倍(Koutsoudakis，G.等人.J.Virol.80：5308-5320，2006)，为了在筛选中使用带有表达报道基因的全长HCV基因组的病毒颗粒，必需开发感染滴度更高的HCV病毒。

相对于此，在本发明中成功制作了来自JFH1突变体的全长基因组复制子，所述JFH1突变体中虽然导入有报道基因但仍保持高复制能力。通过使用本发明的该全长基因组复制子，可以提供高效率的筛选方法。上述筛选方法也包含在本发明范围内。

在该筛选中，可以有效使用上述的、具有全长基因组序列的HCVRNA(全长基因组复制子RNA)，所述全长基因组序列在前体多聚蛋白编码序列内、特别是以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时相当于第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间的位置插入有标记基因。作为标记基因，优选报道蛋白。

适合在本发明的该筛选中使用的、来自整合有报道蛋白编码序列的JFH1突变体的全长基因组复制子的结构可以是：从5’侧到3’侧依次包含本发明的JFH1适应突变体的5’非翻译区、报道蛋白编码序列、EMCV(脑心肌炎病毒，Encephalomyocarditis virus)的IRES序列、JFH1适应突变体的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列以及3’非翻译区的核酸。

上述复制子的更优选的结构可以是：从5’侧到3’侧依次包含本发明的JFH1适应突变体的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、编码在NS5A蛋白中功能性(符合读框的)插入有报道蛋白的蛋白的序列、NS5B蛋白编码序列以及3’非翻译区的核酸。

作为本发明的JFH1适应突变体，可以适当使用上述(1)所述的本发明的核酸。

特别优选的上述复制子的结构可以是：编码在从HCV前体多聚蛋白的N末端起第2394位氨基酸残基与2395位氨基酸残基之间功能性(符合读框的)插入有报道蛋白的蛋白的核酸。

报道蛋白的例子有：萤光素酶、分泌型碱性磷酸酶、绿色萤光蛋白(GFP)、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶、新霉素磷酰转移酶与萤光素酶的融合蛋白等。更优选萤光素酶，进一步优选海肾萤光素酶。编码海肾萤光素酶的基因的核苷酸序列的一个例子见SEQ ID NO：9。

在上述全长基因组HCV中整合有报道基因的复制子中，特别优选的序列为包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的核酸，其中，当该核酸为RNA时，核苷酸序列中的碱基符号“T”读作“U”。在本发明的感染性HCV颗粒的制造中可以使用HCV基因组RNA或HCV基因组DNA。通过使用上述全长基因组复制子HCVRNA，可以提供以萤光素酶活性为指标的、高灵敏度的HCV感染测定系统。

使用在本发明的全长基因组HCV RNA中整合有编码报道蛋白的序列的复制子进行的筛选方法例如可以是筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括：如上操作将该复制子导入到培养细胞中，制作生产丙型肝炎病毒颗粒的培养细胞，之后在受检物质的存在下培养(i)所得的生产丙型肝炎病毒颗粒的培养细胞或(ii)从该细胞释放到培养上清中的丙型肝炎病毒颗粒与丙型肝炎病毒感受性细胞(HCV感染容许细胞)的组合，测定所得培养物中的报道蛋白。上述筛选方法还可用作药物评价系统。

上述药物评价系统的具体例子有：筛选具有抗HCV作用的物质的方法，该方法是通过下述(1)～(3)来评价受检物质的抗HCV效果：(1)在受检物质的存在下培养感染性HCV颗粒和HCV感染容许细胞、例如Huh7细胞，所述感染性HCV颗粒包含如上操作将报道基因整合在全长基因组HCV中的复制子作为基因组；(2)测定随着HCV的复制、颗粒产生而产生的报道蛋白；(3)比较所产生的报道蛋白的水平和未加入受检物质的对照中的报道蛋白的检测水平。

本发明的筛选方法的另一例子为：评价受检物质的抗HCV效果的方法，该方法是通过下述(1)～(3)进行评价：(1)在受检物质的存在下培养感染性HCV颗粒产生细胞，该细胞包含如上操作将报道基因整合到全长基因组HCV中的复制子作为基因组；(2)测定随着HCV的复制、颗粒产生而产生的报道蛋白；(3)比较所产生的报道蛋白的水平和未加入受检物质的对照中的报道蛋白的水平。

更具体而言，上述筛选方法可以是筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括下述步骤：在受检物质的存在下培养生产丙型肝炎病毒颗粒的培养细胞的步骤，所述丙型肝炎病毒颗粒包含插入有编码报道蛋白的核酸的JFH1突变体的全长基因组HCV RNA、即本发明的核酸；以及测定所得培养物中的该报道蛋白，当上述报道蛋白的表达量低时判定为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性的步骤。

(6)SEQ ID NO的概要

SEQ ID NO：1是野生型JFH1(JFH1wt)的全长基因组序列

SEQ ID NO：2是根据野生型JFH1(JFH1wt)的全长基因组序列编码的、前体多聚蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO：3是突变体JFH1-A/WT的全长基因组序列。第341位～9442位核苷酸是前体多聚蛋白编码序列。

SEQ ID NO：4是突变体JFH1-B/WT的全长基因组序列。第341位～9442位核苷酸是前体多聚蛋白编码序列。

SEQ ID NO：5是突变体JFH1-Q862R的全长基因组序列。第341位～9442位核苷酸是前体多聚蛋白编码序列。

SEQ ID NO：6是突变体JFH1-A/WT-Rluc的全长基因组序列。第341位～9442位核苷酸是前体多聚蛋白编码序列。

SEQ ID NO：7是突变体JFH1-B/WT-Rluc的全长基因组序列

SEQ ID NO：8是突变体JFH1wt-Rluc的全长基因组序列

SEQ ID NO：9是海肾萤光素酶基因的全长序列

SEQ ID NO：10～18为PCR引物

实施例

以下，使用实施例进一步具体地说明本发明。但本发明的技术范围并不受这些实施例的限定。

实施例1：用于高生产JFH-1病毒颗粒的JFH1适应突变体的获得

使用作为质粒DNA的pJFH-1(Wakita，T.等人，Nat.Med.，11(2005)第791-796页和国际公开WO2004/104198)作为DNA源，所述质粒DNA是将从重症肝炎的日本人患者中分离的基因型2a的丙型肝炎病毒(HCV)JFH1株(JP2002-171978A)的基因组RNA全区的cDNA(全基因组cDNA(full-genome cDNA)；SEQ ID NO：1)克隆到插入有T7启动子的pUC19质粒载体中的T7启动子序列下游的EcoRI-XbaI位点而得到的。用XbaI切断pJFH-1，之后加入绿豆核酸酶20U(反应液总量为50μl)，在30℃下温育30分钟，从而使Xba I切断末端变得平滑。接着，进行苯酚氯仿萃取、乙醇沉淀，得到除去了切断末端的CTGA4个碱基的XbaI切断片段。以该DNA片段为模板，使用MEGAscriptT7试剂盒(Ambion社)来合成RNA。如下操作将如此合成的JFH1株的全长基因组HCV RNA(full-length genomic HCV RNA)导入细胞中。

前1天，将1×10⁶个Huh7细胞接种在10cm的培养皿中，用不含抗生素的培养基进行培养。在30μl脂质转染胺2000(Invitrogen社)和OPTI-MEM(Invitrogen社)的混合液中加入悬浮在1ml OPTI-MEM中的6μg JFH1 RNA，使之在室温下反应20分钟，形成RNA-脂质转染胺复合体。向前1天准备的Huh7细胞中添加该RNA-脂质转染胺复合体。24小时后将上清更换成新的培养基。之后继续培养2年。该继代培养期间远远长于用于得到适应突变体(culture-adapted variant)的通常的培养期间、即1～2个月(十几次继代)。由该继代培养结束后的细胞生产的病毒株命名为JFH-1a。另一方面，由野生型JFH1株合成全长基因组JFH1 RNA，与上述同样将其导入Huh-7.5.1细胞中。由培养刚刚开始后的野生型JFH1 RNA导入细胞生产的病毒株命名为JFH1wt。图1显示在本实施例中进行的实验流程。

实施例2：作为JFH1适应突变体(adapted JFH1 variant)的JFH1a的性 状解析(characterization)

在病毒感染24小时前，将Huh7.5.1细胞按2×10⁴个/孔(well)接种在24孔平板中。接下来，在37℃下用实施例1中制作的JFH1wt和JFH1a病毒颗粒按M.O.I(感染复数)0.006感染Huh7.5.1细胞2小时。除去病毒液，加入新的培养基，在37℃下继续培养7天。经时回收细胞，提取总RNA(total RNA)。提取总RNA时使用市售的RNA提取试剂ISOGEN(ニッポンジ一ン社)，向cDNA转换时使用ReverTra AceqPCR RT试剂盒(TOYOBO社)，按照附带的操作指南进行提取。PCR反应按照通过SYBR GreenI检测进行的两步骤RT-PCR来进行。通过使用Light Cycler(Roche社)分析所得的PCR产物，确定细胞内的HCVRNA量。用于测定JFH1a基因组的引物序列为按照扩增HCV的NS3区的方式设计的引物，即5’-CTTTGACTCCGTGATCGACC-3’(SEQ IDNO：10)和5’-CCCTGTCTTCCTCTACCTG-3’(SEQ ID NO：11)。使用5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’(SEQ ID NO：12)和5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：13)作为扩增标准化用的肌动蛋白基因的引物，同样通过两步骤RT-PCR来定量，由所得数据算出每100ng总RNA的HCV RNA拷贝数(图2)。其结果，在培养的第6天，JFH1a显示出JFH1wt的约1,000倍高的复制能力。

接下来，分析JFH1wt和JFH1a的干扰素感受性。在病毒感染24小时前，在24孔平板的每孔中接种3×10⁴个Huh7.5.1细胞。第二天，使JFH1wt和JFH1a以0.006的M.O.I.感染细胞2小时。感染后用PBS(-)清洗细胞3次，用含有图3中记载的浓度(0、0.16、0.8、4、20、100IU/ml)的干扰素α(IFN-α)(Universal Type I干扰素，PBL Interferon Source，NJ)的培养基培养72小时。通过定量的PCR来定量用图3中记载的IFN-α浓度处理的细胞内的HCV RNA量。由所得数据算出相对于未添加干扰素(IFN)的对照的相对复制率(％)。由其结果判定：JFH1a和野生型的JFH1wt显示出同样的IFN感受性(图3)。

实施例3：JFH1a突变的解析

在本实施例中，为了根据JFH1a的高病毒生产能力研究重要的适应性突变，首先分析JFH1a的基因组序列。使用ISOGEN-LS(NIPPONGENE社)，从实施例2中得到的JFH1a病毒感染细胞中提取总RNA，通过逆转录反应合成cDNA。该cDNA合成的逆转录反应使用特异性引物A9482：5’-GGAACAGTTAGCTATGGAGTGTACC-3’(SEQ IDNO：16)，使用Transcriptor first Strand cDNA合成试剂盒(Roche社)来进行。逆转录的程序按照附录的操作指南来进行。以所得的cDNA为模板，通过PCR反应扩增编码从核心蛋白到NS3蛋白的序列。使用S58：5’-TGTCTTCACGCAGAAAGCGCCTAG-3’(SEQ ID NO：17)和AS4639：5’-CTGAGCTGGTATTATGGAGACGTCC-3’(SEQ ID NO：18)作为PCR用引物。将通过PCR反应得到的DNA片段连接在pGEM-T Easy载体(Promega社)中，转化成大肠杆菌DH5α，之后在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养，筛选转化大肠杆菌。取出6个集落，在LB培养基中培养一夜，使用Wizard Plus SV Miniprep DNA纯化系统(Promega)提取纯化质粒，确认了PCR扩增的DNA片段的核苷酸序列。

其结果，在JFH1a的前体多聚蛋白的从核心蛋白到NS3蛋白的区(前体多聚蛋白的N末端侧的一半)，与JFH1的前体多聚蛋白序列(SEQID NO：2)相比发现多个氨基酸取代(图4)。还显示出6个克隆中的2个以上克隆存在共同的氨基酸突变(在图4中，用“*”显示)。

实施例4：突变体质粒的构建

构建具有为了使实施例3所示的JFH1a病毒具有高产生量所必需的适应性突变的质粒。如图4所示，由在6个克隆的核苷酸序列中共同发现的突变氨基酸的图式可以判定：JFH1a至少由2个突变株构成。此处将上述2个突变株分别称作组A、组B。选择Clone5-2作为组A、选择Clone5-4作为组B，制作两种的突变体嵌合。将Clone5-2和Clone5-4用限制酶AgeI和SpeI消化，得到包含经PCR扩增的5’侧的突变的区的DNA片段。通过连接反应使上述DNA片段与同样用AgeI和SpeI进行酶处理而得到的pJFH1载体片段结合，从而分别得到pJFH1-A/WT、pJFH1-B/WT。

图5是显示制作的突变体质粒中的突变导入位点的概略图。由突变体质粒pJFH1-A/WT表达的HCV突变体JFH1-A/WT具有全长基因组序列(SEQ ID NO：3)，所述全长基因组序列编码在野生型JFH1(也称作JFH1wt)病毒的前体多聚蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的N末端侧的一半(从核心到NS3的一部分)导入有K74T、Y297H、A330T、S395P、N417S、D483G、A501T、Q862R、Q931R和S961A这10个氨基酸取代的蛋白。由突变体质粒pJFH1-B/WT表达的HCV突变体JFH1-B/WT具有全长基因组序列(SEQ ID NO：4)，所述全长基因组序列编码在野生型JFH1(也称作JFH1wt)病毒的前体多聚蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的N末端侧的一半(从核心到NS3)导入有V31A、K74T、G451R、V756A、V786A和Q862R这6个氨基酸取代的蛋白。

需要说明的是，使用将在JFH1wt的前体多聚蛋白的氨基酸序列中导入有V2440L氨基酸取代的HCV病毒突变体JFH1-mut5的全长基因组序列在T7RNA启动子的控制下克隆化的质粒作为对照。据报道，该病毒JFH1-mut5与JFH1wt相比，病毒生产能力高10倍(Kaul等人，J.Virol.(2007)81：13168-13179)。

实施例5：HCV适应突变体的HCV生产能力的解析

比较野生型JFH1wt及其3种适应突变体JFH1-A/WT、JFH1-B/WT和JFH1-mut5的病毒颗粒生产能力。

首先，以pJFH-1和实施例4中制作的突变体质粒为模板，利用实施例1所示的方法合成上述4种病毒JFH1wt、JFH1-A/WT、JFH1-B/WT和JFH1-mut5的全长基因组HCV RNA。接下来，将各4μg合成的4种HCV RNA与100μl以5×10⁶细胞/ml的密度悬浮在Microporation试剂盒(Degital Bio社)中所含的缓冲液R中的Huh7.5.1细胞混合，使用MicroPorator(Digital Bio社)，在以1350V(脉冲电压)、30ms(脉冲宽度)进行1次脉冲的条件下进行电穿孔。将细胞悬浮于10ml培养基中，在6孔平板的每孔中接种2ml(2×10⁵细胞)。电穿孔后于4、24、48、72、96小时回收细胞和培养上清，使用Ortho(ォ一ソ)HCV抗原IRMA试验(Aoyagi等人，J.Clin.Microbiol.，37(1999)第1802-1808页)来定量新产生的细胞内核心蛋白量(图6A)。同样操作，测定各时间点的培养上清中的核心蛋白量(图6B)。转染效率的校正使用4小时后的细胞内核心蛋白量来进行。

另外，利用病毒效价测定法(转化灶形成实验，focus forming assay)测定JFH1wt、JFH1-A/WT、JFH1-B/WT和JFH1-mut5的感染滴度。通过病毒效价测定法(转化灶形成实验)测定培养上清中的病毒感染效价。更具体而言，在96孔平板的每孔中接种6×10³个Huh7.5.1细胞，第二天，用经培养基逐步稀释的病毒溶液感染细胞，在37℃下培养72小时。病毒感染细胞的检测通过抗原抗体反应的免疫染色法来进行。将感染72小时后的细胞在室温下、在10％福尔马林-PBS(-)溶液中固定20分钟，之后在室温下用0.5％Triton X-PBS(-)处理10分钟。之后，加入用5％脱脂乳-PBS(-)稀释的抗HCV-核心(克隆CP14)单克隆抗体(300倍稀释物)作为1次抗体，使之在室温下反应1小时。再用PBS(-)清洗3次，之后加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体(300倍稀释物)，使之在室温下反应1小时。用PBS(-)清洗3次，之后加入KonicaImmunostain HRP-1000(コニカミノルタ社)，在显微镜下测定染成蓝色的病毒抗原阳性细胞集团(免疫转化灶)的数目(图6C)。

根据所得的核心蛋白量和感染滴度，通过下式算出比活性(相对比感染滴度(relative specific infectivity))。比活性＝(培养上清中的感染滴度)/(培养上清中的核心蛋白量)。其结果见图6D。

在Huh7.5.1细胞中，JFH1-A/WT和JFH1-B/WT与野生型JFH1wt相比显示出高达100倍以上的感染滴度、与JFH1-mut5相比显示出高达10倍以上的感染滴度(图6C)。显示感染滴度高和病毒蛋白向细胞外的释放量高的这些结果意思是指这些病毒将大量的感染性病毒颗粒释放到培养上清中。即，显示JFH1-A/WT和JFH1-B/WT具有非常高的病毒生产能力(图6B、6C)。

另外，如图6D所示，还显示出JFH1-B/WT的比活性明显高。该结果表明：JFH1-B/WT的感染力强、或者可以非常高效地形成病毒颗粒。如上所述，高效率的病毒颗粒形成能力是可以在以疫苗制造等为目的的HCV病毒颗粒生产中有效利用的、非常优异的性质。

实施例6：适应突变体病毒的感染传播(infection transmission)的解析

接下来，分析JFH1wt、JFH1a、JFH1-A/WT、JFH1-B/WT和JFH1-mut5这5种HCV病毒的感染传播力。在进行病毒感染20～24小时前，在6孔平板的每孔中接种1×10⁵个Huh7.5.1细胞。第二天，将这5种病毒用0.001的M.O.I.(100FFU/ml，1ml)在37℃下感染2小时。2小时后除去病毒液，加入2ml新的培养基，将细胞在37℃下继续培养23天。每隔3～4天取20％左右的该细胞进行继代培养，每次回收上清并保存在-80℃下。利用已述的病毒效价测定法(转化灶形成实验)测定回收的培养上清中的病毒感染滴度。其结果，转染后JFH1a和JFH1-B/WT的病毒感染滴度急速上升，感染传播迅速，这表明上述2种病毒具有高感染传播力(图7)。

为了确认JFH1-B/WT的感染传播力高，用5种病毒(各50FFU)感染Huh7.5.1细胞(6×10³细胞)，比较在感染72小时后形成的转化灶的大小。将转化灶按照病毒效价测定法(转化灶形成实验)的程序进行染色、观察。其结果，如图8所示，显示出JFH1a、JFH1-B/WT的转化灶大小特别大、感染传播力格外高。

实施例7：适应突变体病毒JFH1-R/WT的解析

详细分析具有病毒高生产能、且感染传播力高的JFH1适应突变体病毒JFH1-B/WT所具有的6个位置氨基酸突变(氨基酸取代)。在基因的点突变导入中通常采用位点定向诱变法。突变体的制作是按照附带的操作指南，使用QuickChange II XL位点定向诱变试剂盒(Stratagene社)，以将JFH1-B/WT或JFH1wt的全长基因组序列克隆化的质粒为模板，使用点突变导入用引物来进行。如此操作导入到HCV基因组序列中的点突变通过使用DNA序列分析仪进行序列测定即可确认。

将制作的6个位置氨基酸突变(V31A、K74T、G451R、V756A、V786A和Q862R)中的任一个恢复成野生型氨基酸的突变体和将该6个位置氨基酸突变中的任一个导入JFH1wt(野生型)中的突变体分别见图9和图10。

将上述每1个位置氨基酸突变恢复成野生型氨基酸的碱基突变导入JFH1-B/WT全长基因组序列中得到的6种HCV突变体命名为31-(A31V)、74-(T74K)、451-(R451G)、756-(A756V)、786-(A786V)和862-(R862Q)(图9)。31-(A31V)是将氨基酸取代A31V导入JFH1-B/WT中得到的突变体，74-(T74K)是将氨基酸取代T74K导入JFH1-B/WT中得到的突变体，451-(R451G)是将氨基酸取代R451G导入JFH1-B/WT中得到的突变体，756-(A756V)是将氨基酸取代A756V导入JFH1-B/WT中得到的突变体，786-(A786V)是将氨基酸取代A786V导入JFH1-B/WT中得到的突变体，862-(R862Q)是将氨基酸取代R862Q导入JFH1-B/WT中得到的突变体。进行与实施例4相同的操作，制作上述突变体的全长基因组序列被克隆化的突变体质粒。

另外，将引起上述每1个位置氨基酸突变的碱基突变导入野生型JFH1wt全长基因组序列中得到的6种HCV突变体命名为31+(V31A)、74+(K74T)、451+(G451R)、756+(V756A)、786+(V786A)和862+(Q862R)(图10)。31+(V31A)是将氨基酸取代V31A导入JFH1wt中得到的突变体，74+(K74T)是将氨基酸取代K74T导入JFH1wt中得到的突变体，451+(G451R)是将氨基酸取代G451R导入JFH1wt中得到的突变体，756+(V756A)是将氨基酸取代V756A导入JFH1wt中得到的突变体，786+(V786A)是将氨基酸取代V786A导入JFH1wt中得到的突变体，862+(Q862R)是将氨基酸取代Q862R导入JFH1wt中得到的突变体。进行与实施例4相同的操作，制作上述突变体的全长基因组序列被克隆化的突变体质粒。再以制作的突变体质粒为模板，通过实施例1所示的方法合成全长基因组HCV RNA。

接着，通过电穿孔将各4μg的图9所示的6种突变体病毒31-(A31V)、74-(T74K)、451-(R451G)、756-(A756V)、786-(A786V)和862-(R862Q)的全长基因组HCV RNA、以及图10所示的突变体病毒451+(G451R)的全长基因组HCV RNA、JFH1wt和JFH1-B/WT的全长基因组HCV RNA分别转染到Huh7.5.1细胞(1×10⁶)中。将转染的细胞悬浮于10ml培养基中，在6孔平板上各接种2ml(2×10⁵细胞)。测定转染后24、48、72、96小时的培养上清中的病毒感染滴度(FFU/ml)和核心蛋白量(μg/ml)(图11)。如图11A和11B所示，将第451位的氨基酸残基恢复成野生型的G(甘氨酸)时、或者将第862位的氨基酸残基恢复成野生型的R(精氨酸)时，比活性显著降低。由此表明：G451R的突变和R862Q的突变对提高病毒生产能力至关重要。

同样，通过电穿孔将各4μg的图10所示的6种突变体病毒31+(V31A)、74+(K74T)、451+(G451R)、756+(V756A)、786+(V786A)和862+(Q862R)的全长基因组HCV RNA、以及JFH1wt和JFH1-B/WT的全长基因组HCV RNA分别转染到Huh7.5.1细胞(1×10⁶)中。将转染的细胞悬浮于10ml培养基中，在6孔平板上各接种2ml(2×10⁵细胞)。测定转染后24、48、72、96小时的培养上清中的病毒感染滴度(FFU/ml)、核心蛋白量(μg/ml)(图12)。培养上清中的感染滴度显示：通过将K74T、G451R、Q862R的氨基酸突变分别导入JFH1wt中，病毒生产能力有所提高(图12A)。另外，通过导入Q862R突变，细胞外核心蛋白量增加至JFH1wt的10倍(图12B)。

上述测定结果表明：通过导入G451R突变，与JFH1wt相比病毒感染力和病毒生产能力有所提高。另外还显示：K74T突变和Q862R突变也提高了病毒生产能力。但是，仅凭这些突变还不能超过JFH1-B/WT。

并且，为了研究在长期感染中病毒感染传播力随时间的变化，将由各突变体质粒合成的全长基因组HCV RNA转染到Huh7.5.1细胞中，用产生的各感染性病毒颗粒感染Huh7.5.1细胞(M.O.I.0.001)，进行长期培养，经时测定病毒生产量和感染滴度。31-(A31V)、74-(T74K)、451-(R451G)、756-(A756V)、786-(A786V)、862-(R862Q)、451+(G451R)、JFH1wt和JFH1-B/WT的结果汇总在图13中，而31+(V31A)、74+(K74T)、451+(G451R)、756+(V756A)、786+(V786A)、862+(Q862R)、JFH1wt和JFH1-B/WT的结果汇总在图14中。

其结果表明：在将第451位的氨基酸残基恢复成野生型的G(甘氨酸)的突变体(451-(R451G))中，培养上清中的核心蛋白量的增加时间延迟(图13A)，所以G451R突变与感染传播力有关。

如图14所示，培养上清中核心蛋白量和感染滴度的增加的图形显示出：K74T、G451R、Q862R的突变有助于提高感染传播力(图14A和14B)。特别是G451R在核心蛋白量和感染滴度两个方面均显示出显著的增加，表明病毒颗粒产生能力大幅提高。

根据以上解析可知：K74T、G451R、Q862R突变使HCV病毒生产能力增强。需要说明的是，突变体862+(Q862R)的全长基因组序列见SEQ ID NO：5。

实施例8：将报道基因整合在全长基因组序列中的突变体的制作

为了容易检测HCV的感染和增殖，制作包含整合有萤光素酶基因作为报道基因的全长HCV基因组序列的突变体。制作的突变体的结构图见图15。

具体而言，如下制作将编码HCV前体多聚蛋白的DNA片段功能性连接在T7启动子下游的质粒载体，所述HCV前体多聚蛋白在从丙型肝炎病毒JFH1wt(野生型)、JFH1-A/WT和JFH1-B/WT(适应突变体)的前体多聚蛋白的N末端的第1氨基酸起计数的、第2394位氨基酸残基(氨基酸2394位)与第2395位氨基酸残基(氨基酸2395位)之间整合有由311个氨基酸残基形成的海肾(Renilla reniformis)萤光素酶。

首先，以插入在质粒pGL4.27(Promega社)中的海肾萤光素酶基因(SEQ ID NO：9)为模板，使用末端具有XhoI位点(ctcgag)的2个引物5’-ctcgagATGGCTTCCAAGGTGTACGACCCC-3’(SEQ ID NO：14)和5’-ctcgaGCTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTC-3’(SEQ ID NO：15)，扩增海肾萤光素酶基因片段。用XhoI消化已扩增的基因片段。

另一方面，将JFH1wt、JFH1-A/WT和JFH1-B/WT的全长基因组序列被克隆化的质粒用识别核苷酸序列5’-CCTCGAGG-3’的限制酶AbsI消化，在该限制位点插入上述得到的海肾萤光素酶基因扩增产物的XhoI消化片段，进行克隆，筛选具有功能性连接有海肾萤光素酶的载体的克隆。将如此操作得到的海肾萤光素酶(Rluc)基因导入突变体分别命名为JFH1wt-Rluc、JFH1-A/WT-Rluc、JFH1-B/WT-RLuc。被克隆化在载体中的JFH1-A/WT-Rluc的全长基因组序列(SEQ ID NO：5)、JFH1-B/WT-RLuc的全长基因组序列(SEQ ID NO：6)和JFH1wt-Rluc的全长基因组序列(SEQ ID NO：7)通过核苷酸序列测定来确认。

接下来，将上述的序列被克隆化的重组载体用XbaI消化，切出插入片段，用绿豆核酸酶处理，之后使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion社)合成全长基因组序列HCV RNA。将由JFH1wt、JFH1wt-Rluc、JFH1-A/WT-Rluc和JFH1-B/WT-Rluc合成的HCV RNA转染到HuH7.5.1细胞中，72小时后测定培养上清中的感染滴度。感染滴度的测定通过使用抗HCV-核心(CP14)单克隆抗体进行细胞染色、计测转化灶数目来进行。

其结果，将Rluc基因整合在野生型JFH1wt中时，病毒生产能力与野生型JFH1wt相比低约10倍(图16)。另一方面，将Rluc基因整合在突变体JFH1-A/WT或JFH1-B/WT中时，与JFH1wt-Rluc相比感染滴度高约100倍(图16)。

进一步分析由整合有Rluc基因的全长基因组序列生产的HCV颗粒的量与萤光素酶活性的相关。在48孔平板上按1.0×10⁴个/孔接种Huh7.5.1细胞，24小时后用JFH-A/WT-Rluc和JFH-B/WT-Rluc以100、50、25、12、6、3和0FFU(转化灶形成单元)感染2小时。感染后，将细胞用PBS清洗2次，每孔加入200μL新鲜培养基。病毒感染72小时后从平板中回收细胞，测定萤光素酶的活性。萤光素酶的活性通过使用海肾萤光素酶分析系统(Promega社)，按照附带的操作指南进行测定。具体如下：除去培养上清，用200μL PBS清洗2次，加入200μL试剂盒中所含的溶解缓冲液(裂解缓冲液)(海肾萤光素酶分析系统，Promega社)，在室温下搅拌15分钟，使细胞溶解。将20μL溶解液移至萤光素酶分析平板中，加入100μl基质，用Glomax发光计(Promega社)测定发光。其结果，检测出依赖于病毒量的萤光素酶活性。(图17)。

实施例9：干扰素对HCV感染和增殖的抑制效果

关于干扰素对HCV感染和增殖的抑制效果，以公知的干扰素作为受试药物进行实验，确认使用了在全长HCV基因组序列中整合有报道基因的JFH1突变体(实施例8)的抗HCV物质的筛选系统的有效性。

在病毒感染的24小时前，在两块(2セット)48孔平板的每孔中接种1.2×10⁴个Huh7.5.1细胞。第二天，向细胞中加入100FFU的JFH-A/WT-Rluc或JFH-B/WT-Rluc病毒，感染2小时。感染后将细胞用PBS(-)清洗2次，用含有图18中记载的浓度(0、1、4、20、100U/ml)的IFN-α(Universal Type I干扰素，PBL Interferon Source，NJ)的培养基培养72小时。通过病毒效价测定法(转化灶形成实验)测定上述两块病毒感染平板中的一块平板的病毒感染滴度，测定另一块平板的萤光素酶活性。其结果见图18。

干扰素α剂量依赖性地抑制HCV的感染(图18B)。另外，在萤光素酶分析中显示：所示的萤光素酶活性与感染滴度之间高度相关(图18A)。该结果表明：如果使用整合有Rluc基因的JFH1wt及其突变体，则可以以萤光素酶活性为指标，通过测定感染抑制率，高效率筛选干扰素等的抗HCV物质。

【序列表的自由文本】

SEQ ID NO：3～8为JFH1突变体。

SEQ ID NO：10～18为引物。

CPCH1060918          序列表

<110>国立大学法人东京大学

学校法人日本大学

中国科学院微生物研究所

国立感染症研究所长

财团法人东京都医学研究机构

东丽株式会社

<120>感染性丙型肝炎病毒高生产HCV突变体及其应用

<130>PH-4259CN

<160>18

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>9678

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒JFH1株

<220>

<221>CDS

<222>(341)..(9442)

<400>1

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg  300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atg agc aca aat cct    355

Met Ser Thr Asn Pro

1               5

aaa cct caa aga aaa acc aaa aga aac acc aac cgt cgc cca gaa gac    403

Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Glu Asp

10                  15                  20

gtt aag ttc ccg ggc ggc ggc cag atc gtt ggc gga gta tac ttg ttg    451

Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu

25                  30                  35

ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc acg aca agg aaa act tcg    499

Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Thr Thr Arg Lys Thr Ser

40                  45                  50

gag cgg tcc cag cca cgt ggg aga cgc cag ccc atc ccc aaa gat cgg    547

Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Asp Arg

55                  60                  65

cgc tcc act ggc aag gcc tgg gga aaa cca ggt cgc ccc tgg ccc cta    595

Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Gly Lys Pro Gly Arg Pro Trp Pro Leu

70                  75                  80                  85

tat ggg aat gag gga ctc ggc tgg gca gga tgg ctc ctg tcc ccc cga    643

Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg

90                  95                  100

ggc tct cgc ccc tcc tgg ggc ccc act gac ccc cgg cat agg tcg cgc    691

Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg Ser Arg

105                 110                 115

aac gtg ggt aaa gtc atc gac acc cta acg tgt ggc ttt gcc gac ctc    739

Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu

120                 125                 130

atg ggg tac atc ccc gtc gta ggc gcc ccg ctt agt ggc gcc gcc aga    787

Met Gly Tyr Ile Pro Val Val Gly Ala Pro Leu Ser Gly Ala Ala Arg

135                 140                 145

gct gtc gcg cac ggc gtg aga gtc ctg gag gac ggg gtt aat tat gca    835

Ala Val Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala

150                 155                 160                 165

aca ggg aac cta ccc ggt ttc ccc ttt tct atc ttc ttg ctg gcc ctg     883

Thr Gly Asn Leu Pro Gly Phe Pro Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu

170                 175                 180

ttg tcc tgc atc acc gtt ccg gtc tct gct gcc cag gtg aag aat acc     931

Leu Ser Cys Ile Thr Val Pro Val Ser Ala Ala Gln Val Lys Asn Thr

185                 190                 195

agt agc agc tac atg gtg acc aat gac tgc tcc aat gac agc atc act     979

Ser Ser Ser Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Asp Ser Ile Thr

200                 205                 210

tgg cag ctc gag gct gcg gtt ctc cac gtc ccc ggg tgc gtc ccg tgc    1027

Trp Gln Leu Glu Ala Ala Val Leu His Val Pro Gly Cys Val Pro Cys

215                 220                 225

gag aga gtg ggg aat acg tca cgg tgt tgg gtg cca gtc tcg cca aac    1075

Glu Arg Val Gly Asn Thr Ser Arg Cys Trp Val Pro Val Ser Pro Asn

230                 235                 240                 245

atg gct gtg cgg cag ccc ggt gcc ctc acg cag ggt ctg cgg acg cac    1123

Met Ala Val Arg Gln Pro Gly Ala Leu Thr Gln Gly Leu Arg Thr His

250                 255                 260

atc gat atg gtt gtg atg tcc gcc acc ttc tgc tct gct ctc tac gtg    1171

Ile Asp Met Val Val Met Ser Ala Thr Phe Cys Ser Ala Leu Tyr Val

265                 270                 275

ggg gac ctc tgt ggc ggg gtg atg ctc gcg gcc cag gtg ttc atc gtc    1219

Gly Asp Leu Cys Gly Gly Val Met Leu Ala Ala Gln Val Phe Ile Val

280                 285                 290

tcg ccg cag tac cac tgg ttt gtg caa gaa tgc aat tgc tcc atc tac    1267

Ser Pro Gln Tyr His Trp Phe Val Gln Glu Cys Asn Cys Ser Ile Tyr

295                 300                 305

cct ggc acc atc act gga cac cgc atg gca tgg gac atg atg atg aac    1315

Pro Gly Thr Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn

310                 315                 320                 325

tgg tcg ccc acg gcc acc atg atc ctg gcg tac gtg atg cgc gtc ccc    1363

Trp Ser Pro Thr Ala Thr Met Ile Leu Ala Tyr Val Met Arg Val Pro

330                 335                 340

gag gtc atc ata gac atc gtt agc ggg gct cac tgg ggc gtc atg ttc    1411

Glu Val Ile Ile Asp Ile Val Ser Gly Ala His Trp Gly Val Met Phe

345                 350                 355

ggc ttg gcc tac ttc tct atg cag gga gcg tgg gcg aag gtc att gtc    1459

Gly Leu Ala Tyr Phe Ser Met Gln Gly Ala Trp Ala Lys Val Ile Val

360                 365                 370

atc ctt ctg ctg gcc gct ggg gtg gac gcg ggc acc acc acc gtt gga    1507

Ile Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Asp Ala Gly Thr Thr Thr Val Gly

375                 380                 385

ggc gct gtt gca cgt tcc acc aac gtg att gcc ggc gtg ttc agc cat    1555

Gly Ala Val Ala Arg Ser Thr Asn Val Ile Ala Gly Val Phe Ser His

390                 395                 400                 405

ggc cct cag cag aac att cag ctc att aac acc aac ggc agt tgg cac    1603

Gly Pro Gln Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His

410                 415                 420

atc aac cgt act gcc ttg aat tgc aat gac tcc ttg aac acc ggc ttt    1651

Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe

425                 430                 435

ctc gcg gcc ttg ttc tac acc aac cgc ttt aac tcg tca ggg tgt cca    l699

Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr Asn Arg Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro

440                 445                 450

ggg cgc ctg tcc gcc tgc cgc aac atc gag gct ttc cgg ata ggg tgg    1747

Gly Arg Leu Ser Ala Cys Arg Asn Ile Glu Ala Phe Arg Ile Gly Trp

455                 460                 465

ggc acc cta cag tac gag gat aat gtc acc aat cca gag gat atg agg    1795

Gly Thr Leu Gln Tyr Glu Asp Asn Val Thr Asn Pro Glu Asp Met Arg

470                 475                 480                 485

ccg tac tgc tgg cac tac ccc cca aag ccg tgt ggc gta gtc ccc gcg    1843

Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly Val Val Pro Ala

490                 495                 500

agg tct gtg tgt ggc cca gtg tac tgt ttc acc ccc agc ccg gta gta    1891

Arg Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val

505                 510                 515

gtg ggc acg acc gac aga cgt gga gtg ccc acc tac aca tgg gga gag    1939

Val Gly Thr Thr Asp Arg Arg Gly Val Pro Thr Tyr Thr Trp Gly Glu

520                 525                 530

aat gag aca gat gtc ttc cta ctg aac agc acc cga ccg ccg cag ggc    1987

Asn Glu Thr Asp Val Phe Leu Leu Asn Ser Thr Arg Pro Pro Gln Gly

535                 540                 545

tca tgg ttc ggc tgc acg tgg atg aac tcc act ggt ttc acc aag act    2035

Ser Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr

550                 555                 560                 565

tgt ggc gcg cca cct tgc cgc acc aga gct gac ttc aac gcc agc acg    2083

Cys Gly Ala Pro Pro Cys Arg Thr Arg Ala Asp Phe Asn Ala Ser Thr

570                 575                 580

gac ttg ttg tgc cct acg gat tgt ttt agg aag cat cct gat gcc act    2131

Asp Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Asp Ala Thr

585                 590                 595

tat att aag tgt ggt tct ggg ccc tgg ctc aca cca aag tgc ctg gtc    2179

Tyr Ile Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Lys Cys Leu Val

600                 605                 610

cac tac cct tac aga ctc tgg cat tac ccc tgc aca gtc aat ttt acc    2227

His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr

615                 620                 625

atc ttc aag ata aga atg tat gta ggg ggg gtt gag cac agg ctc acg    2275

Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Thr

630                 635                 640                 645

gcc gca tgc aac ttc act cgt ggg gat cgc tgc gac ttg gag gac agg    2323

Ala Ala Cys Asn Phe Thr Arg Gly Asp Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg

650                 655                 660

gac agg agt cag ctg tct cct ctg ttg cac tct acc acg gaa tgg gcc    2371

Asp Arg Ser Gln Leu Ser Pro Leu Leu His Ser Thr Thr Glu Trp Ala

665                 670                 675

atc ctg ccc tgc acc tac tca gac tta ccc gct ttg tca act ggt ctt    2419

Ile Leu Pro Cys Thr Tyr Ser Asp Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu

680                 685                 690

ctc cac ctt cac cag aac atc gtg gac gta caa tac atg tat ggc ctc    2467

Leu His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Met Tyr Gly Leu

695                 700                 705

tca cct gct atc aca aaa tac gtc gtt cga tgg gag tgg gtg gta ctc    2515

Ser Pro Ala Ile Thr Lys Tyr Val Val Arg Trp Glu Trp Val Val Leu

710                 715                 720                 725

tta ttc ctg ctc tta gcg gac gcc aga gtc tgc gcc tgc ttg tgg atg    2563

Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met

730                 735                 740

ctc atc ttg ttg ggc cag gcc gaa gca gca ttg gag aag ttg gtc gtc    261l

Leu Ile Leu Leu Gly Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Lys Leu Val Val

745                 750                 755

ttg cac gct gcg agt gcg gct aac tgc cat ggc ctc cta tat ttt gcc    2659

Leu His Ala Ala Ser Ala Ala Asn Cys His Gly Leu Leu Tyr Phe Ala

760                 765                 770

atc ttc ttc gtg gca gct tgg cac atc agg ggt cgg gtg gtc ccc ttg    2707

Ile Phe Phe Val Ala Ala Trp His Ile Arg Gly Arg Val Val Pro Leu

775                 780                 785

acc acc tat tgc ctc act ggc cta tgg ccc ttc tgc cta ctg ctc atg    2755

Thr Thr Tyr Cys Leu Thr Gly Leu Trp Pro Phe Cys Leu Leu Leu Met

790                 795                 800                 805

gca ctg ccc cgg cag gct tat gcc tat gac gca cct gtg cac gga cag    2803

Ala Leu Pro Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Asp Ala Pro Val His Gly Gln

810                 815                 820

ata ggc gtg ggt ttg ttg ata ttg atc acc ctc ttc aca ctc acc ccg    2851

Ile Gly Val Gly Leu Leu Ile Leu Ile Thr Leu Phe Thr Leu Thr Pro

825                 830                 835

ggg tat aag acc ctc ctc ggc cag tgt ctg tgg tgg ttg tgc tat ctc    2899

Gly Tyr Lys Thr Leu Leu Gly Gln Cys Leu Trp Trp Leu Cys Tyr Leu

840                 845                 850

ctg acc ctg ggg gaa gcc atg att cag gag tgg gta cca ccc atg cag    2947

Leu Thr Leu Gly Glu Ala Met Ile Gln Glu Trp Val Pro Pro Met Gln

855                 860                 865

gtg cgc ggc ggc cgc gat ggc atc gcg tgg gcc gtc act ata ttc tgc    2995

Val Arg Gly Gly Arg Asp Gly Ile Ala Trp Ala Val Thr Ile Phe Cys

870                 875                 880                 885

ccg ggt gtg gtg ttt gac att acc aaa tgg ctt ttg gcg ttg ctt ggg    3043

Pro Gly Val Val Phe Asp Ile Thr Lys Trp Leu Leu Ala Leu Leu Gly

890                 895                 900

cct gct tac ctc tta agg gcc gct ttg aca cat gtg ccg tac ttc gtc    3091

Pro Ala Tyr Leu Leu Arg Ala Ala Leu Thr His Val Pro Tyr Phe Val

905                 910                 915

aga gct cac gct ctg ata agg gta tgc gct ttg gtg aag cag ctc gcg    3139

Arg Ala His Ala Leu Ile Arg Val Cys Ala Leu Val Lys Gln Leu Ala

920                 925                 930

ggg ggt agg tat gtt cag gtg gcg cta ttg gcc ctt ggc agg tgg act    3187

Gly Gly Arg Tyr Val Gln Val Ala Leu Leu Ala Leu Gly Arg Trp Thr

935                 940                 945

ggc acc tac atc tat gac cac ctc aca cct atg tcg gac tgg gcc gct    3235

Gly Thr Tyr Ile Tyr Asp His Leu Thr Pro Met Ser Asp Trp Ala Ala

950                 955                 960                 965

agc ggc ctg cgc gac tta gcg gtc gcc gtg gaa ccc atc atc ttc agt    3283

Ser Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Ile Ile Phe Ser

970                 975                 980

ccg atg gag aag aag gtc atc gtc tgg gga gcg gag acg gct gca tgt    3331

Pro Met Glu Lys Lys Val Ile Val Trp Gly Ala Glu Thr Ala Ala Cys

985                 990                 995

ggg gac att  cta cat gga ctt ccc  gtg tcc gcc cga ctc  ggc cag     3376

Gly Asp Ile  Leu His Gly Leu Pro  Val Ser Ala Arg Leu  Gly Gln

1000                 1005                 1010

gag atc ctc  ctc ggc cca gct gat  ggc tac acc tcc aag  ggg tgg    3421

Glu Ile Leu  Leu Gly Pro Ala Asp  Gly Tyr Thr Ser Lys  Gly Trp

1015                 1020                 1025

aag ctc ctt  gct ccc atc act gct  tat gcc cag caa aca  cga ggc    3466

Lys Leu Leu  Ala Pro Ile Thr Ala  Tyr Ala Gln Gln Thr  Arg Gly

1030                 1035                 1040

ctc ctg ggc  gcc ata gtg gtg agt  atg acg ggg cgt gac  agg aca    3511

Leu Leu Gly  Ala Ile Val Val Ser  Met Thr Gly Arg Asp  Arg Thr

1045                 1050                 1055

gaa cag gcc  ggg gaa gtc caa atc  ctg tcc aca gtc tct  cag tcc    3556

Glu Gln Ala  Gly Glu Val Gln Ile  Leu Ser Thr Val Ser  Gln Ser

1060                 1065                 1070

ttc ctc gga  aca acc atc tcg ggg  gtt ttg tgg act gtt  tac cac    3601

Phe Leu Gly  Thr Thr Ile Ser Gly  Val Leu Trp Thr Val  Tyr His

1075                 1080                 1085

gga gct ggc  aac aag act cta gcc  ggc tta cgg ggt ccg  gtc acg    3646

Gly Ala Gly  Asn Lys Thr Leu Ala  Gly Leu Arg Gly Pro  Val Thr

1090                 1095                 1100

cag atg tac  tcg agt gct gag ggg  gac ttg gta ggc tgg  ccc agc    3691

Gln Met Tyr  Ser Ser Ala Glu Gly  Asp Leu Val Gly Trp  Pro Ser

1105                 1110                 1115

ccc cct ggg  acc aag tct ttg gag  ccg tgc aag tgt gga  gcc gtc    3736

Pro Pro Gly  Thr Lys Ser Leu Glu  Pro Cys Lys Cys Gly  Ala Val

1120                 1125                 1130

gac cta tat  ctg gtc acg cgg aac  gct gat gtc atc ccg  gct cgg    3781

Asp Leu Tyr  Leu Val Thr Arg Asn  Ala Asp Val Ile Pro  Ala Arg

1135                 1140                 1145

aga cgc ggg  gac aag cgg gga gca  ttg ctc tcc ccg aga  ccc att    3826

Arg Arg Gly  Asp Lys Arg Gly Ala  Leu Leu Ser Pro Arg  Pro Ile

1150                 1155                 1160

tcg acc ttg  aag ggg tcc tcg ggg  ggg ccg gtg ctc tgc  cct agg    3871

Ser Thr Leu  Lys Gly Ser Ser Gly  Gly Pro Val Leu Cys  Pro Arg

1165                 1170                 1175

ggc cac gtc  gtt ggg ctc ttc cga  gca gct gtg tgc tct  cgg ggc    3916

Gly His Val  Val Gly Leu Phe Arg  Ala Ala Val Cys Ser  Arg Gly

1180                 1185                 1190

gtg gcc aaa  tcc atc gat ttc atc  ccc gtt gag aca ctc  gac gtt    3961

Val Ala Lys  Ser Ile Asp Phe Ile  Pro Val Glu Thr Leu  Asp Val

1195                 1200                 1205

gtt aca agg  tct ccc act ttc agt  gac aac agc acg cca  ccg gct    4006

Val Thr Arg  Ser Pro Thr Phe Ser  Asp Asn Ser Thr Pro  Pro Ala

1210                 1215                 1220

gtg ccc cag  acc tat cag gtc ggg  tac ttg cat gct cca  act ggc    4051

Val Pro Gln  Thr Tyr Gln Val Gly  Tyr Leu His Ala Pro  Thr Gly

1225                 1230                 1235

agt gga aag  agc acc aag gtc cct  gtc gcg tat gcc gcc  cag ggg    4096

Ser Gly Lys  Ser Thr Lys Val Pro  Val Ala Tyr Ala Ala  Gln Gly

1240                 1245                 1250

tac aaa gta  cta gtg ctt aac ccc  tcg gta gct gcc acc  ctg ggg    4141

Tyr Lys Val  Leu Val Leu Asn Pro  Ser Val Ala Ala Thr  Leu Gly

1255                 1260                 1265

ttt ggg gcg  tac cta tcc aag gca  cat ggc atc aat ccc  aac att    4186

Phe Gly Ala  Tyr Leu Ser Lys Ala  His Gly Ile Asn Pro  Asn Ile

1270                 1275                 1280

agg act gga  gtc agg acc gtg atg  acc ggg gag gcc atc  acg tac    4231

Arg Thr Gly  Val Arg Thr Val Met  Thr Gly Glu Ala Ile  Thr Tyr

1285                 1290                 1295

tcc aca tat  ggc aaa ttt ctc gcc  gat ggg ggc tgc gct  agc ggc    4276

Ser Thr Tyr  Gly Lys Phe Leu Ala  Asp Gly Gly Cys Ala  Ser Gly

1300                 1305                 1310

gcc tat gac  atc atc ata tgc gat  gaa tgc cac gct gtg  gat gct    4321

Ala Tyr Asp  Ile Ile Ile Cys Asp  Glu Cys His Ala Val  Asp Ala

1315                 1320                 1325

acc tcc att  ctc ggc atc gga acg  gtc ctt gat caa gca  gag aca    4366

Thr Ser Ile  Leu Gly Ile Gly Thr  Val Leu Asp Gln Ala  Glu Thr

1330                 1335                 1340

gcc ggg gtc  aga cta act gtg ctg  gct acg gcc aca ccc  ccc ggg    4411

Ala Gly Val  Arg Leu Thr Val Leu  Ala Thr Ala Thr Pro  Pro Gly

1345                 1350                 1355

tca gtg aca  acc ccc cat ccc gat  ata gaa gag gta ggc  ctc ggg    4456

Ser Val Thr  Thr Pro His Pro Asp  Ile Glu Glu Val Gly  Leu Gly

1360                 1365                 1370

cgg gag ggt  gag atc ccc ttc tat  ggg agg gcg att ccc  cta tcc    4501

Arg Glu Gly  Glu Ile Pro Phe Tyr  Gly Arg Ala Ile Pro  Leu Ser

1375                 1380                 1385

tgc atc aag  gga ggg aga cac ctg  att ttc tgc cac tca  aag aaa    4546

Cys Ile Lys  Gly Gly Arg His Leu  Ile Phe Cys His Ser  Lys Lys

1390                 1395                 1400

aag tgt gac  gag ctc gcg gcg gcc  ctt cgg ggc atg ggc  ttg aat    4591

Lys Cys Asp  Glu Leu Ala Ala Ala  Leu Arg Gly Met Gly  Leu Asn

1405                 1410                 1415

gcc gtg gca  tac tat aga ggg ttg  gac gtc tcc ata ata  cca gct    4636

Ala Val Ala  Tyr Tyr Arg Gly Leu  Asp Val Ser Ile Ile  Pro Ala

1420                 1425                 1430

cag gga gat  gtg gtg gtc gtc gcc  acc gac gcc ctc atg  acg ggg    4681

Gln Gly Asp  Val Val Val Val Ala  Thr Asp Ala Leu Met  Thr Gly

1435                 1440                 1445

tac act gga  gac ttt gac tcc gtg  atc gac tgc aat gta  gcg gtc    4726

Tyr Thr Gly  Asp Phe Asp Ser Val  Ile Asp Cys Asn Val  Ala Val

1450                 1455                 1460

acc caa gct  gtc gac ttc agc ctg  gac ccc acc ttc act  ata acc    4771

Thr Gln Ala  Val Asp Phe Ser Leu  Asp Pro Thr Phe Thr  Ile Thr

1465                 1470                 1475

aca cag act  gtc cca caa gac gct  gtc tca cgc agt cag  cgc cgc    4816

Thr Gln Thr  Val Pro Gln Asp Ala  Val Ser Arg Ser Gln  Arg Arg

1480                 1485                 1490

ggg cgc aca  ggt aga gga aga cag  ggc act tat agg tat  gtt tcc    4861

Gly Arg Thr  Gly Arg Gly Arg Gln  Gly Thr Tyr Arg Tyr  Val Ser

1495                 1500                 1505

act ggt gaa  cga gcc tca gga atg  ttt gac agt gta gtg  ctt tgt    4906

Thr Gly Glu  Arg Ala Ser Gly Met  Phe Asp Ser Val Val  Leu Cys

1510                 1515                 1520

gag tgc tac  gac gca ggg gct gcg  tgg tac gat ctc aca  cca gcg    4951

Glu Cys Tyr  Asp Ala Gly Ala Ala  Trp Tyr Asp Leu Thr  Pro Ala

1525                 1530                 1535

gag acc acc  gtc agg ctt aga gcg  tat ttc aac acg ccc  ggc cta    4996

Glu Thr Thr  Val Arg Leu Arg Ala  Tyr Phe Asn Thr Pro  Gly Leu

1540                 1545                 1550

ccc gtg tgt  caa gac cat ctt gaa  ttt tgg gag gca gtt  ttc acc    5041

Pro Val Cys  Gln Asp His Leu Glu  Phe Trp Glu Ala Val  Phe Thr

1555                 1560                 1565

ggc ctc aca  cac ata gac gcc cac  ttc ctc tcc caa aca  aag caa    5086

Gly Leu Thr  His Ile Asp Ala His  Phe Leu Ser Gln Thr  Lys Gln

1570                 1575                 1580

gcg ggg gag  aac ttc gcg tac cta  gta gcc tac caa gct  acg gtg    5131

Ala Gly Glu  Asn Phe Ala Tyr Leu  Val Ala Tyr Gln Ala  Thr Val

1585                 1590                 1595

tgc gcc aga  gcc aag gcc cct ccc  ccg tcc tgg gac gcc  atg tgg    5176

Cys Ala Arg  Ala Lys Ala Pro Pro  Pro Ser Trp Asp Ala  Met Trp

1600                 1605                 1610

aag tgc ctg  gcc cga ctc aag cct  acg ctt gcg ggc ccc  aca cct    5221

Lys Cys Leu  Ala Arg Leu Lys Pro  Thr Leu Ala Gly Pro  Thr Pro

1615                 1620                 1625

ctc ctg tac  cgt ttg ggc cct att  acc aat gag gtc acc  ctc aca    5266

Leu Leu Tyr  Arg Leu Gly Pro Ile  Thr Asn Glu Val Thr  Leu Thr

1630                 1635                 1640

cac cct ggg  acg aag tac atc gcc  aca tgc atg caa gct  gac ctt    5311

His Pro Gly  Thr Lys Tyr Ile Ala  Thr Cys Met Gln Ala  Asp Leu

1645                 1650                 1655

gag gtc atg  acc agc acg tgg gtc  cta gct gga gga gtc  ctg gca    5356

Glu Val Met  Thr Ser Thr Trp Val  Leu Ala Gly Gly Val  Leu Ala

1660                 1665                 1670

gcc gtc gcc  gca tat tgc ctg gcg  act gga tgc gtt tcc  atc atc    5401

Ala Val Ala  Ala Tyr Cys Leu Ala  Thr Gly Cys Val Ser  Ile Ile

1675                 1680                 1685

ggc cgc ttg  cac gtc aac cag cga  gtc gtc gtt gcg ccg  gat aag    5446

Gly Arg Leu  His Val Asn Gln Arg  Val Val Val Ala Pro  Asp Lys

1690                 1695                 1700

gag gtc ctg  tat gag gct ttt gat  gag atg gag gaa tgc  gcc tct    5491

Glu Val Leu  Tyr Glu Ala Phe Asp  Glu Met Glu Glu Cys  Ala Ser

1705                 1710                 1715

agg gcg gct  ctc atc gaa gag ggg  cag cgg ata gcc gag  atg ttg    5536

Arg Ala Ala  Leu Ile Glu Glu Gly  Gln Arg I1e Ala Glu  Met Leu

1720                 1725                 1730

aag tcc aag  atc caa ggc ttg ctg  cag cag gcc tct aag  cag gcc    5581

Lys Ser Lys  Ile Gln Gly Leu Leu  Gln Gln Ala Ser Lys  Gln Ala

1735                 1740                 1745

cag gac ata  caa ccc gct atg cag  gct tca tgg ccc aaa  gtg gaa    5626

Gln Asp Ile  Gln Pro Ala Met Gln  Ala Ser Trp Pro Lys  Val Glu

1750                 1755                 1760

caa ttt tgg  gcc aga cac atg tgg  aac ttc att agc ggc  atc caa    5671

Gln Phe Trp  Ala Arg His Met Trp  Asn Phe Ile Ser Gly  Ile Gln

1765                 1770                 1775

tac ctc gca  gga ttg tca aca ctg  cca ggg aac ccc gcg  gtg gct    5716

Tyr Leu Ala  Gly Leu Ser Thr Leu  Pro Gly Asn Pro Ala  Val Ala

1780                 1785                 1790

tcc atg atg  gca ttc agt gcc gcc  ctc acc agt ccg ttg  tcg acc    5761

Ser Met Met  Ala Phe Ser Ala Ala  Leu Thr Ser Pro Leu  Ser Thr

1795                 1800                 1805

agt acc acc  atc ctt ctc aac atc  atg gga ggc tgg tta  gcg tcc    5806

Ser Thr Thr  Ile Leu Leu Asn Ile  Met Gly Gly Trp Leu  Ala Ser

1810                 1815                 1820

cag atc gca  cca ccc gcg ggg gcc  acc ggc ttt gtc gtc  agt ggc    5851

Gln Ile Ala  Pro Pro Ala Gly Ala  Thr Gly Phe Val Val  Ser Gly

1825                 1830                 1835

ctg gtg ggg  gct gcc gtg ggc agc  ata ggc ctg ggt aag  gtg ctg    5896

Leu Val Gly  Ala Ala Val Gly Ser  Ile Gly Leu Gly Lys  Val Leu

1840                 1845                 1850

gtg gac atc  ctg gca gga tat ggt  gcg ggc att tcg ggg  gcc ctc    5941

Val Asp Ile  Leu Ala Gly Tyr Gly  Ala Gly Ile Ser Gly  Ala Leu

1855                 1860                 1865

gtc gca ttc  aag atc atg tct ggc  gag aag ccc tct atg  gaa gat    5986

Val Ala Phe  Lys Ile Met Ser Gly  Glu Lys Pro Ser Met  Glu Asp

1870                 1875                 1880

gtc atc aat  cta ctg cct ggg atc  ctg tct ccg gga gcc  ctg gtg    6031

Val Ile Asn  Leu Leu Pro Gly Ile  Leu Ser Pro Gly Ala  Leu Val

1885                 1890                 1895

gtg ggg gtc  atc tgc gcg gcc att  ctg cgc cgc cac gtg  gga ccg    6076

Val Gly Val  Ile Cys Ala Ala Ile  Leu Arg Arg His Val  Gly Pro

1900                 1905                 1910

ggg gag ggc  gcg gtc caa tgg atg  aac agg ctt att gcc  ttt gct    6121

Gly Glu Gly  Ala Val Gln Trp Met  Asn Arg Leu Ile Ala  Phe Ala

1915                 1920                 1925

tcc aga gga  aac cac gtc gcc cct  act cac tac gtg acg  gag tcg    6166

Ser Arg Gly  Asn His Val Ala Pro  Thr His Tyr Val Thr  Glu Ser

1930                 1935                 1940

gat gcg tcg  cag cgt gtg acc caa  cta ctt ggc tct ctt  act ata    6211

Asp Ala Ser  Gln Arg Val Thr Gln  Leu Leu Gly Ser Leu  Thr Ile

1945                 1950                 1955

acc agc cta  ctc aga aga ctc cac  aat tgg ata act gag  gac tgc    6256

Thr Ser Leu  Leu Arg Arg Leu His  Asn Trp Ile Thr Glu  Asp Cys

1960                 1965                 1970

ccc atc cca  tgc tcc gga tcc tgg  ctc cgc gac gtg tgg  gac tgg    6301

Pro Ile Pro  Cys Ser Gly Ser Trp  Leu Arg Asp Val Trp  Asp Trp

1975                 1980                 1985

gtt tgc acc  atc ttg aca gac ttc  aaa aat tgg ctg acc  tct aaa    6346

Val Cys Thr  Ile Leu Thr Asp Phe  Lys Asn Trp Leu Thr  Ser Lys

1990                 1995                 2000

ttg ttc ccc  aag ctg ccc ggc ctc  ccc ttc atc tct tgt  caa aag    6391

Leu Phe Pro  Lys Leu Pro Gly Leu  Pro Phe Ile Ser Cys  Gln Lys

2005                 2010                 2015

ggg tac aag  ggt gtg tgg gcc ggc  act ggc atc atg acc  acg cgc    6436

Gly Tyr Lys  Gly Val Trp Ala Gly  Thr Gly Ile Met Thr  Thr Arg

2020                 2025                 2030

tgc cct tgc  ggc gcc aac atc tct  ggc aat gtc cgc ctg  ggc tct    6481

Cys Pro Cys  Gly Ala Asn Ile Ser  Gly Asn Val Arg Leu  Gly Ser

2035                 2040                 2045

atg agg atc  aca ggg cct aaa acc  tgc atg aac acc tgg  cag ggg    6526

Met Arg Ile  Thr Gly Pro Lys Thr  Cys Met Asn Thr Trp  Gln Gly

2050                 2055                 2060

acc ttt cct  atc aat tgc tac acg  gag ggc cag tgc gcg  ccg aaa    6571

Thr Phe Pro  Ile Asn Cys Tyr Thr  Glu Gly Gln Cys Ala  Pro Lys

2065                 2070                 2075

ccc ccc acg  aac tac aag acc gcc  atc tgg agg gtg gcg  gcc tcg    6616

Pro Pro Thr  Asn Tyr Lys Thr Ala  Ile Trp Arg Val Ala  Ala Ser

2080                 2085                 2090

gag tac gcg  gag gtg acg cag cat  ggg tcg tac tcc tat  gta aca    6661

Glu Tyr Ala  Glu Val Thr Gln His  Gly Ser Tyr Ser Tyr  Val Thr

2095                 2100                 2105

gga ctg acc  act gac aat ctg aaa  att cct tgc caa cta  cct tct    6706

Gly Leu Thr  Thr Asp Asn Leu Lys  Ile Pro Cys Gln Leu  Pro Ser

2110                 2115                 2120

cca gag ttt  ttc tcc tgg gtg gac  ggt gtg cag atc cat  agg ttt    6751

Pro Glu Phe  Phe Ser Trp Val Asp  Gly Val Gln Ile His  Arg Phe

2125                 2130                 2135

gca ccc aca  cca aag ccg ttt ttc  cgg gat gag gtc tcg  ttc tgc    6796

Ala Pro Thr  Pro Lys Pro Phe Phe  Arg Asp Glu Val Ser  Phe Cys

2140                 2145                 2150

gtt ggg ctt  aat tcc tat gct gtc  ggg tcc cag ctt ccc  tgt gaa    6841

Val Gly Leu  Asn Ser Tyr Ala Val  Gly Ser Gln Leu Pro  Cys Glu

2155                 2160                 2165

cct gag ccc  gac gca gac gta ttg  agg tcc atg cta aca  gat ccg    6886

Pro Glu Pro  Asp Ala Asp Val Leu  Arg Ser Met Leu Thr  Asp Pro

2170                 2175                 2180

ccc cac atc  acg gcg gag act gcg  gcg cgg cgc ttg gca  cgg gga    6931

Pro His Ile  Thr Ala Glu Thr Ala  Ala Arg Arg Leu Ala  Arg Gly

2185                 2190                 2195

tca cct cca  tct gag gcg agc tcc  tca gtg agc cag cta  tca gca    6976

Ser Pro Pro  Ser Glu Ala Ser Ser  Ser Val Ser Gln Leu  Ser Ala

2200                 2205                 2210

ccg tcg ctg  cgg gcc acc tgc acc  acc cac agc aac acc  tat gac    7021

Pro Ser Leu  Arg Ala Thr Cys Thr  Thr His Ser Asn Thr  Tyr Asp

2215                 2220                 2225

gtg gac atg  gtc gat gcc aac ctg  ctc atg gag ggc ggt  gtg gct    7066

Val Asp Met  Val Asp Ala Asn Leu  Leu Met Glu Gly Gly  Val Ala

2230                 2235                 2240

cag aca gag  cct gag tcc agg gtg  ccc gtt ctg gac ttt  ctc gag    7111

Gln Thr Glu  Pro Glu Ser Arg Val  Pro Val Leu Asp Phe  Leu Glu

2245                 2250                 2255

cca atg gcc  gag gaa gag agc gac  ctt gag ccc tca ata  cca tcg    7156

Pro Met Ala  Glu Glu Glu Ser Asp  Leu Glu Pro Ser Ile  Pro Ser

2260                 2265                 2270

gag tgc atg  ctc ccc agg agc ggg  ttt cca cgg gcc tta  ccg gct    7201

Glu Cys Met  Leu Pro Arg Ser Gly  Phe Pro Arg Ala Leu  Pro Ala

2275                 2280                 2285

tgg gca cgg  cct gac tac aac ccg  ccg ctc gtg gaa tcg  tgg agg    7246

Trp Ala Arg  Pro Asp Tyr Asn Pro  Pro Leu Val Glu Ser  Trp Arg

2290                 2295                 2300

agg cca gat  tac caa ccg ccc acc  gtt gct ggt tgt gct  ctc ccc    7291

Arg Pro Asp  Tyr Gln Pro Pro Thr  Val Ala Gly Cys Ala  Leu Pro

2305                 2310                 2315

ccc ccc aag  aag gcc ccg acg cct  ccc cca agg aga cgc  cgg aca    7336

Pro Pro Lys  Lys Ala Pro Thr Pro  Pro Pro Arg Arg Arg  Arg Thr

2320                 2325                 2330

gtg ggt ctg  agc gag agc acc ata  tca gaa gcc ctc cag  caa ctg    7381

Val Gly Leu  Ser Glu Ser Thr Ile  Ser Glu Ala Leu Gln  Gln Leu

2335                 2340                 2345

gcc atc aag  acc ttt ggc cag ccc  ccc tcg agc ggt gat  gca ggc    7426

Ala Ile Lys  Thr Phe Gly Gln Pro  Pro Ser Ser Gly Asp  Ala Gly

2350                 2355                 2360

tcg tcc acg  ggg gcg ggc gcc gcc  gaa tcc ggc ggt ccg  acg tcc    7471

Ser Ser Thr  Gly Ala Gly Ala Ala  Glu Ser Gly Gly Pro  Thr Ser

2365                 2370                 2375

cct ggt gag  ccg gcc ccc tca gag  aca ggt tcc gcc tcc  tct atg    7516

Pro Gly Glu  Pro Ala Pro Ser Glu  Thr Gly Ser Ala Ser  Ser Met

2380                 2385                 2390

ccc ccc ctc  gag ggg gag cct gga  gat ccg gac ctg gag  tct gat    7561

Pro Pro Leu  Glu Gly Glu Pro Gly  Asp Pro Asp Leu Glu  Ser Asp

2395                 2400                 2405

cag gta gag  ctt caa cct ccc ccc  cag ggg ggg ggg gta  gct ccc    7606

Gln Val Glu  Leu Gln Pro Pro Pro  Gln Gly Gly Gly Val  Ala Pro

2410                 2415                 2420

ggt tcg ggc  tcg ggg tct tgg tct  act tgc tcc gag gag  gac gat    7651

Gly Ser Gly  Ser Gly Ser Trp Ser  Thr Cys Ser Glu Glu  Asp Asp

2425                 2430                 2435

acc acc gtg  tgc tgc tcc atg tca  tac tcc tgg acc ggg  gct cta    7696

Thr Thr Val  Cys Cys Ser Met Ser  Tyr Ser Trp Thr Gly  Ala Leu

2440                 2445                 2450

ata act ccc  tgt agc ccc gaa gag  gaa aag ttg cca atc  aac cct    7741

Ile Thr Pro  Cys Ser Pro Glu Glu  Glu Lys Leu Pro Ile  Asn Pro

2455                 2460                 2465

ttg agt aac  tcg ctg ttg cga tac  cat aac aag gtg tac  tgt aca    7786

Leu Ser Asn  Ser Leu Leu Arg Tyr  His Asn Lys Val Tyr  Cys Thr

2470                 2475                 2480

aca tca aag  agc gcc tca cag agg  gct aaa aag gta act  ttt gac    7831

Thr Ser Lys  Ser Ala Ser Gln Arg  Ala Lys Lys Val Thr  Phe Asp

2485                 2490                 2495

agg acg caa  gtg ctc gac gcc cat  tat gac tca gtc tta  aag gac    7876

Arg Thr Gln  Val Leu Asp Ala His  Tyr Asp Ser Val Leu  Lys Asp

2500                 2505                 2510

atc aag cta  gcg gct tcc aag gtc  agc gca agg ctc ctc  acc ttg    7921

Ile Lys Leu  Ala Ala Ser Lys Val  Ser Ala Arg Leu Leu  Thr Leu

2515                 2520                 2525

gag gag gcg  tgc cag ttg act cca  ccc cat tct gca aga  tcc aag    7966

Glu Glu Ala  Cys Gln Leu Thr Pro  Pro His Ser Ala Arg  Ser Lys

2530                 2535                 2540

tat gga ttc  ggg gcc aag gag gtc  cgc agc ttg tcc ggg  agg gcc    8011

Tyr Gly Phe  Gly Ala Lys Glu Val  Arg Ser Leu Ser Gly  Arg Ala

2545                 2550                 2555

gtt aac cac  atc aag tcc gtg tgg  aag gac ctc ctg gaa  gac cca    8056

Val Asn His  Ile Lys Ser Val Trp  Lys Asp Leu Leu Glu  Asp Pro

2560                 2565                 2570

caa aca cca  att ccc aca acc atc  atg gcc aaa aat gag  gtg ttc    8101

Gln Thr Pro  Ile Pro Thr Thr Ile  Met Ala Lys Asn Glu  Val Phe

2575                 2580                 2585

tgc gtg gac  ccc gcc aag ggg ggt  aag aaa cca gct cgc  ctc atc    8146

Cys Val Asp  Pro Ala Lys Gly Gly  Lys Lys Pro Ala Arg  Leu Ile

2590                 2595                 2600

gtt tac cct  gac ctc ggc gtc cgg  gtc tgc gag aaa atg  gcc ctc    8191

Val Tyr Pro  Asp Leu Gly Val Arg  Val Cys Glu Lys Met  Ala Leu

2605                 2610                 2615

tat gac att  aca caa aag ctt cct  cag gcg gta atg gga  gct tcc    8236

Tyr Asp Ile  Thr Gln Lys Leu Pro  Gln Ala Val Met Gly  Ala Ser

2620                 2625                 2630

tat ggc ttc  cag tac tcc cct gcc  caa cgg gtg gag tat  ctc ttg    8281

Tyr Gly Phe  Gln Tyr Ser Pro Ala  Gln Arg Val Glu Tyr  Leu Leu

2635                 2640                 2645

aaa gca tgg  gcg gaa aag aag gac  ccc atg ggt ttt tcg  tat gat    8326

Lys Ala Trp  Ala Glu Lys Lys Asp  Pro Met Gly Phe Ser  Tyr Asp

2650                 2655                 2660

acc cga tgc  ttc gac tca acc gtc  act gag aga gac atc  agg acc    8371

Thr Arg Cys  Phe Asp Ser Thr Val  Thr Glu Arg Asp Ile  Arg Thr

2665                 2670                 2675

gag gag tcc  ata tac cag gcc tgc  tcc ctg ccc gag gag  gcc cgc    8416

Glu Glu Ser  Ile Tyr Gln Ala Cys  Ser Leu Pro Glu Glu  Ala Arg

2680                 2685                 2690

act gcc ata  cac tcg ctg act gag  aga ctt tac gta gga  ggg ccc    8461

Thr Ala Ile  His Ser Leu Thr Glu  Arg Leu Tyr Val Gly  Gly Pro

2695                 2700                 2705

atg ttc aac  agc aag ggt caa acc  tgc ggt tac aga cgt  tgc cgc    8506

Met Phe Asn  Ser Lys Gly Gln Thr  Cys Gly Tyr Arg Arg  Cys Arg

2710                 2715                 2720

gcc agc ggg  gtg cta acc act agc  atg ggt aac acc atc  aca tgc    8551

Ala Ser Gly  Val Leu Thr Thr Ser  Met Gly Asn Thr Ile  Thr Cys

2725                 2730                 2735

tat gtg aaa  gcc cta gcg gcc tgc  aag gct gcg ggg ata  gtt gcg    8596

Tyr Val Lys  Ala Leu Ala Ala Cys  Lys Ala Ala Gly Ile  Val Ala

2740                 2745                 2750

ccc aca atg  ctg gta tgc ggc gat  gac cta gta gtc atc  tca gaa    8641

Pro Thr Met  Leu Val Cys Gly Asp  Asp Leu Val Val Ile  Ser Glu

2755                 2760                 2765

agc cag ggg  act gag gag gac gag  cgg aac ctg aga gcc  ttc acg    8686

Ser Gln Gly  Thr Glu Glu Asp Glu  Arg Asn Leu Arg Ala  Phe Thr

2770                 2775                 2780

gag gcc atg  acc agg tac tct gcc  cct cct ggt gat ccc  ccc aga    8731

Glu Ala Met  Thr Arg Tyr Ser Ala  Pro Pro Gly Asp Pro  Pro Arg

2785                 2790                 2795

ccg gaa tat  gac ctg gag cta ata  aca tcc tgt tcc tca  aat gtg    8776

Pro Glu Tyr  Asp Leu Glu Leu Ile  Thr Ser Cys Ser Ser  Asn Val

2800                 2805                 2810

tct gtg gcg  ttg ggc ccg cgg ggc  cgc cgc aga tac tac  ctg acc    8821

Ser Val Ala  Leu Gly Pro Arg Gly  Arg Arg Arg Tyr Tyr  Leu Thr

2815                 2820                 2825

aga gac cca  acc act cca ctc gcc  cgg gct gcc tgg gaa  aca gtt    8866

Arg Asp Pro  Thr Thr Pro Leu Ala  Arg Ala Ala Trp Glu  Thr Val

2830                 2835                 2840

aga cac tcc  cct atc aat tca tgg  ctg gga aac atc atc  cag tat    8911

Arg His Ser  Pro Ile Asn Ser Trp  Leu Gly Asn Ile Ile  Gln Tyr

2845                 2850                 2855

gct cca acc  ata tgg gtt cgc atg  gtc cta atg aca cac  ttc ttc    8956

Ala Pro Thr  Ile Trp Val Arg Met  Val Leu Met Thr His  Phe Phe

2860                 2865                 2870

tcc att ctc  atg gtc caa gac acc  ctg gac cag aac ctc  aac ttt    9001

Ser Ile Leu  Met Val Gln Asp Thr  Leu Asp Gln Asn Leu  Asn Phe

2875                 2880                 2885

gag atg tat  gga tca gta tac tcc  gtg aat cct ttg gac  ctt cca    9046

Glu Met Tyr  Gly Ser Val Tyr Ser  Val Asn Pro Leu Asp  Leu Pro

2890                 2895                 2900

gcc ata att  gag agg tta cac ggg  ctt gac gcc ttt tct  atg cac    9091

Ala Ile Ile  Glu Arg Leu His Gly  Leu Asp Ala Phe Ser  Met His

2905                 2910                 2915

aca tac tct  cac cac gaa ctg acg  cgg gtg gct tca gcc  ctc aga    9136

Thr Tyr Ser  His His Glu Leu Thr  Arg Val Ala Ser Ala  Leu Arg

2920                 2925                 2930

aaa ctt ggg  gcg cca ccc ctc agg  gtg tgg aag agt cgg  gct cgc    9181

Lys Leu Gly  Ala Pro Pro Leu Arg  Val Trp Lys Ser Arg  Ala Arg

2935                 2940                 2945

gca gtc agg  gcg tcc ctc atc tcc  cgt gga ggg aaa gcg  gcc gtt    9226

Ala Val Arg  Ala Ser Leu Ile Ser  Arg Gly Gly Lys Ala  Ala Val

2950                 2955                 2960

tgc ggc cga  tat ctc ttc aat tgg  gcg gtg aag acc aag  ctc aaa    9271

Cys Gly Arg  Tyr Leu Phe Asn Trp  Ala Val Lys Thr Lys  Leu Lys

2965                 2970                 2975

ctc act cca  ttg ccg gag gcg cgc  cta ctg gac tta tcc  agt tgg    9316

Leu Thr Pro  Leu Pro Glu Ala Arg  Leu Leu Asp Leu Ser  Ser Trp

2980                 2985                 2990

ttc acc gtc  ggc gcc ggc ggg ggc  gac att ttt cac agc  gtg tcg    9361

Phe Thr Val  Gly Ala Gly Gly Gly  Asp Ile Phe His Ser  Val Ser

2995                 3000                 3005

cgc gcc cga  ccc cgc tca tta ctc  ttc ggc cta ctc cta  ctt ttc    9406

Arg Ala Arg  Pro Arg Ser Leu Leu  Phe Gly Leu Leu Leu  Leu Phe

3010                 3015                 3020

gta ggg gta  ggc ctc ttc cta ctc  ccc gct cgg tag agcggcacac    9452

Val Gly Val  Gly Leu Phe Leu Leu  Pro Ala Arg

3025                 3030

actaggtaca ctccatagct aactgttcct tttttttttt tttttttttt tttttttttt    9512

tttttttttt ttcttttttt tttttttccc tctttcttcc cttctcatct tattctactt    9572

tctttcttgg tggctccatc ttagccctag tcacggctag ctgtgaaagg tccgtgagcc  9632

gcatgactgc agagagtgcc gtaactggtc tctctgcaga tcatgt                 9678

<210>2

<211>3033

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒JFH1株

<400>2

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn

1               5                   10                  15

Arg Arg Pro Glu Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly

20                  25                  30

Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Thr

35                  40                  45

Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro

50                  55                  60

Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Gly Lys Pro Gly

65                  70                  75                  80

Arg Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp

85                  90                  95

Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro

100                 105                 110

Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys

115                 120                 125

Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Val Val Gly Ala Pro Leu

130                 135                 140

Ser Gly Ala Ala Arg Ala Val Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp

145                 150                 155                 160

Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Phe Pro Phe Ser Ile

165                 170                 175

Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Ile Thr Val Pro Val Ser Ala Ala

180                 185                 190

Gln Val Lys Asn Thr Ser Ser Ser Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys Ser

195                 200                 205

Asn Asp Ser Ile Thr Trp Gln Leu Glu Ala Ala Val Leu His Val Pro

210                 215                 220

Gly Cys Val Pro Cys Glu Arg Val Gly Asn Thr Ser Arg Cys Trp Val

225                 230                 235                 240

Pro Val Ser Pro Asn Met Ala Val Arg Gln Pro Gly Ala Leu Thr Gln

245                 250                 255

Gly Leu Arg Thr His Ile Asp Met Val Val Met Ser Ala Thr Phe Cys

260                 265                 270

Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Gly Val Met Leu Ala Ala

275                 280                 285

Gln Val Phe Ile Val Ser Pro Gln Tyr His Trp Phe Val Gln Glu Cys

290                 295                 300

Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly Thr Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp

305                 310                 315                 320

Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Thr Met Ile Leu Ala Tyr

325                 330                 335

Val Met Arg Val Pro Glu Val Ile Ile Asp Ile Val Ser Gly Ala His

340                 345                 350

Trp Gly Val Met Phe Gly Leu Ala Tyr Phe Ser Met Gln Gly Ala Trp

355                 360                 365

Ala Lys Val Ile Val Ile Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Asp Ala Gly

370                 375                 380

Thr Thr Thr Val Gly Gly Ala Val Ala Arg Ser Thr Asn Val Ile Ala

385                 390                 395                 400

Gly Val Phe Ser His Gly Pro Gln Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr

405                 410                 415

Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser

420                 425                 430

Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr Asn Arg Phe Asn

435                 440                 445

Ser Ser Gly Cys Pro Gly Arg Leu Ser Ala Cys Arg Asn Ile Glu Ala

450                 455                 460

Phe Arg Ile Gly Trp Gly Thr Leu Gln Tyr Glu Asp Asn Val Thr Asn

465                 470                 475                 480

Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys

485                 490                 495

Gly Val Val Pro Ala Arg Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr

500                 505                 510

Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Arg Gly Val Pro Thr

515                 520                 525

Tyr Thr Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Phe Leu Leu Asn Ser Thr

530                 535                 540

Arg Pro Pro Gln Gly Ser Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr

545                 550                 555                 560

Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Ala Pro Pro Cys Arg Thr Arg Ala Asp

565                 570                 575

Phe Asn Ala Ser Thr Asp Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys

580                 585                 590

His Pro Asp Ala Thr Tyr Ile Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr

595                 600                 605

Pro Lys Cys Leu Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys

610                 615                 620

Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val

625                 630                 635                 640

Glu His Arg Leu Thr Ala Ala Cys Asn Phe Thr Arg Gly Asp Arg Cys

645                 650                 655

Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Gln Leu Ser Pro Leu Leu His Ser

660                 665                 670

Thr Thr Glu Trp Ala Ile Leu Pro Cys Thr Tyr Ser Asp Leu Pro Ala

675                 680                 685

Leu Ser Thr Gly Leu Leu His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln

690                 695                 700

Tyr Met Tyr Gly Leu Ser Pro Ala Ile Thr Lys Tyr Val Val Arg Trp

705                 710                 715                 720

Glu Trp Val Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys

725                 730                 735

Ala Cys Leu Trp Met Leu Ile Leu Leu Gly Gln Ala Glu Ala Ala Leu

740                 745                 750

Glu Lys Leu Val Val Leu His Ala Ala Ser Ala Ala Asn Cys His Gly

755                 760                 765

Leu Leu Tyr Phe Ala Ile Phe Phe Val Ala Ala Trp His Ile Arg Gly

770                 775                 780

Arg Val Val Pro Leu Thr Thr Tyr Cys Leu Thr Gly Leu Trp Pro Phe

785                 790                 795                 800

Cys Leu Leu Leu Met Ala Leu Pro Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Asp Ala

805                 810                 815

Pro Val His Gly Gln Ile Gly Val Gly Leu Leu Ile Leu Ile Thr Leu

820                 825                 830

Phe Thr Leu Thr Pro Gly Tyr Lys Thr Leu Leu Gly Gln Cys Leu Trp

835                 840                 845

Trp Leu Cys Tyr Leu Leu Thr Leu Gly Glu Ala Met Ile Gln Glu Trp

850                 855                 860

Val Pro Pro Met Gln Val Arg Gly Gly Arg Asp Gly Ile Ala Trp Ala

865                 870                 875                 880

Val Thr Ile Phe Cys Pro Gly Val Val Phe Asp Ile Thr Lys Trp Leu

885                 890                 895

Leu Ala Leu Leu Gly Pro Ala Tyr Leu Leu Arg Ala Ala Leu Thr His

900                 905                 910

Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala His Ala Leu Ile Arg Val Cys Ala Leu

915                 920                 925

Val Lys Gln Leu Ala Gly Gly Arg Tyr Val Gln Val Ala Leu Leu Ala

930                 935                 940

Leu Gly Arg Trp Thr Gly Thr Tyr Ile Tyr Asp His Leu Thr Pro Met

945                 950                 955                 960

Ser Asp Trp Ala Ala Ser Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu

965                 970                 975

Pro Ile Ile Phe Ser Pro Met Glu Lys Lys Val Ile Val Trp Gly Ala

980                 985                 990

Glu Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile  Leu His Gly Leu Pro  Val Ser Ala

995                 1000                 1005

Arg Leu  Gly Gln Glu Ile Leu  Leu Gly Pro Ala Asp  Gly Tyr Thr

1010                 1015                 1020

Ser Lys  Gly Trp Lys Leu Leu  Ala Pro Ile Thr Ala  Tyr Ala Gln

1025                 1030                 1035

Gln Thr  Arg Gly Leu Leu Gly  Ala Ile Val Val Ser  Met Thr Gly

1040                 1045                 1050

Arg Asp  Arg Thr Glu Gln Ala  Gly Glu Val Gln Ile  Leu Ser Thr

1055                 1060                 1065

Val Ser  Gln Ser Phe Leu Gly  Thr Thr Ile Ser Gly  Val Leu Trp

1070                 1075                 1080

Thr Val  Tyr His Gly Ala Gly  Asn Lys Thr Leu Ala  Gly Leu Arg

1085                 1090                 1095

Gly Pro  Val Thr Gln Met Tyr  Ser Ser Ala Glu Gly  Asp Leu Val

1100                 1105                 1110

Gly Trp  Pro Ser Pro Pro Gly  Thr Lys Ser Leu Glu  Pro Cys Lys

1115                 1120                 1125

Cys Gly  Ala Val Asp Leu Tyr  Leu Val Thr Arg Asn  Ala Asp Val

1130                 1135                 1140

Ile Pro  Ala Arg Arg Arg Gly  Asp Lys Arg Gly Ala  Leu Leu Ser

1145                 1150                 1155

Pro Arg  Pro Ile Ser Thr Leu  Lys Gly Ser Ser Gly  Gly Pro Val

1160                 1165                 1170

Leu Cys  Pro Arg Gly His Val  Val Gly Leu Phe Arg  Ala Ala Val

1175                 1180                 1185

Cys Ser  Arg Gly Val Ala Lys  Ser Ile Asp Phe Ile  Pro Val Glu

1190                 1195                 1200

Thr Leu  Asp Val Val Thr Arg  Ser Pro Thr Phe Ser  Asp Asn Ser

1205                 1210                 1215

Thr Pro  Pro Ala Val Pro Gln  Thr Tyr Gln Val Gly  Tyr Leu His

1220                 1225                 1230

Ala Pro  Thr Gly Ser Gly Lys  Ser Thr Lys Val Pro  Val Ala Tyr

1235                 1240                 1245

Ala Ala  Gln Gly Tyr Lys Val  Leu Val Leu Asn Pro  Ser Val Ala

1250                 1255                 1260

Ala Thr  Leu Gly Phe Gly Ala  Tyr Leu Ser Lys Ala  His Gly Ile

1265                 1270                 1275

Asn Pro  Asn Ile Arg Thr Gly  Val Arg Thr Val Met  Thr Gly Glu

1280                 1285                 1290

Ala Ile  Thr Tyr Ser Thr Tyr  Gly Lys Phe Leu Ala  Asp Gly Gly

1295                 1300                 1305

Cys Ala  Ser Gly Ala Tyr Asp  Ile Ile Ile Cys Asp  Glu Cys His

1310                 1315                 1320

Ala Val  Asp Ala Thr Ser Ile  Leu Gly Ile Gly Thr  Val Leu Asp

1325                 1330                 1335

Gln Ala  Glu Thr Ala Gly Val  Arg Leu Thr Val Leu  Ala Thr Ala

1340                 1345                 1350

Thr Pro  Pro Gly Ser Val Thr  Thr Pro His Pro Asp  Ile Glu Glu

1355                 1360                 1365

Val Gly  Leu Gly Arg Glu Gly  Glu Ile Pro Phe Tyr  Gly Arg Ala

1370                 1375                 1380

Ile Pro  Leu Ser Cys Ile Lys  Gly Gly Arg His Leu  Ile Phe Cys

1385                 1390                 1395

His Ser  Lys Lys Lys Cys Asp  Glu Leu Ala Ala Ala  Leu Arg Gly

1400                 1405                 1410

Met Gly  Leu Asn Ala Val Ala  Tyr Tyr Arg Gly Leu  Asp Val Ser

1415                 1420                 1425

Ile Ile  Pro Ala Gln Gly Asp  Val Val Val Val Ala  Thr Asp Ala

1430                 1435                 1440

Leu Met  Thr Gly Tyr Thr Gly  Asp Phe Asp Ser Val  Ile Asp Cys

1445                 1450                 1455

Asn Val  Ala Val Thr Gln Ala  Val Asp Phe Ser Leu  Asp Pro Thr

1460                 1465                 1470

Phe Thr  Ile Thr Thr Gln Thr  Val Pro Gln Asp Ala  Val Ser Arg

1475                 1480                 1485

Ser Gln  Arg Arg Gly Arg Thr  Gly Arg Gly Arg Gln  Gly Thr Tyr

1490                 1495                 1500

Arg Tyr  Val Ser Thr Gly Glu  Arg Ala Ser Gly Met  Phe Asp Ser

1505                 1510                 1515

Val Val  Leu Cys Glu Cys Tyr  Asp Ala Gly Ala Ala  Trp Tyr Asp

1520                 1525                 1530

Leu Thr  Pro Ala Glu Thr Thr  Val Arg Leu Arg Ala  Tyr Phe Asn

1535                 1540                 1545

Thr Pro  Gly Leu Pro Val Cys  Gln Asp His Leu Glu  Phe Trp Glu

1550                 1555                 1560

Ala Val  Phe Thr Gly Leu Thr  His Ile Asp Ala His  Phe Leu Ser

1565                 1570                 1575

Gln Thr  Lys Gln Ala Gly Glu  Asn Phe Ala Tyr Leu  Val Ala Tyr

1580                 1585                 1590

Gln Ala  Thr Val Cys Ala Arg  Ala Lys Ala Pro Pro  Pro Ser Trp

1595                 1600                 1605

Asp Ala  Met Trp Lys Cys Leu  Ala Arg Leu Lys Pro  Thr Leu Ala

1610                 1615                 1620

Gly Pro  Thr Pro Leu Leu Tyr  Arg Leu Gly Pro Ile  Thr Asn Glu

1625                 1630                 1635

Val Thr  Leu Thr His Pro Gly  Thr Lys Tyr Ile Ala  Thr Cys Met

1640                 1645                 1650

Gln Ala  Asp Leu Glu Val Met  Thr Ser Thr Trp Val  Leu Ala Gly

1655                 1660                 1665

Gly Val  Leu Ala Ala Val Ala  Ala Tyr Cys Leu Ala  Thr Gly Cys

1670                 1675                 1680

Val Ser  Ile Ile Gly Arg Leu  His Val Asn Gln Arg  Val Val Val

1685                 1690                 1695

Ala Pro  Asp Lys Glu Val Leu  Tyr Glu Ala Phe Asp  Glu Met Glu

1700                 1705                 1710

Glu Cys  Ala Ser Arg Ala Ala  Leu Ile Glu Glu Gly  Gln Arg Ile

1715                 1720                 1725

Ala Glu  Met Leu Lys Ser Lys  Ile Gln Gly Leu Leu  Gln Gln Ala

1730                 1735                 1740

Ser Lys  Gln Ala Gln Asp Ile  Gln Pro Ala Met Gln  Ala Ser Trp

1745                 1750                 1755

Pro Lys  Val Glu Gln Phe Trp  Ala Arg His Met Trp  Asn Phe Ile

1760                 1765                 1770

Ser Gly  Ile Gln Tyr Leu Ala  Gly Leu Ser Thr Leu  Pro Gly Asn

1775                 1780                 1785

Pro Ala  Val Ala Ser Met Met  Ala Phe Ser Ala Ala  Leu Thr Ser

1790                 1795                 1800

Pro Leu  Ser Thr Ser Thr Thr  Ile Leu Leu Asn Ile  Met Gly Gly

1805                 1810                 1815

Trp Leu  Ala Ser Gln Ile Ala  Pro Pro Ala Gly Ala  Thr Gly Phe

1820                 1825                 1830

Val Val  Ser Gly Leu Val Gly  Ala Ala Val Gly Ser  Ile Gly Leu

1835                 1840                 1845

Gly Lys  Val Leu Val Asp Ile  Leu Ala Gly Tyr Gly  Ala Gly Ile

1850                 1855                 1860

Ser Gly  Ala Leu Val Ala Phe  Lys Ile Met Ser Gly  Glu Lys Pro

1865                 1870                 1875

Ser Met  Glu Asp Val Ile Asn  Leu Leu Pro Gly Ile  Leu Ser Pro

1880                 1885                 1890

Gly Ala  Leu Val Val Gly Val  Ile Cys Ala Ala Ile  Leu Arg Arg

1895                 1900                 1905

His Val  Gly Pro Gly Glu Gly  Ala Val Gln Trp Met  Asn Arg Leu

1910                 1915                 1920

Ile Ala  Phe Ala Ser Arg Gly  Asn His Val Ala Pro  Thr His Tyr

1925                 1930                 1935

Val Thr  Glu Ser Asp Ala Ser  Gln Arg Val Thr Gln  Leu Leu Gly

1940                 1945                 1950

Ser Leu  Thr Ile Thr Ser Leu  Leu Arg Arg Leu His  Asn Trp Ile

1955                 1960                 1965

Thr Glu  Asp Cys Pro Ile Pro  Cys Ser Gly Ser Trp  Leu Arg Asp

1970                 1975                 1980

Val Trp  Asp Trp Val Cys Thr  Ile Leu Thr Asp Phe  Lys Asn Trp

1985                 1990                 1995

Leu Thr  Ser Lys Leu Phe Pro  Lys Leu Pro Gly Leu  Pro Phe Ile

2000                 2005                 2010

Ser Cys  Gln Lys Gly Tyr Lys  Gly Val Trp Ala Gly  Thr Gly Ile

2015                 2020                 2025

Met Thr  Thr Arg Cys Pro Cys  Gly Ala Asn Ile Ser  Gly Asn Val

2030                 2035                 2040

Arg Leu  Gly Ser Met Arg Ile  Thr Gly Pro Lys Thr  Cys Met Asn

2045                 2050                 2055

Thr Trp  Gln Gly Thr Phe Pro  Ile Asn Cys Tyr Thr  Glu Gly Gln

2060                 2065                 2070

Cys Ala  Pro Lys Pro Pro Thr  Asn Tyr Lys Thr Ala  Ile Trp Arg

2075                 2080                 2085

Val Ala  Ala Ser Glu Tyr Ala  Glu Val Thr Gln His  Gly Ser Tyr

2090                 2095                 2100

Ser Tyr  Val Thr Gly Leu Thr  Thr Asp Asn Leu Lys  Ile Pro Cys

2105                 2110                 2115

Gln Leu  Pro Ser Pro Glu Phe  Phe Ser Trp Val Asp  Gly Val Gln

2120                 2125                 2130

Ile His  Arg Phe Ala Pro Thr  Pro Lys Pro Phe Phe  Arg Asp Glu

2135                 2140                 2145

Val Ser  Phe Cys Val Gly Leu  Asn Ser Tyr Ala Val  Gly Ser Gln

2150                 2155                 2160

Leu Pro  Cys Glu Pro Glu Pro  Asp Ala Asp Val Leu  Arg Ser Met

2165                 2170                 2175

Leu Thr  Asp Pro Pro His Ile  Thr Ala Glu Thr Ala  Ala Arg Arg

2180                 2185                 2190

Leu Ala  Arg Gly Ser Pro Pro  Ser Glu Ala Ser Ser  Ser Val Ser

2195                 2200                 2205

Gln Leu  Ser Ala Pro Ser Leu  Arg Ala Thr Cys Thr  Thr His Ser

2210                 2215                 2220

Asn Thr  Tyr Asp Val Asp Met  Val Asp Ala Asn Leu  Leu Met Glu

2225                 2230                 2235

Gly Gly  Val Ala Gln Thr Glu  Pro Glu Ser Arg Val  Pro Val Leu

2240                 2245                 2250

Asp Phe  Leu Glu Pro Met Ala  Glu Glu Glu Ser Asp  Leu Glu Pro

2255                 2260                 2265

Ser Ile  Pro Ser Glu Cys Met  Leu Pro Arg Ser Gly  Phe Pro Arg

2270                 2275                 2280

A1a Leu  Pro Ala Trp Ala Arg  Pro Asp Tyr Asn Pro  Pro Leu Val

2285                 2290                 2295

Glu Ser  Trp Arg Arg Pro Asp  Tyr Gln Pro Pro Thr  Val Ala Gly

2300                 2305                 2310

Cys Ala  Leu Pro Pro Pro Lys  Lys Ala Pro Thr Pro  Pro Pro Arg

2315                 2320                 2325

Arg Arg  Arg Thr Val Gly Leu  Ser Glu Ser Thr Ile  Ser Glu Ala

2330                 2335                 2340

Leu Gln  Gln Leu Ala Ile Lys  Thr Phe Gly Gln Pro  Pro Ser Ser

2345                 2350                 2355

Gly Asp  Ala Gly Ser Ser Thr  Gly Ala Gly Ala Ala  Glu Ser Gly

2360                 2365                 2370

Gly Pro  Thr Ser Pro Gly Glu  Pro Ala Pro Ser Glu  Thr Gly Ser

2375                 2380                 2385

Ala Ser  Ser Met Pro Pro Leu  Glu Gly Glu Pro Gly  Asp Pro Asp

2390                 2395                 2400

Leu Glu  Ser Asp Gln Val Glu  Leu Gln Pro Pro Pro  Gln Gly Gly

2405                 2410                 2415

Gly Val  Ala Pro Gly Ser Gly  Ser Gly Ser Trp Ser  Thr Cys Ser

2420                 2425                 2430

Glu Glu  Asp Asp Thr Thr Val  Cys Cys Ser Met Ser  Tyr Ser Trp

2435                 2440                 2445

Thr Gly  Ala Leu Ile Thr Pro  Cys Ser Pro Glu Glu  Glu Lys Leu

2450                 2455                 2460

Pro Ile  Asn Pro Leu Ser Asn  Ser Leu Leu Arg Tyr  His Asn Lys

2465                 2470                 2475

Val Tyr  Cys Thr Thr Ser Lys  Ser Ala Ser Gln Arg  Ala Lys Lys

2480                 2485                 2490

Val Thr  Phe Asp Arg Thr Gln  Val Leu Asp Ala His  Tyr Asp Ser

2495                 2500                 2505

Val Leu  Lys Asp Ile Lys Leu  Ala Ala Ser Lys Val  Ser Ala Arg

2510                 2515                 2520

Leu Leu  Thr Leu Glu Glu Ala  Cys Gln Leu Thr Pro  Pro His Ser

2525                 2530                 2535

Ala Arg  Ser Lys Tyr Gly Phe  Gly Ala Lys Glu Val  Arg Ser Leu

2540                 2545                 2550

Ser Gly  Arg Ala Val Asn His  Ile Lys Ser Val Trp  Lys Asp Leu

2555                 2560                 2565

Leu Glu  Asp Pro Gln Thr Pro  Ile Pro Thr Thr Ile  Met Ala Lys

2570                 2575                 2580

Asn Glu  Val Phe Cys Val Asp  Pro Ala Lys Gly Gly  Lys Lys Pro

2585                 2590                 2595

Ala Arg  Leu Ile Val Tyr Pro  Asp Leu Gly Val Arg  Val Cys Glu

2600                 2605                 2610

Lys Met  Ala Leu Tyr Asp Ile  Thr Gln Lys Leu Pro  Gln Ala Val

2615                 2620                 2625

Met Gly  Ala Ser Tyr Gly Phe  Gln Tyr Ser Pro Ala  Gln Arg Val

2630                 2635                 2640

Glu Tyr  Leu Leu Lys Ala Trp  Ala Glu Lys Lys Asp  Pro Met Gly

2645                 2650                 2655

Phe Ser  Tyr Asp Thr Arg Cys  Phe Asp Ser Thr Val  Thr Glu Arg

2660                 2665                 2670

Asp Ile  Arg Thr Glu Glu Ser  Ile Tyr Gln Ala Cys  Ser Leu Pro

2675                 2680                 2685

Glu Glu  Ala Arg Thr Ala Ile  His Ser Leu Thr Glu  Arg Leu Tyr

2690                 2695                 2700

Val Gly  Gly Pro Met Phe Asn  Ser Lys Gly Gln Thr  Cys Gly Tyr

2705                 2710                 2715

Arg Arg  Cys Arg Ala Ser Gly  Val Leu Thr Thr Ser  Met Gly Asn

2720                 2725                 2730

Thr Ile  Thr Cys Tyr Val Lys  Ala Leu Ala Ala Cys  Lys Ala Ala

2735                 2740                 2745

Gly Ile  Val Ala Pro Thr Met  Leu Val Cys Gly Asp  Asp Leu Val

2750                 2755                 2760

Val Ile  Ser Glu Ser Gln Gly  Thr Glu Glu Asp Glu  Arg Asn Leu

2765                 2770                 2775

Arg Ala  Phe Thr Glu Ala Met  Thr Arg Tyr Ser Ala  Pro Pro Gly

2780                 2785                 2790

Asp Pro  Pro Arg Pro Glu Tyr  Asp Leu Glu Leu Ile  Thr Ser Cys

2795                 2800                 2805

Ser Ser  Asn Val Ser Val Ala  Leu Gly Pro Arg Gly  Arg Arg Arg

2810                 2815                 2820

Tyr Tyr  Leu Thr Arg Asp Pro  Thr Thr Pro Leu Ala  Arg Ala Ala

2825                 2830                 2835

Trp Glu  Thr Val Arg His Ser  Pro Ile Asn Ser Trp  Leu Gly Asn

2840                 2845                 2850

Ile Ile  Gln Tyr Ala Pro Thr  Ile Trp Val Arg Met  Val Leu Met

2855                 2860                 2865

Thr His  Phe Phe Ser Ile Leu  Met Val Gln Asp Thr  Leu Asp Gln

2870                 2875                 2880

Asn Leu  Asn Phe Glu Met Tyr  Gly Ser Val Tyr Ser  Val Asn Pro

2885                 2890                 2895

Leu Asp  Leu Pro Ala Ile Ile  Glu Arg Leu His Gly  Leu Asp Ala

2900                 2905                 2910

Phe Ser  Met His Thr Tyr Ser  His His Glu Leu Thr  Arg Val Ala

2915                 2920                 2925

Ser Ala  Leu Arg Lys Leu Gly  Ala Pro Pro Leu Arg  Val Trp Lys

2930                 2935                 2940

Ser Arg Ala Arg Ala Val Arg Ala Ser Leu Ile Ser Arg Gly Gly

2945                 2950                 2955

Lys Ala Ala Val Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Lys

2960                 2965                 2970

Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Leu Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp

2975                 2980                 2985

Leu Ser Ser Trp Phe Thr Val Gly Ala Gly Gly Gly Asp Ile Phe

2990                 2995                 3000

His Ser Val Ser Arg Ala Arg Pro Arg Ser Leu Leu Phe Gly Leu

3005                 3010                 3015

Leu Leu Leu Phe Val Gly Val Gly Leu Phe Leu Leu Pro Ala Arg

3020                 3025                 3030

<210>3

<211>9678

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JFH1突变体

<220>

<223>JFH1-A/WT

<400>3

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtgcaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg atacacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg  300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc  360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa gacgttaagt tcccgggcgg    420

cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg    480

cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg agacgccagc ccatccccaa    540

agatcggcgc tccactggca cggcctgggg taaaccaggt cgcccctggc ccctatatgg    600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggctctc gcccctcctg    660

gggccccact gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaagtcatcg acaccctaac    720

gtgtggcttt gccgacctca tggggtacat ccccgtcgta ggcgccccgc ttagtggcgc    780

cgccagagct gtcgcgcacg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt atgcaacagg    840

gaacctacct ggtttcccct tttctatctt cttgctggcc ctgttgtcct gcatcaccgt    900

tccggtctct gctgcccagg tgaagaatac cagtagcagc tacatggtga ccaatgactg    960

ctccaatgac agcatcactt ggcagctcga ggctgcggtt ctccacgtcc ccgggtgcgt   1020

cccgtgcgag agagtgggga atacgtcacg gtgttgggtg ccagtctcgc caaacatggc   1080

tgtgcggcag cccggtgccc tcacgcaggg tctgcggacg cacatcgata tggttgtgat   1140

gtccgccacc ttctgctctg ctctctacgt gggggacctc tgtggcgggg tgatgctcgc   1200

ggcccaggtg ttcatcgtct cgccgcagca ccactggttt gtgcaggaat gcaattgctc   1260

catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc   1320

gcccacgacc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc cccgaggtca tcatagacat   1380

cgttagcggg gctcactggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc   1440

gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg gtggacgcgg gcaccaccac   1500

cgttggaggc gccgttgcac gtcccaccaa cgtgattgcc ggcgtgttca gccatggccc   1560

tcagcagaac attcagctca ttaacaccag cggcagttgg cacatcaacc gtactgcctt   1620

gaattgcaat gactccttga acaccggctt tctcgcggcc ttgttctaca ccaaccgctt    1680

taactcgtca gggtgtccag ggcgcctgtc cgcctgccgc aacatcgagg ctttccggat    1740

agggtggggc accctacagt acgaggataa tgtcaccaat ccagagggta tgaggccgta    1800

ctgctggcac taccccccaa agccgtgtgg cgtagtcccc acgaggtctg tgtgtggccc    1860

agtgtactgt ttcaccccca gcccggtagt agtgggcacg accgacagac gtggagtgcc    1920

cacctacaca tggggagaga atgagacaga tgtcttccta ctgaacagca cccgaccgcc    1980

gcagggctca tggttcggct gcacgtggat gaactccact ggtttcacca agacttgtgg    2040

cgcgccacct tgccgcacca gagctgactt caacgccagc acggacttgt tgtgccctac    2100

ggattgtttt aggaagcatc ctgatgccac ttatattaag tgtggttctg ggccctggct    2160

cacaccaaag tgcctggtcc actaccctta cagactctgg cattacccct gcacagtcaa    2220

ttttaccatc ttcaagataa gaatgtatgt agggggggtt gagcacaggc tcacggccgc    2280

atgcaacttc actcgtgggg atcgctgcga cttggaggac agggacagga gtcagctgtc    2340

tcctctgttg cactctacca cggaatgggc catcctgccc tgcacctact cagacttacc    2400

cgctttgtca actggtcttc tccaccttca ccagaacatc gtggacgtac aatacatgta    2460

tggcctctca cctgctatca caaaatacgt cgttcgatgg gagtgggtgg tactcttatt    2520

cctgctctta gcggacgcca gagtctgcgc ctgcttgtgg atgctcatct tgttgggcca    2580

ggccgaagca gcattggaga agttggtcgt cttgcacgct gcgagtgcgg ctaactgcca    2640

tggcctccta tattttgcca tcttcttcgt ggcagcttgg cacatcaggg gtcgggtggt    2700

ccccttgacc acctattgcc ttactggcct atggcccttc tgcctactgc tcatggcact    2760

gccccggcag gcttatgcct atgacgcacc tgtgcacgga cagataggcg tgggtttgtt    2820

gatattgatc accctcttca cactcacccc ggggtataag accctcctcg gccagtgtct    2880

gtggtggttg tgctatctcc tgaccctggg ggaagccatg attcgggagt gggtaccacc    2940

catgcaggtg cgcggcggcc gcgatggcat cgcgtgggcc gtcactatat tctgcccggg    3000

cgtggtgttt gacattacca aatggctttt ggcgttgctt gggcctgctt acctcttaag    3060

ggccgctttg acccatgtgc cgtacttcgt cagagctcac gctctgataa gggtatgcgc    3120

tttggtgaag cggctcgcgg ggggtaggta tgttcaggtg gcgctgttgg cccttggcag    3180

gtggactggc acctacatct atgaccacct cacacctatg gcggactggg ccgctagcgg    3240

cctgcgcgac ttagcggtcg ccgtggaacc catcatcttc agtccgatgg agaagaaggt    3300

catcgtctgg ggagcggaga cggctgcatg tggggacatt ctacatggac ttcccgtgtc    3360

cgcccgactc ggccaggaga tcctcctcgg cccagctgat ggctacacct ccaaggggtg    3420

gaagctcctt gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat    3480

agtggtgagt atgacggggc gtgacaggac agaacaggcc ggggaagtcc aaatcctgtc    3540

cacagtctct cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca    3600

cggagctggc aacaagactc tagccggctt acgaggtccg gtcacgcaga tgtactcgag    3660

tgctgagggg gacttggtag gctggcccag cccccctggg accaagtctt tggagccgtg    3720

caagtgtgga gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac gctgatgtca tcccggctcg    3780

gagacgcggg gataagcggg gagcattgct ctccccgaga cccatttcga ccttgaaggg    3840

gtcctcgggg gggccggtgc tctgccctag gggccacgtc gttgggctct tccgagcagc    3900

tgtgtgctct cggggcgtgg ccaaatccat cgatttcatc cccgttgaga cactcgacgt    3960

tgttacaagg tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta    4020

tcaggtcggg tacttgcatg ctccaactgg cagtggaaag agcaccaagg tccctgtcgc    4080

gtatgccgcc caggggtaca aagtactagt gcttaacccc tcggtagctg ccaccctggg    4140

gtttggggcg tacctatcca aggcacatgg catcaatccc aacattagga ctggagtcag    4200

gaccgtgatg accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg    4260

gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc    4320

tacctccatt ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca gagacagccg gggtcagact    4380

aactgtgctg gctacggcca caccccccgg gtcagtgaca accccccatc ccgatataga    4440

agaggtaggc ctcgggcggg agggtgagat ccccttctat gggagggcga ttcccctatc    4500

ctgcatcaag ggagggagac acctgatttt ctgccactca aagaaaaagt gtgacgagct    4560

cgcggcggcc cttcggggca tgggcttgaa tgccgtggca tactatagag ggttggacgt    4620

ctccataata ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc accgacgccc tcatgacggg    4680

gtacactgga gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta gcggtcaccc aagctgtcga    4740

cttcagcctg gaccccacct tcactataac cacacagact gtcccacaag acgctgtctc    4800

acgcagtcag cgccgcgggc gcacaggtag aggaagacag ggcacttata ggtatgtttc    4860

cactggtgaa cgagcctcag gaatgtttga cagtgtagtg ctttgtgagt gctacgacgc    4920

aggggctgcg tggtacgatc tcacaccagc ggagaccacc gtcaggctta gagcgtattt    4980

caacacgccc ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa ttttgggagg cagttttcac    5040

cggcctcaca cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt    5100

cgcgtaccta gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga gccaaggccc ctcccccgtc    5160

ctgggacgcc atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc    5220

tctcctgtac cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa    5280

gtacatcgcc acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt gggtcctagc    5340

tggaggagtc ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg actggatgcg tttccatcat    5400

cggccgcttg cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg gataaggagg tcctgtatga    5460

ggcttttgat gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct ctcatcgaag aggggcagcg    5520

gatagccgag atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg cagcaggcct ctaagcaggc    5580

ccaggacata caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag    5640

acacatgtgg aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg    5700

gaaccccgcg gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac    5760

cagtaccacc atccttctca acatcatggg aggctggtta gcgtcccaga tcgcaccacc    5820

cgcgggggcc accggctttg tcgtcagtgg cctggtgggg gctgccgtgg gcagcatagg    5880

cctgggtaag gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt gcgggcattt cgggggccct    5940

cgtcgcattc aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact    6000

gcctgggatc ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc atctgcgcgg ccattctgcg    6060

ccgccacgtg ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg aacaggctta ttgcctttgc    6120

ttccagagga aaccacgtcg cccctactca ctacgtgacg gagtcggatg cgtcgcagcg    6180

tgtgacccaa ctacttggct ctcttactat aaccagccta ctcagaagac tccacaattg    6240

gataactgag gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg ctccgcgacg tgtgggactg    6300

ggtttgcacc atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc tctaaattgt tccccaagct    6360

gcccggcctc cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag ggtgtgtggg ccggcactgg    6420

catcatgacc acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct ggcaatgtcc gcctgggctc    6480

tatgaggatc acagggccta aaacctgcat gaacacctgg caggggacct ttcctatcaa    6540

ttgctacacg gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg aactacaaga ccgccatctg    6600

gagggtggcg gcctcggagt acgcggaggt gacgcagcat gggtcgtact cctatgtaac    6660

aggactgacc actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta ccttctccag agtttttctc    6720

ctgggtggac ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca ccaaagccgt ttttccggga    6780

tgaggtctcg ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc gggtcccagc ttccctgtga    6840

acctgagccc gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca gatccgcccc acatcacggc    6900

ggagactgcg gcgcggcgct tggcacgggg atcacctcca tctgaggcga gctcctcagt    6960

gagccagcta tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc acccacagca acacctatga    7020

cgtggacatg gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt gtggctcaga cagagcctga    7080

gtccagggtg cccgttctgg actttctcga gccaatggcc gaggaagaga gcgaccttga    7140

gccctcaata ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg tttccacggg ccttaccggc    7200

ttgggcacgg cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca    7260

accgcccacc gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag aaggccccga cgcctccccc    7320

aaggagacgc cggacagtgg gtctgagcga gagcaccata tcagaagccc tccagcaact    7380

ggccatcaag acctttggcc agcccccctc gagcggtgat gcaggctcgt ccacgggggc    7440

gggcgccgcc gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag ccggccccct cagagacagg    7500

ttccgcctcc tctatgcccc ccctcgaggg ggagcctgga gatccggacc tggagtctga    7560

tcaggtagag cttcaacctc ccccccaggg ggggggggta gctcccggtt cgggctcggg    7620

gtcttggtct acttgctccg aggaggacga taccaccgtg tgctgctcca tgtcatactc    7680

ctggaccggg gctctaataa ctccctgtag ccccgaagag gaaaagttgc caatcaaccc    7740

tttgagtaac tcgctgttgc gataccataa caaggtgtac tgtacaacat caaagagcgc    7800

ctcacagagg gctaaaaagg taacttttga caggacgcaa gtgctcgacg cccattatga    7860

ctcagtctta aaggacatca agctagcggc ttccaaggtc agcgcaaggc tcctcacctt    7920

ggaggaggcg tgccagttga ctccacccca ttctgcaaga tccaagtatg gattcggggc    7980

caaggaggtc cgcagcttgt ccgggagggc cgttaaccac atcaagtccg tgtggaagga    8040

cctcctggaa gacccacaaa caccaattcc cacaaccatc atggccaaaa atgaggtgtt    8100

ctgcgtggac cccgccaagg ggggtaagaa accagctcgc ctcatcgttt accctgacct    8160

cggcgtccgg gtctgcgaga aaatggccct ctatgacatt acacaaaagc ttcctcaggc    8220

ggtaatggga gcttcctatg gcttccagta ctcccctgcc caacgggtgg agtatctctt    8280

gaaagcatgg gcggaaaaga aggaccccat gggtttttcg tatgataccc gatgcttcga    8340

ctcaaccgtc actgagagag acatcaggac cgaggagtcc atataccagg cctgctccct    8400

gcccgaggag gcccgcactg ccatacactc gctgactgag agactttacg taggagggcc    8460

catgttcaac agcaagggtc aaacctgcgg ttacagacgt tgccgcgcca gcggggtgct    8520

aaccactagc atgggtaaca ccatcacatg ctatgtgaaa gccctagcgg cctgcaaggc    8580

tgcggggata gttgcgccca caatgctggt atgcggcgat gacctagtag tcatctcaga    8640

aagccagggg actgaggagg acgagcggaa cctgagagcc ttcacggagg ccatgaccag    8700

gtactctgcc cctcctggtg atccccccag accggaatat gacctggagc taataacatc    8760

ctgttcctca aatgtgtctg tggcgttggg cccgcggggc cgccgcagat actacctgac    8820

cagagaccca accactccac tcgcccgggc tgcctgggaa acagttagac actcccctat    8880

caattcatgg ctgggaaaca tcatccagta tgctccaacc atatgggttc gcatggtcct    8940

aatgacacac ttcttctcca ttctcatggt ccaagacacc ctggaccaga acctcaactt    9000

tgagatgtat ggatcagtat actccgtgaa tcctttggac cttccagcca taattgagag    9060

gttacacggg cttgacgcct tttctatgca cacatactct caccacgaac tgacgcgggt    9120

ggcttcagcc ctcagaaaac ttggggcgcc acccctcagg gtgtggaaga gtcgggctcg    9180

cgcagtcagg gcgtccctca tctcccgtgg agggaaagcg gccgtttgcg gccgatatct  9240

cttcaattgg gcggtgaaga ccaagctcaa actcactcca ttgccggagg cgcgcctact  9300

ggacttatcc agttggttca ccgtcggcgc cggcgggggc gacatttttc acagcgtgtc  9360

gcgcgcccga ccccgctcat tactcttcgg cctactccta cttttcgtag gggtaggcct  9420

cttcctactc cccgctcggt agagcggcac acactaggta cactccatag ctaactgttc  9480

cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcttttt tttttttttc  9540

cctctttctt cccttctcat cttattctac tttctttctt ggtggctcca tcttagccct  9600

agtcacggct agctgtgaaa ggtccgtgag ccgcatgact gcagagagtg ccgtaactgg  9660

tctctctgca gatcatgt                                                9678

<210>4

<211>9678

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JFH1突变体

<220>

<223>JFH1-B/WT

<400>4

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg  300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc    360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa gacgttaagt tcccgggcgg    420

cggccagatc gctggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg    480

cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg agacgccagc ccatccccaa    540

agatcggcgc tccactggca cggcctgggg aaaaccaggt cgcccctggc ccctatatgg    600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggctctc gcccctcctg    660

gggccccact gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaagtcatcg acaccctaac    720

gtgtggcttt gccgacctca tggggtacat ccccgtcgta ggcgccccgc ttagtggcgc    780

cgccagagct gtcgcgcacg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt atgcaacagg    840

gaacctaccc ggtttcccct tttctatctt cttgctggcc ctgttgtcct gcatcaccgt    900

tccggtctct gctgcccagg tgaagaatac cagtagcagc tacatggtga ccaatgactg    960

ctccaatgac agcatcactt ggcagctcga ggctgcagtt ctccacgtcc ccgggtgcgt   1020

cccgtgcgag agagtgggga atacgtcacg gtgttgggtg ccagtctcgc caaacatggc   1080

tgtgcggcag cccggtgccc tcacgcaggg tctgcggacg cacatcgata tggttgtgat   1140

gtccgccacc ttctgctctg ctctctacgt gggggacctc tgtggcgggg tgatgctcgc   1200

ggcccaggtg ttcatcgtct cgccgcagta ccactggttt gtgcaggaat gcaattgctc   1260

catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc   1320

gcccacggcc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc cccgaggtca tcatagacat   1380

cgttagcggg gctcactggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc   1440

gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg gtggacgcgg gcaccaccac   1500

cgttgggggc gctgttgcac gttccaccaa cgtgattgcc ggcgtgttca gccatggccc   1560

tcagcagaac attcagctca ttaacaccaa cggcagctgg cacatcaacc gtactgcctt    1620

gaattgcaat gactccttga acaccggctt tctcgcggcc ttgttctaca ccaaccgctt    1680

taactcgtca aggtgtccag ggcgcctgtc cgcctgccgc aacatcgagg ctttccggat    1740

agggtggggc accctacagt acgaggataa tgtcaccaat ccagaggata tgaggccgta    1800

ctgctggcac taccccccaa agccgtgtgg cgtagtcccc gcgaggtctg tgtgtggccc    1860

agtgtactgt ttcactccca gcccggtagt agtgggcacg accgacagac gtggagtgcc    1920

cacctacaca tggggagaga atgagacaga tgtcttccta ctgaacagca cccgaccgcc    1980

acagggctca tggttcggct gcacgtggat gaactccact ggtttcacca agacttgtgg    2040

cgcgccacct tgccgcacca gagctgactt caacgccagc acggacttgt tgtgccctac    2100

ggattgtttt aggaagcatc ctgatgccac ttatattaag tgtggttctg ggccctggct    2160

cacaccaaag tgcctggtcc actaccctta cagactctgg cattacccct gcacagtcaa    2220

ttttaccatc ttcaagataa gaatgtatgt agggggggtt gagcacaggc tcacggccgc    2280

atgcaacttc actcgtgggg atcgctgcga cttggaggac agggacagga gtcagctgtc    2340

tcctctgttg cactctacca cggaatgggc catcctgccc tgcacctact cagacttacc    2400

cgctttgtca actggtcttc tccaccttca ccagaacatc gtggacgtac aatacatgta    2460

tggcctctca cctgctatca caaaatacgt cgttcgatgg gagtgggtgg tactcttatt    2520

cctgctctta gcggacgcca gagtctgcgc ctgcctgtgg atgctcatct tgttgggcca    2580

ggccgaagca gcattggaga agttggccgt cttgcacgct gcgagtgcgg ctaactgcca    2640

tggcctccta tattttgcca tcttcttcgt ggcagcttgg cacatcaggg gtcgggcggt    2700

ccccttgacc acctattgcc tcactggcct atggcccttc tgcctactgc tcatggcact    2760

gccccggcag gcttatgcct atgacgcacc tgtgcacgga cagataggcg tgggtttgtt    2820

gatattgatc accctcttca cactcacccc ggggtataag accctcctcg gccagtgtct    2880

gtggtggttg tgctatctcc tgaccctggg ggaagccatg attcgggagt gggtaccacc    2940

catgcaggtg cgcggcggcc gcgatggcat cgcgtgggcc gtcactatat tctgcccggg    3000

tgtggtgttt gacattacca aatggctttt ggcgttgctt gggcctgctt acctcttaag    3060

ggccgctttg acacatgtgc cgtacttcgt cagagctcac gctctgataa gggtatgcgc    3120

tttggtgaag cagctcgcgg ggggtaggta tgttcaggtg gcgctattgg cccttggcag    3180

gtggactggc acctacatct atgaccacct cacacctatg tcggactggg ccgctagcgg    3240

cctgcgcgac ttagcggtcg ccgtggaacc catcatcttc agtccgatgg agaagaaggt    3300

catcgtctgg ggagcggaga cggctgcatg tggggacatt ctacatggac ttcccgtgtc    3360

cgcccgactc ggccaggaga tcctcctcgg cccagctgat ggctacacct ccaaggggtg    3420

gaagctcctt gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat    3480

agtggtgagt atgacggggc gtgacaggac agaacaggcc ggggaagtcc aaatcctgtc    3540

cacagtctct cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca    3600

cggagctggc aacaagactc tagccggctt acggggtccg gtcacgcaga tgtactcgag    3660

tgctgagggg gacttggtag gctggcccag cccccctggg accaagtctt tggagccgtg    3720

caagtgtgga gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac gctgatgtta tcccggctcg    3780

gagacgcggg gacaagcggg gagcattgct ctccccgaga cccatttcga ccttgaaggg    3840

gtcctcgggg gggccggtgc tctgccctag gggccacgtc gttgggctct tccgagcagc    3900

tgtgtgctct cggggcgtgg ccaaatccat cgatttcatc cccgttgaga cactcgacgt    3960

tgttacaagg tctcccacct tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta    4020

tcaggtcggg tacttgcatg ctccaactgg cagtggaaag agcaccaagg tccctgtcgc    4080

gtatgccgcc caggggtaca aagtactagt gcttaacccc tcggtagctg ccaccctggg    4140

gtttggggcg tacctatcca aggcacatgg catcaatccc aacattagga ctggagtcag    4200

gaccgtgatg accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg    4260

gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc    4320

tacctccatt ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca gagacagccg gggtcagact    4380

aactgtgctg gctacggcca caccccccgg gtcagtgaca accccccatc ccgatataga    4440

agaggtaggc ctcgggcggg agggtgagat ccccttctat gggagggcga ttcccctatc    4500

ctgcatcaag ggagggagac acctgatttt ctgccactca aagaaaaagt gtgacgagct    4560

cgcggcggcc cttcggggca tgggcttgaa tgccgtggca tactatagag ggttggacgt    4620

ctccataata ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc accgacgccc tcatgacggg    4680

gtacactgga gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta gcggtcaccc aagctgtcga    4740

cttcagcctg gaccccacct tcactataac cacacagact gtcccacaag acgctgtctc    4800

acgcagtcag cgccgcgggc gcacaggtag aggaagacag ggcacttata ggtatgtttc    4860

cactggtgaa cgagcctcag gaatgtttga cagtgtagtg ctttgtgagt gctacgacgc    4920

aggggctgcg tggtacgatc tcacaccagc ggagaccacc gtcaggctta gagcgtattt    4980

caacacgccc ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa ttttgggagg cagttttcac    5040

cggcctcaca cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt    5100

cgcgtaccta gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga gccaaggccc ctcccccgtc    5160

ctgggacgcc atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc    5220

tctcctgtac cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa    5280

gtacatcgcc acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt gggtcctagc    5340

tggaggagtc ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg actggatgcg tttccatcat    5400

cggccgcttg cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg gataaggagg tcctgtatga    5460

ggcttttgat gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct ctcatcgaag aggggcagcg    5520

gatagccgag atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg cagcaggcct ctaagcaggc    5580

ccaggacata caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag    5640

acacatgtgg aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg    5700

gaaccccgcg gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac    5760

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cctgggtaag gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt gcgggcattt cgggggccct    5940

cgtcgcattc aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact    6000

gcctgggatc ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc atctgcgcgg ccattctgcg    6060

ccgccacgtg ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg aacaggctta ttgcctttgc    6120

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tgtgacccaa ctacttggct ctcttactat aaccagccta ctcagaagac tccacaattg    6240

gataactgag gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg ctccgcgacg tgtgggactg    6300

ggtttgcacc atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc tctaaattgt tccccaagct    6360

gcccggcctc cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag ggtgtgtggg ccggcactgg    6420

catcatgacc acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct ggcaatgtcc gcctgggctc    6480

tatgaggatc acagggccta aaacctgcat gaacacctgg caggggacct ttcctatcaa    6540

ttgctacacg gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg aactacaaga ccgccatctg    6600

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aggactgacc actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta ccttctccag agtttttctc    6720

ctgggtggac ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca ccaaagccgt ttttccggga    6780

tgaggtctcg ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc gggtcccagc ttccctgtga    6840

acctgagccc gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca gatccgcccc acatcacggc    6900

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gagccagcta tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc acccacagca acacctatga    7020

cgtggacatg gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt gtggctcaga cagagcctga    7080

gtccagggtg cccgttctgg actttctcga gccaatggcc gaggaagaga gcgaccttga    7140

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ttgggcacgg cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca    7260

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ggccatcaag acctttggcc agcccccctc gagcggtgat gcaggctcgt ccacgggggc    7440

gggcgccgcc gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag ccggccccct cagagacagg    7500

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gtcttggtct acttgctccg aggaggacga taccaccgtg tgctgctcca tgtcatactc    7680

ctggaccggg gctctaataa ctccctgtag ccccgaagag gaaaagttgc caatcaaccc    7740

tttgagtaac tcgctgttgc gataccataa caaggtgtac tgtacaacat caaagagcgc    7800

ctcacagagg gctaaaaagg taacttttga caggacgcaa gtgctcgacg cccattatga    7860

ctcagtctta aaggacatca agctagcggc ttccaaggtc agcgcaaggc tcctcacctt    7920

ggaggaggcg tgccagttga ctccacccca ttctgcaaga tccaagtatg gattcggggc    7980

caaggaggtc cgcagcttgt ccgggagggc cgttaaccac atcaagtccg tgtggaagga    8040

cctcctggaa gacccacaaa caccaattcc cacaaccatc atggccaaaa atgaggtgtt    8100

ctgcgtggac cccgccaagg ggggtaagaa accagctcgc ctcatcgttt accctgacct    8160

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ctcaaccgtc actgagagag acatcaggac cgaggagtcc atataccagg cctgctccct    8400

gcccgaggag gcccgcactg ccatacactc gctgactgag agactttacg taggagggcc    8460

catgttcaac agcaagggtc aaacctgcgg ttacagacgt tgccgcgcca gcggggtgct    8520

aaccactagc atgggtaaca ccatcacatg ctatgtgaaa gccctagcgg cctgcaaggc    8580

tgcggggata gttgcgccca caatgctggt atgcggcgat gacctagtag tcatctcaga    8640

aagccagggg actgaggagg acgagcggaa cctgagagcc ttcacggagg ccatgaccag    8700

gtactctgcc cctcctggtg atccccccag accggaatat gacctggagc taataacatc    8760

ctgttcctca aatgtgtctg tggcgttggg cccgcggggc cgccgcagat actacctgac    8820

cagagaccca accactccac tcgcccgggc tgcctgggaa acagttagac actcccctat    8880

caattcatgg ctgggaaaca tcatccagta tgctccaacc atatgggttc gcatggtcct    8940

aatgacacac ttcttctcca ttctcatggt ccaagacacc ctggaccaga acctcaactt    9000

tgagatgtat ggatcagtat actccgtgaa tcctttggac cttccagcca taattgagag    9060

gttacacggg cttgacgcct tttctatgca cacatactct caccacgaac tgacgcgggt    9120

ggcttcagcc ctcagaaaac ttggggcgcc acccctcagg gtgtggaaga gtcgggctcg  9180

cgcagtcagg gcgtccctca tctcccgtgg agggaaagcg gccgtttgcg gccgatatct  9240

cttcaattgg gcggtgaaga ccaagctcaa actcactcca ttgccggagg cgcgcctact  9300

ggacttatcc agttggttca ccgtcggcgc cggcgggggc gacatttttc acagcgtgtc  9360

gcgcgcccga ccccgctcat tactcttcgg cctactccta cttttcgtag gggtaggcct  9420

cttcctactc cccgctcggt agagcggcac acactaggta cactccatag ctaactgttc  9480

cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcttttt tttttttttc  9540

cctctttctt cccttctcat cttattctac tttctttctt ggtggctcca tcttagccct  9600

agtcacggct agctgtgaaa ggtccgtgag ccgcatgact gcagagagtg ccgtaactgg  9660

tctctctgca gatcatgt                                                9678

<210>5

<211>9678

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JFH1突变体

<220>

<223>JFH1-Q862R

<400>5

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg  300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc     360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa gacgttaagt tcccgggcgg     420

cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg     480

cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg agacgccagc ccatccccaa     540

agatcggcgc tccactggca aggcctgggg aaaaccaggt cgcccctggc ccctatatgg     600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggctctc gcccctcctg     660

gggccccact gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaagtcatcg acaccctaac     720

gtgtggcttt gccgacctca tggggtacat ccccgtcgta ggcgccccgc ttagtggcgc     780

cgccagagct gtcgcgcacg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt atgcaacagg     840

gaacctaccc ggtttcccct tttctatctt cttgctggcc ctgttgtcct gcatcaccgt     900

tccggtctct gctgcccagg tgaagaatac cagtagcagc tacatggtga ccaatgactg     960

ctccaatgac agcatcactt ggcagctcga ggctgcggtt ctccacgtcc ccgggtgcgt    1020

cccgtgcgag agagtgggga atacgtcacg gtgttgggtg ccagtctcgc caaacatggc    1080

tgtgcggcag cccggtgccc tcacgcaggg tctgcggacg cacatcgata tggttgtgat    1140

gtccgccacc ttctgctctg ctctctacgt gggggacctc tgtggcgggg tgatgctcgc    1200

ggcccaggtg ttcatcgtct cgccgcagta ccactggttt gtgcaagaat gcaattgctc    1260

catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc    1320

gcccacggcc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc cccgaggtca tcatagacat    1380

cgttagcggg gctcactggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc    1440

gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg gtggacgcgg gcaccaccac    1500

cgttggaggc gctgttgcac gttccaccaa cgtgattgcc ggcgtgttca gccatggccc    1560

tcagcagaac attcagctca ttaacaccaa cggcagttgg cacatcaacc gtactgcctt    1620

gaattgcaat gactccttga acaccggctt tctcgcggcc ttgttctaca ccaaccgctt    1680

taactcgtca gggtgtccag ggcgcctgtc cgcctgccgc aacatcgagg ctttccggat    1740

agggtggggc accctacagt acgaggataa tgtcaccaat ccagaggata tgaggccgta    1800

ctgctggcac taccccccaa agccgtgtgg cgtagtcccc gcgaggtctg tgtgtggccc    1860

agtgtactgt ttcaccccca gcccggtagt agtgggcacg accgacagac gtggagtgcc    1920

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gcagggctca tggttcggct gcacgtggat gaactccact ggtttcacca agacttgtgg    2040

cgcgccacct tgccgcacca gagctgactt caacgccagc acggacttgt tgtgccctac    2100

ggattgtttt aggaagcatc ctgatgccac ttatattaag tgtggttctg ggccctggct    2160

cacaccaaag tgcctggtcc actaccctta cagactctgg cattacccct gcacagtcaa    2220

ttttaccatc ttcaagataa gaatgtatgt agggggggtt gagcacaggc tcacggccgc    2280

atgcaacttc actcgtgggg atcgctgcga cttggaggac agggacagga gtcagctgtc    2340

tcctctgttg cactctacca cggaatgggc catcctgccc tgcacctact cagacttacc    2400

cgctttgtca actggtcttc tccaccttca ccagaacatc gtggacgtac aatacatgta    2460

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ggccgaagca gcattggaga agttggtcgt cttgcacgct gcgagtgcgg ctaactgcca    2640

tggcctccta tattttgcca tcttcttcgt ggcagcttgg cacatcaggg gtcgggtggt    2700

ccccttgacc acctattgcc tcactggcct atggcccttc tgcctactgc tcatggcact    2760

gccccggcag gcttatgcct atgacgcacc tgtgcacgga cagataggcg tgggtttgtt    2820

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catgcaggtg cgcggcggcc gcgatggcat cgcgtgggcc gtcactatat tctgcccggg    3000

tgtggtgttt gacattacca aatggctttt ggcgttgctt gggcctgctt acctcttaag    3060

ggccgctttg acacatgtgc cgtacttcgt cagagctcac gctctgataa gggtatgcgc    3120

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gtggactggc acctacatct atgaccacct cacacctatg tcggactggg ccgctagcgg    3240

cctgcgcgac ttagcggtcg ccgtggaacc catcatcttc agtccgatgg agaagaaggt    3300

catcgtctgg ggagcggaga cggctgcatg tggggacatt ctacatggac ttcccgtgtc    3360

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gaagctcctt gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat    3480

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cacagtctct cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca    3600

cggagctggc aacaagactc tagccggctt acggggtccg gtcacgcaga tgtactcgag    3660

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caagtgtgga gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac gctgatgtca tcccggctcg    3780

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tgttacaagg tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta    4020

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gtatgccgcc caggggtaca aagtactagt gcttaacccc tcggtagctg ccaccctggg    4140

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gaccgtgatg accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg    4260

gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc    4320

tacctccatt ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca gagacagccg gggtcagact    4380

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ctgcatcaag ggagggagac acctgatttt ctgccactca aagaaaaagt gtgacgagct    4560

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ctccataata ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc accgacgccc tcatgacggg    4680

gtacactgga gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta gcggtcaccc aagctgtcga    4740

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caacacgccc ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa ttttgggagg cagttttcac    5040

cggcctcaca cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt    5100

cgcgtaccta gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga gccaaggccc ctcccccgtc    5160

ctgggacgcc atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc    5220

tctcctgtac cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa    5280

gtacatcgcc acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt  gggtcctagc   5340

tggaggagtc ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg actggatgcg tttccatcat    5400

cggccgcttg cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg gataaggagg tcctgtatga    5460

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ccaggacata caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag    5640

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cgtcgcattc aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact    6000

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gccctcaata ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg tttccacggg ccttaccggc    7200

ttgggcacgg cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca    7260

accgcccacc gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag aaggccccga cgcctccccc    7320

aaggagacgc cggacagtgg gtctgagcga gagcaccata tcagaagccc tccagcaact    7380

ggccatcaag acctttggcc agcccccctc gagcggtgat gcaggctcgt ccacgggggc    7440

gggcgccgcc gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag ccggccccct cagagacagg    7500

ttccgcctcc tctatgcccc ccctcgaggg ggagcctgga gatccggacc tggagtctga    7560

tcaggtagag cttcaacctc ccccccaggg ggggggggta gctcccggtt cgggctcggg    7620

gtcttggtct acttgctccg aggaggacga taccaccgtg tgctgctcca tgtcatactc    7680

ctggaccggg gctctaataa ctccctgtag ccccgaagag gaaaagttgc caatcaaccc    7740

tttgagtaac tcgctgttgc gataccataa caaggtgtac tgtacaacat caaagagcgc    7800

ctcacagagg gctaaaaagg taacttttga caggacgcaa gtgctcgacg cccattatga    7860

ctcagtctta aaggacatca agctagcggc ttccaaggtc agcgcaaggc tcctcacctt    7920

ggaggaggcg tgccagttga ctccacccca ttctgcaaga tccaagtatg gattcggggc    7980

caaggaggtc cgcagcttgt ccgggagggc cgttaaccac atcaagtccg tgtggaagga    8040

cctcctggaa gacccacaaa caccaattcc cacaaccatc atggccaaaa atgaggtgtt    8100

ctgcgtggac cccgccaagg ggggtaagaa accagctcgc ctcatcgttt accctgacct    8160

cggcgtccgg gtctgcgaga aaatggccct ctatgacatt acacaaaagc ttcctcaggc    8220

ggtaatggga gcttcctatg gcttccagta ctcccctgcc caacgggtgg agtatctctt    8280

gaaagcatgg gcggaaaaga aggaccccat gggtttttcg tatgataccc gatgcttcga    8340

ctcaaccgtc actgagagag acatcaggac cgaggagtcc atataccagg cctgctccct    8400

gcccgaggag gcccgcactg ccatacactc gctgactgag agactttacg taggagggcc    8460

catgttcaac agcaagggtc aaacctgcgg ttacagacgt tgccgcgcca gcggggtgct    8520

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cagagaccca accactccac tcgcccgggc tgcctgggaa acagttagac actcccctat    8880

caattcatgg ctgggaaaca tcatccagta tgctccaacc atatgggttc gcatggtcct    8940

aatgacacac ttcttctcca ttctcatggt ccaagacacc ctggaccaga acctcaactt    9000

tgagatgtat ggatcagtat actccgtgaa tcctttggac cttccagcca taattgagag    9060

gttacacggg cttgacgcct tttctatgca cacatactct caccacgaac tgacgcgggt    9120

ggcttcagcc ctcagaaaac ttggggcgcc acccctcagg gtgtggaaga gtcgggctcg  9180

cgcagtcagg gcgtccctca tctcccgtgg agggaaagcg gccgtttgcg gccgatatct  9240

cttcaattgg gcggtgaaga ccaagctcaa actcactcca ttgccggagg cgcgcctact  9300

ggacttatcc agttggttca ccgtcggcgc cggcgggggc gacatttttc acagcgtgtc  9360

gcgcgcccga ccccgctcat tactcttcgg cctactccta cttttcgtag gggtaggcct  9420

cttcctactc cccgctcggt agagcggcac acactaggta cactccatag ctaactgttc  9480

cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcttttt tttttttttc  9540

cctctttctt cccttctcat cttattctac tttctttctt ggtggctcca tcttagccct  9600

agtcacggct agctgtgaaa ggtccgtgag ccgcatgact gcagagagtg ccgtaactgg  9660

tctctctgca gatcatgt                                                9678

<210>6

<211>10617

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JFH1突变体

<220>

<223>JFH1-A/WT-Rluc

<400>6

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

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ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtgcaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg atacacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg     300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc     360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa gacgttaagt tcccgggcgg     420

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cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg agacgccagc ccatccccaa     540

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gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggctctc gcccctcctg     660

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cgccagagct gtcgcgcacg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt atgcaacagg     840

gaacctacct ggtttcccct tttctatctt cttgctggcc ctgttgtcct gcatcaccgt     900

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catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc    1320

gcccacgacc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc cccgaggtca tcatagacat    1380

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gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg gtggacgcgg gcaccaccac    1500

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gaattgcaat gactccttga acaccggctt tctcgcggcc ttgttctaca ccaaccgctt    1680

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ctgctggcac taccccccaa agccgtgtgg cgtagtcccc acgaggtctg tgtgtggccc    1860

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gcagggctca tggttcggct gcacgtggat gaactccact ggtttcacca agacttgtgg    2040

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ggattgtttt aggaagcatc ctgatgccac ttatattaag tgtggttctg ggccctggct    2160

cacaccaaag tgcctggtcc actaccctta cagactctgg cattacccct gcacagtcaa    2220

ttttaccatc ttcaagataa gaatgtatgt agggggggtt gagcacaggc tcacggccgc    2280

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tggcctccta tattttgcca tcttcttcgt ggcagcttgg cacatcaggg gtcgggtggt    2700

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cctgcgcgac ttagcggtcg ccgtggaacc catcatcttc agtccgatgg agaagaaggt    3300

catcgtctgg ggagcggaga cggctgcatg tggggacatt ctacatggac ttcccgtgtc    3360

cgcccgactc ggccaggaga tcctcctcgg cccagctgat ggctacacct ccaaggggtg    3420

gaagctcctt gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat    3480

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cacagtctct cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca    3600

cggagctggc aacaagactc tagccggctt acgaggtccg gtcacgcaga tgtactcgag    3660

tgctgagggg gacttggtag gctggcccag cccccctggg accaagtctt tggagccgtg    3720

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tgttacaagg tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta    4020

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cggcctcaca cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt    5100

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ctgggacgcc atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc    5220

tctcctgtac cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa    5280

gtacatcgcc acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt gggtcctagc    5340

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ggcttttgat gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct ctcatcgaag aggggcagcg    5520

gatagccgag atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg cagcaggcct ctaagcaggc    5580

ccaggacata caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag    5640

acacatgtgg aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg    5700

gaaccccgcg gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac    5760

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accgcccacc gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag aaggccccga cgcctccccc    7320

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aatgctggta tgcggcgatg acctagtagt catctcagaa agccagggga ctgaggagga    9600

cgagcggaac ctgagagcct tcacggaggc catgaccagg tactctgccc ctcctggtga    9660

tccccccaga ccggaatatg acctggagct aataacatcc tgttcctcaa atgtgtctgt    9720

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<220>

<223>JFH1-B/WT-RLuc

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gaacctaccc ggtttcccct tttctatctt cttgctggcc ctgttgtcct gcatcaccgt  900

tccggtctct gctgcccagg tgaagaatac cagtagcagc tacatggtga ccaatgactg     960

ctccaatgac agcatcactt ggcagctcga ggctgcggtt ctccacgtcc ccgggtgcgt    1020

cccgtgcgag agagtgggga atacgtcacg gtgttgggtg ccagtctcgc caaacatggc    1080

tgtgcggcag cccggtgccc tcacgcaggg tctgcggacg cacatcgata tggttgtgat    1140

gtccgccacc ttctgctctg ctctctacgt gggggacctc tgtggcgggg tgatgctcgc    1200

ggcccaggtg ttcatcgtct cgccgcagta ccactggttt gtgcaagaat gcaattgctc    1260

catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc    1320

gcccacggcc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc cccgaggtca tcatagacat    1380

cgttagcggg gctcactggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc    1440

gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg gtggacgcgg gcaccaccac    1500

cgttggaggc gctgttgcac gttccaccaa cgtgattgcc ggcgtgttca gccatggccc    1560

tcagcagaac attcagctca ttaacaccaa cggcagttgg cacatcaacc gtactgcctt    1620

gaattgcaat gactccttga acaccggctt tctcgcggcc ttgttctaca ccaaccgctt    1680

taactcgtca gggtgtccag ggcgcctgtc cgcctgccgc aacatcgagg ctttccggat    1740

agggtggggc accctacagt acgaggataa tgtcaccaat ccagaggata tgaggccgta    1800

ctgctggcac taccccccaa agccgtgtgg cgtagtcccc gcgaggtctg tgtgtggccc    1860

agtgtactgt ttcaccccca gcccggtagt agtgggcacg accgacagac gtggagtgcc    1920

cacctacaca tggggagaga atgagacaga tgtcttccta ctgaacagca cccgaccgcc    1980

gcagggctca tggttcggct gcacgtggat gaactccact ggtttcacca agacttgtgg    2040

cgcgccacct tgccgcacca gagctgactt caacgccagc acggacttgt tgtgccctac    2100

ggattgtttt aggaagcatc ctgatgccac ttatattaag tgtggttctg ggccctggct    2160

cacaccaaag tgcctggtcc actaccctta cagactctgg cattacccct gcacagtcaa    2220

ttttaccatc ttcaagataa gaatgtatgt agggggggtt gagcacaggc tcacggccgc    2280

atgcaacttc actcgtgggg atcgctgcga cttggaggac agggacagga gtcagctgtc    2340

tcctctgttg cactctacca cggaatgggc catcctgccc tgcacctact cagacttacc    2400

cgctttgtca actggtcttc tccaccttca ccagaacatc gtggacgtac aatacatgta    2460

tggcctctca cctgctatca caaaatacgt cgttcgatgg gagtgggtgg tactcttatt    2520

cctgctctta gcggacgcca gagtctgcgc ctgcttgtgg atgctcatct tgttgggcca    2580

ggccgaagca gcattggaga agttggtcgt cttgcacgct gcgagtgcgg ctaactgcca    2640

tggcctccta tattttgcca tcttcttcgt ggcagcttgg cacatcaggg gtcgggtggt    2700

ccccttgacc acctattgcc tcactggcct atggcccttc tgcctactgc tcatggcact    2760

gccccggcag gcttatgcct atgacgcacc tgtgcacgga cagataggcg tgggtttgtt    2820

gatattgatc accctcttca cactcacccc ggggtataag accctcctcg gccagtgtct    2880

gtggtggttg tgctatctcc tgaccctggg ggaagccatg attcaggagt gggtaccacc    2940

catgcaggtg cgcggcggcc gcgatggcat cgcgtgggcc gtcactatat tctgcccggg    3000

tgtggtgttt gacattacca aatggctttt ggcgttgctt gggcctgctt acctcttaag    3060

ggccgctttg acacatgtgc cgtacttcgt cagagctcac gctctgataa gggtatgcgc    3120

tttggtgaag cagctcgcgg ggggtaggta tgttcaggtg gcgctattgg cccttggcag    3180

gtggactggc acctacatct atgaccacct cacacctatg tcggactggg ccgctagcgg    3240

cctgcgcgac ttagcggtcg ccgtggaacc catcatcttc agtccgatgg agaagaaggt    3300

catcgtctgg ggagcggaga cggctgcatg tggggacatt ctacatggac ttcccgtgtc    3360

cgcccgactc ggccaggaga tcctcctcgg cccagctgat ggctacacct ccaaggggtg    3420

gaagctcctt gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat    3480

agtggtgagt atgacggggc gtgacaggac agaacaggcc ggggaagtcc aaatcctgtc    3540

cacagtctct cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca    3600

cggagctggc aacaagactc tagccggctt acggggtccg gtcacgcaga tgtactcgag    3660

tgctgagggg gacttggtag gctggcccag cccccctggg accaagtctt tggagccgtg    3720

caagtgtgga gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac gctgatgtca tcccggctcg    3780

gagacgcggg gacaagcggg gagcattgct ctccccgaga cccatttcga ccttgaaggg    3840

gtcctcgggg gggccggtgc tctgccctag gggccacgtc gttgggctct tccgagcagc    3900

tgtgtgctct cggggcgtgg ccaaatccat cgatttcatc cccgttgaga cactcgacgt    3960

tgttacaagg tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta    4020

tcaggtcggg tacttgcatg ctccaactgg cagtggaaag agcaccaagg tccctgtcgc    4080

gtatgccgcc caggggtaca aagtactagt gcttaacccc tcggtagctg ccaccctggg    4140

gtttggggcg tacctatcca aggcacatgg catcaatccc aacattagga ctggagtcag    4200

gaccgtgatg accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg    4260

gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc    4320

tacctccatt ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca gagacagccg gggtcagact    4380

aactgtgctg gctacggcca caccccccgg gtcagtgaca accccccatc ccgatataga    4440

agaggtaggc ctcgggcggg agggtgagat ccccttctat gggagggcga ttcccctatc    4500

ctgcatcaag ggagggagac acctgatttt ctgccactca aagaaaaagt gtgacgagct    4560

cgcggcggcc cttcggggca tgggcttgaa tgccgtggca tactatagag ggttggacgt    4620

ctccataata ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc accgacgccc tcatgacggg    4680

gtacactgga gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta gcggtcaccc aagctgtcga    4740

cttcagcctg gaccccacct tcactataac cacacagact gtcccacaag acgctgtctc    4800

acgcagtcag cgccgcgggc gcacaggtag aggaagacag ggcacttata ggtatgtttc    4860

cactggtgaa cgagcctcag gaatgtttga cagtgtagtg ctttgtgagt gctacgacgc    4920

aggggctgcg tggtacgatc tcacaccagc ggagaccacc gtcaggctta gagcgtattt    4980

caacacgccc ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa ttttgggagg cagttttcac    5040

cggcctcaca cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt    5100

cgcgtaccta gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga gccaaggccc ctcccccgtc    5160

ctgggacgcc atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc    5220

tctcctgtac cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa    5280

gtacatcgcc acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt gggtcctagc    5340

tggaggagtc ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg actggatgcg tttccatcat    5400

cggccgcttg cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg gataaggagg tcctgtatga    5460

ggcttttgat gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct ctcatcgaag aggggcagcg    5520

gatagccgag atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg cagcaggcct ctaagcaggc    5580

ccaggacata caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag    5640

acacatgtgg aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg    5700

gaaccccgcg gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac    5760

cagtaccacc atccttctca acatcatggg aggctggtta gcgtcccaga tcgcaccacc    5820

cgcgggggcc accggctttg tcgtcagtgg cctggtgggg gctgccgtgg gcagcatagg    5880

cctgggtaag gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt gcgggcattt cgggggccct    5940

cgtcgcattc aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact    6000

gcctgggatc ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc atctgcgcgg ccattctgcg    6060

ccgccacgtg ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg aacaggctta ttgcctttgc    6120

ttccagagga aaccacgtcg cccctactca ctacgtgacg gagtcggatg cgtcgcagcg    6180

tgtgacccaa ctacttggct ctcttactat aaccagccta ctcagaagac tccacaattg    6240

gataactgag gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg ctccgcgacg tgtgggactg    6300

ggtttgcacc atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc tctaaattgt tccccaagct    6360

gcccggcctc cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag ggtgtgtggg ccggcactgg    6420

catcatgacc acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct ggcaatgtcc gcctgggctc    6480

tatgaggatc acagggccta aaacctgcat gaacacctgg caggggacct ttcctatcaa    6540

ttgctacacg gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg aactacaaga ccgccatctg    6600

gagggtggcg gcctcggagt acgcggaggt gacgcagcat gggtcgtact cctatgtaac    6660

aggactgacc actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta ccttctccag agtttttctc    6720

ctgggtggac ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca ccaaagccgt ttttccggga    6780

tgaggtctcg ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc gggtcccagc ttccctgtga    6840

acctgagccc gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca gatccgcccc acatcacggc    6900

ggagactgcg gcgcggcgct tggcacgggg atcacctcca tctgaggcga gctcctcagt    6960

gagccagcta tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc acccacagca acacctatga    7020

cgtggacatg gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt gtggctcaga cagagcctga    7080

gtccagggtg cccgttctgg actttctcga gccaatggcc gaggaagaga gcgaccttga    7140

gccctcaata ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg tttccacggg ccttaccggc    7200

ttgggcacgg cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca    7260

accgcccacc gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag aaggccccga cgcctccccc    7320

aaggagacgc cggacagtgg gtctgagcga gagcaccata tcagaagccc tccagcaact    7380

ggccatcaag acctttggcc agcccccctc gagcggtgat gcaggctcgt ccacgggggc    7440

gggcgccgcc gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag ccggccccct cagagacagg    7500

ttccgcctcc tctatgcccc ccctcgagat ggcttccaag gtgtacgacc ccgagcaacg    7560

caaacgcatg atcactgggc ctcagtggtg ggctcgctgc aagcaaatga acgtgctgga    7620

ctccttcatc aactactatg attccgagaa gcacgccgag aacgccgtga tttttctgca    7680

tggtaacgct gcctccagct acctgtggag gcacgtcgtg cctcacatcg agcccgtggc    7740

tagatgcatc atccctgatc tgatcggaat gggtaagtcc ggcaagagcg ggaatggctc    7800

atatcgcctc ctggatcact acaagtacct caccgcttgg ttcgagctgc tgaaccttcc    7860

aaagaaaatc atctttgtgg gccacgactg gggggcttgt ctggcctttc actactccta    7920

cgagcaccaa gacaagatca aggccatcgt ccatgctgag agtgtcgtgg acgtgatcga    7980

gtcctgggac gagtggcctg acatcgagga ggatatcgcc ctgatcaaga gcgaagaggg    8040

cgagaaaatg gtgcttgaga ataacttctt cgtcgagacc atgctcccaa gcaagatcat    8100

gcggaaactg gagcctgagg agttcgctgc ctacctggag ccattcaagg agaagggcga    8160

ggttagacgg cctaccctct cctggcctcg cgagatccct ctcgttaagg gaggcaagcc    8220

cgacgtcgtc cagattgtcc gcaactacaa cgcctacctt cgggccagcg acgatctgcc    8280

taagatgttc atcgagtccg accctgggtt cttttccaac gctattgtcg agggagctaa    8340

gaagttccct aacaccgagt tcgtgaaggt gaagggcctc cacttcagcc aggaggacgc    8400

tccagatgaa atgggtaagt acatcaagag cttcgtggag cgcgtgctga agaacgagca    8460

gctcgagggg gagcctggag atccggacct ggagtctgat caggtagagc ttcaacctcc    8520

cccccagggg gggggggtag ctcccggttc gggctcgggg tcttggtcta cttgctccga    8580

ggaggacgat accaccgtgt gctgctccat gtcatactcc tggaccgggg ctctaataac    8640

tccctgtagc cccgaagagg aaaagttgcc aatcaaccct ttgagtaact cgctgttgcg    8700

ataccataac aaggtgtact gtacaacatc aaagagcgcc tcacagaggg ctaaaaaggt    8760

aacttttgac aggacgcaag tgctcgacgc ccattatgac tcagtcttaa aggacatcaa    8820

gctagcggct tccaaggtca gcgcaaggct cctcaccttg gaggaggcgt gccagttgac    8880

tccaccccat tctgcaagat ccaagtatgg attcggggcc aaggaggtcc gcagcttgtc    8940

cgggagggcc gttaaccaca tcaagtccgt gtggaaggac ctcctggaag acccacaaac    9000

accaattccc acaaccatca tggccaaaaa tgaggtgttc tgcgtggacc ccgccaaggg    9060

gggtaagaaa ccagctcgcc tcatcgttta ccctgacctc ggcgtccggg tctgcgagaa    9120

aatggccctc tatgacatta cacaaaagct tcctcaggcg gtaatgggag cttcctatgg    9180

cttccagtac tcccctgccc aacgggtgga gtatctcttg aaagcatggg cggaaaagaa    9240

ggaccccatg ggtttttcgt atgatacccg atgcttcgac tcaaccgtca ctgagagaga    9300

catcaggacc gaggagtcca tataccaggc ctgctccctg cccgaggagg cccgcactgc    9360

catacactcg ctgactgaga gactttacgt aggagggccc atgttcaaca gcaagggtca    9420

aacctgcggt tacagacgtt gccgcgccag cggggtgcta accactagca tgggtaacac    9480

catcacatgc tatgtgaaag ccctagcggc ctgcaaggct gcggggatag ttgcgcccac    9540

aatgctggta tgcggcgatg acctagtagt catctcagaa agccagggga ctgaggagga    9600

cgagcggaac ctgagagcct tcacggaggc catgaccagg tactctgccc ctcctggtga    9660

tccccccaga ccggaatatg acctggagct aataacatcc tgttcctcaa atgtgtctgt    9720

ggcgttgggc ccgcggggcc gccgcagata ctacctgacc agagacccaa ccactccact  9780

cgcccgggct gcctgggaaa cagttagaca ctcccctatc aattcatggc tgggaaacat  9840

catccagtat gctccaacca tatgggttcg catggtccta atgacacact tcttctccat  9900

tctcatggtc caagacaccc tggaccagaa cctcaacttt gagatgtatg gatcagtata  9960

ctccgtgaat cctttggacc ttccagccat aattgagagg ttacacgggc ttgacgcctt 10020

ttctatgcac acatactctc accacgaact gacgcgggtg gcttcagccc tcagaaaact 10080

tggggcgcca cccctcaggg tgtggaagag tcgggctcgc gcagtcaggg cgtccctcat 10140

ctcccgtgga gggaaagcgg ccgtttgcgg ccgatatctc ttcaattggg cggtgaagac 10200

caagctcaaa ctcactccat tgccggaggc gcgcctactg gacttatcca gttggttcac 10260

cgtcggcgcc ggcgggggcg acatttttca cagcgtgtcg cgcgcccgac cccgctcatt 10320

actcttcggc ctactcctac ttttcgtagg ggtaggcctc ttcctactcc ccgctcggta 10380

gagcggcaca cactaggtac actccatagc taactgttcc tttttttttt tttttttttt 10440

tttttttttt tttttttttt tttctttttt ttttttttcc ctctttcttc ccttctcatc 10500

ttattctact ttctttcttg gtggctccat cttagcccta gtcacggcta gctgtgaaag 10560

gtccgtgagc cgcatgactg cagagagtgc cgtaactggt ctctctgcag atcatgt    10617

<210>9

<211>933

<212>DNA

<213>海肾

<220>

<223>海肾荧光素酶

<400>9

atggcttcca aggtgtacga ccccgagcaa cgcaaacgca tgatcactgg gcctcagtgg    60

tgggctcgct gcaagcaaat gaacgtgctg gactccttca tcaactacta tgattccgag    120

aagcacgccg agaacgccgt gatttttctg catggtaacg ctgcctccag ctacctgtgg    180

aggcacgtcg tgcctcacat cgagcccgtg gctagatgca tcatccctga tctgatcgga    240

atgggtaagt ccggcaagag cgggaatggc tcatatcgcc tcctggatca ctacaagtac    300

ctcaccgctt ggttcgagct gctgaacctt ccaaagaaaa tcatctttgt gggccacgac    360

tggggggctt gtctggcctt tcactactcc tacgagcacc aagacaagat caaggccatc    420

gtccatgctg agagtgtcgt ggacgtgatc gagtcctggg acgagtggcc tgacatcgag    480

gaggatatcg ccctgatcaa gagcgaagag ggcgagaaaa tggtgcttga gaataacttc    540

ttcgtcgaga ccatgctccc aagcaagatc atgcggaaac tggagcctga ggagttcgct    600

gcctacctgg agccattcaa ggagaagggc gaggttagac ggcctaccct ctcctggcct    660

cgcgagatcc ctctcgttaa gggaggcaag cccgacgtcg tccagattgt ccgcaactac    720

aacgcctacc ttcgggccag cgacgatctg cctaagatgt tcatcgagtc cgaccctggg    780

ttcttttcca acgctattgt cgagggagct aagaagttcc ctaacaccga gttcgtgaag    840

gtgaagggcc tccacttcag ccaggaggac gctccagatg aaatgggtaa gtacatcaag    900

agcttcgtgg agcgcgtgct gaagaacgag cag                                 933

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

ctttgactcc gtgatcgacc                            20

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

ccctgtcttc ctctacctg           19

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

tggcacccag cacaatgaa           19

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

ctaagtcata gtccgcctag aagca    25

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

ctcgagatgg cttccaaggt gtacgacccc    30

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

ctcgagctgc tcgttcttca gcacgcgctc    30

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

ggaacagtta gctatggagt gtacc         25

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

tgtcttcacg cagaaagcgc ctag          24

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

ctgagctggt attatggaga cgtcc    25

Claims (9)

1.核酸，该核酸编码包含1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，上述前体多聚蛋白中至少第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。

2.权利要求1所述的核酸，其中上述前体多聚蛋白为选自下述(a)～(f)的前体多聚蛋白：

(a)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第297位的酪氨酸被取代成组氨酸、第330位的丙氨酸被取代成苏氨酸、第395位的丝氨酸被取代成脯氨酸、第417位的天冬酰胺被取代成丝氨酸、第483位的天冬氨酸被取代成甘氨酸、第501位的丙氨酸被取代成苏氨酸、第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸、第931位的谷氨酰胺被取代成精氨酸、以及第961位的丝氨酸被取代成丙氨酸；

(b)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；

(c)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；

(d)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；

(e)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；

(f)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，仅第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。

3.权利要求2所述的核酸，该核酸包含序列表的SEQ ID NO：3、4或5所示的核苷酸序列。

4.权利要求1或2所述的核酸，其中，编码报道蛋白的核酸被插入在编码上述前体多聚蛋白的NS5A蛋白的区内。

5.权利要求4所述的核酸，其中，当以序列表的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准时，上述报道蛋白被整合在第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间，作为融合蛋白被翻译。

6.权利要求5所述的核酸，该核酸包含序列表的SEQ ID NO：6或7所示的核苷酸序列。

7.丙型肝炎病毒颗粒，该病毒颗粒包含权利要求1或2所述的核酸。

8.培养细胞，该培养细胞生产权利要求7所述的丙型肝炎病毒颗粒。

9.丙型肝炎病毒疫苗，该疫苗是将权利要求7所述的丙型肝炎病毒颗粒灭活而得到的。

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