CN102190720A - 一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物制备方法 - Google Patents
一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102190720A CN102190720A CN2010106097407A CN201010609740A CN102190720A CN 102190720 A CN102190720 A CN 102190720A CN 2010106097407 A CN2010106097407 A CN 2010106097407A CN 201010609740 A CN201010609740 A CN 201010609740A CN 102190720 A CN102190720 A CN 102190720A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- pro
- human glucagon
- asp
- analog
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程领域，公开一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体及其工程菌的构建、串联体的表达、目的肽的制备方法。通过同尾酶法构建出一系列该类似物基因串联体，并将其融合伙伴进行改造同时引入His标签，融合蛋白中目的肽的比率由22％提高到90％，目的肽的表达量提高了2.7倍，通过Ni琼脂糖凝胶亲和层析和Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析获得的目的肽具有明显的促小肠绒毛生长活性。该制备方法具有目的肽表达量高、纯化过程简便、获取单体肽过程不需使用CNBr或水解酶等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，公开一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体及其工程菌的构建、串联体的融合表达、单体肽的制备方法及促小肠绒毛生长活性检测。
技术背景
人胰高血糖素样肽-2(Glucagon-like Peptide-2，GLP-2)属于肠道产生的胰高血糖素原衍生肽(Proglucagon-derived Peptide，PGDP)家族成员之一，是一条由33个氨基酸残基组成的单链多肽，多肽的羧基末端为天冬氨酸。
GLP-2是肠上皮特异性生长因子，具有肠道特异性及更强的促生长作用，促进肠黏膜生长、抑制肠上皮细胞和隐窝细胞凋亡等生物活性，研究发现其可以治疗或改善胃肠外营养依赖性短肠炎、炎性肠病、骨质疏松、肠粘膜损伤等炎症。由于天然的GLP-2易被二酰肽肽酶Ⅳ(Depiptidyl Peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ)降解而失去活性，所以近年来GLP-2的类似物的研究层出不穷，如NPS公司研发的一种耐DPPⅣ降解的GLP-2类似物Teduglutide能促进短肠综合症患者营养的吸收，且安全性、耐受性良好。
人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物已经实验证实具有明显体内促小肠绒毛生长的作用，并且其体内促肠生长活性与药物剂量呈正相关性。然而，大量制备较为困难，由于肽链较长使化学合成法步骤较多、成本高、率较低；基因工程法生产同样存在很多困难，如长度在20～80氨基酸之间的肽类mRNA和表达的蛋白质在宿主细胞内不稳定，导致表达效率很低；用融合方式虽能获得高效表达，但从融合蛋白上释放出目标多肽相当困难，同时目的肽在融合蛋白中比率较小，最终造成产率低，制备不经济等问题，虽已有将部分线性肽目的基因串联起来，使目的基因在宿主菌中以串联体方式表达，虽可提高目标蛋白的表达效率，但表达的串联体产物通常经酶或化学试剂裂解获得目的肽单体，其中所用的酶一般成本较高；化学试剂如溴化氢存在毒性强等问题，使相关肽的生产和研究受到限制。
融合蛋白的表达形式直接影响到下游工艺路线和最终产品的产率，已有的下游工艺路线为：重组质粒pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)表达的融合蛋白溶解后，经多次乙醇沉淀、等电点沉淀等获得融合蛋白粗品；酸水解后，通过离子交换获得目的肽粗品；HPLC柱进一步去除因粗品融合蛋白带来的杂质。目的肽占融合蛋白的比例仅为22％，且过程繁琐直接影响终产品的产率。
因此需要一种目的肽表达量高、纯化过程方便、可进行大规模生产的制备方法来获得该产品。
发明内容
本发明的目的是公开一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体。
本发明的另一个目的是公开一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物不同拷贝数的基因串联体构建方法。
本发明的再一个目的是公开一种用于制备该类型的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明第一方面，提供了一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体，其特征在于：胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的C端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨酸(Pro)可以重复串联形成串联体，即一个类似物C端的Asp和先一个类似物N端的Pro形成酸水解位点，在盐酸作用下可水解为单体肽，该基因串联体氨基酸序列为：
Met-HP-Asp-(Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp)n
其中HP为一段氨基酸残基的肽链，分子量为3237Da，HP肽链序列为：
Asp-His-His-His-His-His-His-Gln-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Ala；n＝6。
本发明第二方面，提供了一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物不同拷贝数的基因串联体构建方法，包括以下步骤：
(a)含融合伙伴AnsB-C的Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)基因串联体构建
一组同尾酶BamHⅠ和BclⅠ分别位于插入目的肽片段的两端，以质粒pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)为模板构建重组质粒pED-2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)，再以pED-2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)为模板逐步构建重组质粒pED-4Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)、pED-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)、pED-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)。
(b)含截短型融合伙伴HP的Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)基因串联体构建
在重组质粒pED-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)基础上，通过PCR将其396bp的融合伙伴AnsB-C缩短为81bp的新融合伙伴HP，构建重组质粒
pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)和pET-HP-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)。将各质粒转化到Escherichia coli BL21，得6种多拷贝基因串联体工程菌。
本发明第三方面，提供了一种用于制备该类型的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的方法，包括以下步骤：
(a)最佳目的肽串联体筛选
将各重组菌乳糖诱导表达产物进行SDS-PAGE凝胶电泳检测并分析，发现BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的目的肽表达量为24.9％且最高。
(b)人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体的制备
将重组基因工程菌BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)经发酵-离心-洗涤沉淀-超声破碎-1.2％Trition X-100提取-Ni琼脂糖凝胶层析纯化得串联体。
(c)人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的获得
将串联体经酸水解-沉淀-Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析纯化得到人胰高糖素样肽-2(1-35肽)类似物。
本发明的一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物制备方法能带来如下有益效果：所表达的融合蛋白中，融合伙伴HP分子量较低使人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的比率为90％，BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的目的肽表达量是原BL21/pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的2.7倍实现了目的肽的高表达；融合伙伴中含有六个组氨酸组成的标签便于使用Ni琼脂糖凝胶层析纯化使纯化操作简便；单体肽水解过程不需使用CNBr或水解酶，适合于大规模生产。
附图说明
图1各PCR产物凝胶电泳检测结果。
图中M.DNA分子量标准，自下而上依次为：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp；1.526bp的AnsB-C和Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)片段；2.631bp的AnsB-C和2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)片段；3.92bp的HP片段；4：316bp的HP和2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)片段。
图2含不同拷贝数的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体构建关系。
图3人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体基因序列测序结果
图4各重组菌乳糖诱导表达情况。
图中1.Escherichia coli BL21空白对照；2～8分别为含
pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)、pED-2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)、
pED-4Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)、pED-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)、
pED-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)、pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)、
pET-HP-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)重组菌乳糖诱导蛋白表达；
M.标准分子量蛋白自上而下依次为：97.4KDa、66.2KDa、43.0KDa、31.0KDa、20.1KDa、14.4KDa。
图5含不同拷贝数的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体目的肽表达量情况。
图6人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体经酸水解得到人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的单体示意图。
图7人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体的酸水解以及纯化单体的电泳图。
图中1.Ni琼脂糖凝胶层析纯化得人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体；2.人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物酸水解后等电点沉淀所得产物；3.Sephadex G-25聚糖凝胶层析柱纯化得人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物；4.5800bp未经ME处理的标准重组胰岛素。
图8人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的电喷雾质谱图。
图9小肠组织切片
图中A.PBS对照组，B.给药组。
具体实施方式
以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。
本说明书中所提到的材料中
(1)宿主菌和质粒
宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究相关的实验室一般都有保存。质粒pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)为本实验室构建并保存。
(2)酶和试剂
分子克隆工具酶为Fermentas和Takara两家公司；质粒抽提试剂盒为南京天为生物科有限公司；PCR胶回收试剂盒为Takara公司的产品。
(3)培养基
LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
(4)Ni琼脂糖凝胶亲和层析介质为南京金斯瑞生物科技有限公司产品。
(5)Sephadex G-25葡聚糖凝胶为美国GE公司产品
本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
实施例1 重组质粒及相应基因工程菌的构建
1.1 含融合伙伴AnsB-C的Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)基因串联体构建
在基因水平上，每个单体肽的两端都预留编码酸水解位点(Asp-Pro)的核苷酸序列，设计引物NcoⅠ-up(含有NcoⅠ酶切位点)和BclⅠDown(含有BclⅠ酶切位点)，以质粒pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)(该质粒的构建方法见授权公告号CN10041893C发明专利审定授权说明书，质粒pED是在质粒pET-28a的两个酶切位点NcoⅠ和HindⅢ间引入已消除唯一酸水解位点L-天冬酰胺酶AnsB-C构建而成，AnsB-C分子量为13.73KDa)为模板，PCR扩增融合伙伴AnsB-C基因和Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的单基因序列，反应总体积为50μl，经94℃预变性50min，进入如下32个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸70s，最后在72℃下延伸10min。将PCR产物进行NcoⅠ和BclⅠ双酶切，质粒pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)进行NcoⅠ和BamHⅠ双酶切去除AnsB-C基因片段，同尾酶BamHⅠ和BclⅠ的酶切产物的粘性末端相同，将两者的酶切产物连接构建重组质粒pED-2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)。
以质粒pED-2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)为模板，NcoⅠUp和BclⅠDown为引物，PCR扩增，反应条件同上。将PCR产物进行NcoⅠ和BclⅠ双酶切，质粒pED-2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)进行NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，两者的酶切产物连接构建重组质粒pED-4Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)。按同样方法构建重组质粒pED-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)及pED-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)。
1.2 含截短型融合伙伴HP的Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)基因串联体构建
设计编码Thr-HP-Asp肽链(即fusion partner)的序列，其中HP为：Asp-His-His-His-His-His-His-Gln-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Ala.
以质粒pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)为模板，NcoⅠHis Up和BamHⅠDown为引物，PCR扩增，反应条件同上。将PCR产物进行NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，质粒pED-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)进行NcoⅠ和BamHⅠ双酶切去除AnsB-C基因片段，将两者的酶切产物连接构建重组质粒
pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)。
以质粒pED-2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)为模板，NcoⅠHis Up和BclⅠDown为引物，PCR扩增，反应条件同上。将PCR产物进行NcoⅠ和BclⅠ双酶切，质粒pED-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)进行NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，将两者的酶切产物连接构建重组质粒pET-HP-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)，上述各PCR产物凝胶电泳检测结果见附图1，各串联体构建关系见附图2。其中，4条引物序列如下：
NcoⅠUp： 5′-ACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3′
NcoⅠHis Up：5’-TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATCAGACCTGCCCGCCGTGCCCTGCAC-3’
BclⅠDown：5′-AAAATGATCAGTGATTTTGGTCTG-3′
BamHⅠdown：5′-TTTCGGATCCGCACGGCTTTTT-3′
1.3 相应基因工程菌构建
将上述各重组质粒转入大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中，涂布含100μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取部分单菌落培养并诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测选取表达融合蛋白相对分子质量与预期结果相符且表达量较高的阳性重组菌测序，进一步验证人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的多联体基因序列的正确性，其中pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)测序结果见附图3。
实施例2 目的肽表达量最佳串联体筛选
将各重组菌乳糖诱导表达产物进行SDS-PAGE凝胶电泳检测并分析，发现BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的目的肽表达量为24.9％且最高，是BL21/pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的2.7倍，结果见附图5。
实施例3 人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物串联体的制备
3.1 人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体的制备
将重组基因工程菌BL21/pET-HP-6Pro-P-h[Gly2]GLP-2(1-35)以1％的接种量于LB培养基中，37℃恒温培养到对数中期，按4％的接种量转接到玉米浆培养基中，37℃培养4小时后加入终浓度为5mmol/L的乳糖诱导，继续培养。离心收集菌体按10倍重量体积加入菌体洗涤液(10mmol/L Tris-HCl pH 8.0)洗涤两次，离心收集菌体按5倍重量体积加入PBS溶液(20mmol/L Na2PHO4，500mmol/L NaCl，pH 7.4)，混匀，冻融，超声破碎。离心收集沉淀并按20倍重量体积加入提取液(1.2％Triton X-100，5mmol/L imidazole，500mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，得人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物串联体的粗品溶液。
将人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物串联体的粗品溶液上清上样于以Binding Buffer(1.2％TritonX-100，5mmol/L imidazole，500mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)平衡的Ni琼脂糖凝胶亲和层析柱，以10倍柱体积的Wash Buffer(1.2％TritonX-100，20mmol/L imidazole，500mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脱杂蛋白，最后以Elute Buffer(1.2％TritonX-100，100mmol/L imidazole，500mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)收集目的蛋白，得人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物串联体。
3.2 人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的制备
将含有人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物串联体的Elute Buffer透析，冻干，每克串联体加入10ml 40～50mmol/L HCl溶解，置于48℃水浴48h，进行酸水解，理论效果图见附图6。酸水解后，用NaOH调节pH值至3.9，有大量沉淀生成，12000rpm离心20min，去除上清，沉淀冻干后溶解于少量10mmol/L的pH为7.0磷酸盐缓冲液中，上样于Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析柱，收集样品峰，透析除盐，冻干收集目的肽。SDS-PAGE电泳检测，结果见附图7。
实施例4 质谱分析
通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法，测得重组制备的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的相对分子质量为3954.038Da，与理论推算值一致，见附图8。
实施例5 人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物生物活性的检测
选取正常雄性SD大鼠(160-200g)，随机分为2组，6只/组，1组为PBS对照组；另一组组为给药组，剂量分别为0.5mg/Kg/day，1天2次，腹部皮下注射给药14天后，晚上禁食，第二天处死，取小肠，用生理盐水清洗，进行小肠组织切片分析，结果显示给药组的体内促小肠绒毛生长活性明显高于PBS组，结果见附图9。
除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体，其中人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物氨基酸序列为：
Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
2.根据权利要求1所述的一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体，其特征在于：所述的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物C端天冬氨酸(Asp)与N端脯氨酸(Pro)可以重复串联成串联体，即一个类似物C端Asp和下一个类似物N端的Pro形成酸水解位点，在盐酸作用下可以断开，串联体氨基酸序列为：
Met-HP-Asp-(Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp)n
其中HP为含有a个氨基酸残基的肽链(a为非负整数)；n≥1。
3.根据权利要求2所述的一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体，其特征在于，所述HP肽链序列为：
Asp-His-His-His-His-His-His-Gln-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Ala；n＝6。
4.根据权利要求1所述的一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的制备方法，包括重组质粒以及相应的工程菌的构建步骤，人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体的制备步骤，人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的获取步骤，其特征在于：在重组质粒以及相应的基因工程菌构建过程中，质粒pED-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)为模板，是通过PCR反应获得含人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的DNA片段的扩增序列，引物的核酸序为：
NcoⅠUp： 5′-ACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3′
NcoⅠHis Up：5′-TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATCAGACCTGCCCGCCGTGCCCTGCAC-3′
BclⅠDown：5′-AAAATGATACGTGATTTTGGTCTG-3′
BamHⅠdown：5′-TTTCGGATCCGCACGGCTTTTT-3′
5.根据权利要求4所述的一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的制备方法，其特征在于：在人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体的制备步骤中，将重组菌BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)经发酵-离心-洗涤沉淀-超声破碎-1.2％TritionX-100提取-Ni琼脂糖凝胶层析纯化得较纯串联体，其中，发酵温度为36～38℃，pH 6.8～7.2。
6.根据权利要求5所述的一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的制备方法，其特征在于：在人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的串联体的获得步骤中，将串联体经酸水解-沉淀-Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱层析纯化得到人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物，其中酸水解用40～60mmol/L浓度的盐酸，Sephadex G-25聚糖凝胶柱层析纯化，获得人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物。
7.根据权利要求1所述的一种能串联表达和同步酸水解释放的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的活性，其特征在于：所述的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物具有促小肠绒毛生长活性，有望用于治疗短肠综合征、吸收障碍等胃肠道疾病。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010106097407A CN102190720A (zh) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | 一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010106097407A CN102190720A (zh) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | 一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102190720A true CN102190720A (zh) | 2011-09-21 |
Family
ID=44599673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010106097407A Pending CN102190720A (zh) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | 一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102190720A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102660491A (zh) * | 2012-05-18 | 2012-09-12 | 华东师范大学 | 高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN103159848A (zh) * | 2013-01-06 | 2013-06-19 | 中国人民解放军第四军医大学 | 人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白及其制备方法 |
| CN107586330A (zh) * | 2016-07-08 | 2018-01-16 | 上海多米瑞生物技术有限公司 | 替度鲁肽串联多肽及替度鲁肽制备方法 |
| CN114213524A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-22 | 苏州博领干细胞再生医学有限公司 | 用于胰高血糖素样肽-2抗体检测的包被抗原及纯化方法、重组工程菌及培养方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1861635A (zh) * | 2005-05-11 | 2006-11-15 | 中国药科大学 | 人胰高血糖素相关肽－2类似物 |
| CN101041818A (zh) * | 2006-03-24 | 2007-09-26 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 重组生产胰高血糖素样肽－2的方法 |
| CN101307105A (zh) * | 2008-04-28 | 2008-11-19 | 中国药科大学 | 一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物及其制备方法和应用 |
-
2010
- 2010-12-28 CN CN2010106097407A patent/CN102190720A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1861635A (zh) * | 2005-05-11 | 2006-11-15 | 中国药科大学 | 人胰高血糖素相关肽－2类似物 |
| CN101041818A (zh) * | 2006-03-24 | 2007-09-26 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 重组生产胰高血糖素样肽－2的方法 |
| CN101307105A (zh) * | 2008-04-28 | 2008-11-19 | 中国药科大学 | 一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物及其制备方法和应用 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102660491A (zh) * | 2012-05-18 | 2012-09-12 | 华东师范大学 | 高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN103159848A (zh) * | 2013-01-06 | 2013-06-19 | 中国人民解放军第四军医大学 | 人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白及其制备方法 |
| CN103159848B (zh) * | 2013-01-06 | 2015-11-25 | 中国人民解放军第四军医大学 | 人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白及其制备方法 |
| CN107586330A (zh) * | 2016-07-08 | 2018-01-16 | 上海多米瑞生物技术有限公司 | 替度鲁肽串联多肽及替度鲁肽制备方法 |
| CN114213524A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-22 | 苏州博领干细胞再生医学有限公司 | 用于胰高血糖素样肽-2抗体检测的包被抗原及纯化方法、重组工程菌及培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102190720A (zh) | 一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物制备方法 | |
| CN101240033A (zh) | 一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN105385693B (zh) | 一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法 | |
| CN112608933B (zh) | 一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法 | |
| WO2020187270A1 (zh) | 含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途 | |
| JP2862870B2 (ja) | 新規ペプチド | |
| CN103102418B (zh) | 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其突变体(mG-CSF)与人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)的融合蛋白及应用 | |
| WO2012037771A1 (zh) | 蝎毒肽及其制备方法与用途 | |
| JP6667432B2 (ja) | 遺伝子移入促進因子プロトランスズジン（Ｐｒｏｔｒａｎｓｄｕｚｉｎ）Ｂ | |
| CN102260346B (zh) | 一种Exendin-4类似物 | |
| CN102796192A (zh) | 人胰高血糖素相关肽-1类似物 | |
| CN104789513B (zh) | 一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株 | |
| CN100418983C (zh) | 人胰高血糖素相关肽-2类似物 | |
| CN104725485A (zh) | 一种重组活性肽及其同步制备方法 | |
| KR20140148420A (ko) | 재조합 펩티드의 생산 방법 | |
| CN113214410A (zh) | 一种表达促皮质素与胰岛素样生长因子1融合蛋白的重组质粒、重组菌的构建方法 | |
| CN111748505B (zh) | 一种表达羧肽酶g2的基因工程菌及其制备方法和应用 | |
| TWI591177B (zh) | 一種胰高血糖素胜肽－２（ｇｌｐ－２）類似物的製備方法 | |
| CN111378049A (zh) | 抗肿瘤靶向融合蛋白、其偶联物及用途 | |
| US20200024321A1 (en) | Expression and large-scale production of peptides | |
| KR101993844B1 (ko) | 개량형 TAT 펩타이드가 융합된 EGF 또는 hGH 단백질의 생산방법 및 이들 단백질을 포함하는 화장료 조성물 | |
| KR101666934B1 (ko) | 개량형 TAT 펩타이드가 융합된 EGF, 티모신β4, hGH 단백질의 생산방법 및 이들 단백질을 포함하는 화장료 조성물 | |
| CN103755799A (zh) | 一种具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素30肽及其制备方法和应用 | |
| CN101144080A (zh) | 重组人VIP-Humanin融合蛋白制备方法 | |
| CN100383249C (zh) | 酵母细胞表达人白细胞介素24的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110921 |