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CN102170866A - 亲脂性或两亲性治疗剂在纳米乳剂中的包囊 - Google Patents

亲脂性或两亲性治疗剂在纳米乳剂中的包囊 Download PDF

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CN102170866A
CN102170866A CN200980138629XA CN200980138629A CN102170866A CN 102170866 A CN102170866 A CN 102170866A CN 200980138629X A CN200980138629X A CN 200980138629XA CN 200980138629 A CN200980138629 A CN 200980138629A CN 102170866 A CN102170866 A CN 102170866A
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Abstract

本发明涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，其包含连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂。本发明还涉及该制剂的制备方法和应用。

Description

亲脂性或两亲性治疗剂在纳米乳剂中的包囊
本发明涉及特别适用于递送亲脂性或两亲性治疗剂的纳米乳剂类型的组合物、其制备方法和将其用于治疗和诊断疾病、特别是癌症的方法。
背景技术
纳米药物构成了融合纳米技术和药物产生的新领域并且目前是用于研发有效靶向疗法、特别是肿瘤学的最富有希望的途径之一。
就此而言，荷载治疗剂的纳米粒构成通过促成靶向癌组织、被动和/或主动靶向克服药物、特别是抗癌药的低选择性的理想解决方案，并且这是减少严重副作用的方式。
为了治疗和成像应用，已经测试了大量纳米粒，既有无机物(例如半导体、二氧化硅或氧化物)，又有有机物(天然或合成聚合物、脂质体、纳米球、纳米囊、微球)。
已经发现聚合物纳米粒具有特别与有机溶剂残留物相关的潜在细胞毒性和大规模生产难以再现和贮存期限问题。脂质体在稳定性和亲脂性化合物包囊度方面受限并且其生产方法复杂。
作为聚合物纳米粒的可替代选择，自从1990以来注意力集中于脂质纳米粒，其包含更通常地基于可生物降解的甘油三酯类的脂质芯，其被聚合物壳包围。生物相容性脂质的选择及其不使用溶剂生产的可能性使得显著降低其毒性成为可能(Muller，R.H.，Eur J PharmBiopharm 2000，50，161-177；Mehnert，W.等人，Advanced DrugDelivery Reviews 2001，47，165-196)。更常见的是，它们由固体脂质颗粒组成(SLN，“固体脂质纳米粒”的简称)，其中脂质芯在室温下是固体。它们还可以由乳剂组成，其中纳米粒由分散于水溶液并且被表面活性剂稳定的脂质相形成。
然而，SLN的技术仍然不能控制生长且存在胶凝意外的趋向和无法预料的动态多晶态转变。此外，SLN具有有限的被掺入固体脂质晶体结构的能力(Mehnert，W.等人，Advanced Drug Delivery Reviews2001，47，165-196；Westesen，K.等人International Journal ofPharmaceutics 1997，151，3545；Westesen，K.等人，Journal ofControlled Release 1997，48，223-236)。
文件WO 01/64328描述了由液体或半固体芯组成的脂质纳米胶囊，所述液体或半固体芯上包围有固体壳，其具有几个纳米的厚度，可以包囊活性药物成分。通过热法得到纳米胶囊，其中油性和水性成分的混合物在形成乳剂的相转变温度(PIT)周围进行温度循环(60-85℃)。然后通过加入冷水将得到的微乳剂猝灭。
该方法需要特殊设备，以便检测乳剂的倒相并且由于达到高温而与许多治疗剂不相容。此外，固体表面壳形成使得随后的生物靶向配体的锚定复杂化。此外，猝灭要求添加大量冷水(3-10倍稀释)，且由此明显降低了纳米胶囊的收率。此外，脂肪酸甘油三酯类的化学性质对相转移温度具有显著性影响，从而限制了其选择。
文件US 2006/0292186描述了用于给予难溶于水的活性成分(例如紫杉醇)的无水自动纳米乳化制剂。这些制剂包含高比例的泰洛沙泊和TPGS即合成聚合物表面活性剂。
文件WO 2008/042841描述了包含阴离子型磷脂的紫杉醇乳剂的预浓缩物。由于分散于水相，所以该制剂形成水包油型乳剂，其中液滴携带负电荷。然而，这些乳剂不稳定，由此必须恰好在给药前制备。
此外，Tarr等人(1987)在Pharm.Res.4：162-165中报道紫杉醇在英脱利匹特中的制剂，即胃肠外应用的乳剂，但紫杉醇在大豆油中的低溶解度(0.3mg/ml)使得这种赋形剂不适合。
光敏剂类型的治疗剂的有效给药还构成光动力疗法中的重要挑战，这是治疗各种癌症的富有希望的技术。该技术的原理基于将光敏剂导入肿瘤组织并且借助于适合波长的光辐射将该治疗剂转换成高度细胞毒性的化合物。推断光敏剂的细胞毒性效应是因光辐射后形成单态氧所致。
这种方法的选择依赖于光敏剂相对于健康组织选择性地蓄积在肿瘤组织内，且更具体地是蓄积在实际的肿瘤细胞内。目前，活性剂全身注射后的低肿瘤选择性对患者而言产生了至少6-8周的延长期限的皮肤光敏度。
用于光敏剂的完美给药系统由此还构成了用于研发光动力疗法的重要挑战。
文件WO 00/28971描述了用于包含纳米乳剂的5-氨基酮戊酸(5-ALA)局部给药的制剂，其用于光疗法和诊断。
最后，为了减少皮肤光敏度期限，文件US 2005/0215524中提出了在用光敏剂进行光疗法治疗前、过程中或之后给予磷脂类乳剂。在这些实例中，将光敏剂直接溶于注射的磷脂类，从而促进了其在血浆和皮肤中快速清除。
[技术问题]
能够有效地靶向递送的稳定纳米乳剂中高剂量亲脂性和两亲性治疗剂的制剂由此仍然是一个挑战。
在本发明中，我们提出一种制剂，其中将治疗剂包囊在具有特定组成的油相的纳米乳剂中。
[发明概述]
本发明描述了将治疗剂包囊在水包油型纳米乳剂中的新制剂。
通过特定的制剂，本发明的纳米乳剂是稳定的并且能够实现高度的治疗剂包囊。这种纳米乳剂还能够在与分散相小平均直径相关的细胞中实现高度摄入。其制剂支持在连续相中的高浓度表面活性剂并且令人意外地稳定，因为它保持了稳定并且显示不依赖于组成的治疗剂的生物分布。最终，因为可以将其配制成分散相表面具有低、甚至零的ζ电位，所以具有价值。ζ电位是影响纳米乳剂生物分布的关键参数。在接触细胞后，正ζ电位由此促进了胞吞作用。
特别地，纳米乳剂有利地显示在贮存过程中的极佳胶体稳定性(＞3个月)和良好的包囊治疗剂的能力和分散相中增加的浓度。在施用过程中，在将纳米粒静脉内注入生物体后还观察到长血浆寿命(隐身特性)。
因此，本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂。
两亲脂质优选是磷脂。
增溶脂质有利地包含至少一种脂肪酸甘油酯，例如包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯。
油相还可以包含至少一种油，优选具有3-6的亲水亲油平衡值(HLB)的油，特别是选自大豆油和亚麻籽油的油。
助表面活性剂优选包含由环氧乙烷单元或环氧乙烷或环氧丙烷单元形成的至少一种链。助表面活性剂可以特别地选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类、脂肪酸和聚乙二醇酯类、和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
治疗剂可以特别地是活性药物成分或光敏剂。
本发明的第二个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤：
(i)制备包含至少一种增溶脂质、两亲脂质和治疗剂的油相；
(ii)制备包含聚烷氧基化助表面活性剂的水相；
(iii)在足够剪力效应下将油相分散于水相以形成纳米乳剂；和
(iv)回收由此形成的纳米乳剂。
剪力效应优选通过超声处理产生。通过将全部或一些成分置于适合溶剂中形成溶液且然后蒸发溶剂有利地制备油相。
本发明的第三个方面涉及本发明的制剂在对人或动物给予治疗剂以治疗疾病或病患中的应用。
本发明的生产方法能够以简便、快速和低廉的方式生产包含极小分散相的纳米乳剂。该方法还是稳定的并且易于工业化生产。此外，它不使用或仅使用极少的有机溶剂并且可以用经批准可应用于人体注射的产品实现。最后，仅需要适度加热且由此生产方法甚至对不稳定的活性成分而言也可使用。
[本发明的公开内容]
[定义]
在本文件的含义中，术语“纳米乳剂”意指具有至少两相的组合物，一般是油相和水相，其中分散相的平均大小小于1微米，优选10-500nm，且特别是20-100nm，且最优选20-70nm(参见文章C.Solans，P.Izquierdo，J.Nolla，N.Azemar和M.J.Garcia-Celma，Curr Opin Colloid In，2005，10，102-110)。
术语“治疗剂”意指可以用于治疗疾病并且以化学方式(例如活性药物成分)、以物理或生物方式起作用的任意化合物，但不包括诊断试剂。
术语“液滴”包括液体油这样的液滴和来自水包油型乳剂的固体颗粒，其中所述油相是固体。在后面的情况中，通常还使用术语“固体乳剂”。
在本文件的含义中，术语“脂质”表示包含存在于动物脂肪和植物油中的脂肪酸的全部脂肪和油或物质。它们是主要由碳、氢和氧形成并且具有低于水的密度的疏水或两亲分子。脂质在室温(25℃)可以是固态、为蜡或作为油的液体形式。
术语“磷脂”意指具有磷酸酯基的脂质，特别是磷酸甘油脂类。最常见的是，磷脂类包含由任选取代的磷酸酯基形成的亲水端和由脂肪酸链形成的两个疏水端。具体的磷脂类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。
术语“卵磷脂”意指磷脂酰胆碱，即由胆碱、磷酸、甘油和两种脂肪酸形成的脂质。更广泛地说，它包括从生命来源、植物或动物来源提取的磷脂类，条件是它们主要由磷脂酰胆碱组成。这些卵磷脂一般由携带不同脂肪酸的卵磷脂混合物组成。
术语“脂肪酸”意指具有至少4个碳原子的碳链的脂族羧酸。天然脂肪酸具有4-28个碳原子的碳链(一般是偶数)。长链脂肪酸是14-22个碳原子长的那些且极长链脂肪酸是具有22个以上碳原子的那些。
术语“表面活性剂”意指具有两亲结构的化合物，这种结构使得它们对油/水-型和水/油-型界面具有特异性亲和力，使得它们降低这些界面的自由能并且稳定分散的系统。
术语“助表面活性剂”意指与另一种表面活性剂一起起作用以进一步降低界面能量的表面活性剂。
术语“生物配体”意指以特异性方式识别一般排列在细胞表面上的受体的任意分子。
[乳剂]
本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含至少一种连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含聚烷氧基化助表面活性剂。
乳剂由此是水包油型乳剂。该乳剂可以是单相或多相的，特别是通过在分散相中包含第二水相。
本发明能够被包囊在纳米乳剂中的治疗剂特别地包含以化学、生物或物理方式起作用的活性成分。因此，它们可以是活性药物成分或生物制剂(例如DNA、蛋白质、肽类或抗体)和用于物理疗法的活性剂例如用于热疗法的化合物、在被光激发时释放单态氧的化合物(用于光疗法)和放射性试剂。优选它们是通过注射给药的活性成分。
治疗剂根据其亲脂性和两亲性亲和力被分散相包囊或位于两相之间的界面上。
对包囊在纳米乳剂中的治疗剂的性质没有具体限定。然而，纳米乳剂对难以配制在用于常规给药系统中的难溶性化合物和用于光疗法的发光活性成分具有特别的价值，其中必须保持量子收率。
基于制备方法的适度条件，所述制剂对包囊在高温下降解的治疗剂具有特别的价值。
具有作为治疗剂价值的活性药物成分的实例特别地是用于治疗AIDS的活性剂、用于治疗心脏病的活性剂、镇痛药、麻醉剂、减食欲药(anorexigens)、抗蠕虫药、抗过敏药、抗心绞痛药、抗心律不齐药、抗胆碱能药、抗凝血药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗利尿药、止吐药、抗惊厥药、抗真菌药、抗组胺药、抗高血压药、抗炎药、抗偏头痛药、抗毒蕈碱药、抗分支杆菌药、抗癌药、包括抗震颤麻痹药、抗甲状腺药、抗病毒药、收敛药、阻断剂、血液制品、血液代用品、心肌收缩药、心血管药物、用于中枢神经系统的活性剂、螯合剂、化疗药物、造血生长因子、皮质类固醇、镇咳药、皮肤病药、利尿药、多巴胺能药、弹性蛋白酶抑制剂、内分泌药、麦角生物碱类、祛痰药、胃肠病用药、泌尿生殖用药、生长激素因子引发剂、生长激素、血液病用药、造血剂、止血剂、激素、免疫用药、免疫抑制剂、白细胞介素、白细胞介素类似物、脂质调节剂、促性腺素释放素、肌肉松弛剂、麻醉品拮抗药、滋养药、营养滋补药、肿瘤治疗剂、有机硝酸酯类、拟迷走神经药(vagomimetics)、前列腺素类、抗生素类、肾脏用药、呼吸用药、镇静药、性激素、兴奋剂、拟交感神经药、全身抗感染药、他克莫司、血栓溶解剂、甲状腺用药、注意力困难治疗药、疫苗、血管扩张剂、黄嘌呤类和胆固醇减少药。特别关注抗癌药，例如泰素(紫杉醇)、多柔比星和顺铂。
物理试剂的实例特别是放射性同位素和光敏剂。
光敏剂的实例特别是属于四吡咯类的那些化合物，例如卟啉类、菌绿素、酞菁、氯、荔枝螺毒素、卟啉烯类(porphycenes)、脱镁叶绿甲酯酸或那些属于德卟啉或金丝桃素类的化合物。第一代光敏剂的实例是血卟啉和血卟啉衍生物混合物(HpD)(在商品名
Figure BDA0000053090660000091
下由Axcan Pharma销售)。第二代光敏剂的实例是间-四-羟苯基氯(mTHPC；商品名
Figure BDA0000053090660000092
Biolitec AG)和苯并卟啉的A环的一元酸衍生物(BPD-MA，在商品名
Figure BDA0000053090660000093
下由QLT和Novartis Opthalmics销售)。与这些光敏剂相关的作为转运蛋白起作用并且允许其选择性进入肿瘤组织的分子(脂质、肽、糖等)的第二代光敏剂的制剂称作第三代光敏剂。
生物制剂的实例是寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、肽类和蛋白质。
当然，可以以其活性形式或前体药物形式直接配制治疗剂。此外，对多种治疗剂而言能够将其结合纳米乳剂配制。
治疗剂的量取决于指定的关注的应用和活性剂的性质。然而，一般尝试配制具有最大浓度的治疗剂的纳米乳剂，特别是在使用难溶性治疗剂时，以便限制对患者给药的体积和/或期限。
目前，已经发现，在油相中存在增溶脂质能够掺入大量化合物，甚至是疏水性或两亲性化合物。
本发明的制剂更常见的是包含0.001-30％重量、优选0.01-20％重量、或乃至更优选0.1-10％重量的用量的治疗剂。
有利地，将治疗剂掺入溶液形式的乳剂，然后例如通过蒸发分离溶剂。该溶液包含可以达到其溶解度极限的可变量的治疗剂。溶剂的选择依赖于每种治疗剂的溶解度。所用溶剂可以是例如甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、环己烷、DMSO、DMF乃至甲苯。优选使用挥发性溶剂，优选对人是无毒性的。
根据本发明，纳米乳剂的油相还包含至少一种两亲性脂质和至少一种增溶脂质。
为了形成稳定的纳米乳剂，一般在组合物中必需要包括至少一种两亲脂质作为表面活性剂。表面活性剂的两亲性使得油滴在水性连续相中稳定。
两亲脂质包含亲水部分和亲脂部分。它们一般选自亲脂部分包含具有8-30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的化合物。它们可以选自磷脂类、胆固醇类、溶脂质类(lysolipids)、鞘磷脂类、生育酚类、糖脂类、硬脂酰胺类和心磷脂质类，并且可以具有天然或合成来源；由与亲水性基团通过醚或酯官能团偶合的脂肪酸形成的分子，例如山梨坦酯类，例如在
Figure BDA0000053090660000111
商品名下由Sigma销售的失水山梨糖醇单油酸酯和月桂山梨坦；与聚氧化乙烯(PEG)短链共轭的脂质，例如在
Figure BDA0000053090660000112
商品名下由ICI Americas，Inc.销售的和在
Figure BDA0000053090660000113
下由Union Carbide Corp.销售的非离子型表面活性剂；糖酯类，例如蔗糖单月桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯和蔗糖二棕榈酸酯、蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯；能够使用单独或混合物形式的所述表面活性剂。
卵磷脂是优选的两亲脂质。
在一个具体的实施方案中，全部或部分两亲脂质可以具有反应官能团，例如马来酰亚胺、硫醇、胺、酯、羟基胺或醛基。反应官能团的存在使得官能化合物在界面上接枝。将反应性两亲脂质掺入界面上形成的层，稳定分散相，其中它易于偶合存在于例如水相中的反应性化合物。
一般而言，油相包含0.01-99％重量、优选5-75％重量、特别是20-60％重量且最具体的是33-45％重量的两亲脂质。
两亲脂质的量有利地有助于控制得到的纳米乳剂的分散相的大小。
本发明的乳剂还包含增溶脂质。该化合物的主要任务在于增溶在纳米乳剂油相中难溶的两亲脂质。
增溶脂质是对两亲脂质具有足够亲和力以使其增溶的脂质。增溶脂质优选在室温下是固体。
就两亲脂质是磷脂的情况而言，可能的增溶脂质特别是甘油衍生物，尤其是通过用脂肪酸酯化甘油得到的甘油酯类。
所用的增溶脂质有利地依赖于所用两亲脂质而被选择。它一般具有类似的化学结构以便带来期望的增溶。它可以是油或蜡。增溶脂质优选在室温(20℃)下是固体，而在体温(37℃)下是液体。
优选的增溶脂质，特别是磷脂类，是脂肪酸甘油酯类，特别是饱和脂肪酸甘油酯类，且特别是包含8-18个碳原子、甚至更优选12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯类。有利的是包括不同甘油酯的混合物。
优选包括包含至少10％重量的C12脂肪酸、至少5％重量的C14脂肪酸、至少5％重量的C16脂肪酸和至少5％重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。
优选包括包含0％-20％重量的C8脂肪酸、0％-20％重量的C10脂肪酸、10％-70％重量的C12脂肪酸、5％-30％重量的C14脂肪酸、5％-30％重量的C16脂肪酸和5％-30％重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。
特别优选由Gattefossé在商品名
Figure BDA0000053090660000121
NC下销售的半合成甘油酯混合物，其在室温下是固体并且被批准应用于人体注射。N
Figure BDA0000053090660000122
型甘油酯类通过直接酯化脂肪酸和甘油得到。它们是C8-C18饱和脂肪酸的半合成甘油酯类，其中定性-定量组成如下表所示。
上述举出的增溶脂质能够得到有利地稳定的纳米乳剂形式的制剂。不应依赖于具体理论，推定上述举出的增溶脂质能够得到具有无定形芯的纳米乳剂形式的液滴。由此得到的芯具有增加的内部粘度，未显示结晶性。结晶对纳米乳剂的稳定性具有不良影响，因为它一般导致液滴聚集和/或导致包囊分子从液滴中排出。这些特性由此提高了随时间推移的纳米乳剂物理稳定性和治疗剂的包囊稳定性。
增溶脂质的量随存在于油相中的两亲脂质的类型和量而广泛改变。一般而言，油相包含1-99％重量、优选5-80％重量且特别是40-75％重量的增溶脂质。
表1：来自Gattefossé的Suppocire
Figure BDA0000053090660000131
的脂肪酸组成
  链长   [％重量]
  C8   0.1-0.9
  C10   0.1-0.9
  C12   25-50
  C14   10-24.9
  C16   10-24.9
  C18   10-24.9
油相还可以包含一种或多种其他油。
所用的油优选具有小于8且甚至更优选3-6的亲水亲油平衡值(HLB)。有利的是，使用在乳剂形成前无任何化学或物理改变的油。
在提出的应用中，油选自生物相容性油，特别是天然(植物或动物)或合成来源的油。这种类型的油特别包括天然植物来源的油，特别包括大豆油、亚麻籽油、棕榈油、花生油、橄榄油、葡萄籽油和向日葵油；和合成油，特别包括甘油三酯类、甘油二酯类和单酸甘油酯类。这些油可以是其天然形式、精制或酯交换形式。
优选的油是大豆油和亚麻籽油。
一般而言，如果存在，则油包含在油相中，其量为1-80％重量，优选5-50％重量且特别是10-30％重量。
油相还可以包含其他添加剂，例如适量的着色剂、稳定剂、防腐剂、荧光团、用于成像的造影剂无机纳米晶体(例如金、氧化铁或半导体纳米晶体)或其他活性成分。
可以通过单纯混合成分，如果必要将它们加热至全部成分熔化来制备用于乳剂分散相的油相。
本发明方法中使用的水相优选由水和/或缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液，例如PBS(“磷酸缓冲盐水”))或另一种盐水溶液、特别是氯化钠组成。
它还任选包含其他成分，包括助表面活性剂。助表面活性剂稳定纳米乳剂。
助表面活性剂还可以对纳米乳剂的指定应用具有其他影响。特别地，它可以被接枝以便携带靶向配体。
可以用于本发明乳剂的助表面活性剂优选是水溶性表面活性剂。水溶性表面活性剂优选被烷氧基化并且优选包含至少一种由环氧乙烷单元(PEO或PEG)或环氧乙烷和环氧丙烷单元组成的链。优选链中的单元数在2-500之间改变。
助表面活性剂的实例特别包括：共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG/PE)；脂肪酸和聚乙二醇醚类，例如ICI Americas Inc.在
Figure BDA0000053090660000141
商品名下销售的产品(例如
Figure BDA0000053090660000151
35、58、78或98)；脂肪酸和聚乙二醇酯类，ICI Americas Inc.在
Figure BDA0000053090660000152
商品名下销售的产品(例如
Figure BDA0000053090660000153
45、52、53或59)；和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物，例如BASF AG在
Figure BDA0000053090660000154
商品名下销售的产品(例如
Figure BDA0000053090660000155
F68、F127、L64、L61、10R4、17R2、17R4、25R2或25R4)或Unichema Chemie BV在
Figure BDA0000053090660000156
商品名下销售的产品(例如PE/F68、PE/L61或PE/L64)。
水相优选包含0.01-50％重量、优选1-30％重量且特别是5-20％重量的助表面活性剂。
在一个优选的实施方案中，连续相还包含增稠剂，例如甘油、糖、寡糖或多糖、树胶乃至蛋白质，优选甘油。实际上，较高粘度连续相的应用促进乳化且由此能够减少超声处理时间。
水相有利地包含0-50％重量、优选1-30％重量且特别是5-20％重量的增稠剂。
一般而言，水相还可以包含其他添加剂，例如适量的着色剂、稳定剂和防腐剂。
可以通过单纯混合不同成分与选择的水性介质制备用于乳剂连续相的水相。
[制备方法]
易于通过在剪力的作用下分散适量的油相和水相制备上述纳米乳剂。
在本发明方法中，最初混合不同的油成分和治疗剂，以制备用于乳剂分散相的油预混合物。可以任选通过将成分之一或全部混合物放入适合有机溶剂形成溶液，从而促进混合。然后蒸发有机溶剂，以便得到用于分散相的均匀油预混合物。
此外，还优选在全部成分是液体的温度下生产预混合物。
根据优选的实施方案，在表面上使纳米乳剂分散相与有益分子(例如生物配体)接枝。这种类型的接枝过程能够识别特定细胞(例如S.Achilefu文章Technology in Cancer Research & Treatment，2004，3，393-408中所述的肿瘤细胞)或特定身体器官。
表面接枝过程优选通过使分子或其前体与两亲化合物、特别是助表面活性剂偶合进行。就此而言，两亲化合物作为能够使靶向分子排列在表面上的间隔物起作用。这种偶合可以在乳化之前或之后进行。后一种情况在所用化学反应与乳剂胶体稳定性相容时，特别是在pH方面是优选的。偶合反应过程中的pH优选是5-11。
有益分子可以是，例如：
-生物靶向配体，例如抗体、肽类、糖类、适体、寡核苷酸类或化合物例如叶酸；
-隐身剂：添加以使纳米乳剂对免疫系统而言不可见、增加其在生物体中的循环并且减缓其消除的物质。
还能够通过共价键或不通过共价键引入纳米粒内部、在其表面或被吸收在其上：
-成像剂，特别是用于MRI(磁共振成像)、PET(正电子发射断层摄影术)、SPECT(单光子发射计算体层摄影)、超声检查、放射摄影术、X-体层摄影术和光学成像(荧光、生物发光、扩散等)；和/或
-如上述所定义的治疗剂。
油相和水相的比例高度可变。然而，通常使用1-50％、优选5-40％且特别是10-30％重量的油相和50-99％、优选60-95％且特别是70-90％重量的水相制备纳米乳剂。
有利的是，将油相以液态分散在水相中。如果各相之一在室温固化，则优选制备具有一相或优选两相的混合物，将其加热至大于或等于熔化温度的温度。
优选使用超声处理器或微量流化床(microfluidiser)产生在剪力影响下的乳化。优选将水相、然后将油相以期望的比例导入适合的圆柱形贮器并且将超声处理器浸入介质并且开启足以得到纳米乳剂的时间期限，通常是几分钟。
这就产生了均匀的纳米乳剂，其中油滴的平均直径大于10nm且小于200nm，优选20-50nm。
ζ电位的绝对值优选低于20mV，即为-20至20mV。
在调配前，例如通过过滤或透析稀释和/或灭菌乳剂。该步骤能够消除任何可能在乳剂制备过程中形成的聚集物。
如果必要，由此得到的乳剂易于在稀释后备用。
[使用方法]
可以使用本发明的制剂，因为它能够或适合于指定应用，例如通过稀释，用于对人或动物给予治疗剂。
由于如下事实：仅由批准用于人的成分制备，所以该制剂特别适合于胃肠外给药。然而，还能够通过其他途径、特别是口服或局部进行给药。
所公开的制剂能够在简单的方法中通过特别是化疗或光疗法给予治疗剂，这对治疗疾病(例如癌症)而言是必要的。
本发明还涉及治疗方法，其包含对有此需要的哺乳动物、优选人给予有效治疗量的如上述所定义的制剂。
下文借助于如下实施例和附图更详细描述本发明，其中：
图1：显示透析前后根据实施例2A和2C的mTHPP和mTPC的纳米乳剂在650nm的光密度，其中荷载比例分别是mTHPP的0-1000μM和mTPC的0-2000μM，通过CARY 300-SCAN分光光度计测定并且分别表示为A和B。透析前的线性相关直线方程是，就mTHPP而言：y＝0.0042x+0.2331(R＝0.99；就mTPC而言：y＝0.0049x+0.023(R＝0.99)，透析后的直线方程是，就mTHPP而言：y＝0.0056x+0.1503(R＝0.99)；就mTPC而言：y＝0.0059x+0.0584(R＝0.99)；
图2：显示透析后用Zetasizer(Malvern Instruments)测定的实施例2A-2C的乳剂的分散相的平均直径的棒形图(用PBS 0.1X以1∶1000稀释的样品)；
图3：显示在近红外用共焦显微镜检查观察到的实施例3中得到的细胞影像。黑色颗粒代表mTHPP发发射的荧光；
图4：显示携带Ts/Apc类的皮下肿瘤(1000万个细胞)的小鼠。对麻醉小鼠静脉内(iv)注射具有50μM荧光团的200μL纳米乳剂溶液后24h的观察结果(A：包囊DiD的纳米乳剂；B：包囊ICG的纳米乳剂)；
图5：显示作为被cRGDs官能化的纳米乳剂和未官能化的纳米乳剂的时间函数的肿瘤发射的荧光信号与皮肤发射的荧光信号之比的增长；和
图6：显示作为掺入亲脂性芯的分子函数的不同纳米乳剂分散相的平均直径。
图7：显示温度T＝10℃和T＝60℃生产后的纳米乳剂的两个1HNMR光谱(实施例6)。
图8：显示通过生产后(a)和在室温贮存4个月后(b)使用UniversalV3.8B TA仪器(实施例6)的纳米乳剂的示差扫描量热法(DSC)得到的热分析图(热流(W/g)作为以℃计的温度的函数)。
图9：显示在40℃作为三种纳米乳剂时间(以天数计)函数的纳米乳剂液滴大小(以nm计)增长。菱形代表不含增溶脂质且包含油的纳米乳剂，三角形代表包含增溶脂质和油50∶50混合物的纳米乳剂，圆形代表不含油且包含增溶脂质的纳米乳剂(实施例6)。
实施例
实施例1
包囊紫杉醇的纳米乳剂的制备
按照下列方式制备包囊紫杉醇的批量2mL纳米乳剂(起始紫杉醇载量为1mM，即850μg/mL)。
通过将190mg在商品名NC(Gattefossé)下销售的半合成甘油酯类和138mg大豆卵磷脂(L-α-磷脂酰胆碱，由Fluka销售)，≥30％磷脂酰胆碱)导入加热至50℃的适合的容器制备油相。将溶于1mL氯仿的17mg紫杉醇(由Sigma-Aldrich销售)(即0.002mmol的紫杉醇)加入到该混合物中，然后通过涡旋混合匀化该混合物。然后在40-45℃、在旋转蒸发器中真空蒸发溶剂，同时逐步减压。
通过将228mg Myrj 53(由Sigma-Aldrich销售的聚乙氧基化表面活性剂)导入2mL小瓶、然后加入1.38mL(1444mg)盐水溶液([NaCl]＝154mM)制备水相。将该混合物加热至50℃，以熔化表面活性剂，然后通过涡旋混合匀化得到的溶液。将该水溶液保持在50℃。
将油相、然后将水相(在50℃)在50℃导入浸入水浴的烧瓶。然后将两相溶液接触安装浸入混合物约1cm的圆锥形探头的超声发生器(Vibra-cell 75115，由Bioblock Scientific销售)。用调整至25％的最大功率的超声发生器将该混合物适度超声处理5分钟，使用如下脉冲序列：10秒超声处理/30秒停止。
然后通过0.2mM滤器过滤得到的纳米乳剂，以便分离任何未包囊的泰素。得到的纳米乳剂中脂质纳米粒的浓度约为25％重量。
然后将纳米乳剂备用药物应用并且浓缩至测定为在盐水缓冲液(154mM NaCl)中612μg/mL紫杉醇的量(即30mg治疗剂量的注射的50mL溶液)，以备治疗注射。将配方概述在下表2中。
表2：实施例1制剂的组成
包囊的泰素的分析
通过HPLC根据从S.Kim等人的研究(S.C.Kim，J.Yu，J.W.Lee，E.-S.Park，S.-C.Chi，Journal of Pharmaceutical and Biomedicalanalysis，2005，39 170-176)研发的方法分析得到的包囊在纳米乳剂中的紫杉醇。
首先，通过验证进行超声处理、热处理(在60℃4h)和分析条件下(在乙腈/水混合物中)无降解，证实在制备纳米乳剂和用于分析的条件下泰素的令人满意的物化性能。
所用HPLC(高效液相色谱法)仪器如下：
●检测模块：DualλAbsorbance Detector Waters 2487，在227nmUV检测
●分离模块：Separations module Waters 269
柱：Supelco phase Supelcosil C18 250×4.6mm，5μm，流速1mL/min。
注射体积：20μL溶液(1mg/mL泰素的甲醇溶液，即1.17mM)。
流动相：CH3CN/H2O。
就下表3中所示的洗脱梯度而言，泰素的保留时间tR＝14.64min：
表3：使用的洗脱梯度
Figure BDA0000053090660000221
为了进行定量分析，使用内标4-二甲氨基苯甲酸乙酯(EI)(C11H15NO2，由Sigma-Aldrich销售)，在上述条件下它具有的保留时间tR(EI)＝15.256min。通过破坏乳剂、从混合物中萃取泰素和添加已知量的用于HPLC分析的内标从纳米乳剂中提取包囊的泰素。将得到的结果与上述制备的标准曲线比较，该标准曲线代表泰素与内标之间的峰面积A之比。
发现泰素浓度为0.597mM(理论浓度0.83mM)，且由此包囊度至少为72％。
实施例2A
包囊光敏剂(mTHPP)的纳米乳剂的制备
如下制备包含由Sigma-Aldrich销售的5，10，15，20-四(4羟基苯基)-(21H，23H)-卟啉(mTHPP)的纳米乳剂。
将0.05g大豆油(Sigma-Aldrich)与0.150g半合成甘油酯类(在商品名
Figure BDA0000053090660000222
NC下销售(Gattefossé))和0.100g大豆卵磷脂(富含至75％的磷脂酰胆碱，由
Figure BDA0000053090660000223
在商品名
Figure BDA0000053090660000224
S75下销售)一起导入适合的容器。向该预混合物在二甲亚砜(DMSO)中的溶液中加入0.27mg-1.37mg量的5，10，15，20-四(4羟基苯基)-(21H，23H)-卟啉(由Sigma-Aldrich销售的mTHPP)。真空蒸发掉溶剂后，将残余物加热至50-60℃，将脂质混合物保持在该温度下以便乳化。
在另一个容器中，制备0.05g甘油、0.331g具有50摩尔环氧乙烷的聚氧乙烯硬脂酸酯(在商品名53下由ICI Americas Inc.销售)和氯化钠的154mM水溶液组成的混合物，得到1.7g。将得到的水溶液保持温热(50-60℃)。
将油相、然后将水相加热至50℃，在50℃将其导入浸入水浴的烧瓶。然后将两相溶液接触安装可测定3mm直径的浸入溶液约1cm的圆锥形探头的
Figure BDA0000053090660000232
超声发生器(Sonics，Newtown)。然后用调整至25％的最大功率的超声发生器将该溶液超声出处理5分钟，使用如下脉冲序列：10秒超声处理/30秒停止。在超声处理过程中，将该溶液保持在50℃、在水浴中。
用具有等于12000的截止阈值的
Figure BDA0000053090660000233
透析膜将得到的乳剂对154mM氯化钠溶液透析，以除去未反应的反应剂。然后将得到的乳剂通过0.22μm滤器过滤，以对其灭菌并且除去任何聚集物和过量的光敏剂。
可以照此保持该乳剂，然后在能够稀释后直接用于治疗应用，无需之前的特定处理例如再混悬。
下表4概述了透析前得到的制剂的组成。根据光密度计算的纳米乳剂中mTHPP的平均掺入度约为75％(图1)。
表4：实施例2A-2C制剂的组成
Figure BDA0000053090660000234
按照这种方式得到的乳剂具有通过光散射测定(ZeiterSizerNano，Malvern Instrument)的29nm的分散相平均直径，如图2示例的。
此外，这种光敏剂制剂极为稳定地保持至少40天，正如根据图2A和2B所示例的分散相平均直径对时间推移的稳定性所证实的。
就所有这些特性而言，本发明的制剂由此可以以随时可用的形式销售。
实施例2B
包囊光敏剂(mT20M2P)的纳米乳剂的制备
以相同方式重复实施例2A，除了在预混合物中直接用2.3mg用量的5，10，15，20-四(4十八氧基甲基苯基)-21H，23H-卟啉(mT20M2P，由Porphyrin systems销售)替代光敏剂。
上述表4概述了透析前得到的制剂组成。根据光密度计算的得到的纳米乳剂中mT20M2P的平均掺入程度约为89％。
实施例2C
包囊光敏剂(mTPC)的纳米乳剂的制备
以相同方式重复实施例2A，除了用以10mM甲苯溶液形式添加的0.24mg-2.4mg用量的内消旋-四苯基氯(mTPC，由PorphyrinSystems销售)替代光敏剂。
上述表4概述了透析前得到的制剂组成。根据光密度计算的得到的纳米乳剂中mTPC的平均掺入程度约为83％图1。
荧光量子产率的测定
参比高氯酸尼罗蓝的乙醇溶液测定配制在纳米乳剂和溶剂中的不同光敏剂的荧光量子产率，λexc605nm(Fref＝0.27)。将结果概述在表5中。发现该产率基本上是光敏剂在其相应溶剂中的收率。纳米乳剂形式的制剂由此不会影响测试光敏剂的荧光量子产率。
表5：荧光量子产率F
  光敏剂   F
  乙醇中的mTHPP   0.23
  mTHPP(纳米乳剂，荷载比例800μM)   0.23
  mT2OM2P(纳米乳剂，荷载比例660μM)   0.16
  甲苯中的mTPC   0.38
  mTPC(纳米乳剂，荷载比例800μM)   0.40
实施例3
纳米乳剂在肿瘤细胞中的内化
通过荧光显微镜检查在体外监测根据实施例2A得到的包囊mTHPP(荷载比例600μM)的纳米乳剂在U373肿瘤细胞系中的内化。
将置于培养室载玻片(Labtech，Nunc)上的U373肿瘤细胞在包含5％CO2的受控气氛中、在根据实施例2配制成纳米乳剂的mTHPP的存在下温育24h，mTHPP在DMEM培养基(Gibco，Invitrogen提供)中的终浓度为2μM。使用DMEM进行一系列冲洗操作和固定在37℃、4％多聚甲醛溶液中后，将细胞放入专用包埋剂以便检测荧光(Prolong anti-fade，Invitrogen)并且用盖玻片覆盖载玻片。
样品的共焦显微镜检查(Leica TS2)显示肿瘤细胞中的荧光，如图3所示，显示配制成纳米乳剂的mTHPP从肿瘤细胞外部进入内部。
实施例4
在不同肿瘤模型中的被动蓄积
在携带肿瘤的小鼠中并且使用非侵害性荧光成像研究本发明纳米乳剂的生物分布。
就这些要求而言，根据实施例1和2制备纳米乳剂，除了使用适合于体内非侵害性荧光成像的亲脂性和两亲性有机荧光团(荧光团DiD或DiR，Invitrogen，和ICG Sigma)替代包囊的治疗剂，如专利申请PCT FR2007/000269中所述。
作为肿瘤模型起作用的细胞是来源于鼠乳腺癌(Ts/Apc)的Ts/Apc细胞(Lollini，P.L.；Degiovanni，C.；Landuzzi，L.；Nicoletti，G.；Frabetti，F.；Cavallo F.；Giovarelli，M.；Forni，G，；Modica，A，；Modesti，A，；Musiani，P，；Nanni，P，；Human Gene Therapy 1995，6，(6)，743-752)。将Ts/Apc细胞在包含10％FCS、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、2.5×10-5M的2-巯基乙醇(由Sigma-Aldrich销售)的RPMI 1640培养物中培养。将细胞保持在37℃、具有5％CO2的潮湿气氛中。在注射纳米乳剂前2周将106细胞经皮下注入5-6周龄的雌性裸鼠背部(IFFA-Credo，Marcy l’Etoile，France)。进行全部注射和图像获取，同时用气体(异氟烷)将小鼠保持在全身麻醉状态下。用适合于包囊荧光团的光谱特性的荧光反射成像(FRI)装置给麻醉的动物拍摄影像。
图4显示注射后24h得到的荧光信号。该图像清楚地显示两种不同荧光团在肿瘤中的荧光示踪剂蓄积。
实施例5
官能化纳米乳剂的制备
可以使用可官能化的表面活性剂使纳米乳剂官能化，以便通过主动靶向现象增加其在肿瘤中的蓄积。
作为实例，根据实施例4制备的包囊DiD的纳米乳剂被能够固定在膜受体αVβ3整联蛋白上的环肽(cRGD)官能化。这些整联蛋白在血管发生现象即明显伴随大部分肿瘤生长的新血管生成过程中被超表达。
可以在乳化之前或之后进行官能化。下文给出了如何在乳化前对助表面活性剂进行官能化的解释。
通过接枝助表面活性剂官能化的靶向肽的制备
使在内皮细胞表面上超表达的和下文称作cRGD的具有被保护硫氢基的巯基乙酸形式的αVβ3整联蛋白的靶向环肽即Ansynth ServiceBV(Netherlands)销售的c(RGCf[ε-S-乙酰基硫代乙酰基K与接枝助表面活性剂即二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚(乙二醇)5000-马来酰亚胺(Avanti Polar Lipids Inc销售的DSPE-PEG(5000)-马来酰亚胺)，后者与cRGD按1∶1的摩尔比在具有0.05M羟基胺浓度的(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷/乙二胺四乙酸(HEPES/EDTA)的磺酸缓冲溶液中混合。在室温在适度氩气流中缓慢搅拌溶液4小时，低压蒸发，然后再溶于氯仿，然后进行第二步。
然后按照实施例2所示的方案制备官能化纳米乳剂，除了用等量的如上所述制备的肽替代2％重量的油。
将被cRGD官能化的掺杂DiD的纳米乳剂溶液和作为对照的未官能化的掺杂DiD的纳米乳剂注入携带来源于Hekβ3细胞的肿瘤的小鼠。按照与上述类似的方案将这些肿瘤细胞植入雌性裸鼠背部。
比较用被cRGD官能化的纳米乳剂治疗小鼠与接受未官能化纳米乳剂的小鼠的皮肤上的肿瘤比例发展，结果显示被cRGD官能化的纳米粒优选在肿瘤中蓄积。这表明所关注分子向量化的主动靶向。
因此，本发明的纳米乳剂构成了能够允许更多靶向给药的治疗剂制剂，由此促成给药剂量降低且由此减少了治疗期限和不期望的副作用。
此外，发现治疗剂的荷载在分散相大小、界面性质及其负荷、对其体内生物分布起作用的主要因素方面难以改变制备的纳米乳剂的特性。最终，包囊活性成分例如紫杉醇或光敏剂的纳米乳剂以被动方式蓄积在肿瘤中，这种蓄积能够通过接枝生物配体(例如cRGD)而被主动靶向所强化。
本发明提供的纳米乳剂由此构成以被动或主动方式将治疗剂定向于肿瘤载体化的有效方式且由此构成用于改善疾病(例如癌症)诊断和治疗、特别是通过化疗或光疗途径的有价值的工具。
实施例6
纳米乳剂的突出稳定性
进行如下实验以显示增溶脂质赋予纳米乳剂的稳定性。
实施例6A：通过NMR突出显示液滴的高内部粘度
根据实施例1的方案制备包含255mg
Figure BDA0000053090660000281
NC(Gattefossé)(增溶脂质)、85mg大豆油(Sigma Aldrich)(油)、345mg
Figure BDA0000053090660000282
(ICIAmericas Inc)(助表面活性剂)、65mg
Figure BDA0000053090660000283
s75(卵磷脂、两亲脂质)和磷酸盐缓冲液(PBS)的纳米乳剂。
通过质子核磁共振在10℃和60℃分析纳米乳剂。在1H NMR光谱内观察到的与纳米乳剂(油/增溶脂质和两亲脂质)液滴的芯成分相关的峰(0.9；1.5；1.6；2.0；2.2；4.1；4.2ppm)比参比物(0ppm 4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸(DSS))扩大，尤其是在温度低时，由此突出显示了液滴的高内部粘度。与助表面活性剂
Figure BDA0000053090660000284
(3.7ppm)相关的峰没有显示任何扩大，这表明表面活性剂保持在液滴表面上，其中聚氧乙烯链被增溶在水性缓冲液中(图7)。
实施例6B：通过示差扫描量热法突出显示液滴中不存在结晶
根据实施例1的方案制备包含150mg
Figure BDA0000053090660000285
NC(Gattefossé)(增溶脂质)、50mg大豆油(Sigma Aldrich)(油)、228mg
Figure BDA0000053090660000286
(ICIAmericas Inc)(助表面活性剂)、100mgs75(卵磷脂，两亲脂质)和磷酸盐缓冲液(PBS)的纳米乳剂。
在制备后和在室温贮存4个月后通过对纳米乳剂的示差扫描量热法分析得到的热分析图显示生产后、在室温贮存4个月以上均未观察到融合峰(fusion peak)，表明液滴未结晶(图8)。
实施例6C：揭示纳米乳剂组成对其物理稳定性的影响
根据实施例1的方案制备包含228mg
Figure BDA0000053090660000291
(ICI Americas Inc)(助表面活性剂)、100mg
Figure BDA0000053090660000292
s75(卵磷脂，两亲脂质)、1600μL磷酸盐缓冲液(PBS)、用量如表6中所示的
Figure BDA0000053090660000293
NC(Gattefossé)(增溶脂质)和大豆油(Sigma Aldrich)(油)的三种纳米乳剂。
表6：纳米乳剂中
Figure BDA0000053090660000294
NC和大豆油的量
Figure BDA0000053090660000295
对三种得到的纳米乳剂在40℃进行加速稳定性试验。监测一定时间期限内纳米乳剂大小/多分散性能够突出显示增溶脂质的稳定效果。而不含增溶脂质的纳米乳剂的大小在40℃几乎170天后显著增加，包含增溶脂质的纳米乳剂未显示液滴大小显著改变(图9)。结果显示将增溶脂质添加到纳米乳剂组成中赋予液滴和纳米乳剂更好的物理稳定性。

Claims (16)

1.纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含连续水相和至少一种分散的油相，其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂，且其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，所述增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含：
-至少10％重量的C12脂肪酸；
-至少5％重量的C14脂肪酸；
-至少5％重量的C16脂肪酸；和
-至少5％重量的C18脂肪酸。
2.权利要求1的治疗剂制剂，其中增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含：
-0％-20％重量的C8脂肪酸；
-0％-20％重量的C10脂肪酸；
-10％-70％重量的C12脂肪酸；
-5％-30％重量的C14脂肪酸；
-5％-30％重量的C16脂肪酸；和
-5％-30％重量的C18脂肪酸。
3.权利要求1或权利要求2的治疗剂制剂，其中两亲性脂质是磷脂。
4.权利要求1-3任一项的治疗剂制剂，其中所述油相还包含至少一种油。
5.权利要求4的治疗剂制剂，其中所述油具有3-6的亲水亲油平衡值(HLB)。
6.权利要求1-5任一项的治疗剂制剂，其中助表面活性剂包含至少一种由环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元组成的链。
7.权利要求6的治疗剂制剂，其中助表面活性剂选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类、脂肪酸和聚乙二醇酯类、和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
8.权利要求1-7任一项的治疗剂制剂，其中治疗剂是药物成分。
9.权利要求1-7任一项的治疗剂制剂，其中治疗剂是光敏剂。
10.权利要求1-9任一项的治疗剂制剂，其特征在于它被官能化。
11.权利要求1-10任一项的纳米乳剂形式的治疗剂制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤：
(i)制备包含治疗剂、两亲脂质和至少一种增溶脂质的油相，所述增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含：
-至少10％重量的C12脂肪酸；
-至少5％重量的C14脂肪酸；
-至少5％重量的C16脂肪酸；和
-至少5％重量的C18脂肪酸；
(ii)制备包含聚烷氧基化助表面活性剂的水相；
(iii)在足够剪力效应下将油相分散于水相以形成纳米乳剂；和
(iv)回收由此形成的纳米乳剂。
12.权利要求11的制备方法，其中增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含：
-0％-20％重量的C8脂肪酸；
-0％-20％重量的C10脂肪酸；
-10％-70％重量的C12脂肪酸；
-5％-30％重量的C14脂肪酸；
-5％-30％重量的C16脂肪酸；和
-5％-30％重量的C18脂肪酸。
13.权利要求11或权利要求12的制备方法，其中剪力效应通过超声处理产生。
14.权利要求11-13任一项的制备方法，其中如下制备油相：通过将全部或一些成分放入适合的溶剂形成溶液，且然后蒸发溶剂。
15.权利要求1-10任一项的制剂，用于对人或动物给予治疗剂以治疗疾病或病患。
16.治疗方法，包含对有此需要的哺乳动物给予有效治疗量的权利要求1-10任一项的制剂。
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