CN102166374A - 羊膜复合角膜缘干细胞膜片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种羊膜复合角膜缘干细胞膜片的制备方法。首先制备去上皮无菌羊膜片，再将上述得到的羊膜片的上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒的端面上，用嵌入式培养小室扣在套筒的羊膜片上，即制成羊膜嵌套式培养模具；将该培养模具放置入铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6孔板的孔内，最后用消化法制备角膜缘干细胞细胞悬液并接种于羊膜片的上皮面上，每套培养模具接种2.0-3.0×105个角膜缘干细胞，培养10日后即得到羊膜复合角膜缘干细胞膜片。相比以往羊膜平铺法和乳胶圈羊膜固定法，本发明制备的羊膜复合角膜缘干细胞膜片的羊膜培养面很平坦，且角膜缘干细胞复层均匀，特别是具有临床应用方便羊膜不易破裂的优点。
Description
技术领域
本发明属于眼角膜缘干细胞培养领域，具体涉及到一种羊膜复合角膜缘干细胞膜片的制备方法。
背景技术
角膜上皮细胞来自于角膜缘部位的干细胞，正常角膜缘是维持正常眼表功能的关键。角膜缘受损后，使损伤区干细胞功能缺陷或数量不足，会引起结膜上皮长入角膜表面，角膜新生血管生成，进一步引起角膜瘢痕等严重症状，使视力明显下降甚至丧失。而通过移植补充一定数量的干细胞是目前最有效的治疗方法之一。
角膜缘移植由于受到材料来源限制和术后免疫排斥等难题的制约，培养的角膜缘干细胞移植成为众多学者研究的热点。在以角膜缘干细胞缺乏或功能障碍为特征的疾病治疗过程中，培养的角膜缘干细胞移植术已成为眼科研究的一个新的发展方向。培养的角膜缘干细胞移植部分解决了供体不足的问题，它的临床应用将为眼表疾病的治疗开辟广阔前景，具有深远意义。目前常用的用于移植的角膜缘干细胞培养方法主要由两种，一种是将羊膜平铺于细胞培养器皿或载玻片表面，其获得的细胞膜片移植前需要从培养器皿上揭取下来，非常容易揭破，影响临床使用，同时应用此方法无法与饲养层细胞共培养，也会导致干细胞数量的丢失，影响移植后的效果；另一种方法是将羊膜用乳胶圈固定于嵌入式培养板小室(transwell或insert)中，但此方法在培养后期会因为羊膜松弛而造成培养上皮复层不均匀的缺点，而大大影响临床手术治疗的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊膜复合角膜缘干细胞膜片的嵌套式培养方法，以弥补现有技术的不足。
本发明的制备方法如下：首先，按照常规方法制备5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮无菌羊膜片，再将上述得到的羊膜片的上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒的端面上，用嵌入式培养小室扣在套筒的羊膜片上，即制成羊膜嵌套式培养模具；然后用丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞后，再消化接种到细胞培养用的6孔板中制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，将上述制好的羊膜嵌套式培养模具放置入铺有上述饲养层的6孔板的孔内，最后用中性蛋白酶、0.25％胰酶/0.02％EDTA消化而制备角膜缘干细胞细胞悬液，并接种于羊膜上皮面，每套培养模具接种2.0-3.0×105个角膜缘干细胞，培养10日后长满角膜缘干细胞即可用，即制得羊膜复合角膜缘干细胞膜片。
使用时，将套筒从嵌入式培养小室中取出，轻轻将羊膜复合角膜缘干细胞膜片取下即可用于临床角膜缘干细胞移植手术。
本发明以眼库剩余角膜环为原材料，培养制备羊膜复合角膜缘干细胞膜片，用于角膜缘干细胞缺乏或功能障碍为特征的疾病移植治疗中。
本发明的羊膜嵌套式培养模具应用于制备羊膜复合角膜缘干细胞膜片，相比以往羊膜平铺法和乳胶圈羊膜固定法，本发明的嵌套式培养具有如下优点：羊膜培养面很平，可使角膜缘干细胞复层更为均匀，临床应用方便且羊膜不易破裂。
附图说明
图1、羊膜嵌套式培养模具基本结构示意图。
其中，1嵌入式培养板小室，2套筒，3羊膜片。
具体实施方式
本发明以眼库剩余角膜环为原材料，制备成了羊膜为基底膜的羊膜复合角膜缘干细胞膜片，具有角膜缘干细胞的特性，用于角膜缘干细胞缺乏或功能障碍为特征疾病的移植治疗中。
本发明的制备方法：
一、羊膜嵌套式培养模具的制备：
如图1，按照常规方法制备5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮无菌羊膜片3，将该羊膜片3上皮面朝上平铺于6孔培养板中；将上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培养小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培养模具。其中所用套筒2外径24mm，高16mm。
二：小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备：
用0.01mg/ml丝裂霉素C溶液处理贴壁的小鼠胚胎成纤维细胞，37℃孵育2小时；用10ml PBS磷酸盐缓冲液仔细清洗细胞后；加1ml 0.25％胰酶/0.02％EDTA，37℃孵育3-5分钟；加9ml含血清的DMEM培养液中止消化，吹打细胞；离心收集细胞，弃上清，用10ml含胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞；细胞计数，以2.5×104细胞/cm2的细胞密度接种细胞到6孔培养板中，37℃培养过夜使其贴壁，即制备成小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。
三、角膜缘干细胞悬液制备：
将眼库来源的角膜环放入盛有含100单位/ml青霉素和链霉素抗生素的无血清DMEM培养液中浸泡，冲洗，再放入2.4单位/ml中性蛋白酶(Dispase)中，37℃消化1小时；从Dispase中取出角膜环，浸入0.25％胰酶/0.02％EDTA中消化2分钟，用含100单位/ml青霉素和链霉素抗生素的PBS磷酸盐缓冲液洗2次，移入含DMEM培养液的培养皿中，上皮面朝上，实体显微镜下撕取角膜缘上皮组织，用培养基反复冲洗撕取的角膜缘上皮组织，收集在15ml离心管中；1500转/分钟离心5分钟，小心去除上清，加0.5ml 0.25％胰酶/0.02％EDTA37℃消化角膜缘上皮组织20-30分钟后，加含10％胎牛血清的培养基终止消化，离心5min，小心去除上清，使用含血清及牛转铁蛋白、霍乱毒素等添加因子的培养基混匀，计数细胞，即制得角膜缘干细胞悬液。
四、将上述步骤一制备的羊膜嵌套式培养模具放置入铺有上述步骤二制备的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6孔板中，再将上述步骤三制备的角膜缘干细胞细胞悬液接种于羊膜3上皮面，放置于37℃培养箱中培养，每套培养模具接种2.0-3.0×105个角膜缘干细胞，培养10日后长满角膜缘干细胞即可用，即制得羊膜复合角膜缘干细胞膜片。
实施例1
按照常规方法制备5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮无菌羊膜片3，将羊膜片3上皮面朝上平铺于6孔培养板中；将上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的外径24mm，高16mm的套筒2的端面上，用嵌入式培养小室1扣在套筒2的羊膜片3上，制成羊膜嵌套式培养模具。按照常规方法在6孔板板孔中制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，将羊膜嵌套式培养模具放置在饲养层上面。取眼库剩余新鲜角膜环两个，放入盛有内加无血清含100单位/ml青霉素和链霉素抗生素的DMEM培养液中浸泡，冲洗，再放入含2.4单位/ml中性蛋白酶的培养皿中37℃消化1小时；从中性蛋白酶中取出组织块，浸入0.25％胰酶/0.02％EDTA消化2分钟后用含100单位/ml青霉素和链霉素抗生素的PBS磷酸盐缓冲液洗2次，移入含DMEM培养液的培养皿中，上皮面朝上，实体显微镜下用镊子刮下角膜缘上皮组织，用培养基反复冲洗撕取的角膜缘组织，收集在15ml离心管中；1500转/分钟离心5分钟；小心去除上清，加0.5ml 0.25％胰酶/0.02％EDTA 37℃消化20-30分钟后，加含10％胎牛血清的培养基终止消化；离心5min，小心去除上清，使用含血清及牛转铁蛋白、霍乱毒素等添加因子的培养基混匀，计数3×105个细胞，接种于放置在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的羊膜嵌套式培养模具的羊膜片3上皮面上，10日后角膜缘干细胞长满可用，即制得羊膜复合角膜缘干细胞膜片。使用时，将套筒3从嵌入式培养小室1中取出，轻轻将羊膜复合角膜缘干细胞膜片取下即可用于临床角膜缘干细胞移植手术。
Claims (2)
1.一种羊膜复合角膜缘干细胞膜片的制备方法，其特征在于将羊膜嵌套式培养模具放置入铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6孔板的孔内，再用消化法制备角膜缘干细胞细胞悬液，并接种于上述羊膜嵌套式培养模具的羊膜片(3)上皮面，每套培养模具接种2.0-3.0×105个角膜缘干细胞，培养10日后长满角膜缘干细胞即得到羊膜复合角膜缘干细胞膜片。
2.如权利要求1所述的羊膜复合角膜缘干细胞膜片的制备方法，其特征在于上述羊膜嵌套式培养模具是按照常规方法制备5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮无菌羊膜片(3)，再将上述得到的羊膜片(3)的上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒(2)的端面上，用嵌入式培养小室(1)扣在套筒(2)的羊膜片(3)上，即制成羊膜嵌套式培养模具。
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