CN102154188B - 大肠杆菌DH5α的nfi基因敲除突变株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌DH5α菌株nfi基因敲除突变株及其制备方法和应用。所述突变株DH5αΔnfi，保藏号为CGMCC No.4236。其制备方法为：利用λred同源重组技术将E.coli DH5α菌株染色体上编码核酸内切酶V(EndoV)的nfi基因进行基因敲除，经PCR产物电泳和测序鉴定证实，确定所获得的菌株为基因敲除突变株，命名为DH5αΔnfi。用本发明所述突变株作为克隆宿主菌，对鸟枪法难测序铜绿假单胞菌噬菌体PaP1基因组的“不可克隆片段”再次进行鸟枪法测序拼接，结果能够成功组装出这一“不可克隆片段”，表明利用该突变株可以克服传统鸟枪法难以解决的DNA测序或/和克隆问题。

Description

大肠杆菌DH5α的nfi基因敲除突变株及其制备方法和应用

技术领域

本发明属细菌类，具体说是一株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α的nfi基因敲除突变株的制备方法，及其在鸟枪法难测序DNA的测序或/和克隆研究中的应用。

背景技术

大肠杆菌DH5α(简称E.coli DH5α)是一种重要的模式工程菌株，是分子克隆技术中常用的受体细胞大肠杆菌K-12的衍生菌株。在分子生物学、微生物学、细胞生物学及遗传学等研究领域中起着重要的作用。大肠杆菌DH5α也是传统鸟枪法测序中所最常使用的宿主菌，对多种物种的基因组测序作出了重要贡献。

但是传统鸟枪法测序策略并不适用于所有的基因组DNA，例如某些噬菌体和病毒的基因组DNA在使用鸟枪法测序时往往得不到完整的基因组序列。在基因组测序中心经常遇到这样的情况，无法完成一个噬菌体的基因组测序，不得不半途而止。所以，到目前为止(2010年12月8日)，完成全基因组测序并在Genbank上登录的噬菌体只有595个，而在Genbank上登录的细菌的已完成的全基因组序列已经达到1671个(其中1568个真细菌、103个古细菌)。但是，事实上噬菌体的种类数量要比细菌多得多，有人估计生物圈内约有10³¹噬菌体，平均每个细菌体内大约可分离10个左右的噬菌体(或前噬菌体)。因此，分离、鉴定新的噬菌体应该比分离鉴定新的细菌有更多的机会。所以，在GenBank上登录的噬菌体基因组似乎应该比细菌多得多才是合理的。可事实是截然相反的，其中一个重要原因就是：尽管噬菌体基因组很小，有时要完成其全基因测序组并不容易。

我们实验室在前期工作中成功分离、鉴定了3株铜绿假单胞菌噬菌体，分别命名为PaP1、PaP2和PaP3。其中PaP2和PaP3的全基因组鸟枪法测序与功能注释迅速完成，并在GenBank上登录(登录号分别为AY575774和AY078382)。然而，对于裂菌性噬菌体PaP1的基因组测序却严重受阻：分别在我国人类基因组南方中心和北方中心，均采用ABI3730测序仪，经多次测序，所获得的序列无法拼接成完整的基因组全序列。鉴于此，我们把PaP1基因组称为“鸟枪法难测序基因组”，把基因组内那些测不到的序列称为“鸟枪法不可克隆片段”。目前还没有一种很好的方法能弥补鸟枪法测序策略的这一不足。

发明内容

本发明的目的，是针对上述传统鸟枪法的不足之处提供一株大肠杆菌DH5α的nfi基因敲除突变株及其制备方法，以及在鸟枪法难测序DNA的测序或/和克隆研究中的应用。

对一株大肠杆菌K-12substr.DH10B(Genbank登录号：NC 010473)的衍生菌株DH5α进行基因工程技术改造，将位于其染色体上的核酸内切酶V(EndoV)编码基因nfi(序列表SEQ ID NO：1)进行基因敲除。第一步取代nfi基因的是氯霉素抗性基因(Chloromycetin resistance gene，序列表SEQ ID NO：2)，第二步是消除氯霉素抗性基因。通过PCR产物电泳和测序鉴定方法，确定所获得的菌株为nfi基因敲除突变株。

然后，使用大肠杆菌DH5α的nfi基因敲除突变株作为宿主菌，对鸟枪法难测序铜绿假单胞菌噬菌体PaP1基因组的“不可克隆片段”再次进行鸟枪法测序拼接，结果能够成功组装出这一“不可克隆片段”。此外，我们将选择更多的传统鸟枪法难测序的基因组，包括某些噬菌体基因组和其他一些难测序基因组，使用我们的方案来解决它们的测序问题。虽然以454测序仪为代表的第二代测序技术可以克服上述鸟枪法测序所带来的难题，但是第二代测序技术大多用于高通量大规模测序。而采用鸟枪法策略的“ABI3730测序仪”仍然是目前最常用的测序仪之一，当面临像某些噬菌体DNA这样一些难测序的DNA序列需要测序或/和克隆时，Endo V基因缺失的工程菌株将有非常特别的用途。

因此，制备大肠杆菌DH5αnfi基因敲除突变株的方法，主要包括以下步骤：

1.线性基因打靶片段的构建；

2.nfi基因敲除大肠杆菌DH5α突变株的筛选与鉴定；

3.实际测序应用。

目前本发明所述大肠杆菌DH5α菌株nfi基因敲除突变株的菌种保藏号是：CGMCC No.4236；保藏单位：中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；菌种的拉丁学名是：Escherichiacoli，中文名称是：大肠埃希氏菌；参据的微生物(株)：DH5αΔnfi，保藏日期为2010年10月21日。

本发明大肠杆菌DH5α菌株nfi基因敲除突变株具有以下特征：所述突变株属于肠杆菌科、埃希菌属，为革兰氏阴性菌；兼性厌氧，呈短杆状，有菌毛，无芽胞；在液体培养基中呈浑浊生长，营养要求不高，在普通琼脂平板上37摄氏度培养24小时后，形成直径2～3mm圆形突起灰白色S型菌落；能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸产气。

本发明的突出优点：

1.用本发明所述大肠杆菌DH5α的nfi基因敲除突变株，能克服传统鸟枪法难以解决的DNA测序或/和克隆的问题，可以成为实验室常用克隆菌株之一。

2.本发明所述大肠杆菌DH5α的nfi基因敲除突变株生物学性状稳定，可以替代原DH5α菌株成为大型测序公司和科研机构进行商业化测序或/和克隆的专用宿主菌。

申请人在研究中发现大肠杆菌对多种外源DNA具有限制性，其中最主要的机制是其编码的核酸内切酶V(Endo V)可以降解某些含有特殊结构或碱基的外源DNA，找到了解决鸟枪法难测序问题的钥匙。

采用鸟枪法策略的“ABI3730测序仪”仍然是目前最常用的测序仪之一，如当某些噬菌体DNA这样一些难测序的DNA序列需要测序或/和克隆时，本发明所述EndoV基因缺失的工程菌株将有非常特别的用途。用该菌能克服传统鸟枪法难以解决的DNA测序或/和克隆的问题，可以成为实验室常用菌株之一；同时该菌生物学性状稳定，可以替代原DH5α菌株成为大型测序公司和科研机构进行商业化测序或/和克隆的专用宿主菌。

附图说明

图1：采用λred重组系统敲除大肠杆菌DH5α的nfi基因过程示意图，图中，A：线性基因打靶片段的构建过程，H1为nfi基因的同源左臂，H2为nfi基因的同源右臂，P1、P2是根据质粒pKD3所设计的引物，线性基因打靶片段包含两个FRT位点和一个氯霉素抗性基因；B：nfi基因在大肠杆菌DH5α基因组中的相对位置，上下游同源臂各自分别仅包含nfi基因的起始密码子和终止密码子；C：氯霉素抗性基因取代nfi基因；D：氯霉素抗性基因的消除，第一个FRT位点序列及两个FRT位点之间的序列均被消除掉，第二个较长的FRT位点保留。

图2：大肠杆菌DH5αnfi基因敲除突变株的PCR鉴定结果，图中，1：原始DH5α菌株(821bp)；2：氯霉素抗性基因代替nfi基因后的DH5α菌株(1169bp)；3：氯霉素抗性基因被消除后的突变株(237bp)。

具体实施方式

材料：

1.普通Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品，中国大连)

2.HS DNA聚合酶(TaKaRa公司产品，中国大连)

3.EcoR I、BamH I、HindIII等限制性内切酶(TaKaRa公司产品，中国大连)

4.质粒pKD46、pKD3、pCP20(本室保存)

5.质粒DNA抽提试剂盒(华舜公司产品，中国上海)

6.DNA胶回收试剂盒(华舜公司产品，中国上海)

7.PCR产物纯化试剂盒(华舜公司产品，中国上海)

8.大肠杆菌DH5α(本室保存)

9.酵母提取物、胰蛋白胨(Oxoid公司产品，英国)

10.LB液体培养基：称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，溶于1000ml去离子水中，高压蒸气灭菌。

11.LB固体培养基：每1000ml液体LB培养基中加入15g琼脂粉，高压蒸气灭菌。

12.L-阿拉伯糖：(Sigma公司产品，美国)

13.氯霉素(上海生工产品，中国)

14.氨苄青霉素(北京鼎国产品，中国)

15.凝胶成像仪(BIO-RAD公司产品，美国)

16.Gene Pulser Xcell TM型电穿孔仪(BIO-RAD公司产品，美国)

实施例1：线性基因打靶片段的构建

(1)引物设计：根据质粒pKD3的DNA序列(序列表SEQ ID NO：3)设计PCR引物，碱基序列如下：

线性基因打靶引物(P7、P8)：

P7：5′CGTGGAGGCAGTGCATCGACTGTCTGAACAGTATCACCGCTAAG

GAGTGATTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3′(下划线为55bp的nfi基因上游同源臂，仅包括nfi基因的起始密码子)

P8：5′TTTGTAACATGTTGAGTTCTCAAATACGGAAATTATCCGCAGTTT

ACCTGAATTACATATGAATATCCTCCTTAG 3′(下划线为55bp的nfi基因下游同源臂，仅包括nfi基因的终止密码子)

引物P7和P8用于构建线性基因打靶片段。

(2)PCR扩增：以质粒pKD3的DNA为模板，用引物P7和P8进行PCR，扩增含有氯霉素抗性基因的线性基因打靶片段；

PCR的反应体系为：

模板(质粒pKD3的DNA)       1μl(400pg)

P7                        2μl

P8                        2μl

dNTP(10mM each)           8μl

5×Prime STAR PCR buffer  20μl

HS DNA聚合酶1μl

ddH₂O                        66μl

Total                        100μl

PCR的反应条件为：采用两步法，第一阶段98℃10秒；第二阶段68℃70秒(1min/kbp)，循环30次；所得PCR产物经0.8％琼脂糖电泳检测可见约1100bp大小的电泳条带，将PCR产物回收、纯化，稀释200倍后，取1ul作为模版，如前步骤再一次进行PCR扩增，这样可以尽量减少质粒pKD3所带来的假阳性干扰。将二次PCR后的产物回收、纯化，冻存备用。

实施例2：大肠杆菌DH5α菌株nfi基因敲除突变株的构建、筛选与鉴定

(1)电转化法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞

受体菌(DH5α)接种于LB培养基在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600＝0.5左右(约3小时)；将菌液迅速置于冰上冷却10分钟，4℃下3000g冷冻离心5分钟；弃上清，加入1500μl冰冷的10％甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，4℃下3000g冷冻离心5分钟；弃上清，加入750μl冰冷的10％甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，4℃下3000g冷冻离心5分钟；加入20μl冰冷10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

(2)将pKD46质粒通过电转化转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中

取20ul大肠杆菌DH5α电转化感受态细胞先置于冰上冷却；加入20ng质粒pKD46DNA，轻轻摇匀，冰上放置30～60s；调节电击仪，使电脉冲为25μF，电压1.8kV，电阻200Ω；将细菌与质粒DNA的混合物加至冷的电击杯内，放入电击仪，启动对细胞的电脉冲，听到响声停止，仪器显示时间约为4～5ms，检查电压是否为1.8kV；尽可能快地取出电转杯，室温下加入1ml 37度预热的LB培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中，37度轻柔振荡复壮1h；取200μl菌液铺制平板，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16小时左右。

(3)Red重组酶的诱导表达和打靶序列转化的感受态细胞的制备

将DH5α(含pKD46质粒)在含有氨苄青霉素(浓度为100μg/ml)的LB培养基(加入100mM，即15mg/ml的L-阿拉伯糖)中于30℃振荡培养过夜；次日按1∶100接种至100ml LB培养基(加入氨苄青霉素及100mM的L-阿拉伯糖，诱导pKD46上的Exo、Bet和Gam三个蛋白得到充分表达)，30℃培养至OD600为0.4～0.6，立刻冰上预冷15～20min；然后4000r/min、4℃离心6min，弃培养基收集菌体；用预冷的10％甘油离心洗涤3次，浓缩100倍成1ml的感受态细胞，分装每管约100μl用于电击转化。

(4)线性基因打靶序列的转化

取约400ng同源臂引物扩增的外源打靶片段与40μl感受态细胞混匀；转入已经预冷了的0.1cm的Bio-Rad电击杯中，然后进行电击，选择程序EC2，电击条件为电阻200Ω，频率25μF，电压1.8kV，电击时间为5ms；电击完成后迅速加入1ml 30度预热的加有L-阿拉伯糖(终浓度为80mM)的LB培养基，30℃复壮2h，涂布两个氯霉素平板(浓度为25μg/ml)，30℃培养过夜培养，挑选转化子；上述得到的具有氯霉素和氨苄抗性的单菌落可能是携带有pKD46的nfi基因被氯霉素取代的突变株，在同源臂上下游设计引物通过设计引物进行验证(使用引物P9和P10验证)。

(5)质粒pKD46的消除：质粒pKD46具有氨苄抗性，是温敏型质粒，在温度高时无法复制。

将上述验证为正确的突变株在含有氯霉素的LB液体培养基37℃过夜培养；次日转接到同样的培养基，在37℃培养2个小时，再提高温度至42℃培养4-6个小时；37℃划线分离单菌落，筛选氯霉素抗性和氨苄敏感的菌株。

(6)氯霉素抗性基因的去除

将以上获得氯霉素抗性的DH5α突变株制成电转感受态细胞，导入编码FLP位点专一性重组酶的质粒pCP20；在含有氨苄青霉素的平板上30℃培养，筛选阳性转化子，然后转接至无抗性的液体LB培养基中，在30度培养2个小时，提高温度至42℃培养4-6个小时，在无抗性的LB平板上37℃划线分离单菌落，对单菌落进行氨苄青霉素和氯霉素敏感性检测，获得对两种抗生素均敏感的克隆即为去除了pCP20质粒和氯霉素抗性基因的nfi基因缺失突变株。

(7)nfi基因敲出后的PCR鉴定和测序分析

1)引物设计：根据原大肠杆菌DH5α基因组nfi基因的上下游DNA序列(序列表SEQ ID NO：4和5)设计基因敲除鉴定引物，引物序列如下：

基因敲除鉴定PCR引物(P9、P10)：

P9：5′TGTGCCGCCAGAACATGC 3′

P10：5′GACGCAGATGAATTGGGT 3′

鉴定引物P9和P10均位于nfi基因上、下游同源臂的外侧。引物P9和P10用于基因敲出后的PCR鉴定。

2)PCR扩增：以氯霉素抗性基因取代nfi基因后的大肠杆菌DH5α(标记为A)基因组DNA和氯霉素抗性基因消除后的大肠杆菌DH5α(标记为B)基因组DNA为模板，用引物P9和P10进行PCR，看结果是否符合预期。

PCR的反应体系为：

A的对数期菌液(B的对数期菌液)           2μl

P9                                     2μl

P10                                    2μl

dNTP(10mM each)                        8μl

MgCl₂(25mM)                            7μl

10×PCR buffer                         10μl

rTaq DNA聚合酶                         1μl

ddH₂O                                  68μl

Total                                  100μl

PCR的反应条件为：第一阶段95℃预变性10分钟；第二阶段94℃变性60秒，55℃退火30秒，72℃延伸70秒，循环35次；第三阶段72℃延伸10分钟。所得PCR产物经0.8％琼脂糖电泳检测分别可见约1150bp(A)和250bp(B)大小的电泳条带，将PCR产物回收、纯化，分别送交华大基因进行测序，结果符合预期(序列表SEQ ID NO：6和7)

实施例3：实际测序应用分析

为检测该大肠杆菌DH5α的fi基因敲除突变株对测序的实际作用，我们随机选择一段铜绿假单胞菌噬菌体PaP1基因组上的“鸟枪法不可克隆片段”，使用DH5αΔnfi作为克隆宿主菌，再次采用鸟枪法策略对其进行克隆和建库，最终成功拼接出传统鸟枪法不可克隆的这一片段。

Claims (1)

1.一种大肠杆菌DH5α菌株nfi基因敲除突变株，其保藏号为CGMCC No. 4236。

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