CN102154169B

CN102154169B - 一株丙酸杆菌菌株及其发酵生产抗菌代谢物的方法

Info

Publication number: CN102154169B
Application number: CN2011100042195A
Authority: CN
Inventors: 齐斌; 王立梅; 郑丽雪; 缪芳芳; 刘靖
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Lianyungang Haiwa Food Co Ltd
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-01-11
Also published as: CN102154169A

Abstract

本发明涉及一株丙酸杆菌CS01（Propionibacteriumsp.CS01）菌株及其发酵生产抗菌代谢物的方法。该菌株的保藏登记号为CCTCCNO：M 2010007。该菌株发酵代谢物经硫酸铵沉淀所得粗提物具有抑制革兰氏阳性细菌、部分革兰氏阴性细菌和霉菌作用。该代谢物能够有效的抑制污染食品的有害微生物的生长，延长食品的货架期，对提高食品安全具有重要作用。该代谢物在碱性蛋白酶作用下失去抑菌作用，相对分子质量分布在350～3600Da范围内，为肽类抗菌物质。

Description

一株丙酸杆菌菌株及其发酵生产抗菌代谢物的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一株丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）菌株及其发酵生产抗菌代谢物的方法。

背景技术

丙酸杆菌属（Propionibacterium sp.）是一类革兰氏阳性菌，不形成芽孢，不运动，化能异氧、厌氧到耐氧，过氧化氢酶阳性，都含有血红素酶，通常呈多形态存在。丙酸杆菌包括2大类群：皮肤丙酸杆菌和乳品丙酸杆菌。前者来源于人的皮肤，是人皮肤的正常菌群；后者从土壤、蔬菜、乳品及青贮饲料中分离得到，由于其无致病性，因此广泛用于发酵工业，主要用来生产瑞士奶酪和发酵法生产丙酸及VB12。乳品丙酸杆菌包括费氏丙酸杆菌（P.freudenreichii）、特氏丙酸杆菌（P.thoenii）、丙酸丙酸杆菌（P. acidipropionici）和詹氏丙酸杆菌（P. jensenii）等。

丙酸杆菌的代谢过程中可合成一种特殊的肽或蛋白——丙酸杆菌素。丙酸杆菌素是由丙酸杆菌产生的异型抗菌物质，其抑菌特性已受到研究者的广泛关注。现有技术已经发现，有的丙酸杆菌细菌素具有广泛的抑菌作用，能抑制革兰氏阴性细菌、部分革兰氏阳性菌、霉菌和酵母，且其抑菌效果显著优于一些常用的如苯甲酸钠、山梨酸钾等合成食品防腐剂，可延长食品的货架期。由于它是一种通过生物合成的天然化合物，在消费者崇尚天然、营养食品的今天，世界各国的研究者把研究的重点转移到了通过微生物的新陈代谢合成防腐剂，即通过完整的微生物细胞的立体选择性生物催化来实现。因此筛选具有分泌更高抗菌代谢产物的生产菌株具有重要意义。

丙酸杆菌作为益生菌在国外很早就被人们研究。早在1986年，Grinstead就发现乳品丙酸杆菌抑制其他亲缘较近的细菌生长现象，随后开展了对这种抑制因子的研究并从P. thoenii P126（ATCC 4872）中分离出的Jenseniin，且发现酸乳中加JenseniinG可使酸奶保持适宜的酸度（pH4.2～4.3），这说明该细菌素对防止酸乳过度酸化起了重要作用；1991年，Lyon等从P.thoenii P127中分离得到Propionicin PLG-1，它是一种对蛋白水解酶敏感的蛋白质，具有热不稳定性，相对分子质量为9327.7 Da，在pH3～9下具有活性，它能有效地抑制亲缘关系相近的丙酸杆菌的其它种及一些霉菌和酵母；2000年，Faye等从P. thoenii 419菌株中分离的Propionicin T1，它对产酸丙酸杆菌、特氏丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌和乳杆菌都有抑制作用，由于其具有pH耐受性和热稳定性，所以可作为食品保护剂，可通过离子交换层析、反相和离子交换高效液相得到纯化；Miescher 等从P. jensenii DF1中分离的丙酸杆菌素Propionicin SM1，于30℃保存两周，4℃保存半年以上，仍具有强抗真菌性，且SM1是第一个提出由丙酸杆菌质粒编码可在遗传学方面应用的细菌素；2003年，Galit Ben-Shushart发现P.thoeniiP127的不同培养条件下得到两种不同的杆菌素；2004年，Merwe等从P. thoenii 447中分离出了Thoeniicin 447，其在100℃条件下处理15 min及pH1～10下培养30 min，仍具有活力，可以有效地抑制德氏乳杆菌及丙酸杆菌。

国内研究人员对丙酸杆菌生长及代谢物的抑菌活性也分别进行了研究，结果表明，不同的培养条件下丙酸杆菌代谢物对酵母的抑菌活性不同。

发明内容

本发明的技术目的是提供一株新的丙酸杆菌菌株，使得该菌株具有高产抗菌代谢物的能力；本发明的另一个技术目的是提供利用该丙酸杆菌菌株发酵生产抗菌代谢物的方法。

为了实现本发明的技术目的，本发明技术方案为：

一、本发明以Propionibacterium feudenreichii As1.231作为原始出发菌株，将其诱变并筛选得到一株突变菌株，其分类命名为丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01），其保藏登记号为CCTCC NO：M 2010007。

本发明所述的诱变并筛选得到丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）的具体方法为：

1、原始菌株的培养

将原始菌株Propionibacterium feudenreichii As1.231在固体培养基上进行活化，挑取较大的菌落接种于液体种子培养基中，静置培养56 h后，于4℃下8000 r/min离心收集菌体，用灭菌的0.01 M、pH6.8的TrisHCl 洗涤两次，重悬于灭菌的pH6.8、0.01M TrisHCl溶液中，得到菌液备用；

2、菌种诱变

对菌液采用功率为15 W的紫外线辐射处理0.5～5分钟后，光复活5 h，重复操作两次；取0.2 mL菌液均匀涂布至固体培养基上，然后于培养皿中心放入厚的圆滤纸片，加入1 mg/mL的亚硝基胍0.02 mL到滤纸片上，30℃暗光培养7 d后，挑取滤纸片周围的菌落接种至液体种子培养基中，30℃静置培养7～8 d后，4℃下8000 r/min离心10分钟，取突变菌株上清液备用；

3、高产菌株筛选

将发酵液在4℃、8000 r/min的条件下离心10分钟，在上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末，硫酸铵终浓度为70%，继续搅拌均匀，放置4℃冰箱中沉淀过夜，于4℃、12000 r/min的条件下离心10分钟，沉淀物加入少量水溶解后，用（MWCO:10000Da）透析袋对离心发酵上清液透析48 h，每隔6 h换水一次，透析后将透析液浓缩约10倍。

将双层抑菌实验培养基冷却至50℃，先将底层培养基倒入平皿，凝固后先将牛津杯放置于底层培养基上，上层培养基中分别加入100 mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液混匀，配制成带菌琼脂，然后迅速倒在已冷却的底层培养基上。轻轻转动培养皿使其均匀铺开，待冷却后依次准确吸取200 mL突变菌株透析浓缩液于牛津杯（几乎充满孔洞）中，盖上皿盖于4℃静置2小时，再移至37℃ 培养箱内培养18 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，挑选抑菌圈最大的菌株，即将其命名为丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）。

二、一种利用本发明所述的丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）发酵生产抗菌代谢物的方法。

其具体方法为：将丙酸杆菌CS01菌种接种至液体种子培养基中，以温度30℃静止培养4 d，然后将种子培养液按2%～10%接种量接入发酵培养基中，pH为6.0～8.0，发酵温度为30～37℃，发酵培养8～9 d。

其中，本发明所述发酵方法的最优的接种量为5%。

本发明所述发酵方法中的发酵培养基利用的碳源和氮源，只要能被该菌株利用并转化形成抗菌代谢物都可以。在优选实施方案中，本发明使用葡萄糖、麦芽糖、乳糖和乳酸钠作为碳源；牛肉浸膏、酵母抽提物、蛋白胨、玉米浆、尿素和硫酸铵为氮源；进一步优选实施方案中，本发明使用葡萄糖作为碳源；酵母抽提物为氮源；营养素包括磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80。

最优选的发酵培养基为：葡萄糖25 g/L，酵母膏10 g/L，KH₂PO₄ 1.25 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，吐温80 0.1 mL/L。

本发明采用响应面分析法进行本发明菌株发酵条件的优化，确定了发酵时间、初始pH、温度和接种量等生产工艺参数：pH为7.0，发酵温度为30℃，培养时间为9 d。

其中，所述的发酵方法还可以包括下述纯化得到抗菌代谢物的方法：将发酵液在4℃、8000 r/min的条件下离心10分钟，在上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末，硫酸铵终浓度为70%，继续搅拌均匀，放置4℃冰箱中沉淀过夜，于4℃、12000 r/min的条件下离心10分钟，沉淀物加入水溶解后，透析48 h，每隔4 h换水一次，最后将透析液浓缩10倍。

本发明所述丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）所发酵得到的抗菌代谢物的蛋白质性质确定方法为：

将发酵液加入硫酸铵粉末得到的硫酸铵沉淀物的浓缩液用蛋白酶（国药上海生化试剂公司）进行酶解，酶解液对照浓缩液进行抑菌活性检测，结果碱性蛋白酶解液不具有抑菌活性，木瓜蛋白酶酶解液抑菌活性略有下降，表明硫酸铵沉淀所得抑菌物能够被蛋白酶水解，因此具有蛋白质性质。采用高效凝胶过滤色谱测定了透析浓缩液的相对分子质量分布，主要分布在350Da、908 Da、3600Da范围内，因此为肽类抗菌物质。

本发明的有益效果在于：

本发明所述的丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）是乳品中常见的丙酸杆菌菌株，具有改善肠道肠道生态功能；该变异菌株所产生的肽类抗菌物质是一种新型天然微生物防腐剂，抑菌范围更广，抑菌活性强于自身所产生丙酸的抑菌效果；这种肽类防腐剂可以直接应用于食品和饲料中。本发明所得的抗菌代谢物是一种安全、抑菌范围广的肽类天然防腐剂，对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、大肠杆菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，特别是对霉菌具有显著的抑制作用。

附图说明

图1为丙酸杆菌CS01的菌体形态（1000×）。

图2为抗菌代谢物的抑菌实验结果图

其中图中1-突变株硫酸铵提取物抑菌图；2-原菌株硫酸铵提取物抑菌图；3-丙酸抑菌图；4-乳酸抑菌图；指示菌为金黄色葡萄球菌。

图3为丙酸杆菌CS01硫酸铵提取物对雅致放射毛霉的抑菌图。

图4为丙酸杆菌CS01硫酸铵提取物的相对分子质量分布图。

本发明的微生物丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）的保藏日期为2010年1月13日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏登记号为CCTCC NO：M 2010007。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明本发明所述的丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）的诱变选育方法：

其中，本实施例所用培养基为：

（1）固体培养基（g/L）：乳酸钠20，酵母膏10，KH₂PO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.2，琼脂20，pH7.0；

（2）液体种子培养基（g/L）：乳酸钠20，酵母膏10，KH₂PO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.2，pH7.0；

（3）双层抑菌实验培养基（g/L）：

上层培养基：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0，琼脂7.5；

底层培养基：琼脂20。

采用固体培养基将原始菌株Propionibacterium feudenreichii As1.231（购自中国科学院微生物保藏中心）进行活化，挑取较大的菌落接种于液体种子培养基中，静置培养56 h后，于4℃下8000 r/min离心收集菌体，用灭菌的0.01M、pH6.8的TrisHCl 洗涤两次，重悬于灭菌pH6.8、0.01M的TrisHCl溶液中，调整菌液的菌体浓度为10⁸cfu/mL；取5个灭菌培养皿，分别加入15 mL菌液，培养皿放置在磁力搅拌器载物台上，开启搅拌器，在预热20 min的紫外灯（功率为15 W，距离15 cm）下边照射边搅拌，并计时。分别于0.5 min、1.0 min、1.5 min、3.0 min、5.0 min取出光复活5小时，重复上述操作。分别取0.2 mL诱变菌液，进行适当稀释后，均匀涂布至固体培养基上，然后于皿中心放入厚的圆滤纸片，加入1 mg/mL亚硝基胍0.02 mL到滤纸片上，30℃，暗光培养7d，挑取滤纸片周围的菌落接种至液体（种子）培养基中，30℃静置培养7 d后，4℃下8000 r/min离心10分钟，取上清液进行突变菌株筛选；

采用双层抑菌实验培养基筛选高产菌株。培养基冷却至50℃，先将底层培养基倒入平皿，凝固后先将牛津杯放置于底层培养基上，上层培养基中分别加入100 mL的金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和大肠杆菌（ATCC25922）菌液混匀，配制成带菌琼脂，然后迅速倒在已冷却的底层培养基上。轻轻转动培养皿使其均匀铺开，待冷却后依次准确吸取200 mL 突变菌株上清液于牛津杯（几乎充满孔洞）中，盖上皿盖置于4℃冰箱预静置2 h，再移至37℃ 培养箱内培养18 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，挑选抑菌圈最大的菌株，即得到突变菌株，即将其命名为丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）。

实施例2

本实施例说明在利用丙酸杆菌CS01发酵发酵生产抗菌代谢物的方法中，对培养基的优化方法。

为了提高突变菌株丙酸杆菌CS01抗菌代谢物的产量，采用Placket-Burman设计方法（表1）优化培养条件，从而获得大规模生产条件。对葡萄糖、酵母膏、KH₂PO₄ 、MgSO₄ 、Tween80、发酵时间、温度、pH和接种量等因素进行优化，考察各因素的主效应和交互作用的一级作用。利用SAS软件进行分析，结果表明初始葡萄糖浓度、pH和吐温80是影响抗菌代谢物产量的关键因子。优化后的培养条件为：葡萄糖25 g/L，酵母膏10g/L，KH₂PO₄ 1.25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，吐温80 0.1mL/L， pH7.0，接种量5%，温度30℃。

实施例3

本实施例说明利用丙酸杆菌CS01（Propionibacterium sp. CS01）发酵生产抗菌代谢物的方法。

一、发酵培养：

将丙酸杆菌CS01菌种接种至液体种子培养基中，以温度30℃静止培养4 d，然后将种子培养液按2%～10%接种量接入发酵培养基中，初始pH为6.0～8.0，发酵过程pH控制在3.2～6.0，发酵温度为30～37℃，发酵培养8～9 d。

二、抗菌代谢物的纯化

将上述发酵液在4℃、8000 r/min的条件下离心10分钟，在上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末，硫酸铵终浓度为70%，继续搅拌均匀，放置4℃冰箱中沉淀过夜，于4℃、12000 r/min的条件下离心10分钟，沉淀物加入少量水溶解后，透析48 h，每隔4 h换水一次，最后将透析液浓缩10倍。

实施例4

本发明菌株所产抗菌代谢物的蛋白质性质确定。用Alcalase 2.4 L、Neutrase 0.8 L（诺维信生物技术有限公司）和木瓜蛋白酶（国药上海生化试剂公司）对实施例3所述透析浓缩液进行酶解，酶解液对照浓缩液进行抑菌活性检测，结果Alcalase 2.4 L、Neutrase 0.8 L酶解液抑菌活性消失，木瓜蛋白酶酶解液抑菌活性略有下降，表明硫酸铵沉淀所得抑菌物能够被蛋白酶水解，因此具有蛋白质性质；高效凝胶过滤色谱（见附图4）所测定的透析浓缩液的相对分子质量分布在350Da、908 Da、3600Da范围内，因此Propionibacterium sp. CS01所产抗菌代谢物为肽类抗菌物质。

实施例5

本发明所得的抗菌代谢物的抑菌活性检测。测试菌株为食品中重要的致病菌和腐败菌包括金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、蜡样芽孢杆菌（As1.1686）、谷氨酸棒杆菌（ATCC 13032）、福氏志贺氏菌（51571，中国药品生物制品检验所）、鼠伤寒沙门氏菌（50115，中国药品生物制品检验所）、单核细胞增生李斯特菌（ATCC 19114）、大肠杆菌（ATCC25922），植物乳杆菌（As1.557）、干酪乳杆菌（As1.62）、保加利亚乳杆菌（As1.148）、雅致放射毛霉（上海工业微生物所）、黑曲霉（As3.739）、酿酒酵母（As2.109）等为本实验室分离、鉴定并保藏。

细菌、酵母菌发酵液的制备：将测试菌株接入装有10 mL的牛肉膏蛋白胨培养液和PDA培养液中，37℃培养24 h，用0.85%生理盐水稀释至具有相同OD值的菌悬液。

霉菌孢子悬液制备：将测试菌株接入装有10 mL的马铃薯葡萄糖培养液中，37℃培养24 h，用0.85%生理盐水稀释至具有相同OD值的菌悬液。

抑菌活性检测：在无菌平皿中倒入10 mL已融化的琼脂，凝固后，放入无菌牛津杯，将已融化的15 mL检测培养基冷却到50℃左右，加入100 μL指示菌悬液，快速充分混匀，倒入平皿，待其凝固。向牛津杯中加入200 μL透析浓缩液，将检测平皿放置在37℃培养箱培养16 h后，测量抑菌圈直径，实验结果见表2。

表2及图2和图3充分说明丙酸杆菌抗菌代谢物对4株革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、谷氨酸棒杆菌、蜡样芽孢杆菌）、1株革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）、2株霉菌（黑曲霉和雅致放射毛霉）和酿酒酵母均具有显著的抑制作用。

Claims

1.一株丙酸杆菌菌株，其分类命名为丙酸杆菌（Propionibacterium sp.）CS01，其保藏登记号为CCTCC NO：M 2010007。

2.利用权利要求1所述的丙酸杆菌CS01发酵生产抗菌代谢物的方法，其特征在于：将丙酸杆菌CS01菌种接种至液体种子培养基中，以温度30℃静止培养4 d，然后将种子培养液按2%～10%接种量接入发酵培养基中，发酵条件为pH6.0～8.0，发酵温度30～37℃，发酵培养8～9 d。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的种子培养液的接种量为5%。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基为：葡萄糖25 g/L，酵母膏10 g/L，KH₂PO₄ 1.25 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，吐温80 0.1 mL/L。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的发酵条件为pH为7.0，发酵温度为30℃，培养时间为9 d。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于还包括纯化得到抗菌代谢物的方法：将发酵液在4℃、8000 r/min的条件下离心10分钟，在上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末，硫酸铵终浓度为70%，继续搅拌均匀，放置4℃冰箱中沉淀过夜，于4℃、12000 r/min的条件下离心10分钟，沉淀物加入水溶解后，透析48 h，每隔4 h换水一次，最后将透析液浓缩10倍。