CN102149819B

CN102149819B - 具有提高的活性的β-葡糖苷酶变体及其用途

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Publication number: CN102149819B
Application number: CN200980136701.5A
Authority: CN
Inventors: 尼古拉斯·洛普·费雷拉; 安东尼·马尔若; 于格·马蒂; 洛朗·富拉热
Original assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN; Proteus SA
Current assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN; Proteus SA
Priority date: 2008-09-12
Filing date: 2009-09-10
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2029-09-10
Also published as: HRP20170064T1; BRPI0918789A2; PL2342329T3; US20110171674A1; DK2342329T3; WO2010029259A8; EP2342329B1; BR122020004623B1; FR2935986A1; ES2612744T3; US9309538B2; CA2736602C; CN102149819A; FR2935986B1; MY160100A; SI2342329T1; WO2010029259A1; CA2736602A1; EP2342329A1

Abstract

本发明涉及与木质纤维素生物质分解有关的酶的表达和优化。更具体地，本发明涉及包含至少一个氨基酸修饰的β-葡糖苷酶变体，这些修饰的氨基酸根据里氏木霉菌β-葡糖苷酶的SEQ ID No.2的编号位于第225、238、240和241位，本发明还涉及具有改善的效能的这些变体在纤维素分解方法和生物燃料的制备方法中的用途。

Description

具有提高的活性的β-葡糖苷酶变体及其用途

技术领域

本发明涉及分解木质纤维素生物质的酶的表达和优化。更具体地，本发明涉及包含至少一个氨基酸修饰的β-葡糖苷酶变体，这些修饰的氨基酸根据里氏木霉菌β-葡糖苷酶的SEQ ID No.2的编号位于第225、238、240和241位。本发明还涉及这些具有改善的效能的变体在纤维素分解方法和生物燃料(例如：乙醇、丁醇、异丙醇)的制备方法中的用途。

背景技术

乙醇是一种清洁燃料，并且起始原料来源广泛，因此从纤维素制备乙醇的可能性已经得到了极大的关注。

该方法的天然纤维素起始原料用术语“生物质”表示。许多类型的生物质，包括木材、农业废弃物、草本作物和固体废物，被认为可以用作制备生物燃料的起始原料。这些原料主要由纤维素、半纤维素和木质纤维素组成。

纤维素是由葡萄糖分子组成的聚合物，其中葡萄糖分子通过β1-4键连接，该连接对于酸、酶或微生物的分解或解聚作用具有很强的抗性。一旦纤维素转变成葡萄糖，所述葡萄糖就易于通过酵母发酵形成生物燃料，例如乙醇。

这些将纤维素转变成糖的传统研究方法都是基于酸水解作用。这些方法可在浓酸或稀酸存在的情况下进行。但是，这些方法存在一些缺点，例如在使用浓酸时，酸的回收率差，在使用稀酸时，葡萄糖产率低，这些都使酸水解方法不能实现商业化。

为了克服酸水解方法的缺点，最近提出了使用纤维素型酶进行酶水解的纤维素转化方法。但是酶水解木质纤维素生物质(例如纤维素)的方法也有工业生产成本过高的缺点。因此，有必要使用分泌更加有效的纤维素酶的微生物株。

在此方面，许多微生物含有水解纤维素的酶，例如真菌：木霉菌(Trichoderma)、曲霉菌(Aspergillus)、腐质霉菌(Humicola)或镰孢菌(Fusarium)，以及细菌，例如：热单孢菌(Thermomonospora)、芽孢杆菌 (Bacillus)、纤维单胞菌(Cellulomonas)和链霉菌(Streptomyce)。这些微生物中的酶在用于将纤维素转变成葡萄糖时具有三种活性类型，因此可被分成三组：内切葡聚糖酶，随机地作用于纤维素纤维的内部；外切葡聚糖酶，作用于纤维素的末端，释放出纤维二糖；β-葡糖苷酶，将此纤维二糖水解成葡萄糖。这些β-葡糖苷酶是纤维素转化方法的限速步骤。这是因为该方法的主要困难在于纤维二糖转化成葡萄糖，因为在制备生物燃料时，在方法结束时任何未水解的纤维二糖代表收率的损失。

由于一些产生纤维素酶的微生物，包括木霉菌，产生的β-葡糖苷酶极少，因此在酶水解方法中纤维二糖的蓄积是一个主要的问题。具体而言，工业木霉菌株产生的所有蛋白质中，β-葡糖苷酶类型要少于1％。因此，较低的β-葡糖苷酶量导致将纤维二糖水解成葡萄糖的容量较低，从而导致了所述纤维二糖在系统中的蓄积。而且，高浓度的纤维二糖抑制了其它以纤维二糖作为最终反应产物的纤维素酶，特别是外切葡聚糖酶的活性。

已经提出了几种提高微生物中的β-葡糖苷酶活性，从而提高纤维二糖到葡萄糖的转化率的方法。

第一种方法包括加入外源性产生的β-葡糖苷酶到微生物分泌的混合物中，以促进水解。然而，该方法由于成本昂贵而没有商业可行性。

第二种方法，如WO 92/010581中描述，采用基因工程方法将新的β-葡糖苷酶基因的拷贝插入到微生物的基因组中，如此所述微生物产生大量的酶。

第三种方法，如WO 99/46362中描述，包括使用包含启动子、成熟的β-葡糖苷酶基因和木聚糖酶分泌信号序列的基因构建物对微生物进行遗传修饰。木聚糖酶分泌信号序列的存在使得可能显著提高微生物产生的β-葡糖苷酶的量。

然而，为了使木质纤维素生物质的水解有效和有经济价值，该酶混合物必须由一种并且是唯一的菌株产生，并且必须包括平衡比例的各种酶活性(尤其是，但不仅仅是，外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡糖苷酶)。举例来说，在里氏木霉菌的天然混合物中，一般存在70-80％的外切葡聚糖酶、15-20％的内切葡聚糖酶、数个百分比的半纤维素酶和约0.5％的β-葡糖苷酶。该混合物完全适合水解大多数的预处理的底物(例如，在酸性条件下蒸汽爆破(steam-explode)处理的麦秆)，并且收率可以接受。总之，如果通过富集酶的量以增加β-葡糖苷酶的活性，其必须不能损害其它酶的活性。

因此，不显著改变混合物中所有酶的比例而获得高β-葡糖苷酶活性的可能性，对于将木质纤维素生物质转变成生物燃料的方法具有重要意义。

发明内容

基于这种想法，申请人公司做出了巨大的努力，通过大量的研究发现了分离的或者纯化的多肽，该多肽具有比野生型BGL1蛋白质(SEQ ID No.2)的β-葡糖苷酶活性提高的β-葡糖苷酶活性，包含相比SEQ ID No.2的氨基酸序列有至少一个氨基酸被修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸选自氨基酸序列SEQ ID No.2的第225、238、240和241位，所述的氨基酸序列与SEQ ID No.2有至少75％的序列同一性，优选与SEQ ID No.2有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。

此外，根据本发明的多肽具有对葡萄糖产生的抑制作用较不敏感的优点，因此，在高葡萄糖浓度的存在下维持了较好的β-葡糖苷酶活性。

在一个实施方式中，上述多肽的特征在于：与在缺乏葡萄糖时测定的野生型BGL1蛋白(SEQ ID No.2)的β-葡糖苷酶活性相比，在葡萄糖存在时测定的β-葡糖苷酶活性得到了提高。

本领域技术人员可以，例如，使用底物pnp-吡喃葡萄糖苷通过酶活性测试确定本发明多肽的酶活性的增加(换言之，确定多肽的酶活性的提高)。β-葡糖苷酶作用后获得的对硝基苯酚的量可以例如通过在414nm下读取吸光度而确定。

本领域技术人员用来确定本发明的多肽相比于野生型BGL1蛋白质是否具有提高的酶活性的方案的实例如下：

-形成表达本发明多肽的大肠杆菌储存培养物，在37℃下过夜。

-在20℃下用1％的储存培养物接种LB培养基24h；

-在13000rpm下离心2分钟；

-将细胞沉淀物用100mM pH 5的琥珀酸缓冲液重悬浮(OD₆₀₀终值为100)；

-用含有15mM pnp-吡喃葡萄糖苷的100mM pH 5的琥珀酸缓冲液 100μl在50℃下孵育50μl细胞1.5小时，随后在冰上孵育5分钟；

-加入0.2M的Na₂CO₃溶液150μl；

-在13 000rpm下离心2分钟；

-在414nm下读取150μl上清液的吸光度。

此外，本领域技术人员可使用上述方案，用含有15mM的pnp-吡喃葡萄糖苷和60g/l葡萄糖的100mM pH 5的琥珀酸缓冲液100μl在50℃下孵育50μl细胞1.5小时，以确定本发明的多肽相比于野生型BGL1蛋白质是否对葡萄糖产生的抑制作用更不敏感。

本发明上下文中，“修饰的”氨基酸表示“取代的”、“插入的”或“缺失的”氨基酸。

根据一个实施方式，“修饰的”氨基酸为相比于SEQ ID No.2的氨基酸序列“取代的”氨基酸。

根据一个实施方式，“修饰的”氨基酸为相比于SEQ ID No.2氨基酸序列“插入的”氨基酸。

根据一个实施方式，“修饰的”氨基酸为相比于SEQ ID No.2氨基酸序列“缺失的”氨基酸。

根据一个实施方式，上述多肽的特征在于，与氨基酸序列SEQ ID No.2相比，氨基酸序列有至少2个氨基酸是经修饰的，所述经修饰的氨基酸选自序列SEQ ID No.2的第225、238、240和241位。

根据一个实施方式，上述多肽的特征在于，与氨基酸序列SEQ ID No.2相比，氨基酸序列的至少3个氨基酸是经修饰的，所述经修饰的氨基酸选自序列SEQ ID No.2的第225、238、240和241位。

根据一个实施例，上述多肽的特征在于：与氨基酸序列SEQ ID No.2相比，氨基酸序列的至少4个氨基酸是经修饰的，所述经修饰的氨基酸为氨基酸序列SEQ ID No.2的第225、238、240和241位的氨基酸。

根据一个实施方式，上述多肽的特征在于：与氨基酸序列SEQ ID No.2相比，氨基酸序列的至少1个、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸是经修饰的，所述修饰选自Q225H、V238I、T240G和T241S。

根据一个实施方式，上述多肽的特征在于，与序列SEQ ID No.2相比，1个氨基酸是经修饰的，所述修饰为Q225H。

根据一个实施方式，上述多肽的特征在于，与序列SEQ ID No.2相比，3个氨基酸是经修饰的，所述修饰为V238I、T240G和T241S。

根据一个实施方式，上述多肽的特征在于：与序列SEQ ID No.2相比，4个氨基酸是经修饰的，所述修饰为Q225H、V238I、T240G和T241S。

根据一个实施方式，上述多肽也包含至少1个另外的经修饰的氨基酸，所述氨基酸选自氨基酸序列SEQ ID No.2的位置97、99、100、118、119、121、123、126、127、128、130、132、134、135、140、147、151、153、163、168、173、174、177、179、182、187、193、206、207、212、217和621。

根据一个实施方式，上述多肽的特征在于：所述另外的经修饰的氨基酸包含一个或者多个修饰，所述修饰选自由V97I、Y99F、S100G、V118T、N119E、I121M、E123Q、Q126E、F127Y、I128L、E130A、V132A、A134G、S135C、S135V、I140L、P147A、T151I、Q153H、V163T、T168A、G173A、G173S、Q174E、N177E、I179L、V182A、V182N、T187C、L193V、N206D、P207V、L212M、T217L、L621F和L621T组成的组。

根据一个实施例方式，上述多肽选自：

-选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14的氨基酸序列；或

-氨基酸序列SEQ ID No.X，其具有：

i)相对于SEQ ID No.4、6、8、10、12或14的长度，至少70％同一性，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的相同残基百分比；

ii)相对于SEQ ID No.X的长度，至少70％同一性，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的相同残基百分比。

本发明的氨基酸序列的变体可通过多种常规方法制备，例如用本文中出现的全部或部分核苷酸或肽序列进行随机诱变、定点诱变、基因合成或改组。这些变体包括，例如，酶的氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入和/或取代。本发明涉及从本文中出现的序列获得的任何变体，只要所述氨基酸序列的变体与Bgl-1相比保持提高的β-葡糖苷酶功能(定义如上)。

在一个实施方案中，本发明涉及由于实用原因以下称为SEQ ID No.X的氨基酸序列，当其与SEQ ID No.4、6、8、10、12或14排比时，包括：

a)相对于SEQ ID No.4、6、8、10、12或14的长度，至少70％同一性，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的相同残基百分比；和

b)相对于SEQ ID No.X的长度，至少70％同一性，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的相同残基百分比。

根据本发明，相对于SEQ ID No.4、6、8、10、12或14的长度的相同残基百分比对应于在SEQ ID No.X和SEQ ID No.4、6、8、10、12或14之间相同的残基数目除以SEQ ID No.4、6、8、10、12或14中的残基数目。当使用GenomeQuest数据库时，所述相对于SEQ ID No.4、6、8、10、12或14的长度的相同残基百分比对应于查询(Query)同一性百分比(％id Query)，其中查询对应于序列SEQ ID No.4、6、8、10、12或14。

根据本发明，相对于SEQ ID No.X的长度的相同残基百分比对应于在SEQ ID No.X和SEQ ID No.4、6、8、10、12或14之间相同的残基数目除以SEQ ID No.X中的残基数目。当使用GenomeQuest数据库时，所述相对于SEQ ID No.X的长度的相同残基百分比对应于目标(Subject)同一性百分比(％id Subject)，其中目标对应于SEQ ID No.X。

本发明的主题也在于编码至少一种上述的多肽的纯化的或分离的核酸。下表1包括对Bgl-1基因和基因A和C、以及本发明的多肽的核酸和多肽序列的鉴定。

表1

克隆	核酸	多肽
			BGL1(野生型)	SEQ ID No.1	SEQ ID No.2
10H7	SEQ ID No.3	SEQ ID No.4
			59B8	SEQ ID No.5	SEQ ID No.6
164A2	SEQ ID No.7	SEQ ID No.8
			100B11	SEQ ID No.9	SEQ ID No.10
115E1	SEQ ID No.11	SEQ ID No.12
			149G7	SEQ ID No.13	SEQ ID No.14
基因A	SEQ ID No.15	SEQ ID No.16
			基因C	SEQ ID No.17	SEQ ID No.18

本发明也涉及包含上述核酸的载体。

根据本发明，术语“载体”是指任何可能插入外源性核酸片段的DNA序列，载体使得将外源性DNA引入宿主细胞成为可能。载体的实例为：质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和P1噬菌体衍生的人工染色体(PACs)、和病毒衍生载体。

根据本发明，上述核酸可以与启动子、终止子或任何其它在宿主细胞中表达所述核酸所需的序列功能性连接。

本发明的载体可携带选择性标记。术语“选择性标记”意指这样一种基因，该基因的表达给含有它的细胞提供了使得能够选择所述细胞的特性。例如，该选择性标记是抗生素抗性基因。

本发明的主题也在于分离的宿主细胞，该细胞包含至少一种上述多肽，或至少一种上述核酸，或至少一种上述载体。

本领域技术人员可通过熟知的常规方法将至少一种上述多肽、至少一种上述核酸或至少一种上述载体引入宿主细胞。例如，可提及的方法有氯化钙处理、电穿孔或使用基因枪。

根据一个实施方式，本领域技术人员可通过常规的方法将编码本发明具有提高β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸的几个拷贝引入宿主细胞。

根据一个实施方式，上述分离的宿主细胞选自：木霉菌属、曲霉菌属、脉孢菌属、腐质霉菌属、青霉菌属、镰孢菌属、嗜热单孢菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、梭菌属、纤维单胞菌属、链霉菌属、耶氏酵母属、毕赤酵母属和酵母属。

根据一个优选的实施方式，上述分离的宿主细胞选自：里氏木霉菌、绿色木霉菌、康氏木霉菌、黑曲霉菌、构巢曲霉菌、文氏曲霉菌、米曲霉菌、海枣曲霉菌、粗糙脉孢霉菌、灰色腐殖霉菌(Humicola grisea)、嗜松青霉菌、草酸青霉菌、大肠杆菌、丙酮丁醇梭杆菌、解糖梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、毕赤酵母、解脂耶氏酵母及其混合物。

根据一个优选的实施方式，上述分离的宿主细胞是里氏木霉菌。

本发明也涉及上述任意一种多肽在水解β-寡糖中的应用。

本发明还涉及上述任意一种多肽在将纤维二糖水解成葡萄糖中的应用。

本发明的主题还在于上述任意一种多肽在制备生物燃料中的应用。

根据本发明，术语“生物燃料”可以被定义为生物质转化产生的、并且可用于能量目的的任何产物。另外，并不意图限制本发明，可以提及的实例是生物气、可掺入(任选在随后的转化后)燃料中的产物、或本身就是燃料的产物，例如醇(根据所用的发酵生物类型为乙醇、丁醇和/或异丙醇)，溶剂(丙酮)，酸(丁酸)，脂质及其衍生物(短链或长链脂肪酸、脂肪酸酯)以及氢。

优选地，本发明的生物燃料是醇，例如乙醇、丁醇和/或异丙醇。更优选地，本发明的生物燃料是乙醇。

在另一实施方式中，生物燃料是生物气。

除了用于制备生物燃料外，本发明的具有提高的β-葡糖苷酶活性的多肽也可通过催化水解不同底物而释放各种香味而用于其它类型的应用。例如，通过催化水果内的一些葡萄糖苷这些多肽可用于释放水果香味，或者这些多肽可水解葡萄的单萜基β-葡糖苷酶，从而成为酒香的重要来源。因此，本发明的具有提高的β-葡糖苷酶活性的多肽可用于多个领域，特别是香料、食品工业、酿酒等。

能表达至少一种本发明的多肽的丝状真菌菌株，优选木霉菌，更优选里氏木霉菌，在碳基底物存在下在发酵罐中培养，碳基底物针对微生物生长而选择，例如乳糖或葡萄糖。在一个实施方式中，取决于碳基底物的性质，其可在灭菌前引入发酵罐，或先单独灭菌，然后在发酵罐灭菌后引入发酵罐，从而获得20-35g/1的初始浓度。

然后加入含有为了产生酶而选择的底物的水溶液。由真菌产生的、对木质纤维素生物质起作用的酶组合物最后通过过滤培养基进行回收。该组合物具体含有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和本发明的β-葡糖苷酶。在一个实施方式中，含有为了产生酶而选择的底物的水溶液制备为200-250g/l的浓度；该溶液应该含有诱导底物，例如乳糖。在初始碳基底物耗尽后注射该水溶液，从而提供35-45mg/g细胞的优化量(“分批补料(fed batch)”)。在该分批补料阶段，培养基中残留糖的浓度低于1g/1，并且由真菌分泌对木质纤维素生物质起作用的酶。所述酶可以通过过滤培养基而回收。

本发明的主题在于对木质纤维素生物质起作用的酶组合物，所述酶组合物由丝状真菌产生并且包含至少一种相比于野生型BGL1蛋白质具有提高的β-葡糖苷酶活性的多肽。

最后，本发明的主题在于从生物质制备生物燃料的方法，包括以下步骤：

-将待水解物悬浮于水相中；

-加入上述作用于木质纤维素生物质的酶组合物；

-测定释放的糖；

-分离糖溶液与未水解的固体部分；

-发酵糖溶液；

-从发酵液中分离生物燃料。

在一个实施方式中，将待水解物悬浮于水相中，其中干物质的比例为6％-40％，优选为20％-30％。将pH调节至4至5.5之间，优选在4.8至5.2之间，将温度调节至40至60℃之间，优选在45至50℃之间。加入对木质纤维素生物质起作用的酶组合物引发水解反应，常用的量为每克预处理的底物10至30mg分泌的蛋白质或更少。反应通常持续15至48小时。反应之后测量释放的糖，特别是葡萄糖。通过过滤或离心分离糖溶液与未水解的固体部分(基本由木素组成)，糖溶液用于发酵。

在一个实施方式中，可通过蒸馏从发酵液中分离生物燃料。

本发明的另一主题在于从生物质制备生物燃料的方法，其特征在于它包括以下步骤：

-将待水解的生物质悬浮于水相中；

-同时加入上述对木质纤维素生物质起作用的酶组合物和发酵生物体；

-从发酵液中分离生物燃料。

根据该实施方式，生物质中的纤维素被转变成葡萄糖，同时在同一反应器中，发酵生物体(例如酵母)根据本领域技术人员已知的SSF(同时糖化和发酵)过程将葡萄糖转变成最终产物。取决于发酵生物体的代谢和水解能力，为使发酵平稳地进行，可能需要加入大量的外源性纤维素分解混合物，加入量可多可少。

在另一实施方案中，同一种发酵生物体可将生物质转化为葡萄糖，然后再将葡萄糖转化为最终产物。

因此，使用本发明的具有更好的β-葡糖苷酶活性的多肽具有可获得更高的葡萄糖产率的优点。因此本发明可以使用比先前少的酶，这在经济上具有优势，例如降低了生物燃料的生产成本。

下述非限制性的描述通过实施例和图1的方式说明了本发明优选的实施方式，在阅读这些描述后可理解本发明的其它方面、主题、优点和特征。

图1表示在葡萄糖存在时，与亲本BGL1基因相比，149G7、100B11和115E1变体的β-葡糖苷酶活性的提高。

图2表示了转化克隆(100B11、164A2和115E1)和起始菌株CL847在烧瓶中产生的酶混合物的β-葡糖苷酶比活性。CL847-bgl1+株通过比较的方式表示。

图3表示由对照株(CL847)和变体(100B11)产生的酶的水解结果(葡萄糖释放)。

具体实施方式

实施例1：第一轮改组：

使用与亲本BGL1基因具有70％同一性的球毛壳霉(Chaetomium globosum)的推定葡糖苷酶基因(基因A)(SEQ ID No.15和SEQ ID No.16(蛋白质序列))，根据EP 1104457B1中描述的专利方法，对里氏木霉菌β-葡糖苷酶基因序列(亲本BGL1基因，SEQ ID No.1)进行第一轮改组。

1-高通量筛选

高通量筛选试验使得可以筛选出这两个序列改组产生的最佳克隆，即，当与里氏木霉菌的亲本BGL1基因的β-葡糖苷酶活性比较时，改善倍数大于2的克隆。

第一轮改组库的筛选试验根据以下步骤进行：

-在琼脂上分离表达本发明重组酶的改组变体的大肠杆菌的各种克隆，并将所述克隆在37℃下在LB培养基中预培养过夜；

-将3％的预培养物接种LB培养基，然后在37℃下孵育4h；

-加入100μM的异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)，然后在20℃孵育过夜，以诱导变体的表达；

-在13000rpm下离心2分钟；

-将细胞沉淀物再悬浮于100μL的0.1M琥珀酸盐缓冲液中，该缓冲液中含有2.2mM的对硝基苯基-D-葡萄糖苷-6-磷酸(pNPGlc)。

-在室温下孵育3h。

-碱化后在414nm下读取光密度值。

在这些筛选条件下，在一些克隆中发现与BGL1对照酶相比β-葡糖苷酶活性提高，这些克隆特别包括克隆10H7(SEQ ID Nos.3和4)、59B8(SEQ ID Nos.5和6)和164A2(SEQ ID Nos.7和8)。

2-β-葡糖苷酶活性提高的确定

2-1/对pNPGlc底物

为确定在第一轮改组中选择的变体的相对Kcat，进行如下步骤：

-形成表达本发明重组酶的大肠杆菌的存储培养物，在37℃下过夜；

-在20℃下将1％的存储培养物接种到LB培养基中，进行24h，使用IPTG(250μM)诱导；

-在13000rpm下离心2分钟；

-将细胞沉淀物再悬浮到pH为5、100mM的琥珀酸盐缓冲液中(OD₆₀₀终值为100)；

-将50μl的细胞与100mM的pH5琥珀酸盐缓冲液100μl在50℃孵育1.5h，再置于冰上5分钟，所述琥珀酸盐缓冲液含有15mM的pnp-吡喃葡萄糖苷；

-加入150μl 0.2M的Na₂CO₃；

-在13000rpm下离心2分钟；

-读取150μl上清液在414nm下的光密度值。

表2给出了克隆10H7、59B8和164A2在这些实验条件下获得的Kcat值和改善倍数。

表2：β-葡糖苷酶活性的提高(诱导培养物的结果)

结果显示，与对照酶(BGL1)相比，3种克隆10H7、59B8和164A2的酶活性大幅提高。

2-2/ 对纤维二糖

然后确定了克隆10H7、59B8和164A2对第二种底物：纤维二糖的活性的提高。

此测试对表达本发明重组酶的大肠杆菌培养物进行。测试步骤如下所述：

-将IPTG诱导的1％的存储培养物接种到LB培养基中，然后在37℃下孵育过夜。

-在37℃下培养所述细胞，直至在600nm下的光密度达到0.4。

-在20℃下以250μM的IPTG 250诱导所述细胞20小时。

-以100mM的琥珀酸盐缓冲液(pH5)洗涤细胞沉淀物3次，以除去培养基中的葡萄糖。

-在50℃下于微孔板中以190μl的263.2mM纤维二糖(最终浓度为250mM)孵育10μl的所述细胞12小时。

显色(Developing)：

-在室温下混合和孵育以下物质1小时：

-10μl上述反应物；

-90μl 100mM琥珀酸盐缓冲液，pH5；

-5μl葡萄糖氧化酶，44U/ml；

-在室温下混合和孵育以下物质30分钟：

-10μl葡萄糖氧化酶反应物；

-2μl辣根过氧化物酶(10U/ml)；

-5μl的100mM ABTS；

-83μl的50mM磷酸盐缓冲液pH为7.4。

在420nm下读取光密度值。

表3：β-葡糖苷酶活性的提高(诱导培养物的结果)

相似地，结果显示在纤维二糖用作底物时，与起始酶(BGL1)相比，克隆10H7、59B8和164A2的酶活性大幅提高。

实施例2：第二轮改组

将在第一轮改组中获得的改善的基因序列随后进行第二轮改组(仍然根据EP1104457B1所述的专利方法)。为了提高遗传多样性，加入了至少一种具有70％同一性的、编码β-葡糖苷酶的基因。在该具体的实施例中，使用了粗糙链孢霉菌(Neurospora crassa)的推定的葡糖苷酶基因(基因C)(SEQ ID No.17和SEQ ID No.18(蛋白质序列))。

1-高通量筛选

对在第二轮改组获得的克隆进行如上所述的高通量筛选(不包括IPTG诱导步骤，因为在第一轮改组中获得的改善使得仅基于启动子渗漏就可检测β-葡糖苷酶活性)，以筛选最佳的克隆，即当与克隆164A2相比时，β-葡糖苷酶活性的改善倍数大于2的克隆。

在这些筛选条件下，在一些克隆中发现与对照酶(164A2)相比β-葡糖苷酶活性具有提高，这些克隆特别包括克隆100B11(SEQ ID Nos.9和10)、115E1(SEQ ID Nos.11和12)。

2-β-葡糖苷酶活性提高的确定

2-1/对pNPGlc

为确定相对kcat，使用前述活性测试测量克隆100B11和115E1的活性。

表4给出了克隆100B11和115E1在这些实验条件下获得的Kcat值以及改善倍数。

表4：β-葡糖苷酶活性的提高(诱导培养物的结果)

结果显示，与对照酶(164A2)和(BGL1)(×60)相比，克隆100B11和115E1的酶活性大幅提高。

2-2/对纤维二糖

然后确定了克隆100B11和115E1对第二种底物：纤维二糖的活性的提高。

为确定相对kcat，将纤维二糖用作底物使用前述活性测试测量克隆100B11和115E1的活性。

表5：β-葡糖苷酶活性的提高(诱导培养物的结果)

相似地，结果显示在纤维二糖用作底物时，与对照酶(164A2)相比，克隆100B11和115E1的酶活性有极大的提高。

实施例3：第三轮改组

将在第二轮改组中获得的改善的基因序列随后进行第三轮改组(仍然根据EP1104457B1所述的专利方法)。为了提高遗传多样性，加入了至少一种具有70％同一性的、编码β-葡糖苷酶的基因。在该具体的实施例中，使用了粗糙链孢霉(Neurospora crassa)推定的葡糖苷酶基因(基因C)(SEQ ID No.17和SEQ ID No.18)和球毛壳霉(Chaetomium globosum)推定的葡糖苷酶基因(基因A)(SEQ ID No.15和SEQ ID No.16)。

1-高通量筛选

对在第三轮改组获得的克隆进行如上所述的高通量筛选(不包括IPTG诱导步骤，因为在第一轮改组中获得的改善使得仅基于启动子渗漏就可检测β-葡糖苷酶活性)，以筛选最佳的克隆，即当与克隆115E1比较时，β-葡糖苷酶活性的改善倍数大于2的克隆。

在这些筛选条件下，发现特别是克隆149G7(SEQ ID Nos.13和14)，其β-葡糖苷酶活性比对照酶(115E1)有所提高。

2-β-葡糖苷酶活性提高的确定

2-1/对pNPGlc

为确定相对kcat，使用前述活性测试测量克隆149G7的活性。

结果显示与克隆115E1相比，克隆149G7的酶活性提高了2.4倍，与BGL1相比提高了多于100倍。

实施例4：在葡萄糖存在时的β-葡糖苷酶活性提高

为比较克隆149G7、100B11和115E1相对于BGL1的活性，通过上述活性测试方法测量这些克隆对pNPGlc的活性，其中反应基质中存在着60g/l的葡萄糖(反应产物)。

图1显示，在存在60g/l的葡萄糖时，克隆149G7保留了其61％的活性，而BGL1对照亲本蛋白仅保留了其27％的活性。

尽管本发明通过其优选实施方式的实施例进行了说明，但是应该理解的是本发明在不离开其精神和本质的情况下，可作出修改，如在权利要求中所定义的。

实施例5：具有提高的β-葡糖苷酶活性的里氏木霉菌的转化

将对应于变体115E1、100B11和164A2的每个基因克隆入可以在里氏木霉菌中表达并且可以用潮霉素筛选的载体中。将基因置于强启动子cbh1的控制下，该启动子可与里氏木霉菌的其它纤维素酶同时诱导。

里氏木霉菌的转化根据本领域技术人员已知的常规方法进行(通过钙休克的原生质转化和使用50μg/ml潮霉素选择)。转化体通过孢子形成而纯化，然后在选择性培养基中传代培养两次以除去不稳定的克隆。然后根据Yu等人(Fungal Genet.Biol.(2004)；41(11)：973-981)所述的方法，通过PCR确定感兴趣的DNA的整合。

然后在烧瓶中评估PCR阳性克隆的纤维素酶产生。将各克隆的一些孢子用于接种50ml的PD肉汤培养基(Difco)。将烧瓶在30℃下孵育72小时，同时以150rpm的速度振摇。72h后，用该预培养物以30％接种产生纤维素酶的培养基，该培养基具有如下组成：乳糖(20g/l)、Solka絮凝纤维素(20g/l)、蛋白胨(5g/l)、KH₂PO₄(15g/l)、(NH₄)₂SO₄(5g/l)、CaCl₂(0.6g/l)、MgSO₄(0.6g/l)、FeSO₄(0.005g/l)、MnSO₄(0.0014g/l)、ZnSO₄(0.0014g/l)、CoCl₂(0.0037g/l)、马来酸(11.6g/l)、Tris(12.1g/l)和NaOH(2.08g/l)。

将培养物在30℃下孵育，同时以150rpm的速度振摇。5天后，离心培养物，通过Bradford方法测量上清液中蛋白质的浓度。通过在如下条件下水解发色底物对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)测量上清液的β-葡糖苷酶活性。

-50mM柠檬酸盐缓冲液，pH4.8

-5mM的pNPG

-10μl的样品

-在50℃下孵育30分钟。

反应通过加入100μl 2％碳酸钠终止。通过测量在410nm处的吸光度并与对硝基苯酚的范围进行比较，从而测量由pNPG水解释放的对硝基苯酚的量。对于25至400μM的对硝基苯酚，反应是线性的。

图2显示了各变体获得的结果(每种变体一个实例)，并与未转化的菌株(CL847)和以里氏木霉菌天然β-葡糖苷酶转化的菌株(CL847-bgl1+)的测量活性进行比较。

表6给出了相对于起始菌株CL847(Durand等人，Enzyme Microb.Technol.，1988；10：341-346)和过度表达里氏木霉菌天然β-葡糖苷酶bgl1的CL847-bgl1+的改善倍数。

表6：相对于对照的β-葡糖苷酶比活性增长倍数

(数据来自图2)

克隆	增长倍数
		CL847	-
CL847-bgl1+	2.9
		100B11	26.2
164A2	22.3
		115E1	12.1

实施例6：由表达改善的β-葡糖苷酶的里氏木霉菌转化体在发酵罐中产生的纤维素酶组合物的酶活性

实施例5的变体100B11用于在2L的发酵罐中生产纤维素酶。

在机械搅拌的发酵罐中进行纤维素酶生产。培养基具有如下组成：KOH(1.66g/l)、85％H₃PO₄(2ml/l)、(NH₄)₂SO₄(2.8g/l)、MgSO₄.7H₂O(0.6g/l)、CaCl₂(0.6g/l)、MnSO₄(3.2mg/l)、ZnSO₄.7H₂O(2.8mg/l)、CoCl₂(4.0mg/l)、FeSO₄.7H₂O(10mg/l)、玉米浆(1.2g/l)、消泡剂(0.5ml/l)。

发酵罐含有1.75L矿物培养基和70g乳糖，将其在120℃下灭菌，然后接种0.25L里氏木霉菌株CL847的液体预培养物。预培养物的培养基补充加入了5g/l的邻苯二甲酸钾以控制pH值变化，该培养基与发酵罐的培养基相同。真菌在预培养物中依靠浓度为30g/l的乳糖生长。接种物的生长持续了2至3天，在27至30℃下在振动台上进行。

在生长46小时后，发酵罐的初始底物耗尽，以4.5ml/h的流速持续注入250g/l的乳糖溶液，注入时间最多达142小时。

在生物质生长阶段将温度控制在27℃，然后控制在25℃直至培养结束。通过加入氨水溶液，在生长阶段将pH控制在5，然后将pH控制在4直至培养结束，氨水溶液提供了分泌蛋白合成必需的氮。通过通气和振摇将溶解氧含量保持在高于15-20％。

在通过过滤或离心分离菌丝体后，通过Folin方法(Lowry，Biol.Chem.1951；193：265-275)测定细胞外蛋白质，从而监测酶的生成。根据上述方法(见实施例5)使用底物pNPG测量β-葡糖苷酶活性。根据Mandels等人推荐的方法(Biotechnology for Biofuels，2009；2：21)测量FPase滤纸活性。结果在表7中给出。

表7：

实施例7：由表达改善的β-葡糖苷酶的里氏木霉菌转化体产生的纤维素分解混合物对预处理木质纤维素底物的水解效果

对照菌株CL847产生的纤维素分解混合物和实施例6所得的表达改善的β-葡糖苷酶的转化体100B11产生的纤维素分解混合物用于在酸性条件下水解通过蒸汽爆炸处理的麦秆。水解在夹套Bio-Laffite生物反应器中进行，并以两个“船锚”式搅拌器搅拌，实验条件如下：

-稀释至10％干物质的木质纤维素底物

-反应体积2L

-1M乙酸盐缓冲液，pH 4.8(pH值每天测试)

-温度为48℃。

将所有的物质在300rpm下浸渍12小时，之后加入20mg/g干物质的酶，切换至500rpm。加入酶后，在第0、5、24、48和72小时时取样。将样品置于沸水浴中10分钟使酶失活。然后离心样品，过滤上清液，之后由HPLC测定葡萄糖。

在图3中给出了结果。早在第24小时，含有由转化体100B11产生的改善的β-葡糖苷酶的酶混合物释放的葡萄糖是由对照菌株(CL847)产生的酶混合物的两倍。从菌株10B11所得的混合物早在24小时时就到达了最大收率。而对照酶混合物(CL847)在第72小时仍未到达该收率。

因此，在相同的酶剂量下，由转化体100B11产生的酶混合物的效率远高于对照酶混合物(CL847)的效率。该性质导致了更高的收率和生产率，使得底物水解更加完全。或者，可能减少酶的使用剂量以获得同等的水解结果。由于纤维素分解酶的成本占了木质纤维素生物乙醇成本价格的大部分，酶用量的任何明显的降低都可以认为是对该方法的显著的改进。