CN102144568B - 一种改良水稻籽粒氨基酸品质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良水稻籽粒氨基酸品质的方法，步骤是：A、把从蜘蛛中分离的一段拖丝蛋白基因的cDNA片段与谷蛋白启动子融合，构建重组载体；B、利用根癌农杆菌介导的转基因方法将重组载体导入水稻中，获得转化植株；C、利用聚合酶链式反应（PCR）对T0代转基因植株进行阳性检测，收获阳性单株自交种子；D、将选留的T0代阳性单株的种子种成家系（T1），对T1代单株进行阳性检测；E、继续种植T1代阳性单株种子成T2代家系，从中选择氨基酸品质提高的纯合单株，自交留种；F、对选留的纯合单株进一步进行表型选择，培育新材料。方法易行，操作简便，在水稻籽粒中表达来自蜘蛛拖丝蛋白基因的cDNA片段提高水稻籽粒氨基酸含量，提高了籽粒营养品质；提高水稻籽粒品质，效率高；应用于作物品质的改良。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。更具体涉及一种改良水稻籽粒氨基酸品质的方法，具体包含了应用转基因方法将一个蜘蛛拖丝蛋白基因的cDNA片段通过农杆菌转化水稻，使该片段在水稻籽粒中表达，以提高水稻籽粒氨基酸含量，创造水稻品质改良新材料的方法。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，然而其籽粒中蛋白质和氨基酸特别是赖氨酸和色氨酸含量非常低，由于蛋白质和必需氨基酸含量是反应其营养价值的关键因子，因此提高水稻籽粒氨基酸含量特别是必需氨基酸含量成为水稻品质改良的重要任务。
目前，在水稻中未发现高赖氨酸和高色氨酸的突变体，因此，提高水稻籽粒的氨基酸含量主要集中在用基因工程的方法研究上。Lee等(2001)将玉米赖氨酸反应不敏感的合酶基因dhps(二氢吡啶二羧酸合成酶)的全长cDNA连上水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1的启动子构建成嵌合基因，转化水稻，发现转基因材料的未成熟种子中游离赖氨酸含量要高于野生型植株，但其成熟种子中的游离氨基酸含量和野生型差异不明显。Wu等(2003)利用微弹法，将编码tRNA-lys(赖氨酸摆动密码子)的基因转入水稻，发现转基因材料种子的赖氨酸含量提高了6％，但其远不足以满足人们对其含量的需求。也有研究表明在水稻中过量表达色氨酸合酶基因OASA1D，能够使水稻种子中的色氨酸显著增加，但转基因材料的产量、育性以及种子萌发等表现均出现缺陷，而很难加以应用(Wakasa et al，2006)。
蜘蛛(Araneus ventricosue)拖丝蛋白(Dragline)纤维以其特殊的溶解特性和力学特性引人注目。利用人工改造的蜘蛛拖丝蛋白基因可以在动物细胞、细菌以及植物如土豆和烟草中产生蜘蛛拖丝蛋白(Pan et al，2006)；有人尝试应用蜘蛛丝蛋白基因转化海岛棉来提高棉花纤维品质，但不清楚其效果如何(Huang et el，2004)。目前，利用蜘蛛拖丝蛋白基因来改良作物营养品质的研究尚未见报道。
本发明的目的是将蜘蛛拖丝蛋白(Dragline)基因的一段cDNA片段，用专一性谷蛋白GluB-1启动子驱动，转化水稻，使这段cDNA片段在水稻籽粒中特异表达，以提高水稻籽粒氨基酸含量，改良水稻籽粒品质，创造水稻品质改良新材料。
本发明在国内外未见报道，所在课题组也未公开发表涉及本发明内容的文章，本发明在国内外公众未知。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种改良水稻籽粒氨基酸品质的方法，方法易行，操作简便，包括通过转基因方法，把蜘蛛拖丝蛋白(Dragline)基因的一段cDNA片段和水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子的融合基因转化水稻，获得转基因植株；结合聚合酶链式反应(PCR)和分子杂交方法，生化分析方法以及农艺性状的调查，在转基因植株后代中选育氨基酸显著提高、单株产量不变或有提高的转基因株系，创造水稻品质改良新材料。
一种改良水稻籽粒氨基酸品质的方法，其步骤是：
1、从蜘蛛中分离的一段拖丝蛋白(Dragline)基因的cDNA片段，该cDNA片段由905个碱基组成，编码264个氨基酸，富含甘氨酸(31％)和丙氨酸(25.8％)(图1)。将它与水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子酶切连接连到表达载体pCAMBIA1300上(Cambia公司产品)，构建重组载体；
2、利用根癌农杆菌(Takara公司产品)介导的转基因方法将重组载体导入水稻品种Dongjing中，获得转基因植株；
3、利用聚合酶链式反应(PCR)对T0代转基因植株进行阳性检测，通过Northern杂交检测阳性转基因植株转入片段的表达，通过Southern杂交鉴定阳性转基因植株的整合拷贝数，选择含单拷贝的转入片段、且正常结实的转基因植株，收获单株自交种子；
4、将步骤3选留的转基因植株的种子种成家系(T1代)，继续利用PCR对T1代单株进行阳性检测，利用Northern杂交方法对阳性单株检测转入片段的表达，结合田间表现选择多个表现优良的转基因单株，自交留种；
5、继续种植步骤4中选留的目标单株成T2代家系，利用PCR对T2代单株进行阳性检测，对阳性单株进行农艺性状考察和水稻种子氨基酸分析，从中选择表型稳定，氨基酸品质和农艺性状有较大改善的纯合单株，自交留种；
6、对选留的纯合单株进行表型选择，培育新材料。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
A、在水稻籽粒中表达来自蜘蛛拖丝蛋白(Dragline)基因的一段cDNA片段可以提高水稻籽粒氨基酸含量，特别是必需氨基酸含量，从而提高了水稻籽粒营养品质，同时，单株产量也有一定提高；
B、本方法采用转基因方法提高水稻籽粒品质，改良周期短，效率高；
C、本方法可以直接应用于其他作物品质的改良实践；
D、将蜘蛛拖丝蛋白(Dragline)基因的一段cDNA片段，用籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子驱动，转化水稻，使该段cDNA在水稻籽粒中特异表达，方法易行，操作简便，提高了水稻籽粒氨基酸含量，增加了单株产量，为水稻品质改良创造了新材料。本发明所产生的材料能直接应用于制备必需氨基酸等医药制品和饲料产品，对促进人体健康和预防疾病以及水稻的可持续生产等具有极其重要的意义。
附图说明
图1为一种转化所用cDNA片段的核苷酸序列以及氨基酸序列。
该cDNA片段有905个碱基组成，编码264个氨基酸。
图2为一种重组载体构建示意图。
先将谷蛋白GluB-1启动子(Glb)连接到表达载体pCAMBIA1300上形成中间载体，再将蜘蛛拖丝蛋白基因的cDNA片段连接到中间载体形成重组载体。
图3为一种T0代转基因植株阳性检测示意图。
第2泳道为分子量标记，第3泳道为阳性对照(重组载体扩增结果)，第4-5泳道为阴性对照(野生型Dongjing扩增结果)，第6-19泳道为部分T0代转基因植株扩增结果；
图4为一种Northern杂交检测T0带转基因植株导入基因片段的表达量示意图。
上排为rRNA，下排为各单株籽粒RNA与探针杂交结果。
图5A为一种Southern杂交检测基因整合的拷贝数示意图。
有3个为单拷贝转化植株。
图5B为一种Southern杂交检测基因整合的拷贝数示意图。
有3个单拷贝植株。
图6A为一种Northern杂交检测单拷贝单株的T1代家系的目标基因表达量示意图。
有9个转化植株的转入片段得到表达。
图6B为一种Northern杂交检测单拷贝单株的T1代家系的目标基因表达量示意图。
有6个转化植株的转入片段得到表达。
图6C为一种Northern杂交检测单拷贝单株的T1代家系的目标基因表达量示意图。
有6个转化植株的转入片段得到表达。
具体实施方式
本发明通过以下详细的实施例给出。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：重组载体的构建和转化农杆菌的建立：
(1)、根据图2的技术路线，将带谷蛋白GluB-1启动子(Glb)的质粒pUC18-Glb(根据EMBL序列X5433314进行PCR扩增克隆到pUC18载体(Takara公司产品)上，方法参照Lee etal，2001，Constitutive and seed-specific expression of a maize lysinefeedback-insensitivedihydrodipioolinate synthase gene leads to increased free lysine levels in rice seedsMolecular Breeding 8：75-84)用EcoR I和Hind III双酶切，分离回收目的片段，与用EcoR I和Hind III双酶切后的pCAMBIA1300(Cambia公司产品)用T4连接酶连接形成中间载体，再将从蜘蛛中分离克隆的一段蜘蛛拖丝蛋白(Dragline)基因的cDNA片段(序列见图1)用Kpn I和Sac I双酶切，分离回收目标片段，与用Kpn I和Sac I双酶切过中间载体用T4连接酶连接形成重组载体，以上限制性内切酶(EcoR I Hind IIIKpn I和Sac I)和T4连接酶均购于Takara公司；
(2)、将重组载体转化大肠杆菌感受态DH5α(Takara公司产品)，在含X-Gal、IPTG和卡那霉素(上海生工公司产品)的抗性培养基上挑选白色单菌落；
(3)、将挑选的白色单菌落富集抽提质粒，用EcoR I和Hind III双酶切后电泳检测，挑选连接正确的质粒转化农杆菌EHA105(Takara公司产品)中，转化后的菌株命名为S1；
上述分子克隆方法及试剂配方参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。
实施例2：农杆菌介导的遗传转化：
(1)、诱导：
将成熟的水稻品种(Dongjign韩国公开的粳稻品种)种子去壳，然后依次用70％体积比的乙醇处理1分钟，0.15％浓度的氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在粳稻诱导培养基上；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
(2)、继代：
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻继代培养基上黑暗下培养2-3周，温度25±1℃。
(3)、预培养：
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻预培养基上黑暗下培4-5天，温度25±1℃。
(4)、农杆菌培养：
在带有卡那霉素抗性(上海生工公司产品)选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002)上预培养农杆菌株S1两天，温度28℃；刮取农杆菌至悬浮培养基中悬浮培养，温度28℃。
(5)、侵染：
将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌S1的悬浮液至OD600 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在粳稻共培养基上培养3天，温度19-20℃。
(6)、筛选：
用灭菌水洗涤愈伤8遍；浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)(上海生工公司产品)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至含有250mg/L羧苄青霉素(CN)、50mg/L潮霉素(Hn)(Roche公司产品)粳稻选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。
(7)、分化：
将抗性愈伤转移至粳稻分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
(8)、生根：
剪掉再生苗分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
(9)、移栽：
洗掉再生植株根上的残留培养基，移入钵中盆栽，同时在最初的几天保持水分湿润，待植株存活健壮后移入大田。
实施例3：
取转基因植株叶片抽提DNA，进行聚合酶链式反应(PCR)，PCR程序：94℃预变性5分钟；33个循环(94℃变性1分钟；55℃退火1分钟；72℃延伸2分钟)，72℃延伸7分钟；)检测阳性转化植株，能扩增出1.2kb大小条带的单株即为阳性转化单株(图3)。抽提阳性单株籽粒的RNA进行Northern杂交检测转入片段在籽粒中的表达，阳性单株的转入片段全部表达(图4)。抽提阳性单株DNA大样分别用Sac I和Xba I(Takara公司产品)酶切，进行Southern杂交鉴定阳性转化单株的片段整合拷贝数，得到3个单拷贝的独立转化植株(图5)。DNA抽提、RNA抽提、PCR反应体系、Southern和Northern杂交等相关技术参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。
实施例4：
将选留的3个单拷贝转基因单株的种子种成T1代家系，由于T1代会分离，因此进一步利用聚合酶链式反应(PCR)(方法同实施例3)检测各家系中的阳性单株，对阳性单株抽提籽粒RNA进行Northern杂交检测转入片段的表达(方法同实施例3，图6)，结合田间表现各家系选一个含有目标片段且目标片段正常表达的单株，自交收种；
实施例5：
将实施例4中选留的3个单株的种子种成T2代家系，继续利用PCR(方法同实施例3)检测各家系中的阳性单株，其中家系3和家系5已经纯合稳定(表1)。考察家系3和家系5的主要农艺性状并分析籽粒氨基酸含量，从中选择3个氨基酸含量提高且田间表现良好的纯合单株(SPD1、SPD2和SPD3)。
表1 T2代阳性植株率(阳性植株数/检测植株数)
主要农艺性状考察标准如下：
株高：收获前于田间测定单株最高穗颖尖距离地面的高度(cm)；
每穗实粒数：每株选取3个大穗，计数每穗所有实粒数；
结实率：每穗实粒数除以每穗颖花数乘以100(％)；
单株产量：单株全部实粒重(g)
籽粒氨基酸含量测定方法通过盐酸水解(参照王令强，2007，分子标记遗传图谱构建和稻米品质性状的遗传分析，博士学位论文：166-167)，利用氨基酸分析仪(日立L-8800全自动氨基酸分析仪)测定；氨基酸分析仪操作规程见氨基酸全自动分析仪说明书。
米粉制备：取约25克稻谷在出糙机上脱壳，然后用国产JMJ-100型精米机碾米出精，再用旋风式粉碎机(Udy corporation，Colorado，USA)将精米碎成粉，过100目筛后装入塑料袋封口，置于-20℃冰箱中保存备用。
盐酸水解法测定步骤如下：
(1)，称样量大约为100mg左右(天平的感量为1/10000，一般控制80-110mg)称量样品时注意长柄小勺子取样，然后将样品送入水解管底部，并做好记录。操作时要戴手套。
(2)，用可调定量加液器向装有样品的水解管中加入6-8mL的6mol/L的盐酸。注意先加入0.5mL左右浸湿。
(3)，抽真空减压后用丁烷喷灯灼烧封口。
(4)，110℃烘箱中水解22小时。
(5)，摇匀水解管中液体，用滤纸(11×11cm)过滤至50mL容量瓶中并用双蒸水定容至50mL。注意一定要双蒸水润洗水解管三次以上，并保证滤纸上水已过滤至容量瓶后再加下一次水过滤，以保证水解管及滤纸上无氨基酸残留。
(6)，摇匀后取1mL于2.5mL塑料离心管中，冻干机真空浓缩4-6小时至近干燥状态。(也可用其它仪器代替冻干机，只要能进行真空干燥就行)
(7)，加入1mL 0.02mol/L盐酸于离心管中震荡均匀。
(8)，14000rpm离心15min，吸上清液0.8mL于氨基酸测定仪样品瓶，上机测定。每个样品测定2次。
按照标样换算样品中每种氨基酸的含量，单位为mg/g。色氨酸在盐酸水解的时候被破坏，本方法未测定；谷氨酸(Glu)和天门冬氨酸(Asp)含量包含了来自于谷氨酰氨(Gln)和天门冬酰氨(Asn)降解的部分。因此，必需氨基酸含量(Eaa)为苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸这7种必需氨基酸含量之和。所有氨基酸总量(Total)为17种氨基酸含量之和。
实施例6：
把上代选择的纯合单株SPD1与对照野生型Dongjing分别于2008年6月和12月在武汉和海南种植成家系，分析转基因植株和对照的籽粒氨基酸含量(方法同实施例5)，与对照相比，家系SPD1在武汉和海南种植时籽粒必需氨基酸含量均提高了17％以上，总氨基酸含量均提高了20％以上，其中脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸和亮氨酸等7种氨基酸含量与对照相比均有较大程度提高，只是在海南种植的提高幅度比武汉种植的小(表2)。同时考察海南种植的转基因家系与对照的主要农艺性状(方法同实施例5)，与对照相比，株高无明显差异，而结实率、每穗实粒数和单株产量均有显著提高(表3)。
表2转基因家系SPD1与对照在武汉和海南种植的氨基酸含量分析(mg/g)
注：增幅％＝(转基因家系-对照)/对照×100
表3转基因家系SPD1与对照海南种植主要农艺性状表现
*，**，0.05和0.01水平的显著性
实施例7：
把上代选择的纯合单株SPD2与对照野生型Dongjing分别于2008年6月和12月在武汉和海南种植成家系，分析转基因植株和对照的籽粒氨基酸含量(方法同上实施例5)，与对照相比，家系SPD2在武汉和海南种植籽粒必需氨基酸含量均提高了17％左右，总氨基酸含量均提高了20％以上，其中脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸和缬氨酸等6种氨基酸含量与对照相比均有较大程度提高，只是在海南种植的提高幅度比武汉种植的小(表4)。同时考察海南种植的转基因家系与对照的主要农艺性状(方法同实施例5)，与对照相比，株高和每穗实粒数无明显差异，而结实率和单株产量均有显著提高(表5)。
表4转基因家系SPD2与对照在海南种植的氨基酸含量分析(mg/g)
注：增幅％＝(转基因家系-对照)/对照×100
表5转基因家系SPD2与对照海南种植主要农艺性状表现
*，**，0.05和0.01水平的显著性
实施例8：
把上代选择的纯合单株SPD3与对照野生型Dongjing分别于2008年6月和12月在武汉和海南种植成家系，分析转基因植株和对照的籽粒氨基酸含量(方法同实施例5)，与对照相比，家系SPD3在武汉和海南种植籽粒必需氨基酸含量分别提高了18％和10％，总氨基酸含量分别提高了25％和17％，其中脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸和缬氨酸等6种氨基酸含量均比对照有较大程度提高，只是在海南种植的提高幅度比武汉种植的小(表6)。同时考察海南种植的转基因家系与对照的主要农艺性状(方法同实施例5)，与对照相比，株高和结实率无明显差异，而每穗实粒数和单株产量均有显著提高(表7)。
表6转基因家系SPD3与对照在海南种植的氨基酸含量分析(mg/g)
注：增幅％＝(转基因家系-对照)/对照×100
表7转基因家系SPD3与对照海南种植主要农艺性状表现
*，**，0.05和0.01水平的显著性
本发明所用到的遗传转化的培养基及其配制的方法如下所述：
(1)试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：
6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；
CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；
KT(Kinetin，激动素)；
NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；
IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；
2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；
AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；
CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；
HN(Hygromycin B，潮霉素)；
DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；
N6max(N6大量元素成分溶液)；
N6mix(N6微量元素成分溶液)；
MSmax(MS大量元素成分溶液)；
MSmix(MS微量元素成分溶液)
(2)主要溶液配方
1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：
将上述试剂逐一溶解，然后室温(20-25℃，以下相同)下用蒸馏水定容至1000毫升。
2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制
将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)
将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)和2.78克FeSO4·7H2O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)
加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升 蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。
8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升 蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升 蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升 蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：
秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制：
秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
2)继代培养基
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
3)预培养基
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升 葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
4)共培养基
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升 葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。
5)悬浮培养基
加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。
使用前加入1毫升 无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
6)选择培养基
加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。
7)预分化培养基
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
8)分化培养基
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
9)生根培养基
加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。
Claims (1)
1.一种改良水稻籽粒氨基酸品质的方法，其步骤是：
A、从蜘蛛中分离的一段拖丝蛋白基因的cDNA片段，该cDNA片段由905个碱基组成，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；编码264个氨基酸，富含甘氨酸和丙氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；将它与水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子酶切连接连到表达载体pCAMBIA1300上，构建重组载体；
B、利用根癌农杆菌介导的转基因方法将重组载体导入水稻中，获得转基因植株；
C、利用聚合酶链式反应对T0代转基因植株进行阳性检测，通过Northern杂交检测阳性转基因植株转入片段的表达，通过Southern杂交鉴定阳性转基因植株的整合拷贝数，选择含单拷贝的转入片段且正常结实的转基因植株，收获单株自交种子；
D、将步骤C选留的转基因植株的种子种成家系T1代，继续利用聚合酶链式反应PCR对T1代单株进行阳性检测，利用Northern杂交检测阳性单株转入片段的表达，结合田间表型选择转入片段表达的转基因植株，自交留种；
E、继续种植步骤D中选留的目标单株成T2代家系，利用聚合酶链式反应PCR对T2代单株进行阳性检测，对阳性单株进行农艺性状考察和籽粒氨基酸分析，从中选择表型稳定，氨基酸品质和农艺性状有较大改善的纯合单株，自交留种；
F、对选留的纯合单株进一步进行表型选择，培育新材料。
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