CN102134596A

CN102134596A - 一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法

Info

Publication number: CN102134596A
Application number: CN2010106082806A
Authority: CN
Inventors: 毛红菊; 邹能利; 金庆辉; 赵建龙
Original assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2030-12-28
Also published as: CN102134596B

Abstract

本发明涉及一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，包括：(1)核酸横向流试纸条的制备；(2)取待测样本，变性，退火；取水、纳米金探针溶液、连接探针、Taq DNA连接酶缓冲液和Taq DNA连接酶，打匀，得混合液；向混合液中加入KIF-1、KIF-2或它们的混合液，打匀；然后加入待测样本，杂交连接，变性，退火，最后将所得溶液滴加在核酸横向流试纸条的结合区，将试纸条浸入区浸入运行缓冲液中，观察。本发明的方法操作简单，成本低，具有特异、快速、高分辨、高灵敏度的特点，可应用于临床医学中遗传病、传染性疾病、肿瘤以及心血管疾病中基因的单核苷酸多态性、基因型的检测以及不同病原微生物的鉴定。

Description

一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属单核苷酸多态性的检测领域，特别是涉及一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法。

背景技术

心血管疾病是现代人的第一大杀手。现在全球有近四分之一人口为心血管及相关疾病所威胁，而且终其一生，大约有三分之一人的人生为心血管疾病阴影所笼罩，最后有五分之一的人口死于心血管相关疾病。在心血管疾病(如冠心病)的发生、诊断和治疗中，KIF6(kinesin-like protein 6)基因有着重要的影响。KIF6(kinesin-like protein 6)蛋白是一种与细胞内运输有关的蛋白质。KIF6基因型提供了传统风险因素以外的重要信息，以帮助识别冠心病的高危患者并进行个性化的治疗。KIF6(719 Arg)的单核苷酸多态性(SNP)已被证实可以预测冠心病(CHD)风险的增加，并减少statin(他汀类药物)治疗的事故。这类KIF6基因型携带者含有一个或两个719Arg等位基因(e.g.，Arg/Trp or Arg/Arg)，而非携带者的基因型缺乏719Arg等位基因(e.g.，Trp/Trp)。并且女性KIF6(719Arg)等位基因携带者心梗及冠心病(CHD)危险高于非携带者。

目前最常见的单核苷酸多态性检测方法包括：测序法、单链构象多态性检测(SSCP)、连接或引物延伸法(ligation or primer extension)、基于分子信标的荧光能量共振转移方法(molecular-beacon-based fluorescence resonance energy transfer)，电化学检测(electrochemical detecting)以及双色荧光偏振技术等方法。但这些方法普遍存在操作过程复杂，比较费时以及需要贵重的检测仪器等缺点。因此建立简单、特异、快速、便捷的靶核酸及单核苷酸多态性检测方法可以更便于在医学诊断及临床检验上的推广使用。

最近许多研究都集中在新的检测技术的开发以便使PCR及其他扩增技术更适应现代分子诊断的需求。如试纸条检测技术为生化检测以及医学快速检测提供了便捷的途径。然而，目前试纸条技术主要是标记了扩增产物或寡核苷酸探针的抗体或链亲和素试纸条。该试纸条具有一定的优势，但也因为运用了蛋白的抗原抗体反应，需要更多的标记，并且高亲和力的抗体/半抗原对的数量限制了基因多靶标的检测，增加了成本和步骤，并且更不易于保存。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，该方法操作简单，成本低，具有特异、快速、高分辨、高灵敏度的特点，可应用于临床医学中遗传病、传染性疾病、肿瘤以及心血管疾病中基因的单核苷酸多态性、基因型的检测以及不同病原微生物的鉴定。

本发明的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，以心血管病相关基因KIF的基因多态性检测为例进行详细阐述，包括：

(1)将含有毛细管的膜(Membrane)粘贴在衬垫纸板上，再把吸收区(Absorbent Pad)放置在含有毛细管的膜之上，重叠1-2mm；再把结合区(Conjugation Pad)放置在含有毛细管的膜之上，重叠1-2mm；最后把浸入区(Immersion Pad)放置在结合区之上，重叠1-2mm，得核酸横向流试纸条；所述含有毛细管的膜上有以捕获DNA探针包被的两条检测线(检测线1、检测线2)，和一条质控线；

(2)KIF6 DNA的单核苷酸多态性检测

取1μL待测样本，在PCR仪中95℃变性4min，再放入-20℃冰盒退火3min；

首先配制检测KIF6基因型的反应体系，用于目标DNA与检测探针的杂交和连接，取水4μL、纳米金探针溶液2μL、连接探针Z-KIF-1和Z-KIF-2(浓度为1μM/L)各1μL、TaqDNA连接酶缓冲液1μL和Taq DNA连接酶(浓度为1个单位)溶液1μL，用移液枪打匀，得混合液；向混合液中加入1μL(浓度为1μM/L)的KIF-1、KIF-2或它们的混合液，用移液枪打匀；然后加入上述处理后的待测样本，用移液枪打匀，之后再PCR仪中45℃杂交连接30分钟，再95℃变性4min，再放到-20℃冰盒中退火3min，最后将所得溶液滴加在上述核酸横向流试纸条的结合区，迅速将试纸条浸入区浸入运行缓冲液(RunningBuffer)中，在液体到达吸收区时平放试纸条，10min后观察现象。

所述步骤(1)中含有毛细管的膜的成分为硝酸纤维素膜；结合区的成分为聚脂纤维；浸入区的成分为玻璃纤维；吸收区的成分为吸水纸；玻璃纤维的型号是SB06，聚脂纤维膜的型号是VL68，吸水纸的型号是SX27。

所述步骤(1)中含有毛细管的膜上包被的是捕获DNA探针，其序列为一个或几个通用序列，利用DNA的杂交捕获检测探针上与其互补的通用序列；质控线上包被的是质控探针Control Probe，而两条检测线上分别包被了不同的捕获探针(ZW-T和ZM-T)，其中捕获DNA探针浓度为20μM/L，包被捕获DNA探针用量为1μL/mm，捕获探针被溶解在含2％蔗糖和5％甲醇的溶液中以固定捕获探针并保存捕获探针的活性。包被线后试纸条在室温下晾干并保存。

所述步骤(2)中的运行缓冲液的成分为50mM/L的Tris-HCl，50mM/L的NaCl，2ml/L的Tween-20和0.5g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)。

表1.KIF6基因DNA序列及探针序列

在心血管疾病(如冠心病)的发生、诊断和治疗中，KIF6(kinesin-like protein 6)基因有着重要的影响。KIF6(kinesin-like protein 6)蛋白是一种与细胞内运输有关的蛋白质。KIF6基因型提供了传统风险因素以外的重要信息，以帮助识别冠心病的高危患者和进行个性化的治疗。KIF6(719 Arg)的单核苷酸多态性(SNP)已被证实可以预测冠心病(CHD)风险的增加，并减少statin(他汀类药物)治疗的事故。

根据检测原理(图1、3)及信号探针序列设计(表1)，用不同的捕获探针在膜(Membrane)包被了三条线，质控线上包被的是质控探针Control Probe，用于捕获未参与连接反应的纳米金探针，显色指示试纸条的有效性；而第一检测线1和第二检测线2上分别包被了不同的捕获探针(ZW-T和ZM-T)，用于捕获不同的连接探测产物聚集显色，从而判断Target DNA的基因型。

本发明采用双探针检测方法根据KIF6基因719Arg等位基因(Arg/Trp or Arg/Arg)的DNA序列设计检测探针和连接探针。首先选取包含了KIF6基因719Arg等位基因单核苷酸多态性位点的一段序列(30bp)，合成两个Target DNA，命名为KIF-1和KIF-2，分别对应于等位基因KIF6(719Arg)和KIF6(719Trp)。以单核苷酸多态性位点上游的序列为模板，设计其互补的纳米金检测探针(KIF-P-PS)，5’末端经过巯基功能化修饰，以便与纳米金颗粒结合。再设计两个连接探针(27bp)，3’端的第一个碱基为单核苷酸多态性检测位点，与KIF6(719Arg)对应的多态位点为C，探针命名为Z-KIF-1，而与KIF6(719Trp)对应的多态位点为T，探针命名为Z-KIF-2；3’端的另15个碱基与Target DNA(KIF-1和KIF-2)在多态位点下游的序列互补；5’端的12个碱基是一段与试纸条上的捕捉探针互补的通用序列。试纸条上的捕获探针为两个通用的序列ZW-T和ZM-T，分别与连接探针Z-KIF-1和Z-KIF-2在5’端的半段序列互补配对。

试纸条检测KIF6基因型的检测原理如图1、图2和图3，所有用到的DNA序列见表2，探针的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

表2.KIF6基因DNA序列及探针序列

所述纳米金探针溶液的制备，包括：

纳米金胶体的制备

配置浓度为1mM/L HAuCl4溶液及浓度为38.8mM/L的柠檬酸三钠溶液。将HAuCl4溶液加热至130℃，在加热过程中充分搅拌，过约20分钟时迅速加入新配好的柠檬酸三钠溶液(此过程中注意保温，不要让HAuCl4溶液降温)25ml，持续搅拌至溶液冷却至室温、即形成为酒红色溶液。以0.22μm硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均匀的纳米金溶液；

DNA标记的纳米金探针的制备

取浓度为12nM/L的13nm纳米金溶液1.0mL，9500rpm、4℃离心1小时，去上清夜，以97μL无菌去离子水重悬；加入3μL巯基标记的DNA探针(浓度为100μM/L)使其最终浓度为3μM/L，室温放置过夜(≥12小时)；逐步加入1M/LNaCl溶液、0.1M/L(PH7.2)PB缓冲液(分3次，第一次各3μL，第二次各4μL，第三次各5.5μL，间隔1小时)至终浓度分别为0.1M/L、10mM/L，充分混匀，室温放置48小时以上；加0.01M/L PB、0.1M/LNaCl混合溶液至1.0mL，9500rpm、4℃离心1小时，去上清液，重复两次；以100μl的0.01M/LPB、0.1M/L NaCl混合溶液重悬，4℃储存备用。

所述待测样本的制备：采用裂解法抽提血清样品中KIF6基因组DNA，然后对KIF6DNA进行PCR扩增，制得KIF6 DNA临床待测样本。其中PCR扩增体系为：10×缓冲液1.5μl，Taq酶(1个单位)，25mmol/L MgCl₂ 0.8μl、25mmol/L dNTP 1μl，上下游引物各0.5μl，引物终浓度为0.5pmol/L；扩增条件：94℃变性4分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环，72℃延伸4分钟。

KIF6 DNA临床样本单核苷酸多态性的检测结果判断

观察步骤(2)试纸条中检测线1、检测线2和质控线三个线性区域的颜色，并据此判断KIF6DNA临床样本的单核苷酸多态性。

①如果质控线没有显现红色条带，那么该KIF6基因型检测试纸条无效；

②如果质控线显现红色条带，但是检测线1和检测线2都没有显现红色条带，那么检测KIF6基因型的反应体系有问题或无效。

③如果质控线和检测线1都显现红色条带，但是检测线2没有显现红色条带，那么该KIF6 DNA的基因型为KIF6(719Arg/Arg)；

④如果质控线和检测线2都显现红色条带，但是检测线1没有显现红色条带，那么该KIF6DNA的基因型为KIF6(719Trp/Trp)；

⑤如果检测线1、检测线2和质控线都显现红色条带，那么该KIF6DNA的基因型为KIF6(719Arg/Trp)。

本发明利用连接酶检测反应(LDR)中Taq DNA连接酶的特异性识别单核苷酸多态性，并根据KIF6DNA临床样本的基因型将纳米金探针与相应的捕获序列连接在一起。信号探针序列设计如表1，以KIF-1和KIF-2分别代表KIF6等位基因719Arg和719Trp在单核苷酸多态性位点附近的Target DNA片段。如图2所示，在连接酶检测反应LDR中，Target DNAKIF6(719Arg)与KIF6(719Trp)、连接探针Z-KIF-1与Z-KIF-2还有KIF-P-PS纳米金探针可以杂交形成双链结构，但是由于Taq DNA连接酶的特异性，只有KIF6(719Arg)、Z-KIF-1和KIF-P-PS以及KIF6(719Trp)、Z-KIF-2和KIF-P-PS这两种结构才可以在Taq DNA连接酶的作用下将连接探针Z-KIF-1和纳米金探针KIF-P-PS或者连接探针Z-KIF-2和纳米金探针KIF-P-PS连接成一条链，分别称之为Z-KIF-Au-W和Z-KIF-Au-M，纳米金探针因此与捕获序列连接在了一起。而同时，Target DNAKIF6(719Arg)、连接探针Z-KIF-2和纳米金探针KIF-P-PS，或者Target DNA KIF6(719Trp)、连接探针Z-KIF-1和纳米金探针KIF-P-PS这两种结构也能形成双链，但是在接头处有一个单碱基错配，无法在Taq连接酶的作用下连接，反应产物变性后，纳米金探针因此与捕获序列就会分开。

本发明利用DNA杂交中碱基互补配对的特异性，识别与KIF6DNA临床样本基因型相对应的连接酶检测反应产物(LDR Production)，捕获纳米金探针在相应的区域聚集显色。试纸条的结构如图1，在试纸条上的两个检测线分别固定了与连接探针Z-KIF-1和Z-KIF-2相配对的单链DNA(捕获探针ZW-T、ZM-T)。如图3所示，将连接酶检测反应产物(LDRProduction)滴于试纸条的的结合区(CP)，并迅速将试纸条浸入区(IP)浸入运行缓冲液(Running Buffer)溶液中时，连接酶检测反应产物(LDR Production)将被虹吸而上，两个检测线的捕获探针ZW-T和ZM-T将分别与其中的连接产物Z-KIF-Au-W和Z-KIF-Au-M杂交，纳米金探针因此而被捕获，从而聚集显红色；而在单碱基错配的情况下，仅有连接探针Z-KIF-1和Z-KIF-2被捕获，纳米金探针将移动到质控线与Control Probe捕获探针结合显色。因此实验结束后，对比两个检测线的颜色深浅，就能判断出该KIF6DNA临床样本的基因型。

有益效果

本发明通过连接酶检测反应(LDR)，结合核酸横向流试纸条技术，建立了一种快速的、简易的、用后可弃的DNA单核苷酸多态性传感器，并开发了一种基于试纸条的可用于单核苷酸多态性检测的新方法。相对与现有的其它方法而言，本发明基于核酸试纸条上的检测技术，将寡核苷酸探针固定在试纸条上，利用DNA标记的纳米金探针结合连接酶检测反应(LDR)用于KIF6基因单核苷酸多态性的检测，可在较短时间内完成对KIF6基因的检测，结果准确，操作简单，灵敏度能够满足临床检测的要求，在医学诊断方面具有良好的应用前景。

本发明中基于核酸的试纸条制备过程简单、方便，保存时间长且稳定性好；连接酶检测反应(LDR)的反应过程简单，对于单核苷酸多态性检测特异性高，而且可以在较短时间内完成；具有快速、简便和低廉等优势，灵敏度能够满足临床检测的要求，在医学诊断方面具有良好的应用前景。因此本方法为临床上一种用于基因多态性及基因型检测的新方法。

附图说明

图1为核酸横向流试纸条的示意图；

浸入区(Immersion pad)、结合区(Conjugation pad)、膜(Membrane)和吸收区(Absorbent pad)；膜(Membrane)包被了三条线，质控线上包被的是质控探针Control Probe，而检测线1和检测线2上分别包被了不同的捕获探针(ZW-T和ZM-T)；

图2为基于连接酶检测反应(LDR)检测KIF6单核苷酸多态性的原理示意图；

连接酶检测反应(LDR)利用Taq DNA连接酶的特异性识别单核苷酸多态性，并根据KIF6DNA临床样本的基因型将纳米金探针与相应的捕获序列连接在一起；

图3为单核苷酸多态性检测试纸条的显色原理图

根据DNA杂交中碱基互补配对的特异性，识别与KIF6DNA临床样本基因型相对应的连接酶检测反应产物(LDR Production)，捕获纳米金探针在相应的区域聚集显色。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

基于核酸横向流试纸条检测KIF单核苷酸多态性方法的建立

(1)巯基标记的寡核苷酸纳米金探针的制备

①纳米金胶体的制备

配置浓度为1mM/L HAuCl4溶液及浓度为38.8mM/L的柠檬酸三钠溶液。将HAuCl4溶液加热至130℃，在加热过程中充分搅拌，过约20分钟时迅速加入新配好的柠檬酸三钠溶液(此过程中注意保温，不要让HAuCl4溶液降温)25mL，持续搅拌至溶液冷却至室温、即形成为酒红色溶液。以0.22μm硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均匀的纳米金溶液。

②DNA标记的纳米金探针的制备

(2)KIF6 DNA检测探针的设计及合成

试纸条检测KIF6基因型的检测原理如图1、图2和图3，所有用到的DNA序列见表1，探针的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

(3)核酸横向流试纸条的制备

试纸条由粘贴在塑料粘性衬垫纸板的四个部分组成，浸入区(Immersion Pad，IP，3mm×15mm)的成分是玻璃纤维，用于浸入并吸取运行缓冲液(Running Buffer)；结合区(Conjugation Pad，CP，3mm×10mm)的成分是聚脂纤维，用于将检测溶液滴于其上，进行反应；膜(Membrane，M，3mm×25mm)的成分是硝酸纤维素膜，内有毛细管，利用其虹吸作用将检测溶液往上吸，最终与点于其上的DNA杂交；吸收区(Absorbent Pad，AP，3mm×15mm)成分是吸水纸，用于增强膜的虹吸作用。

组装程序如下：如图1所示，首先将膜(M，25mm)粘贴在衬垫纸板上；再把吸收区(AP，15mm)放置在膜(M)之上，重叠2mm；再把结合区(CP，10mm)放置在膜(M)之上，重叠2mm；最后把浸入区(IP，15mm)放置在结合区(CP)之上，重叠2mm。

根据检测原理(图1、3)及信号探针序列设计(表1)，用不同的捕获探针在膜(Membrane)包被了三条线，质控线上包被的是DNA探针Control Probe，用于捕获未参与连接反应的纳米金探针，显色指示试纸条的有效性；而检测线1和检测线2上分别包被了不同的捕获探针(ZW-T和ZM-T)，用于捕获不同的连接探测产物聚集显色，从而判断Target DNA的基因型。探针浓度为20μM/L，包被线用量为1μL/mm。为固定捕获探针并保存捕获探针的活性，捕获探针被溶解在含2％蔗糖和5％甲醇的溶液中。包被线后试纸条在室温下晾干并保存。

(4)KIF6DNA的单核苷酸多态性的检测与判断

首先配制检测KIF6基因型的反应体系，用于目标DNA与检测探针的杂交和连接，取3个150μL的离心管，分别标记1、2、3，各加水4μL、纳米金探针溶液2μL、连接探针Z-KIF-1和Z-KIF-2(浓度为1μM/L)各1μL、Taq DNA连接酶缓冲液1μL和Taq DNA连接酶(浓度为1个单位)1μL，用移液枪打匀，4℃待用。

然后取(2)中合成的Target DNA(浓度为1μM/L)，往离心管1、2中分别加入1μL的KIF-1和KIF-2，往离心管3中同时加入1μL的KIF-1和KIF-2，用移液枪打匀，然后在PCR仪中45℃杂交连接30分钟，再95℃变性4min，再放到-20℃冰盒中退火3min；取3根(3)中的试纸条，分别标记1、2、3；再将上述离心管的溶液滴在相应试纸条的结合区(CP)，迅速将试纸条浸入区(IP)浸入运行缓冲液(Running Buffer)溶液中，在液体到达吸收区(AP)时拿出试纸条平放，10min后观察现象。

(5)KIF6DNA的单核苷酸多态性的判断

观察上述步骤中的试纸条中检测线1、检测线2和质控线三个线性区域的颜色，并据此判断KIF6DNA临床样本的单核苷酸多态性。

①KIF6(719Arg)型DNA的检测结果判断

试纸条1上的质控线和检测线1都显现红色条带，但是检测线2没有显现红色条带，所以判断该KIF6DNA为KIF6(719Arg)，与实验方案的预测结果一致；

②KIF6(719Trp)型DNA的检测结果判断

试纸条2上的质控线和检测线2都显现红色条带，但是检测线1没有显现红色条带，所以判断该KIF6DNA为KIF6(719Trp)，与实验方案的预测结果一致；

③KIF6(719Arg/Trp)型DNA的检测结果判断

试纸条3上的检测线1、检测线2和质控线都显现红色条带，所以判断该KIF6DNA为KIF6(719Arg/Trp)，与实验方案的预测结果一致。

由以上结果可以看出，实验验证的结果与实验方案的预测结果相一致，表明了该方法用于单核苷酸多态性检测的可行性与准确性。

实施例2

KIF6DNA临床样本的单核苷酸多态性检测与判断

(1)巯基标记的寡核苷酸纳米金探针的制备

方法如实施例1/(1)所述；

(2)KIF6DNA检测探针的设计及合成

本发明采用双探针检测方法根据KIF6基因719Arg等位基因(Arg/Trp or Arg/Arg)的DNA序列设计检测探针和连接探针。首先选取包含了KIF6基因719Arg等位基因单核苷酸多态性位点的一段序列(30bp)为Target DNA，包括等位基因KIF6(719Arg)和KIF6(719Trp)。以单核苷酸多态性位点上游的序列为模板，设计其互补的纳米金检测探针(KIF-P-PS)，5’末端经过巯基功能化修饰，以便与纳米金颗粒结合。再设计两个连接探针(27bp)，3’端的第一个碱基为单核苷酸多态性检测位点，与KIF6(719Arg)对应的多态位点为C，探针命名为Z-KIF-1，而与KIF6(719Trp)对应的多态位点为T，探针命名为Z-KIF-2；3’端的另15个碱基与Target DNA(KIF-1和KIF-2)在多态位点下游的序列互补；5’端的12个碱基是一段与试纸条上的捕捉探针互补的通用序列。试纸条上的捕获探针为两个通用的序列ZW-T和ZM-T，分别与连接探针Z-KIF-1和Z-KIF-2在5’端的半段序列互补配对。

试纸条检测KIF6基因型的检测原理如图1、图2和图3，所有用到的DNA序列见表2，探针与引物的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

(3)核酸横向流试纸条的制备

方法如实施例1/(3)所述；

(4)KIF6DNA临床样本的制备；

分别采集2个基因型为KIF6(719Arg/Arg)、KIF6(719Trp/Trp)和KIF6(719Arg/Trp)的个体血清样品，再采用裂解法分别抽提血清样品中KIF6基因组DNA，然后对KIF6DNA进行PCR扩增，制得KIF6DNA临床待测样本：

将血清裂解离心后，取1.5μl，加双蒸水至15μl；PCR体系：10×缓冲液1.5μl，Taq酶(1个单位)，25mmol/L MgCl₂ 0.8μl、25mmol/L dNTP 1μl，上下游引物各0.5μl，引物终浓度为0.5pmol/L；扩增条件：94℃变性4分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环，72℃延伸4分钟。最终得到三种各2个PCR产物样本(扩增产物大约265bp)(记为样本1～样本6)；

(5)KIF6DNA临床样本单核苷酸多态性的检测

①首先配制检测KIF6基因型的反应体系，用于目标DNA与检测探针的杂交和连接，取6个150μL的离心管，加水4μL、纳米金探针溶液2μL、连接探针Z-KIF-1和Z-KIF-2(浓度为1μM/L)各1μL、Taq DNA连接酶缓冲液1μL和Taq DNA连接酶(浓度为1个单位)溶液1μL，用移液枪打匀，4℃待用。

②然后从(4)中的KIF6DNA临床样本各取10μL(记为样本01～样本06)，在PCR仪中95℃变性4min，再放入-20℃冰盒退火3min。

③分别从(5)/②中的样本中取1μL加入(5)/①中相应离心管的混合液，用移液枪打匀，然后在PCR仪中45℃杂交连接30分钟，再95℃变性4min，再放到-20℃冰盒中退火3min；取6根(3)中的试纸条(记为1～6)，将(5)/③中的溶液分别滴在相应试纸条的结合区(CP)，迅速将试纸条浸入区(IP)浸入运行缓冲液(Running Buffer)中，在液体到达吸收区(AP)时拿出试纸条平放，10min后观察现象。

(6)KIF6DNA临床样本单核苷酸多态性的检测结果判断

观察(5)/③步骤中的试纸条中检测线1、检测线2和质控线三个线性区域的颜色，并据此判断KIF6DNA临床样本的单核苷酸多态性。

试纸条1、2上的检测线1和质控线显现红色条带，但是检测线2没有显现红色条带，所以判断该KIF6DNA临床样本的基因型为KIF6(Arg/Arg)，与实验方案的预测结果一致；

试纸条3、4上的检测线2和质控线显现红色条带，但是1没有显现红色条带，所以判断该KIF6DNA临床样本的基因型为KIF6(Trp/Trp)，与实验方案的预测结果一致。

试纸条5、6上的检测线1、检测线2和质控线都显现红色条带，所以判断该KIF6DNA临床样本的基因型为KIF6(Arg/Trp)，与实验方案的预测结果一致。

Claims

1.一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，包括：

(1)将含有毛细管的膜粘贴在衬垫纸板上，再把吸收区放置在含有毛细管的膜之上，重叠1-2mm；再把结合区放置在含有毛细管的膜之上，重叠1-2mm；最后把浸入区放置在结合区之上，重叠1-2mm，得核酸横向流试纸条；所述含有毛细管的膜上有以捕获DNA探针包被的两条检测线和一条质控线；

(2)取1μL待测样本，在PCR仪中95℃变性4min，再放入-20℃冰盒退火3min；

取水4μL、纳米金探针溶液2μL、连接探针Z-KIF-1和Z-KIF-2各1μL、Taq DNA连接酶缓冲液1μL和浓度为1个单位的Taq DNA连接酶1μL，用移液枪打匀，得混合液；向混合液中加入1μL的KIF-1、KIF-2或它们的混合液，用移液枪打匀；然后加入上述处理后的待测样本，用移液枪打匀，之后再PCR仪中45℃杂交连接30分钟，再95℃变性4min，再放到-20℃冰盒中退火3min，最后将所得溶液滴加在上述核酸横向流试纸条的结合区，迅速将试纸条浸入区浸入运行缓冲液中，在液体到达吸收区时平放试纸条，10min后观察现象。

2.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(1)中含有毛细管的膜的成分为硝酸纤维素膜；结合区的成分为聚脂纤维；浸入区的成分为玻璃纤维；吸收区的成分为吸水纸。

3.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(1)中含有毛细管的膜上包被的是捕获DNA探针，其序列为一个或几个通用序列，利用DNA的杂交捕获检测探针上与其互补的通用序列；质控线上包被的是质控探针Control Probe，而两条检测线上分别包被了不同的捕获探针：ZW-T和ZM-T；其中捕获DNA探针浓度为20μM/L，包被捕获DNA探针用量为1μL/mm，捕获探针被溶解在含2％蔗糖和5％甲醇的溶液中。

4.根据权利要求3所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述捕获探针ZW-T的序列为5’-TGCGGGTAATCG-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’，捕获探针ZM-T的序列为5’-CAGCATCGTGCG-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’，质控探针Control Probe的序列为5‘-AGAGGAGTTGGGACC-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。

5.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(2)中待测样本的制备：采用裂解法抽提血清样品中KIF6基因组DNA，然后对KIF6 DNA进行PCR扩增，即得；其中PCR扩增体系为：10×缓冲液1.5μl，Taq酶，25mmol/L MgCl₂ 0.8μl、25mmol/L dNTP 1μl，上下游引物各0.5μl，引物终浓度为0.5pmol/L；扩增条件：94℃变性4分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环，72℃延伸4分钟。

6.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的纳米金探针的序列为5’-PO4-GGTCCCAACTCCTCT-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH-3’；连接探针Z-KIF-1序列为5’-CGATTACCCGCA ACTCCCAGCATGAAC-3’，连接探针Z-KIF-2的序列为5’-CGCACGATGCTG ACTCCCAGCATGAAT-3’；Target DNA KIF-1的序列为5′-AGAGGAGTTGGGACCGTTCATGCTGGGAGT-3′，TargetDNA KIF-2的序列为5′-AGAGGAGTTGGGACCATTCATGCTGGGAGT-3′。

7.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的运行缓冲液的成分为50mM/L的Tris-HCl，50mM/L的NaCl，2ml/L的Tween-20和0.5g/L的十二烷基硫酸钠。

8.根据权利要求1所述的一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的Taq DNA连接酶缓冲液成分为200mmol/L的Tris-HCl，250mmol/L的KAcO，100mmol/L的MgAcO，10mmol/L的NAD，1％的Triton X-100，pH7.6@25℃。