CN102132311A

CN102132311A - 用于评价临床不育的方法和系统

Info

Publication number: CN102132311A
Application number: CN2009801337999A
Authority: CN
Inventors: 玛莲·W·M·姚; W·H·黄
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2008-07-01
Filing date: 2009-07-01
Publication date: 2011-07-20
Also published as: BRPI0913924B1; CA2729763C; US9458495B2; CA2729763A1; AU2017265007B2; IL210156A0; BRPI0913924A2; CN105224827A; HK1220016A1; EA201100120A1; US10438686B2; EP2321789B1; US20160357917A1; AU2015242969B2; IL210156A; WO2010003020A1; US20100036192A1; AU2015242969A1; AU2009266951A1; EP2321789A1

Abstract

提供了用于便于评价临床不育的方法和基于计算机的系统。可实施所述方法和系统，例如，便于为体外受精治疗周期评价受治疗者，包括确定活产事件概率。可实施所述方法和系统，例如，便于确定胚胎的成功植入、选择将移植的胚胎的最佳数目、确定在不成功的治疗周期之后随后体外受精治疗周期的成功。

Description

用于评价临床不育的方法和系统

交叉引用

本申请要求2008年7月1日提交的美国临时专利申请号61/077,439和2008年7月17日提交的美国临时专利申请号61/081,596的权益，这些申请通过引用全文并入本文。

政府权益

本发明在美国国家卫生研究院给予的联邦政府拨款第R01 GM067250和R01 HD057970号的政府支持下进行。美国政府对本发明有某些权利。

发明背景

生殖失败是严重的问题，临床上已通过各种辅助的生殖技术包括体外受精(IVF)和胚胎移植(ET)来解决。由于体外受精提供了在形态学水平表现正常的胚胎用于移植到完全易感的接受者，可能预料这些程序产生极其高的受孕率。尽管有这些努力，IVF/ET的成功率低于理想。在1994年美国和加拿大公布的IVF/ET数据中，开始了26,961个标准IVF周期。其中，86.2％达到采集，其中的90.2％达到移植。然而，在临床妊娠方面，总成功率是每个开始的周期22.7％，每次移植29.1％的妊娠率。

另外，在体外受精之后似乎有早期妊娠丢失的高发生率，生化妊娠率是18％，自然流产率是27％。因此，看起来IVF技术已被充分优化，但植入失败可能是进行ET的大量丢失的原因，这种围植入丢失是可能改进的领域。各种辅助的生殖技术的成功率的关键因素是子宫内膜容受性，这是一种必须与胚胎发育至植入-感受态的胚泡协调的过渡态。

IVF是一种昂贵的程序，对于患者来说在心理学上可能是创伤性的。需要外科手术来从IVF的女性收集卵子，在受精之后，需要进一步的外科手术来在子宫中植入受精卵。然后接受者必须等待一段时间才能确定是否已建立起妊娠。在一些病例，可能尽管重复多次努力而不能实现妊娠，这些病例可能对患者和社会在财务和人力两方面造成相当大的花费。

因此，尽管可改进IVF的成功率，可能期望的是能够在治疗前鉴定IVF不太可能成功的接受者，从而使这些患者能够避免以上提到的IVF程序的花费和创伤。

本发明解决了这些需要。

发明概述

提供了用于便于评价临床不育的方法和基于计算机的系统。可实施所述方法和系统以，例如，便于为体外受精治疗周期评价受治疗者，包括确定活产事件概率。可实施所述方法和系统以，例如，便于确定胚胎的成功植入、选择将移植的胚胎的最佳数目、确定在不成功的治疗周期之后随后体外受精治疗周期的成功。

本领域技术人员阅读以下更完全地描述的本发明细节之后，本发明的这些和其它目标、益处和特征将变得明显。

附图简述

当结合附图阅读时，最佳地从以下详述理解本发明。需要强调的是，根据一般实践，图的各个特征不是按比例的。相反，为了清楚，各个特征的大小是任意放大或缩小的。附图中包括以下各图。

图1显示数据的来源。图A显示在2005年进行的IVF周期。图B显示在665个新的、非供体IVF周期中卵母细胞和胚胎的利用。图A中的所有数目表示周期的数目，图B中的数目表示卵母细胞或胚胎的数目。新的周期由在同一周期中进行的促性腺素卵巢刺激和胚胎移植来界定；冷藏周期利用从之前的周期获得和冷藏的胚胎；“全冷冻”是其中由于医学或非医学原因，在同一周期中进行卵巢刺激，但胚胎被冷藏而不是被移植回的周期。由于多种医学和非医学原因未达到新鲜胚胎移植，从分析中去除157个周期。

图2显示根据在第3天的细胞数目，来自665个新的、非供体IVF病例的所有胚胎的分布。

图3显示变量和其在确定A)8细胞胚胎数(图A)、第3天FSH(图B)和胚胎总数(图C)时的相对重要性。

图4显示细胞周期蛋白A2被Ccna2-MO翻译阻滞，导致胚胎在2-细胞期停滞。图A显示通过RT-PCR在1-至2-细胞胚胎中的Ccna2表达。图B显示核细胞周期蛋白A2定位在83.4±6.0％Ccna2-MO-注射的胚胎中不存在，但在所有未注射胚胎中存在；p＜0.01)。图C显示～50kD细胞周期蛋白A2蛋白在Ccna2-MO-注射的胚胎中未检测到。

图5，图A显示与对照相比，Ccna2-MO诱导更高比率的2-细胞期停滞(p＜0.01)。图B显示只有1.8±1.8％Ccna2-MO-注射的胚胎达到胚泡期(与Ccna2-MM相比p＝0.06)。图C显示2-细胞期停滞比率随着Ccna2-MO浓度减少(0.5mM的p＝0.05；0.25mM的p＝0.01)。图D显示在0.25mM比在0.75mM胚泡发育比率更高(p＜0.001)。所有的柱和误差棒代表分别来自至少3个独立实验组的平均值±s.e.m.。比例尺是40μm。参见表1使用的所有MO的靶向序列，表7是在每组实验中检验的胚胎总数。

图6显示在最早阶段调节哺乳动物胚胎发育的机制。在野生型(+/-)胚胎中，在胚胎基因组激活(EGA)之前存在母体转录物，而在母体-胚胎过渡阶段存在母体转录物和胚胎转录物，这二者导致产生正常基因产物(图A)。在从对无效突变杂合(+/-)的母体产生的纯合无效突变(-/-)胚胎中，持续的母体转录物和/或蛋白可能“拯救”或延迟表型出现(图B)。相反，在从纯合突变女性或带有卵母细胞-特异性基因缺失的女性产生的纯合无效突变胚胎中，观察到的缺陷可能反映卵母细胞缺陷，而不是早期胚胎中的特异性基因需求(图C)。因此，当母体和早期胚胎转录物二者可能同时存在时，这些策略不解决特异性基因在EGA尖点或在EGA期间的精确作用。在EGA时或EGA之前细胞质微注射反义吗啉代寡核苷酸(MO)到野生型胚胎中导致母体和胚胎基因转录物二者的特异性翻译阻滞(图D)。因为MO持续至少数个细胞分裂周期，基因-特异性翻译阻滞可能直到桑葚胚-胚泡期都有效。在这些发育阶段期间基因产物的不存在将揭示关键的基因功能和暴露早期表型，这是在常规基因-靶向策略中通过同源重组和基因转置可能不可检测的。尽管在其它物种中已充分建立此模型，其将示例从考察胚胎基因的功能转化为考察基因产物的功能而不论其母体或胚胎来源。

图7显示实验策略。从野生型交配收集在2前核(2PN)或1-细胞期的胚胎，并注射设计为靶向特定基因的反义吗啉代寡聚物(MO)。MO结合于5’UTR或转录起始位点并通过空间位阻阻滞翻译。体外培养微注射的胚胎和未注射的对照胚胎，观察发育表型诸如在2-细胞、4-细胞、多细胞或桑葚胚阶段碎裂或停滞。如果基因-特异性MO一致地产生相同表型，而错配对照MO允许正常发育，则目标基因的敲低由免疫细胞化学和/或免疫印迹法验证。基因功能的机制通过从在mid-2-细胞期(HCG后43小时)的注射和对照胚胎获得全体基因表达谱而进一步研究。检验候选下游基因在早期胚胎中的差异表达和基因功能。

图8显示通过单胚胎RT-PCR在小鼠合子中的Oct4表达。

图9显示在形成胚泡之前早期胚胎发育需要Oct4。图A显示Oct4-MO-注射的胚胎在多细胞期停滞，而对照达到胚泡期。图B显示Oct4敲低诱导在1-至多细胞期更高的停滞比率；p＜0.01。图C显示Oct4-MO-注射的胚胎都不发育为胚泡。图D显示随着Oct4-MO浓度，在1-至多细胞期停滞比率减少(p＜0.01)。图E显示随着减少浓度的Oct4-MO，有更高比率胚泡发育的非显著趋势。

图10显示在Oct4-MO-注射的胚胎中在4-细胞期之前减少的Oct4表达是明显的。Oct4信号在注射Oct4-MO的胚胎中不存在，但其核定位在未注射的对照和错配对照中存在。比例尺是40μm。

图11，图A显示核Oct4表达在Oct4-MO-注射的胚胎中不存在(上图)，但在Oct4-MM-注射的胚胎和未注射的胚胎中存在。图B显示与没有共注射或mEYFP mRNA共注射相比，共注射36或3.6ng/μL Oct4 mRNA通过具体地减少在1-至多细胞期的停滞比率而导致部分拯救Oct4-MO诱导的表型，这导致更高比率的胚泡发育(p＜0.01)。图C显示过表达Oct4 mRNA以剂量依赖性方式诱导更高的发育停滞，以使注射36或90ng/μL Oct4mRNA后与过表达mEYFP相比胚泡比率显著降低(p＜0.01)。基因过表达通过q-PCR或免疫细胞化学验证(数据未显示)。(比例尺是＝40μm)。

图12显示Oct4-MO-注射的胚胎中在多细胞期减少的Oct4表达。只有6.4±3.2％Oct4-MO-注射的胚胎显示核Oct4信号，而88.9±11.1％Oct4-MM-注射的胚胎和82.7±10.9％未注射的对照胚胎在多细胞期显示明确的核Oct4表达；p＜0.05。

图13显示由Oct4E4-MO证实在早期胚胎发育中需要Oct4，Oct4E4-MO是靶向Oct4的外显子4的剪接位点的反义吗啉代。图A显示由两种吗啉代Oct4-MO和Oct4E4-MO靶向的位点。Oct4-MO靶向开始于ATG起始位点的25个核苷酸，而Oct4E4-MO靶向在第4个外显子(E4)的内含子(I)-外显子(E)边界的剪接位点。预期去除E4会产生一种缺少DNA-结合和活化结构域的蛋白产物。图B显示注射Oct4E4-MO的64.6±19.9％的胚胎在2-细胞期停滞，而注射错配对照Oct4E4-MM的胚胎都不在2-细胞期停滞。图C显示与错配对照Oct4E4-MM相比，注射Oct4E4-MO之后胚泡发育严重受损。

图14和15显示Oct4的基因调节。图14，图A显示3种Oct4敲低、3种Ccna2敲低和6种未注射的(NI)汇集的胚胎样品的无监督聚类(unsupervised clustering)，以及增加(红色)和减少的(蓝色)基因表达。标尺是标准偏差。图14，图B显示差异表达的基因在Oct4和Ccna2敲低胚胎中的交叉。图14，图C和图15显示通过单胚胎q-PCR的Oct4敲低相对表达，图14，图C是过表达的基因(对Hes5p＜0.05)，图15是下调的基因(^*p＜＜0.001，^**p＜0.05，^***p＜0.1)。TR是翻译阻遏。误差棒表示s.e.m.。

图16显示Oct4功能在1-至2-细胞期的模型。图A显示绝对(ΔC_T)(红色)大于其s.e.m.(蓝色)的基因，基于递增的s.e.m.顺时针地排列(对数标尺)。图B显示Oct4经由转录和转录后机制对各模块提议的调节。

图17显示活产分析的数据来源概述。框中的数目表示在Stanford IVF中心经2003-06进行的新周期的数目。未包括的周期是关于：代孕母亲(gestational carriers)、冷冻ET或冷藏胚胎移植(利用冷冻胚胎的周期，不论周期是在Stanford还是外面进行)、供体卵母细胞(非自身卵母细胞)、接受者周期和其中不注射促性腺素的周期。因为重复的条目和未知结果，从分析排除9个周期。取决于患者为了新的IVF周期返回的次数，分析的周期进一步分为周期1、2、3或超过。

图18显示活产结果的概述。不同的框代表C1(第一-IVF周期)、C2(第二-IVF周期)和C3(第三-IVF周期)。每个框显示具有活产(LB+)或无活产(LB-)结果的周期数目、分析的周期总数目(N)的百分比以及退出并没有返回的患者数目。

图19是显示胚胎关于发育阶段的分布的图。来自所有三个周期的2969个新的、非供体IVF病例根据在体外培养第3天的细胞数目的分布。每个胚胎的细胞数目和具有8个细胞的胚胎的最大数目(～40％)在周期C1(无填充图案)、C2(水平填充图案)和C3(垂直填充图案)之间相似。

图20显示预测模型和它们与典型IVF周期的时间关系。IVF周期包括利用口服避孕药(OCP)下调内源促性腺素和月经周期、定期FSH注射、和以带有或不带有血清雌二醇的超声波监控周期、然后是hCG注射以模拟内源LH波动、卵母细胞采集、由IVF或ICSI受精、体外胚胎培养、胚胎移植、和低温储存多余胚胎。三个黑色星形代表患者可获取关于进一步治疗选择和是否继续治疗的知情决定的时间点。Pre-IVF模型继续直到治疗开始日。Pre-OR(卵母细胞采集)模型继续直到hCG注射。Post-IVF模型包括直到胚胎移植的所有变量。

图21A、21B和21C显示三个分析组的树模型：Pre-IVF(21A)、Pre-OR(21B)和Post-IVF(21C)。饼图显示活产(LB)在分析的周期总数目(N)中的百分比。最终人群标为群1(Pop 1)等等，并标出其活产率。

图22显示2007年数据集的纳入和排除标准。

图23显示Pre-IVF、Pre-OR和Post-IVF模型鉴定具有不同活产率的不同群。

图24A、24B和24C显示Pre-IVF(图23A)、Pre-OR-(图23B)、Post-IVF模型和基于年龄的对照模型之间活产率的比较。

图25显示Post-IVF模型C1群分配预测在C2中的不同活产率和在随后周期(C2和C3)中的累计活产率。

图26显示在1-细胞期进行的基因芯片实验结果。

图27显示在4-细胞期进行的基因芯片实验结果。

图28显示在8-细胞期进行的基因芯片实验结果。

图29显示两个基因芯片实验的关联，显示一组基因在不同细胞期的表达。

图30显示两个基因芯片实验的关联，显示一组基因在不同细胞期的表达。

在描述本发明的实施方案之前，要理解的是，本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这些当然可以变化。还需要理解的是，在本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，不意为限制性的，因为本发明的范围将仅由附随的权利要求书限定。

当提供数值的范围时，要理解的是，除非上下文明确地相反说明，否则在所述范围的上限和下限之间的每个中间值，直到所述下限的单位的十分之一，也具体地公开了。在提及的范围内任何提及的值或中间值与在提及的范围内任何其它提及的值或中间值之间的每个更小的范围包含于本发明的范围内。这些更小的范围的上限和下限可以独立地包括或排除在所述更小的范围之内，且上限和下限的之一、无一或二者包括在所述更小的范围之内时的范围也包含于本发明的范围内，并受在所提及的范围内特别排除任何值的限制。当提及的范围包括两个限值之一或二者时，排除了所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明的范围之内。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似于或等同于在本文描述的任何方法和材料可以用于本发明的实践或试验，但现在描述了一些可能的和优选的方法和材料。在本文中提及的所有出版物在此通过引用并入本发明，来公开和描述与所述出版物所引用的相关的方法和/或材料。应理解的是，当本发明公开与并入的出版物的任何公开存在矛盾时，以本发明公开为准。

必须注意的是，在本文使用的和在附随的权利要求书中，除非上下文中有明确的相反说明，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括了复数的指称对象。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，提及“该化合物”包括提及一种或多种化合物和本领域技术人员已知的其等价物，等等。

进一步注意，权利要求可以撰写成排除任何任选的元素。因而，这一声明旨在充当先行的基础，用于与权利要求元素的叙述一起来使用排他性术语如“单独地”、“仅”等等，或用于“否定的”限制。

本文讨论的出版物仅为了其在本申请提交日之前的公开而被提供。此处不应解释为一种承认，即承认本发明没有权利凭借在先发明而先于上述出版物。进一步的，所提供的出版物的日期可能不同于实际的出版日期，其可能需要被独立地确认。

定义

术语“受治疗者”、“个体”和“患者”在本文可互换地使用，指被评价治疗和/或正被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人类，诸如女人。因此，术语“受治疗者”、“个体”和“患者”涵盖需要评价临床不育的个体，包括已经经历体外受精周期或正候选体外受精周期的个体。

本文所用的术语“相关”或“与...相关”和类似术语是指两次事件的实例之间统计相联，其中事件包括数目、数据集等等。例如，当事件包括数目时，正相关(在本文还称为“直接相关”)表示当一个增加时，另一个也增加。负相关(在本文还称为“逆相关”)表示当一个增加时，另一个减少。

“生物样品”涵盖从个体获得的多种样品类型。该定义涵盖血液和生物来源的其它液体样品、实体组织样品诸如活检样本或来源于其的组织培养物或细胞及其后代。该定义还包括在取得后已通过任何方式操纵的样品，诸如通过试剂处理；洗涤；或富集某些细胞群诸如癌细胞。该定义还包括已经富集特定类型分子如核酸、多肽等等的样品。术语“生物样品”涵盖临床样品，并还包括通过外科切除获得的组织、由活检获得的组织、培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、组织样品、器官、骨髓、血液、血浆、血清等等。“生物样品”包括从患者子宫获得的样品，包括胚胎培养物。

术语“基因产物”和“表达产物”在本文提及基因时可互换地使用，是指基因的RNA转录产物(转录物)，包括mRNA和这种RNA转录物的多肽翻译产物，无论所述产物是否在翻译后被修饰。术语“基因产物”和“表达产物”在本文提及RNA，特别是mRNA时可互换地使用，是指这种RNA的多肽翻译产物，无论所述产物是否在翻译后被修饰。基因产物可以是，例如，未剪接的RNA、mRNA、剪接变体mRNA、多肽、翻译后修饰多肽、剪接变体多肽等等。

本文所用的术语“标准化的表达水平”是指响应指示基因相对于参考基因的表达产物水平的表达水平。

本文所用的术语“标记”和“检测标记”是指能够被检测的分子，其中所述分子包括但不限于，放射性同位素、荧光剂(荧光团)、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(如，生物素、亲和素、链霉亲和素或半抗原)、嵌入染料及类似物。术语“荧光剂”或“荧光团”是指能够在可检测的范围表现荧光的物质或其部分。

本文所用的术语“靶核酸区”或“靶核酸”是指带有将被检测(如，在包括核酸杂交和/或扩增的方法中)的“靶序列”的核酸。靶核酸可以是单链或双链的，可以包括或不包括靶序列以外的其它序列(如，靶核酸可以包括或不包括上游的核酸序列或5’侧翼序列，可以包括或不包括下游或3’侧翼序列。当检测是通过扩增时，靶序列以外的这些其它序列可与靶序列一起扩增或不与靶序列一起扩增。

本文所用的术语“引物”或“寡核苷酸引物”是指当放置在其中诱导引物延伸产物合成的条件下时，作用为起始互补核酸链合成的寡核苷酸，如，在存在核苷酸和聚合诱导剂诸如DNA或RNA聚合酶并在合适温度、pH、金属离子浓度和盐浓度时。引物通常为与其在合成引物延伸产物中的用途相适合的长度，长度可以在约8个核苷酸至约100个核苷酸(nt)的范围，诸如约10nt至约75nt、约15nt至约60nt、约15nt至约40nt、约18nt至约30nt、约20nt至约40nt、约21nt至约50nt、约22nt至约45nt、约25nt至约40nt、等等，如，长度在约18nt至约40nt、约20nt至约35nt、约21至约30nt的范围(包含性)、和在所提出范围之间的任何长度。引物可以在长约10-50个核苷酸的范围，诸如约15-45、约18-40、约20-30、约21-25nt、等等、和在所提出范围之间的任何长度。在一些实施方案中，引物长度不超过约10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸。在这样的上下文中，术语“约”可以解释为表示从5’或3’任一端或从两端多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

在许多实施方案中，为了扩增的最大效率，引物是单链的，但可选地可以是双链的。如果是双链，在许多实施方案中，在被用于制备延伸产物之前，引物首先被处理以分开其各链。这一变性步骤通常通过加热实现，但可选地可以利用碱，随后中和来实现。从而，“引物”与模板互补，通过氢键合或杂交与模板复合，获得引物/模板复合体以起始由聚合酶的合成，通过在其3’端共价加入碱基来延伸。

本文所用的“引物对”是指具有适于基于核酸扩增靶核酸的核酸序列的第一引物和第二引物。这样的引物对通常包括具有与靶核酸第一部分相同或相似的序列的第一引物、和具有与靶核酸第二部分互补的序列的第二引物，以提供靶核酸或其片段的扩增。除非另外特别指明，否则本文提及“第一”和“第二”引物是随机的。例如，第一引物可设计为“正向引物”(起始从靶核酸5’端的核酸合成)或为“反向引物”(起始从正向引物起始的合成产生的延伸产物5’端的核酸合成)。类似地，第二引物可设计为正向引物或反向引物。

本文所用的术语“探针”或“寡核苷酸探针”在本文可交换使用，是指包括如上定义的多核苷酸的结构，含有与靶核酸分析物(如，核酸扩增产物)中存在的核酸序列互补的核酸序列。探针的多核苷酸区域可包括DNA、和/或RNA、和/或合成的核苷酸类似物。探针的长度通常与其在特异性检测靶核酸的靶序列的所有或部分中的用途相适应，在许多实施方案中，长度在约8nt至约100nt的范围，诸如约8至约75nt，约10至约74nt，约12至约72nt，约15至约60nt，约15至约40nt，约18至约30nt，约20至约40nt，约21至约50nt，约22至约45nt，约25至约40nt，等等，如，长度在约18-40nt，约20-35nt或约21-30nt的范围，和所指范围之间的任何长度。在一些实施方案中，探针长在约10-50个核苷酸的范围，诸如约15-45，约18-40，约20-30，约21-28，约22-25，等等，和所指范围之间的任何长度。在一些实施方案中，引物长度不超过约10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸。在这一上下文中，术语“约”可解释为表示在5’或3’的任一端或两端多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

当表示核酸杂交于所指核酸序列时，杂交是在严格条件下。严格杂交条件的一个实例是在50℃或更高温度和0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)杂交。严格杂交条件的另一实例是在42℃在以下溶液中过夜培养：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml变性的、修剪的鲑精DNA，随后在约65℃在0.1×SSC中洗涤滤器。严格杂交条件是至少与上述代表性条件同样严格的杂交条件，其中如果条件与以上具体严格条件至少约80％地同样严格，如，至少约90％地同样严格，则认为条件是至少同样严格的。

发明详述

如上所述，提供了用于便于评价临床不育的方法和基于计算机的系统。可实施所述方法和系统以，例如，便于为体外受精治疗周期评价受治疗者，包括确定活产事件概率。可实施所述方法和系统以，例如，便于确定胚胎的成功植入、选择将移植的胚胎的最佳数目、确定在不成功的治疗周期之后随后体外受精治疗周期的成功。

在某些实施方案中，所述方法包括从女性受治疗者获得信息项以提供所述女性受治疗者的谱，其中每个信息项与预选的患者变量有关，利用基于所述预选的患者变量的算法比较所述女性受治疗者的所述谱与已知指示对体外受精程序的响应度的已知谱图的文库，其中所述比较提供为体外受精程序对所述女性受治疗者的评价。在某些实施方案中，所述体外受精程序是所述女性受治疗者的至少第二次体外受精程序。

各信息项可由女性受治疗者基于书面或电子的调查问卷提供，或可在医学评价期间或与医学评价同时由医疗从业者诸如医生、护士、技术员等等请求、抄写或以其它方式记录，医学评价可任选地伴有对经历第一或随后的体外受精周期的确定。

关于预选的患者变量的示例信息项包括但不限于：患者特征，诸如年龄、此前的不育史、临床诊断；临床治疗信息，诸如药物类型、刺激天数、卵母细胞数目、等等；常规胚胎形态学数据，诸如胚胎数目、发育阶段、等级等等。在一些实施方案中，信息包括年龄、胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平和移植的8细胞胚胎数。

在某些实施方案中，所述体外受精程序在所述体外受精程序之后提供活产事件。在所述实施方案中，方法至少部分基于女性受治疗者的信息项，提供第一或随后的体外受精周期导致的活产事件概率。

在一些实施方案中，所述女性受治疗者是体外受精前(pre-IVF)程序患者。在某些实施方案中，有关预选的患者变量、用于为pre-IVF程序患者确定活产事件概率的信息项可包括年龄、卵巢储备下降(diminished ovarian reserve)、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、多囊卵巢病、季节、原因不明的女性不育、自然流产次数、年份、女性不育的其它原因、此前妊娠次数、此前足月分娩次数、子宫内膜异位症、输卵管病、输卵管结扎、男性不育症、子宫肌瘤、输卵管积水和男性不育症原因。

在一些实施方案中，所述女性受治疗者是外科手术前(pre-OR)程序患者(pre-OR在本文还称为卵母细胞采集前)。在某些实施方案中，有关预选的患者变量、用于为pre-OR程序患者确定活产事件概率的信息项可包括年龄、子宫内膜厚度、卵母细胞总数、施用促性腺素的总量、洗涤后活动精子总数、洗涤前活动精子总数、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、采精、配偶年龄、季节、自然流产次数、原因不明的女性不育、此前足月分娩次数、年份、此前妊娠次数、女性不育的其它原因、子宫内膜异位症、男性不育症、输卵管结扎、多囊卵巢病、输卵管病、来自供者的精子、输卵管积水、子宫肌瘤和男性不育症原因。

在一些实施方案中，所述女性受治疗者是体外受精后(post-IVF)程序患者。在某些实施方案中，有关预选的患者变量、用于为pre-IVF程序患者确定活产事件概率的信息项可包括胚泡发育速度、胚胎总数、施用促性腺素的总量、子宫内膜厚度、短方案(flare protocol)、每个胚胎的平均细胞数、所用导管类型、移植的8细胞胚胎百分比、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、洗涤前活动精子数、洗涤后活动精子数、胚胎平均等级、胚胎移植日、季节、自然流产次数、此前足月分娩次数、口服避孕药、采精、未受精卵百分比、在4细胞期停滞的胚胎数、移植后第3天的紧密化、正常受精百分比、异常受精卵百分比、正常和成熟卵母细胞百分比、此前妊娠次数、年份、多囊卵巢病、原因不明的女性不育、输卵管病、仅男性不育症、男性不育症原因、子宫内膜异位症、女性不育的其它原因、子宫肌瘤、输卵管结扎、来自供者的精子、输卵管积水、ICSI表现或辅助孵化。

另外的参数实例在实施例部分提供，包括例如表13和表15。

在某些实施方案中，所述方法包括获得有关至少两个预选的患者变量或更多的信息项。如此，在其它实施方案中，方法包括获得关于3个或更多个预选的患者变量的信息项，包括4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、15个或更多个、17个或更多个、20个或更多个、等等。

在某些实施方案中，所述方法包括对每个预选的患者变量分配相对于其它预选的患者变量的加权相对重要性。例如，在Pre-IVF模型受治疗者的分析中，对年龄和卵巢储备下降的预选的患者变量给予比其它预选的患者变量更高的相对重要性值，其它预选的患者变量诸如例如，体重指数、输卵管病(tubular disease)和子宫内膜异位症。在所述实施方案中，每个预选的患者变量的相对重要性总和将等于100。

在另一实施方案中，在Pre-OR模型受治疗者的分析中，对促性腺素总量、子宫内膜厚度和年龄的预选的患者变量给予比其它预选的患者变量更高的相对重要性值，其它预选的患者变量诸如例如，此前妊娠次数、输卵管结扎和自然流产次数。在所述实施方案中，每个预选的患者变量的相对重要性总和将等于100。

在另一实施方案中，在Post-IVF模型受治疗者的分析中，对胚泡发育速度、胚胎总数、施用促性腺素的总量和子宫内膜厚度的预选的患者变量给予比其它预选的患者变量更高的相对重要性值，其它预选的患者变量诸如例如，体重指数、洗涤前活动精子数、洗涤后活动精子数、胚胎平均等级和胚胎移植日。在所述实施方案中，每个预选的患者变量的相对重要性总和将等于100。

在一些实施方案中，所述比较包括应用判定规则。在一些实施方案中，所述数据分析算法包括使用分类树。在其它实施方案中，所述数据分析算法是非参数的，诸如使用Wilcoxon符号秩检验(Wilcoxon Signed Rank Test)。在某些实施方案中，所述数据分析算法检测特征值分布的差异。在一些实施方案中，所述数据分析算法包括使用多重累计回归树。在一些实施方案中，所述数据分析算法是逻辑回归。

在进一步实施方案中，方法包括评价来自女性受治疗者的停滞胚胎的基因表达谱。例如，检测已经停滞的胚胎，例如在体外受精后第3天具有少于约5个细胞的胚胎对于胚胎发育关键的一组基因的相对表达水平。然后将基因表达谱与对照基因表达谱比较。

其标准化的表达水平与不育或体外受精周期的成功或失败可能性相关(正相关或负相关)的任何基因适于用于本发明方法。示例性的基因包括但不限于，Oct4、Eif3c、Papola、Piwil2、Eif3b、Eif4b、Rbm3、Cpsf4和发现当敲低Oct4或敲低编码多能调节子的另一基因(如Sall4)时被下调或上调的其它基因。其它示例性基因包括列在附录A-D中表8A、8B、9A和9B、以及表12中的基因。这些基因产物在本文称为“不育指示基因产物”；编码响应指示基因产物的基因称为“不育指示基因”。可确定一种或多种这些不育指示基因的标准化的表达水平来评价女性患者的体外受精治疗周期。不育指示基因如以下实施例中详述地鉴定。适于用在分析中的其它基因可利用本文在实施例部分描述的方法鉴定。

在进行所述评价时，检测包含不育指示基因的样品的不育指示基因产物水平。当被检测的基因产物是核酸时，核酸样品(如，包含核酸的样品)从胚胎细胞获得。当被检测的基因产物是蛋白时，多肽样品(如，包含多肽的样品)从胚胎获得。

核酸(包括mRNA)和/或多肽不育指示基因产物可利用标准方法从包括卵母细胞的胚胎获得，诸如停滞的胚胎或卵母细胞(如，在受精后约第3天具有少于约8个细胞的胚胎或卵母细胞，包括约7个细胞、约6个细胞、约5个细胞、约4个细胞、约3个细胞、等等)。核酸和/或多肽基因产物的水平可利用多种已知方法的任一种测量，包括在以下实施例中描述的方法。

响应指示基因的表达水平相对于参考基因表达产物的水平标准化。评价不育可能性通过比较标准化的表达水平与胚胎细胞中该基因产物的标准化的表达水平的一定范围的值来进行。

可进行一种或多种不育指示基因的标准化的表达水平来评价患者将正或负响应体外受精治疗周期的可能性。可进行单个不育指示基因的标准化的表达水平来评价患者将正或负响应体外受精治疗周期的可能性。此外，可进行两种或多种不育指示基因的标准化的表达水平来评价患者将正或负响应体外受精治疗周期的可能性。分析可以更严格，如，移植到女性患者的胚胎的最佳数目以使活产结果的可能性最大同时使多胎妊娠的可能性最小。分析可以较不严格，如，患者将表现对体外受精治疗周期有益响应的可能性。

在一些实施方案中，分析包括确定移植胚胎的最佳数目以使受治疗者多胎妊娠事件的概率最小。在所述实施方案中，首先鉴定受治疗者为具有多胎妊娠事件高概率的受治疗者。然后分析受治疗者以确定移植胚胎的最佳数目以在体外受精周期后提供单活产事件。

应理解的是，评价患者将正或负响应体外受精治疗周期的可能性可通过确定两种或更多不育指示基因(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不育指示基因)或一组或多组不育指示基因的任意组合的标准化的表达水平来进行。评价可包括分析不育指示基因组合的表达水平，并确定不育指示基因组合的标准化的表达水平，其中不育指示基因产物可包括与体外受精治疗周期正相关的基因产物和与体外受精治疗周期负相关的基因产物。例如，可确定与体外受精治疗周期正相关的第一基因的标准化的水平，和与体外受精治疗周期负相关的第二基因的标准化的水平。

确定基因产物的标准化水平

如上所述，不育指示基因的表达水平被标准化，从而提供标准化值。不育指示基因的表达水平相对于参考基因表达产物的水平标准化。

例如，不育指示基因的表达水平可相对于两种或更多参考基因的基因产物的平均水平标准化。例如，不育指示基因的表达水平可相对于所有检验的基因或检验的基因的亚组的基因产物的平均水平标准化，其中检验的基因的亚组可包括3、4、5、6、7、8、9或更多种检验的基因。

适合的参考基因包括但不限于，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(参见如，GenBank登录号NM_002046；磷酸甘油酸酯激酶1(参见如，GenBank登录号NM_000291)；乳酸脱氢酶A(参见如，GenBank登录号NM_005566)；核糖体蛋白L32(参见如，GenBank登录号NM_000994)；核糖体蛋白S18(参见如，GenBank登录号NM_022551)；微管蛋白β多肽(TUBB)(参见如，GenBank登录号NM_001069)；和β肌动蛋白(参见如，GenBank登录号NM_001101)。参见如，Eisenberg和Levanon(2003)Trends in Genetics 19：362，另外的合适参考基因的列表。

RT-PCR测量的RNA转录物水平是指循环阈值(Ct)。Ct越低，样品中存在mRNA的量越大。RNA转录物在样品中的表达值是标准化的，如，通过首先确定指定参考基因在样品中的Ct平均表达值(Ct_参 _考)。然后计算基因的标准化的表达值(Ct_基因)为Ct_基因-Ct Ct_参考。任选地，可调整所有基因的标准化的表达值，如，以使所有调整后的标准化的Ct具有＞0的值。

确定有益响应的概率

对个体患者确定的不育指示基因产物的标准化水平可与在已知临床结果的患者群体中确定的不育指示基因标准化的表达水平值比较，以确定个体患者有益响应于体外受精治疗周期的概率。可使用与概率相关的标准化的表达水平值(如，表示为Ct)。例如，可图解地比较响应指示基因产物的标准化的水平，以确定有益响应于体外受精治疗周期的概率。

可进行本文关于评价响应可能性的所述方法描述的分析和确定而不需要评价响应指示基因水平随时间的任何变化。

分类树分析

分析这一数据的一种方法是使用搜寻大数据集中的模式和关系的分类树算法。“分类树”是一种利用一组问题为体外受精程序评价女性受治疗者的递归分割，这些问题设计为将患者准确地归为一类。每个问题询问患者的情况是否满足一个给定预测值，每个回答被用来指导用户沿着分类树向下，直到可确定患者落入的类。本文所用的“预测值”是特征的值的范围，所述特征诸如例如，年龄、胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平和移植的8细胞胚胎数。

多重累计回归树

利用多重累计回归树(MART)的自动、灵活的建模技术也可用于将特征组分类为属于两个群体之一。MART模型利用起始补偿，这指明施加到所有预测值的常数，然后是一系列回归树。其拟合由每个树中决定点数目、待拟合的树数目、和指明具体的树如何根本地影响MART模型的“粒度常数”指明。对于每次迭代，拟合回归树以估计拟合标准的最速下降的方向。在该方向采取具有由粒度常数指明的长度的步长。随后MART模型由起始补偿加上回归树提供的步长构成。重新计算观察值与预测值之间的差，再次继续该循环，导致预测值的渐进性细化。该过程继续预定数目的循环，或直到触发了一些终止规则。

每个树中分叉数目是尤其有意义的拟合参数。如果每个树仅具有一个分叉，模型看起来只有一个特征，不具有组合两个预测值的能力。如果每个树具有两个分叉，模型可容纳特征间双向的相互作用。如果有三个树，模型可容纳三向的相互作用，等等。

预测类状态时的特征组的值对具有特征和已知类状态的数据集确定。MART提供单个特征对分类判定规则的贡献或重要性的量度。具体地，可测量单个特征对在给定树分叉选择时的判定规则贡献的程度以提供特征在其确定最终判定规则中的重要性的分级。对同一数据集重复MART分析可能产生对特征略微不同的分级，尤其是关于在确立判定规则时较不重要的那些特征。因此，可用于本发明的预测特征和其相应的生物标记可能与本文所列的那些略微不同。

MART技术的一种示例性实现见于R统计编程环境的模块或“包”(参见Venables等人，Modern Applied Statistics with S，第4版.(Springer，2002)中；www.r-project.org)。这一文献里报道的结果利用R 1.7.0和1.7.1版本计算。Dr.Greg Ridgeway编写的实现MART的模块称为“gbm”，也可下载获得(参见www.r-project.org)。MART算法服从十倍交叉验证。粒度参数设为0.05，gbm包的内部终止规则是基于在每个标出的迭代排除20％的数据情形。相互作用程度设为一，所以认为各特征之间没有相互作用。gbm包基于百分比估计各特征的相对重要性，生物标记谱的所有特征累加等于100％。一起占总重要性的至少90％的具有最高重要性的特征，报告为可能具有预测值。注意，拟合每个MART模型时的终止规则对模型拟合和特征选择贡献随机分量。因此，基于同样数据运行的多个MART建模可能选择略微或甚至可能完全不同的特征组。这样的不同组传递相同的预测信息；因此，所有组在本发明中有用。拟合MART模型时，预计足够的次数产生谱中所有可能的预测特征组。因此，公开的预测值组仅仅是可用于将个体分类为群体的特征组的代表。

Wilcoxon符号秩检验分析

在另一方法中，非参数的检验诸如Wilcoxon符号秩检验可用于鉴定感兴趣的单独生物标记。对生物标记谱中的特征指定“p-值”，这表示生物标记可用于将个体分类为属于具体参考群体的确定性程度。通常，具有预测值的p-值低于约0.05。具有低p-值的生物标记本身可用于分类个体。可选地，两个或更多生物标记的组合可用于分类个体，其中基于生物标记的相对p-值选择组合。一般，对于给定信息项组合，具有较低p-值的生物标记是优选的。至少三个、四个、五个、六个、10、20或30或更多生物标记的组合也可用于以这种方式分类个体。技术人员将理解，取决于参考群体的大小，任何给定生物标记的相对p-值可能变化。

分析结果报告

如上讨论的，为了体外受精程序评价女性受治疗者，包括确定活产事件概率，通过以下进行：获得来自女性受治疗者的信息项并利用基于所述预选的患者变量的算法比较来自女性受治疗者的信息项与已知指示对体外受精程序的响应度的已知谱图的文库，任选地评价一种或多种不育性响应基因的标准化的表达水平。在一些实施方案中，患者的评价在报告中提供。因此，在一些实施方案中，方法进一步包括准备或生成包括关于患者体外受精程序成功可能性的信息的报告的步骤。例如，所述方法可进一步包括生成或输出提供对患者评价结果的报告的步骤，该报告可以电子介质(如，计算机显示器上的电子展示)或以有形介质形式(如，印在纸或其它有形介质上的报告)提供。

包括关于对患者评价的信息的报告提供给用户。评价可包括，例如，确定胚胎的成功植入、选择将移植的胚胎的最佳数目、和确定在不成功的治疗周期之后随后体外受精治疗周期的成功。

报告生成者还可进行样品收集、样品处理和数据生成的一种或多种，如，报告生成者还可进行以下一种或多种：a)样品收集；b)样品处理；c)测量不育指示基因产物水平；d)测量参考基因产物水平；和e)确定不育指示基因产物的标准化水平。可选地，报告生成者以外的机构可进行样品收集、样品处理和数据生成的一种或多种。

应注意的是，为了清楚起见，术语“用户”与“客户”可互换使用，是指向其传送报告的个人或机构，可以是进行以下一种或多种的同一个人或机构：a)收集样品；b)处理样品；c)提供样品或处理过的样品；和d)生成用于可能性评价的数据(如，响应指示基因产物水平；参考基因产物水平；响应指示基因产物的标准化的水平)。在一些情况，提供样品收集和/或样品处理和/或数据生成的个人或机构与接收结果和/或报告的人可以是不同的人，但在本文都称为“用户”或“客户”以避免混淆。在某些实施方案中，如，当方法完全在单个计算机上执行时，用户或客户提供数据输入和数据输出的评论。“用户”可以是保健专业人员(如，临床医师、实验室技术员、内科医生(如，生殖内分泌专家)等等)。

在用户仅执行一部分方法的实施方案中，在根据本发明方法计算机化数据处理后，评论数据输出(如，在发布以提供完整报告之前的结果、完整、或评论“不完整”报告、提供人工干预和完成解释性报告)的个体在本文称为“评论者”。评论者可以位于用户远端(如，在设在用户位于的医疗机构以外的机构)。

报告

本文所述的“报告”是电子或有形文件，包括提供关于所述可能性评价和其结果的目标信息的报告组成部分。所述报告至少包括对体外受精治疗周期的评价，如，便于确定胚胎的成功植入、选择将移植的胚胎的最佳数目、和确定在不成功的治疗周期之后随后体外受精治疗周期的成功。所述报告可完全或部分地电子生成。所述报告可进一步包括以下一种或多种：1)关于测试设备的信息；2)服务提供机构信息；3)患者数据；4)样品数据；5)解释性报告，其可包含包括以下的多种信息：a)适应症；b)测试数据，其中测试数据可任选地包括一种或多种不育指示基因产物的标准化的水平；和6)其它特征。

当适用政府法规或其它限制时(如，保健、治疗失当或责任保险的要求)，完全或部分电子生成的所有结果都在对用户发布之前经受质量控制程序。

测试设备信息

报告可包括关于测试设备的信息，该信息与在其中进行样品收集和/或数据生成的医院、诊所或实验室相关。数据生成可包括以下一种或多种：a)测量基因产物(如，不育指示基因产物、参考基因产物)水平；b)确定不育指示基因产物的标准化水平。这一信息可包括关于以下的一种或多种详细资料：例如，测试设备的名称和位置、进行检验和/或录入输入数据的实验室技术员的身份、进行和/或分析检验的日期和时间、存储样品和/或结果数据的位置、检验中使用的试剂(如，试剂盒等等)的批号、等等。带有这一信息的报告区段一般可利用用户提供的信息来填充。

服务提供机构信息

报告可包括关于服务提供机构的信息，服务提供机构可以位于用户位于的医疗机构之外或在医疗机构内。这种信息的实例可包括服务提供机构的名称和位置、评论者名称、和当需要或期望时，进行样品收集和/或数据生成的个体名称。带有这一信息的报告区段一般可利用用户输入的信息来填充，所述信息可选自预先写好的选项(如，使用下拉菜单)。报告中的其它服务提供机构信息可包括关于结果和/或关于解释性报告的技术资料的联络信息。

患者数据

患者数据可包括患者医疗史(可包括，如，关于之前或当前体外受精治疗周期的数据)、个人史；患者管理数据(即，对可能性评价并非必要的数据)，诸如确认患者的信息(如，名字、患者生日(DOB)、性别、邮寄地址和/或居住地址、病历号(MRN)、医疗机构中的房间号和/或床位号)、保险信息等等)、患者的医生或提供响应可能性评价的其它保健专业人员的名字、和在不同于提供评价的医生时，负责护理患者的护理医生的名字(如，主要护理医师)。带有这一信息的报告区段一般可利用用户输入的数据来填充。

典型的信息项包括但不限于：患者特征，诸如年龄、此前的不育史、临床诊断；临床治疗信息，诸如药物类型、刺激天数、卵母细胞数目、等等；常规胚胎形态学数据，诸如胚胎数目、发育阶段、等级等等。在一些实施方案中，信息包括年龄、胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平、移植的8细胞胚胎数、年龄、卵巢储备下降、子宫内膜厚度、胚泡比率、胚胎总数、卵母细胞总数、施用促性腺素的总量和活动精子总数。

样品数据

样品数据可提供关于可能性评价中分析的胚胎的信息，诸如受精后导致停滞的天数、和收集的日期和时间。带有这一信息的报告区段一般可利用用户输入的数据来填充，其中一些数据可以作为预先写好的选项提供(如，使用下拉菜单)。

解释性报告

报告的解释性报告部分包括如本文所述地处理数据后生成的信息。解释性报告可包括为了体外受精程序对女性受治疗者的评价。解释性报告可包括，例如，利用基于所述预选的患者变量的算法比较女性受治疗者的谱与已知指示对体外受精程序的响应度的已知谱图的文库的分析结果，和任选地，不育指示基因的标准化水平(如，“不育指示基因的标准化水平”)的结果；解释；和任选地，建议。

报告的解释部分可包括建议。其中结果指示：确定胚胎的成功植入、选择将移植的胚胎的最佳数目、和确定在不成功的治疗周期之后随后体外受精治疗周期的成功。

容易理解的是，报告可包括以上所有或一些组成部分，条件是报告一般至少包括足以提供用户要求的分析(如，可能性评价)的组成部分。

其它特征

还容易理解的是，报告可包括其它组成部分或修改的组成部分。例如，当是电子形式时，报告可包含指向内部或外部数据库的超链接，其提供关于所选的报告组成部分更详细的信息。例如，报告的患者数据组成部分可包括患者电子记录的超链接或访问所述患者记录的网址，该患者记录保留在秘密数据库中。后一实施方案在住院系统或诊所环境可能是感兴趣的。

基于计算机的系统和方法

本文描述的方法和系统可以多种方式实现。在特别感兴趣的一个实施方案中，方法包括使用通信设施例如因特网。本发明的多种实施方案在以下讨论。还应理解的是，本发明可以多种形式的硬件、软件、固件、处理器或其组合来实现。本文描述的方法和系统可以作为硬件和软件的组合实现。软件可作为应用程序有形地在程序存储装置上体现而实现，或软件的不同部分在用户的计算环境中实现(如，作为小应用程序)和在评论者的计算环境实现，其中评论者可以位于连接的远端位置(如，在服务提供机构)。

计算装置的不同部件，诸如输入装置，可以经由有线连接或无线连接与系统的其它部件关联，所述无线连接包括例如，无线LAN连接、蓝牙连接协议、ZigBee连接协议、射频连接协议或手机连接协议，包括码分多址(CDMA)或经由全球移动通信系统(GSM)。

例如，在用户输入数据期间或之后，数据处理部分可在用户端计算环境中进行。例如，可以对用户端计算环境编程以提供规定的测试码来表示可能性“分数”，其中分数作为处理或部分处理的对评论者的计算环境的响应以测试码形式传送，随后执行一种或多种算法以提供结果和/或在评论者的计算环境中生成报告。

用于执行本文所述算法的应用程序可以上传到包含任何合适结构的机器，并被其执行。一般，机器包括带有硬件诸如一个或多个中央处理器(CPU)、随机存取存储器(RAM)和输入/输出(I/O)界面的计算机平台。计算机平台还包括操作系统和微指令码。本文描述的各种处理和功能可以是由操作系统执行的微指令码的部分或应用程序的部分(或其组合)。此外，各种其它外围设备可以连接到计算机平台，所述外围设备诸如另外的数据存储装置和打印装置。

作为计算机系统，系统一般包括处理器单元。处理器单元运转以接收信息，这一般包括所述信息数据，诸如年龄、胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平、移植的8细胞胚胎数、年龄、卵巢储备下降、子宫内膜厚度、胚泡比率、胚胎总数、卵母细胞总数、施用促性腺素的总量和活动精子总数。接收的这一信息可以至少临时存储在数据库中，分析数据以生成如上所述的报告。

输入和输出数据的部分或所有也可电子传送；某些输出数据(如，报告)可电子传送或电话传送(如，通过传真，如，利用装置诸如传真回复)。示例性输出接收装置可包括展示部件、打印机、传真装置等等。电子形式的传送和/或展示可包括电子邮件、交互电视等等。在特别感兴趣的实施方案中，输入数据的所有或一部分和/或输出数据(如，通常至少最终报告)的所有或一部分保持在网络服务器上用于用典型浏览器获取，优选地机密存取。数据可以由保健专业人员如所需地获取或发送。输入和输出数据，包括最终报告的所有或一部分，可用于填充患者的病历，病历可在医疗机构的机密数据库中存在。

用在本文所述方法中的系统通常包括至少一个计算机处理器(如，其中方法在单个位置完整进行)或至少两个联网的计算机处理器(如，其中数据将被用户(在本文还称为“客户”)输入并传送到远处位置的第二计算机处理器来分析，其中第一和第二计算机处理器由网络连接，如，经由内部网或因特网)。系统还可包括用于输入的用户组件；和用于评论数据、生成报告和人工干预的评论者组件。系统的其它组件可包括服务器组件；和用于存储数据的数据库(如，如在报告组成部分的数据库中，如，解释性报告组成部分或可包括由用户的数据输入和数据输出的相关数据库(RDB)。计算机处理器可以是通常见于以下中的处理器：个人台式计算机(如，IBM、Dell、Macintosh)、便携计算机、主机、微型计算机或其它计算装置，诸如Smartphone装置，包括例如，

装置。

联网的客户/服务器体系结构可如所需地选择，可以是例如经典的两层或三层客户服务器模型。相关数据库管理系统(RDMS)作为应用服务器组件的部分或作为独立的组件(RDB器)为数据库提供界面。

在一个实施方案中，体系结构作为数据库-中心客户/服务器体系结构提供，其中客户应用通常请求来自应用服务器的服务，应用服务器对数据库(或数据库服务器)产生请求来以如所需的报告组成部分填充报告，特别是解释性报告组成部分，尤其是解释文本和警告。服务器(如，作为应用服务器的部分或独立的RDB/相关数据库器)响应于客户的请求。

输入客户组件可以是完整、独立的个人计算机，提供全范围的功率和特征来运行应用。客户组件通常在任何期望的操作系统下操作，包括通信部件(如，调制解调器或用于连接到网络的其它硬件)、一种或多种输入装置(如，键盘、鼠标、小键盘或用于传送信息或命令的其它装置)、存储部件(如，硬盘或其它计算机可读的、计算机可写的存储介质)、和展示部件(如，显示器、电视机、LCD、LED或向用户传达信息的其它展示装置)。用户经由输入装置向计算机处理器输入命令。通常，用户界面是为网络浏览器应用编写的图形用户界面(GUI)。

服务器组件可以是个人计算机、微型计算机或主机，并提供数据管理、客户之间的信息共享、网络管理和安全。应用和使用的任何数据库可以在同一或不同服务器上。

涵盖了用于客户和服务器的其它计算配置，包括在单个机器诸如主机、机器组合或其它合适的构造上处理。一般，客户机器和服务器一起工作来实现本发明的处理。

使用时，数据库通常连接于数据库服务器组件，可以是容纳数据的任何装置。例如，数据库可以是用于计算机的任何磁性或光存储装置(如，CDROM、内部硬盘、磁带机)。数据库可位于服务器组件远处(经由网络、调制解调器等等可存取)或位于服务器组件当地。

当在系统和方法中使用时，数据库可以是根据数据项之间的关系组织和存取的相关数据库。相关数据库通常包括多个表格(实体)。表格的行代表记录(关于不同条目的信息的集合)，列代表区段(记录的具体特征)。以最简单的概念，相关数据库是由至少一个共同区段彼此“相关”的数据条目的集合。

装备有计算机和打印机的其它工作站可以在服务的地方使用以输入数据，且在一些实施方案中，如果需要，生成适当的报告。计算机可具有快捷方式(如，在桌面上)以启动应用来便于如所需地开始数据录入、传送、分析、报告收到等等。

计算机可读存储介质

本发明还涵盖计算机可读存储介质(如CD-ROM、记忆钥匙、闪存卡、软盘等等)，其中存储有程序，当在计算环境中执行该程序时，提供进行如本文所述的为了体外受精程序评价受治疗者的分析方法的所有或一部分的算法的实现。当计算机可读介质包含用于进行本文所述方法的完整程序时，程序包括用于收集、分析和生成输出的程序指令，且通常包括与本文所述的用户交互、联合分析信息处理数据、并为用户生成独特的印刷或电子介质的计算机可读码装置。

当存储介质提供程序，该程序提供本文所述的方法的一部分的实现时(如，方法的用户端方面(如，数据输入、报告收到能力等等))，程序提供用户输入数据向在远处计算环境的传送(如，经由因特网、经由内部网等等)。处理或处理数据的完成在远处进行来生成报告。评论报告，且完成为了提供完整的报告任何所需的人工干预后，然后将完整报告作为电子文件或印刷文件(如，传真或邮寄的纸质报告)传送回用户。包含根据本发明的程序的存储介质可与说明书(如，对于程序安装、使用等等)一起包装，所述说明书记录在合适的基质或可以获取所述说明书的网址上。计算机可读存储介质还可与用于进行确定所述信息数据的一种或多种试剂一起提供，如，用于确定分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平和移植的8细胞胚胎数等等的材料。

试剂盒

用于本发明方法中的材料适于制备根据公知方案产生的试剂盒。因此本发明提供包含试剂的试剂盒，所述试剂可包括可用于测定本文公开的基因表达和用于评价对体外治疗周期响应可能性的基因-特异性或基因-选择性探针和/或引物。

例如，所述试剂盒可包括特异性杂交于核酸不育指示基因产物的一种或多种核酸探针。所述试剂盒可包括，如，一种或多种核酸探针，其中一种或多种探针的每种特异性杂交于不同响应指示基因产物。例如，所述试剂盒可包括特异性杂交于不育指示基因的核酸产物的探针，所述不育指示基因包括但不限于，Oct4、Eif3c、Papola、Piwil2、Eif3b、Eif4b、Rbm3和Cpsf4。另一例子是，所述试剂盒可包括一组两个或更多核酸探针，其中所述组的每个探针杂交于不同不育指示基因的核酸产物。例如，所述试剂盒可包括一组两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多核酸探针，其中所述组的每个探针杂交于一组不育指示基因的不同成员的核酸产物。

在一些情况，除了特异性杂交于不育指示基因的核酸产物的探针以外，所述试剂盒包括特异性杂交于参考基因产物的一种或多种探针。所述探针可用于确定不育指示基因的标准化表达水平。

所述试剂盒可包括一种或多种核酸引物对，其中引物对当在聚合酶链式反应中作为引物时，扩增靶核酸响应指示基因产物或核酸响应指示基因产物的靶区域。所述试剂盒可包括多个不育指示基因的引物对。

核酸引物和探针的示例性序列在本文所述的实施例中提供。本领域技术人员将容易理解，其它探针和引物序列也是可能的，且基于不育指示基因的已知核苷酸序列和/或基于参考基因的已知核苷酸序列容易获得。

除了上述探针和引物以外，所述试剂盒可包括用于从单细胞胚胎，特别是固定的石蜡包埋的组织样品提取和/或分离RNA的试剂、和/或用于制备mRNA的cDNA拷贝的试剂、和/或用于核酸扩增的试剂。示例性的试剂包括使用

48.48动态阵列系统、相当的单细胞基因表达分析平台(RT-PCR)或新兴技术诸如下一代、在单细胞水平的全转录组测序所需的试剂。

引物和探针可基于不育指示基因的已知序列设计，并易于由标准技术合成，如，经由亚磷酰胺化学反应的固相合成，公开在美国专利第4,458,066和4,415,732号，通过引用并入本文；Beaucage等人(1992)Tetrahedron48：2223-2311；和Applied Biosystems User Bulletin No.13(1 Apr.1987)。其它化学合成方法包括，例如，Narang等人，Meth.Enzymol.(1979)68：90描述的磷酸三酯方法和Brown等人，Meth.Enzymol.(1979)68：109公开的磷酸二酯方法。Poly(A)或poly(C)或其它非互补核苷酸延伸可以利用这些相同方法掺入探针。六环氧乙烷延伸可以由本领域已知方法偶合于探针。Cload等人(1991)J.Am.Chem.Soc.113：6324-6326；Levenson等人的美国专利第4,914,210号；Durand等人(1990)Nucleic Acids Res.18：6353-6359；和Horn等人(1986)Tet.Lett.27：4705-4708。

探针或引物可包括可检测标记。示例性的标记包括荧光染料，如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、Cy5、Cy3等等；和放射性标记(如，32p等等)。

用于包含在所述试剂盒中的探针和引物包括可用于各种扩增和/或检测系统的探针和引物。示例性的扩增和/或检测系统包括基于Sunrise^TM引物的系统、Molecular Beacons、Taqman^TM系统、基于Amplifluor^TM发夹引物的系统、Scorpions技术(如，包含共价连接于探针元件的PCR引物元件的双功能分子)、Light Upon Extension或基于LUX^TM的系统、以及48.48动态阵列系统。其他示例性的检测系统包括基于熔解曲线分析的那些、和利用嵌入染料诸如荧光素染料SYBR绿的那些。

试剂盒可任选地包括带有关于其在本发明方法中的使用的识别描述或标签或说明书的试剂。试剂盒可包括容器(包括适于用在方法自动实现中的微量滴定板)，其各带有用在本发明方法中的一种或多种不同试剂(通常以浓缩形式)，包括例如，预装配的微阵列、缓冲液、适当的三磷酸核苷酸(如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP；或rATP、rCTP、rGTP和UTP)、反转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、以及本发明的一种或多种探针和引物(如，连接于与RNA聚合酶反应的启动子的适当长度的poly(T)或随机引物)。

用于为体外受精治疗周期评价女性受治疗者，包括确定活产事件概率的数学算法的使用说明书也可包括在所述试剂盒中。在所述实施方案中，试剂盒将进一步包括书面或电子介质或说明书以获取如上所述的远程数据库来提供和/或获取信息，为了进行如上所述的方法，所述信息包括所述信息数据，诸如年龄、胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平、移植的8细胞胚胎数、年龄、卵巢储备下降、子宫内膜厚度、胚泡比率、胚胎总数、卵母细胞总数、施用促性腺素的总量和活动精子总数。

实施例

列出以下实施例以对本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，不意为限制发明人认为是本发明的范围，也不意为代表以下实验是进行的所有或仅有的实验。已经努力确保关于使用的数字(如量、温度等等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则部分是重量部分，分子量是重均分子量，温度是以摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

材料和方法

以下方法和材料用在以下实施例中。

数据收集、纳入和排除标准

关于从2003年1月1日至2006年12月31日在Stanford University Medical Center进行的所有IVF周期的临床诊断、IVF治疗方案和监测、胚胎学数据以及治疗结果的数据从广泛使用的生育力数据库管理系统BabySentryPro(BabySentry Ltd，Limassol，Cyprus)检索，或从医学和胚胎学记录如所需地获得。回顾性数据收集、去身份识别和分析按照斯坦福大学设施内伦理委员会批准的方案(Stanford University Institutional Review Board-approved protocol)进行。数据分析的纳入标准是新的、刺激的、非供体的卵母细胞IVF周期。

在某些实验中，排除了因为任何原因未能导致胚胎移植的周期、对超过45岁的妇女进行的周期、和对植入前遗传筛选进行的周期。

其它实验中，我们没有排除在IVF治疗已开始后因为医学或非医学原因在任何时间点取消的周期。我们排除了使用在不同IVF诊所已经受孕的胚胎的冷藏胚胎移植周期。

定义周期数目

我们按照以下方法重编号了所有IVF周期。对于每个患者，在这四年的数据集中出现的第一个新的IVF周期称为“周期1”。利用新的或从周期1受孕的冷藏胚胎的所有胚胎移植治疗的最终结果定义为周期1的结果。出现的第二个新的IVF周期定义为“周期2”，等等。我们的数据库未能容纳在别处进行的IVF周期的数据。

评价胚胎发育

IVF治疗、受精、胚胎培养、胚胎评价、低温贮藏标准和临床结果的标准临床方案如下所述。人类胚胎体外发育的正常进展特征是：在授精后16-20小时出现2个前核作为第1天受精的迹象，第0天是卵母细胞采集日。在第1天晚些时候，胚胎发育达到2-细胞期，随后分别在第2天和第3天达到4-细胞和8-细胞期。在第4天和第5天，胚胎发育特征是分别建立桑葚胚和胚泡期。所有胚胎在第3天可获得用于评价。胚胎移植日由在第3天分裂球的数目确定。一般，如果存在4个或更多8-细胞胚胎，我们将建议延长胚胎培养到第5天，此时伴有更高妊娠率，进行胚泡移植。如果存在少于四个8-细胞胚胎，胚胎移植将在第3天进行。

患者、IVF周期和胚胎参数

分析了与IVF治疗结果有关的30个变量，如表1所列，在四个主要分类下：患者特征和临床诊断、IVF周期特征、胚胎组参数、和移植胚胎的参数。分裂停滞率定义为在体外培养第3天一组中具有4或更少细胞的胚胎百分比。所有其它变量是自明的。

结果的定义

统计分析基于活产相对于无活产的二分结果进行。无活产包含所有其它结果诸如阴性血清β-hCG或阳性血清β-hCG随后是生化妊娠、自发性流产和宫外孕。

统计分析

因为一些患者在研究期间经历多于一个IVF周期，分析基于治疗周期而不是基于患者进行。统计分析基于阴性血清β-hCG确定的无活产和阳性血清β-hCG确定的妊娠的二分结果进行，并包括生化妊娠、临床妊娠、自发性流产和宫外孕。我们进行了每个变量与结果的成对逻辑回归，确定了每对连续变量之间的Pearson相关系数。

对于主要分析，由

构建提升的(boosted)分类树来识别非冗余预后变量，进一步由CART分析非冗余预后变量来识别将其限定为分类变量的阈值。是用于识别预测结果的变量的交互结构的可靠方法。

中交叉验证、参数选择提升和模型评价的使用还保留了简洁性并避免过度拟合。在构建

树时，将全数据集分为10个亚组来实现对模型评价的10倍交叉验证。同样的10倍交叉验证重复1000次以进行可靠预测率估计和识别在CART中具有最高预测率的树模型。尽管

从高度交互变量大组选择非冗余预后变量是强有力的，CART分析导致简单的算法，和用在医学文献中的更容易理解的“决定树”(Guznick等人，N Engl J Med 345：1388-1393.(2001))。因此，用CART分析由

识别的赋予预测的非冗余、预后变量以进一步限定预后的阈值。

在一些实验中，如果患者在研究期间经历多个新的IVF周期，仅分析前三个周期。我们仅基于周期1(C1)数据生成模型。C2和C3的数据仅用于检验移植前模型的周期间验证。

在这样的实验中，我们进行了每个变量与结果的成对逻辑回归，确定了每对连续变量之间的Pearson相关系数。我们基于在IVF治疗前(pre-IVF)、卵母细胞采集前(pre-OR)、和胚胎移植后(post-IVF)的三个不同时间点可获得的数据生成三个模型。我们通过利用的R-软件实现梯度提升器(GBM)根据其相对影响来分级变量，然后以Rpart软件利用最高级的变量构建回归树模型，来生成每个模型。

是用于识别预测结果的变量的交互结构的可靠方法。

树时，将全数据集分为10个亚组来实现对模型评价的10倍交叉验证。同样的10倍交叉验证重复1000次以进行可靠预测率估计和识别具有最高预测率的树模型。尽管

从高度交互变量大组选择非冗余预后变量是强有力的。

用于辅助生殖技术(ART)的治疗方案

我们分析的IVF周期大多数是对具有差的卵巢储备、严重的男性因素不育、输卵管性不育、排卵障碍或原因不明的病因学的患者进行。一般，每个治疗周期中使用三种刺激方案之一：下调黄体(长)方案用于大多数患者，微小剂量lupron(短)方案和拮抗剂方案主要用于推测具有卵巢储备下降或此前具有失败IVF周期历史的患者。长方案由以下构成：利用0.5mg醋酸亮丙瑞林下调黄体，醋酸亮丙瑞林随着刺激减少到0.25mg。在短方案中，口服避孕药2-4周后开始微小剂量lupron(0.04mg s.c.bid)。在拮抗剂方案中，当前滤泡(lead follicle)大小达到14mm时开始GnRH拮抗剂。在所有三种方案中，进行基线超声检测以证明卵巢中不存在＞1.5cm的囊肿。当满足基线标准时，开始利用重组FSH与人类更年期促性腺素的促性腺素治疗。通常利用每天给药每天共150-600IU实现刺激以使卵泡募集最大化。在周期第7天开始，然后如所示地每1-3天进行卵泡生长的超声监测。如所需地监测血清雌二醇水平。

当至少两个卵泡达到＞17mm的平均直径时施用10,000IU人类绒毛膜促性腺素的剂量。经阴道以超声引导的卵母细胞采集在hCG施用后34-36小时以标准方式进行，并伴有监测的麻醉护理。

卵母细胞受精和胚胎培养

卵母细胞在受精前成组培养在矿物油下大约125μl Sage Cleavage Medium(Cooper Surgical，Inc，Trumbull，CT)液滴(含有10％血清蛋白替代物(SPS，Irvine Scientific，Santa Ana，CA))中。预定常规IVF的卵母细胞5个1组培养，预定胞质内精子注射(ICSI)的卵母细胞在剥离卵丘细胞后达20个1组培养。如果精液分析正常且预计受精是正常的，以精子对卵母细胞授精。卵母细胞通常在采集后4-6小时授精。如果精液分析异常或预计受精差，则使用ICSI对卵母细胞注射精子。受精的卵母细胞达20个1组地在矿物油下大约125μl Sage Cleavage Medium(Cooper Surgical，Inc，Trumbull，CT)液滴(含有10％SPS)中在37℃、5％O₂、5％CO₂和90％N₂的潮湿环境中培养。授精或ICSI后16～18小时进行受精检查。具有透明的两个前核的合子在Sage Cleavage Medium(含有10％SPS)中培养另外48小时。具有单个前核(1PN)或三个或更多前核的卵母细胞认为是异常受精的。如果指示第5天胚泡移植，在移植前在Quinn’s Advantage胚泡培养基(Cooper Surgical)(含有10％SPS)中进行延长的胚胎培养48小时。注意，在研究时间阶段期间使用相同培养基。

胚胎的分裂和分级

在采集后第3天、收集卵母细胞后68至72小时，单独一组有经验的胚胎学家评价胚胎。检查胚胎的分裂(细胞数目)和等级，包括胞浆碎裂。胚胎在第3天如下分级：1级，分裂球具有同样大小，没有胞浆碎裂；2级，分裂球具有同样大小，有较少胞浆碎裂，牵涉＜10％的胚胎；3级，分裂球具有不同大小，碎裂牵涉10-20％的胚胎；4级，分裂球具有相同或不同大小，中度到严重的胞浆碎裂，牵涉20-50％的胚胎；和5级，分裂球少，严重的碎裂，牵涉≥50％的胚胎(Veeck等人，(1999)An Atlas of Human Gametes and Conceptuses.New York：Parthenon Publishing.47-50)。注意，基于碎片大小、其在胚胎中的位置、不存在细胞核，胚胎中胞浆碎裂容易与分裂区分。相反，卵母细胞的胞浆碎裂不被包括作为变量，因为其是尤其罕见的。我们的胚胎学家在第3天例行地注意到紧密性的存在或不存在。因为在＜10％的胚胎观察到紧密性，我们在分析中未包括这一变量。

辅助孵化

我们的中心中，辅助孵化(AH)的适应症是高龄母亲、FSH水平升高、和/或辅助生殖周期多次失败的历史。在胚胎移植日，将用于孵化的胚胎放置在含有10％SPS的磷酸缓冲盐水(PBS)中。AH通过利用ZILOS-tk激光(Hamilton Thorne Biosciences，Beverly，MA)在分裂球之间的透明带区域中产生洞而实现。然后洗涤胚胎并放回培养基直到移植。

胚胎移植和低温贮藏

超声引导的胚胎移植利用Tefcat或Echotip Softpass导管(Cook Ob/Gyn，Spencer，IN)进行。对所有患者进行以阴道栓剂的黄体酮补充。对于在第3天具有胚胎移植的患者，将具有多于五个分裂球的任何剩余胚胎放置在延长培养中另外2或3天。在第5天或第6天将具有良好内细胞质和滋养外胚层的任何扩大中的、已扩大和孵化的胚泡冷冻。此外，对多余胚胎、严重的卵巢过度刺激综合征和因为医学或社会原因的生育力保存进行低温贮藏。如果其质量不足以低温贮藏或如果患者出于非医学原因未选择胚胎低温贮藏，通常丢弃未移植的多余胚胎。在植入前遗传诊断的情况，还丢弃检验为遗传疾病阳性或非整倍性的胚胎。

临床结果

在胚胎移植后8-10天获得血清定量β-hCG水平，并连续进行直到通过经阴道超声，妊娠囊的存在而进行临床妊娠的诊断。临床妊娠以外的结果包括：1)无妊娠，如果血清定量β-hCG是阴性；2)生化妊娠，定义为在经阴道超声观察到妊娠囊之前减少的血清定量β-hCG水平；3)自发性流产，定义为在经阴道超声观察到妊娠囊之后的流产；和4)宫外孕；以及5)其它异常妊娠诸如妊娠性滋养层疾病。活产结果通过作为常规临床护理的一部分的随访患者而获得，但不在本研究中使用。

回归树

临床IVF数据，尤其当考虑卵母细胞和胚胎参数时，通常不适合于由多变量逻辑回归进行有意义的分析。许多相关变量的高程度相互作用和多重共线性干扰常规的多变量回归。在这些情况中，回归和分类树模型(CART)已广泛用于临床研究(Fonarow GC，Jama 293：572-580(2005)；Friedman J(1999)Greedy function approximation：A stochastic boosting machine(贪婪函数近似：随机提升机).Technical Report，Department of Statistics，Stanford University；Friedman J(1999)Stochastic gradient boosting(随机梯度提升).Technical Report，Department of Statistics，Stanford University；Friedman J(2002)Tutorial：Getting started with MART in R(指南：开始R的MART).Department of Statistics，Stanford University；Friedman等人，Stat Med 22：1365-1381(2003)；Guzick等人，N Engl J Med 345：1388-1393(2001)；Pilote等人，N Engl J Med 335：1198-1205(1996))。在本文，我们使用多重累计回归树(

)，这是一种更强有力的统计方法，组合了“提升”与CART来“提升”或增加CART方法准确度以识别非冗余预后变量。

一般，回归树具有多种关键益处：1)能够考虑所有类型的临床IVF和胚胎学数据，包括数字变量、顺序变量、二元变量和分类变量；2)能够充分基于“替代品”分裂技术操纵缺失值而不需要归咎；3)能够产生对单调数据转化不变的结果，因此消除检验数据转化或度量的不同方法的需要；4)能够生成不受极端值影响的树；5)能够生成本身探测和识别变量相互作用的树，否则变量相互作用将需要在多重逻辑回归中明确指出。最重要地，回归树能够考虑大量的变量，包括可能证实是不相关的变量，即使只有小数目的变量对结果有显著的统计影响。考虑许多变量的这一能力对于IVF结果分析是关键的，因为许多变量，诸如8-细胞胚胎百分比、8细胞胚胎数、移植的8细胞胚胎百分比、和移植的8细胞胚胎数，可能是高度交互的；因此，随意选择其中之一可能损害数据的完整性而引入偏倚，而包括其所有可能导致常规的多变量回归崩溃。

的结果可能帮助识别能够以多变量逻辑回归再分析的变量。通常，它们可识别阈值或“截止(cut-offs)”，所述阈值或“截止”将用于产生分类变量以将情形分类为亚组，用于由常规方法诸如t-检验、卡方分析或Wilcoxon秩和检验进行进一步组内特征比较。例如，CART分析由Guzick等人使用来基于精子浓度、活动性和形态学的阈值将男性分类为低生育力的、不确定生育力状态或有生育力的，例示了这一策略在不育研究中的效力(Guzick等人，N Engl J Med 345：1388-1393(2001))。

胚胎培养

对3-5周大的野生型F1(C57BL6xDBA/2)雌性(Charles River)通过腹膜内注射5IU怀孕母驴的血清促性腺素(Sigma)、然后48小时后注射5IU人类绒毛膜促性腺素(Sigma)来使排卵过度，并与野生型雄性交配过夜。在hCG注射后17小时通过颈脱位法处死小鼠，从输卵管释出1-细胞胚胎。通过透明质酸酶(Sigma)治疗和吸取去除卵丘细胞。从3-6个雌性回收处于两个前核阶段的植入前胚胎，汇集在M2培养基(Chemicon International)中，然后立即细胞质微注射，并在37℃在混合气体(90％氮气、5％氧气、5％二氧化碳；Praxair)下培养在矿物油(Sigma)下的补充10％血清的人类输卵管液(In-Vitro Fertilization，Inc.)微滴中，并以每20μL滴十个胚胎培养。

微注射反义吗啉代寡核苷酸

特异性地靶向5’UTR或翻译起始位点的25-nt反义吗啉代寡核苷酸(MO)或在5nt错配的对照购自Gene Tools，LLC.(参见表1的序列详情)。我们确定0.6-0.75mM是允许胚泡发育正常速率的最大浓度(数据未显示)。因此，除非另外指明，否则在装备有液压显微操作系统(IM300Microinjector，Narishige，Japan)的倒置显微镜(Olympus IX70)上向每个胚胎的细胞质注射5-10pL 0.75mM Ccna2-MO(对于Oct4-MO，0.60mM)。每个实验中使用10个未注射的对照胚胎，每个实验进行至少三次。计算进展到每个发育阶段或在每个发育阶段停滞的胚胎的平均百分比和平均值的标准误差(平均值±s.e.m.)，统计显著性通过利用2-尾Student t-检验计算p-值来确定。

表1：靶向5’UTR和/或起始位点中基因-特异性序列的反义吗啉代寡核苷酸

免疫印迹和免疫细胞化学

在2-细胞期(施用人类绒毛膜促性腺素(hCG)后43小时)收集注射的胚胎和对照胚胎并在包含3mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的PBS中洗涤。对于免疫印迹，将注射的胚胎和对照胚胎在包含磷酸酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、1mMEDTA、1％Nonident P-40、2mg/ml aprotonin、2mg/ml亮抑酶肽、1mg/mlpepstain和20mg/ml苯甲基磺酰)中裂解，在Laemli缓冲液中煮沸，储存在-80℃直到从每种情况收集来自75个胚胎的裂解液。将样品上样并由在10％Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶上电泳而分析，半干转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，在0.1％吐温-20-1％酪蛋白TBS封闭溶液(Bio-Rad)中封闭，在4℃在1∶250稀释的第一兔多克隆抗细胞周期蛋白A2抗体(Santa Cruz Biotechnologies，sc-751)中培养过夜，在室温在1∶2000稀释的第二驴抗兔辣根过氧化物酶-连接的抗体(Amersham，NA934V)中培养一小时，利用ECL印迹检测试剂(Amersham)显现。免疫细胞化学按照标准方案进行。简单地说，将胚胎在4％低聚甲醛-PBS溶液中固定，在0.1％TritonX-PBS中使之通透化，在RT用ImageIT FX Signal Enhancer solution(Invitrogen)处理，在4℃在1∶100稀释的第一抗体中培养过夜，在1∶10,000稀释的第二抗体中培养一小时，然后在3μM DAPI中培养10min.，在VectaShield封固剂(Vector Laboratories，H-1000)中封固。对照以正常兔或小鼠血清对照平行进行。所有抗体在1％BSA中稀释。由共聚焦显微镜术利用LSM 510共聚焦激光扫描显微镜或表面荧光显微镜术或装备有Axiocam数码相机(Zeiss)的Axiovert 200显微镜利用固定的参数和曝光时间对胚胎成像。第一抗体购自Santa Cruz Biotechnologies(抗细胞周期蛋白A2兔多克隆(sc-751)、正常兔IgG(sc-2027)、小鼠单克隆抗Oct4(sc-5279)和正常小鼠IgG(sc-2025)。第二抗体购自Molecular Probes(Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG(A-11012)和山羊抗小鼠IgG(A-11001)。

由体外转录合成mRNA.

对全长小鼠cDNA克隆Oct4-pSPORT(克隆ID 30019896)(Open Biosystems)和编码荧光有丝分裂生物传感器：修饰的增强的黄色荧光蛋白(mEYFP)的质粒进行序列验证，通过限制性酶消化来线性化，并用作模板。体外转录5’加帽和多聚腺苷酸的mRNA转录物(mMessage and PolyA-Tail试剂盒，Ambion)，然后由UV分光光谱定量，由电泳分析来证实大小。

用于基因芯片实验的RNA样品制备

经3滴PBS/PVP洗涤包含20种汇集的注射的或对照小鼠胚胎的样品，为了总RNA提取和分离(Picopure总RNA分离试剂盒，Molecular Devices Corp.)而收集，产生10μL总RNA。根据制造商的说明书对5μL总RNA或10个小鼠胚胎的等价物进行两轮扩增(WT-Ovation Pico system，Nugen)。在Bioanalyzer 2100(Agilent)上检验第二轮扩增获得的ssDNA的质量，由ND-1000UV分光光度计(Nanodrop Technologies)定量每个样品5-8μg的典型产量。进行直接的生物素标记和碎裂(FL-Ovation cDNA Biotin Module(Nugen)。将碎裂的、标记的ssDNA样品提交到Stanford University PAN Core Facility以与

小鼠基因组4302.0阵列(Affymetrix)杂交，并激光扫描。

用于基因芯片实验的统计分析

来自共12个基因芯片(3个Ccna2-MO和其未注射的对照、以及3个Oct4-MO和其未注射的对照)的原始数据由dChip(Li C&Wong WH(2003)在The analysis of gene expression data：methods and software(基因表达数据的分析：方法和软件).(Springer，New York)，pp.120-141中)标准化。对具有以下的基因进行无监督聚类分析：1)在至少10％样品中表达水平大于500的信号强度(SI)；2)样品之间标准偏差与平均值的比值＞0.4且＜1000。随后的分析不限于这些标准。差异表达的基因的列表和其分级由Johnson和Wong提供的方法产生，该方法基于倍变、对数倍变和未配对的t-统计量(Nicholas Johnson和W.H.W.(2007)Combining scientific and statistical significance in gene ranking(在基因分级时组合科学显著性与统计显著性).未出版.)。差异表达由从样品之间300个随机排列估计的5％中值假发现率(FDR)的阈值来限定。为了发现显著地富集的基因本体论(GO)条件(Ashburner M，等人(2000)Gene ontology：tool for the unification of biology(基因本体论：统一生物学的工具).The Gene Ontology Consortium.Nat Genet 25，25-29)，将每个基因列表对Entrez基因识别号(NCBI)绘图，并由GOSTAT PACKAGE(Beissbarth T & Speed TP(2004)GOstat：find statistically overrepresented Gene Ontologies within a group of genes(GOstat：发现一组基因中统计上过度代表的基因本体).Bioinformatics 20，1464-1465)针对一组“通用”基因检验，“通用”基因是由(MAS，Affymetrix)在3种处理样品中至少2种或6种对照样品中4种中的“P”值限定的。为了估计FDR，以从“通用”基因组中随机产生的基因列表进行50次检验，计算富集的GO条件的平均数(Ashburner等人；Beissbarth等人)。选择p-值的截止以反映～10％的FDR。具有可能的Oct4结合位点的差异表达的基因通过与Zhou等人此前鉴定的推定的Oct4-调节基因(Zhou Q，Chipperfield H，Melton DA，& Wong WH(2007)A gene regulatory network in mouse embryonic stem cells(小鼠胚胎干细胞中的基因调节网络).Proc Natl Acad Sci U S A 104，16438-16443)比较而鉴定，随后利用BIOCONDUCTOR ANNOT PACKAGE(R.C.Gentleman VJC，D.M.Bates，B.Bolstad，M.Dettling，S.Dudoit，B.Ellis，L.Gautier，Y.Ge，J.Gentry，K.Hornik，T.Hothorn，W.Huber，S.Iacus，R.Irizarry，F.Leisch，C.Li，M.Maechler，A.J.Rossini，G.Sawitzki，C.Smith，G.Smyth，L.Tierney，J.Y.H.Yang，J.Zhang.(2004)Bioconductor：Open software development for computational biology and bioinformatics(Bioconductor：计算生物学和生物信息学的开放软件开发).Genome Biology 5，R80)将探针组与Refseq绘图。

RT-PCR、q-PCR和单胚胎q-PCR分析

将裂解缓冲液加到经PBS/PVP洗涤的胚胎(Cens-to-cDNA试剂盒，Ambion)，用1μL DNA酶I处理样品。反转录(RT)按照实验方案利用1.0μL SuperScript III RT酶(200U/μL)(Invitrogen)进行。基因-特异性产物的扩增由Taq聚合酶高保真试剂盒(Invitrogen)在温控循环器(Mastercycler gradient 5331，Eppendorf)上如下进行：94.0℃2min.，94.0℃15sec.，60.0℃30sec.，68.0℃45sec，68.0℃7分钟，50个循环(参见表2的所有引物序列和TaqMan探针)。单胚胎qRT-PCR利用Biomark 48.48动态阵列系统(Fluidigm，South San Francisco，CA)进行。以tyrode酸处理单胚胎，收集在10μl反应缓冲液中，随后按照制造商的说明书预扩增(TaqMan基因表达试验，Applied Biosystem；表S8)。利用NanoFlex IFC控制器(Fluidigm)将扩增的cDNA上样到48.48动态阵列上。作为相对荧光强度的测量的阈值周期(C_T)从BioMark PCR分析软件(Fluidigm)提取。所有反应以两份或三份进行，在至少三个至五个独立实验中伴有阴性RT、PBS和阳性对照。每个测定基因的数据以线性模型(ANCOVA)检验，其中C_T～β₀+β₁ ^*条件+β₂ ^*CT[磷酸甘油醛脱氢酶]+β₃ ^*C_T[β-肌动蛋白]，其中“条件”是指无注射或Oct4敲低。C_T值直接用于数据分析，因为在单细胞水平的基因表达已经显示遵循对数正态分布。

表2.用在q-PCR中的

探针和基因-特异性引物

实施例1

临床和胚胎学数据

在2005年在Stanford University进行的所有1117个IVF治疗中，822个是使用患者自身的卵母细胞的新的IVF周期(图1，图A)。基于我们的排除标准，出于多种医学和非医学原因排除了157周期。

排除的157个周期由以下组成：由于卵巢刺激差取消卵母细胞采集(63个周期)，由于完全缺乏胚胎发育取消胚胎移植(8个周期)，由于未预料的医学或非医学原因取消胚胎移植(35个周期)，未用促性腺素治疗的周期(3个周期)，缺失的结果(8个周期)，和仅基于年龄，≥45岁的女性(29个周期)。我们的研究中，在此前失败地尝试共368个周期后，160位患者经历随后的重复周期。这其中，同一年在同一机构中126位患者进行2个IVF周期，25位患者进行3个周期，6位患者进行4个周期，1位患者进行5个周期，2位患者进行6个周期。具有第3天胚胎移植的511个周期(76.8％)和具有第5天移植的154个周期(23.2％)、或共665个IVF周期满足分析的纳入和排除标准。

分别分析满足纳入和排除标准的其余665个周期和其4144个胚胎的临床和胚胎学数据以检验以下假设：同期组群-特异性变量预测IVF周期结果(图1)。这些4144个胚胎中，在第3天对4002个胚胎记录分裂球或细胞的数目(96.6％)。总之，38.8％具有发育适当的细胞数目的8个细胞，而18.2％的胚胎具有≤4个细胞，33.6％具有5-7个细胞(图2)。

实施例2

预后显著性和变量相关性

我们系统地检查了每个变量与IVF结果的关联、以及每对变量的相关性。逐对逻辑回归检验证实了许多已知预后变量，包括女性年龄、第3天FSH和8细胞胚胎数。然而，除了这些已知预后变量以外，我们观察到同期组群-特异性变量诸如受精率和分裂停滞率也与IVF周期结果显著关联(p＜0.001；表3)。相反，除了男性因素不育以外(p＜0.05)，常规临床不育诊断都不与IVF结果显著关联。特别地，尽管在许多变量与评价卵巢老化的年龄或第3天FSH水平之间有高度相关性，年龄或第3天FSH水平都不与同期组群-特异性胚胎参数相关(表4)。这些结果综合表示，年龄相关机制和临床诊断以外的决定因素影响同期组群-特异性胚胎发育能力。

表4：每对变量之间的相关性

实施例3

限定人类胚胎同期组群表型的非冗余、预后变量的阈值

对所有30个变量(列在表3和其图例中)的连续多重累计回归树

与分类和回归树(CART)分析确定，通过利用以下仅四个非冗余变量，IVF周期结果以～70％被最准确地预测：胚胎总数、胚胎同期组群中分裂停滞率、同期组群中8细胞胚胎数和第3天FSH水平。显著地，这四个变量都描述胚胎同期组群而不是单独的胚胎，比年龄、临床诊断或移植的胚胎的任何量度更提供消息。有趣地，胚胎总数、第3天FSH和8细胞胚胎数依赖于许多其它变量，并因此捕获许多其它变量的作用。相反，分裂停滞率独立于任何这些已知变量。(

和CART分析的细节在表5和图3中报告)。

表3：每个变量与妊娠结果的关联

表5：

产生的识别非冗余、预后变量的模型

在识别的预后阈值中，最可靠的表型是A1和A2、以及B1和B2(表6)。＜6或≥6的胚胎数目由所有前5个CART模型使用，限定所有其它表型(B至F)，可适用于所有情形。特别地，由具有少于6胚胎限定的表型与≥6胚胎的情形相比对无妊娠具有3.9的优势比(95％置信区间[CI]，2.8至5.5)。类似地，下一最可靠表型由胚胎数目和分裂停滞率限定，从而对于≥6胚胎的情形，分裂停滞率＞14.6％的情形比分裂停滞率≤14.6％的情形3.0倍地更可能导致无妊娠(95％CI，1.9至4.9)。

表6：限定同期组群-特异性表型的预后阈值

相反，列在表6的其余阈值各自仅由1个CART模型使用，适用于较少情形。然而，由于那些表型中的一些描述了非常具体的情形亚组，并具有高度辨识性的优势比，因此根据临床或翻译研究情况，它们可以尤其有用。例如，对于具有≥6胚胎的情形，与分裂率≤14.6％的情形相比，具有14.6-52.8％和＞52.8％的分裂停滞率分别增加无妊娠的优势比2.6(95％CI1.6至4.3)和10.6(95％CI 3.2至49.6)。

实施例3

由

和CART模型分析

为了克服变量之间的高度交互性质和可能的非线性依赖性、以及其多重共线性造成的挑战，由

分析列在表5和其图例的所有30个变量，以产生利用非冗余预后变量的模型。由

产生八个模型，单独树的复杂度增加以提升，而选择学习率来产生给定复杂度的最小实验误差。其中，前3个级别的模型具有0.301至0.308的交叉验证(CV)预测差错率，这将它们与另五个模型充分分开，另五个模型的CV差错率从0.315到0.331(表5)。然而，基于非常复杂的单独树的第三个模型仍显示比前面两个模型大的CV差错；因此将其从分析中排除。所获得的前两个模型与有意义的回归树模型的特征一致，使用非常少的树并共有共同的特征，从而这两个模型共同使用包含5个变量的仅5个树，而一些其它模型各自使用达16至30个树。

这5个非冗余预后变量是：胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天FSH水平和移植的8细胞胚胎数。每个模型中，去除前四个变量的每一个而保持所有其它参数恒定增加了模型的差错率，从而证实其显著贡献。然而，去除移植的8细胞胚胎数未改变差错率(数据未显示)，这说明这一变量比其它变量较不相关。

由CART分析代表这5个变量所有可能组合的24个模型以进一步限定具有预后显著性的阈值。由CART产生的前5个树与其余模型(0.565至0.6700)相比具有较佳预测分数(0.6828至0.6950)。因为存在共有的特征，这前5个树模型利用4个变量的几乎相同的阈值条件，而变量移植的8细胞胚胎数在这5个模型的任何一个中未利用。因此，通过利用比年龄、临床诊断或移植胚胎的任何量度更能提供信息的仅四个非冗余变量，IVF周期结果能以～70％被最准确地预测。

为了理解患者特征、诊断和IVF治疗特征中的哪些因素反过来决定这四个非冗余、同期组群-特异性预后变量，由MART构建树模型以表示这四个预后变量每一个的依赖性。胚胎总数、第3天FSH和8细胞胚胎数依赖于许多其它变量，并因此捕获许多其它变量的作用(图3)。相反，分裂停滞率独立于任何这些已知变量。

实施例4

吗啉代介导的基因敲除研究

此处我们通过对Ccna2基因试验实验方案，提供MO-介导的基因敲低的效力和特异性的概念验证。然后我们报告由MO-介导的基因敲低揭示的Oct4的新作用。Ccna2是编码细胞周期调节物细胞周期蛋白A2的基因，已被表示是胚胎基因组激活中的重要转录调节物(Hara KT，等人(2005)Dev Biol 286，102-113)，在1-至2-细胞期的关键发育里程碑，在此阶段出现了很少的清除机制或调节物。与文献一致，MO-介导的Ccna2敲低减少了细胞周期蛋白A2蛋白表达。此外，我们的结果显示，细胞周期蛋白A2是发育超过2-细胞期所需的(图4，图A-C，图5，图A-D，表1和7)。MO通过空间位阻以有效和基因-特异性方式阻滞转录物的翻译，这已经在斑马鱼和其它模型生物体中充分确立(Gore AV，等人(2005)Nature 438，1030-1035；Imai等人，(2006).Science 312，1183-1187；Sumanas S & Larson JD(2002)Brief Funct Genomic Proteomic 1，239-256；Yamada L，等人(2003)Development 130，6485-6495)。最重要地，MO介导转录物的快速敲低而不论其母系来源还是胚胎来源，下游基因的之前活化可提供部分“拯救”表型。不同于siRNA，MO独立于内源途径起作用，所以MO-介导的翻译阻滞不应限制敲低效力或干扰内源mRNA降解机制。

通过联合MO-介导的基因敲低与全局基因表达谱绘制和单胚胎水平定量RT-PCR(q-PCR)，我们确定了Oct4对基因表达的影响，并分析了早期胚胎中Oct4-调节的基因网络(图6和图7)。与文献一致，我们证实在1-细胞期的Oct4基因表达(图8)。在向1-细胞胚胎微注射0.6mMOct4-MO后，在1-至多细胞期的发育停滞率显著高于对未注射的和错配(Oct4-MM)对照所观察到的(图9，图A和B)。注射了Oct4-MO并达到多细胞期的胚胎中，86.8±8.3％停滞，未形成桑葚胚，相比之下，注射Oct4-MM的10.5±10.5％胚胎停滞(p＜0.01；数据未显示)。最显著地，相比相对高胚泡比率的Oct4-MM-注射的和未注射的胚胎，Oct4-MO-注射的胚胎都未发育到胚泡(p＜0.01；图9，图C)。进一步，Oct4-MO的特异性由表型严重性和由Oct4-MO浓度滴定的推测“基因-剂量”之间的直接关系支持(图9，图D和E)。Oct4蛋白表达在Oct4-MO-注射的胚胎中在4-细胞(图10)和多细胞期(图11，图A和图12)实际上减少。注射靶向Oct4中内含子-外显子边界的另一MO证实，破坏Oct4功能对胚泡期前的发育是不利的(图13，图A-C)。

Oct4在1-细胞向2-细胞转变时的关键功能是胚胎-自主的。Oct4敲低的作用不能被以下拯救：由未注射的胚胎调整的介质或通过向适当调整周期的代孕母亲的输卵管移植注射的胚胎而提供的体内环境(数据未显示)。共注射低(3.6ng/μL)或高(3.6ng/μL)浓度未改变的、全长Oct4 mRNA与0.6mM Oct4-MO导致与共注射编码修饰的增强的黄色荧光蛋白(mEYFP)的对照mRNA相比，在1-至多细胞期停滞的胚胎百分比减少图11，图B)。共注射Oct4 mRNA的胚胎不在多细胞期停滞，而80.0±5.2％在共注射mEYFP mRNA后停滞(p＜0.01；数据未显示)。因此，共注射Oct4 mRNA而不是对照mRNA部分地拯救了Oct4-MO-引起的多细胞期停滞表型。未能实现表型的完全拯救可能是因为以低浓度共注射Oct4 mRNA后Oct4表达不足、以高浓度不适当地高Oct4表达或与Oct4-MO相比体外转录Oct4 mRNA的相对不稳定；进一步，这些可能性不是互相排斥的。因此，我们接下来检验Oct4过表达本身是否将干扰发育。

注射Oct4 mRNA导致由q-PCR定量的过表达，但未导致Oct4蛋白的异位表达(数据未显示)。Oct4过表达实际上以剂量依赖性方式诱导发育停滞，而注射相当或更大量mEYFP mRNA最低程度地干扰胚泡发育(图11，图C)。Oct4 RNA注射的“基因剂量”作用可能是因为Oct4在转录调节中的功能增强，或Oct4过量产生可能允许非特异性启动子-结合，或过量Oct4导致辅因子的不适当隔离和随后的失活。总之，这些数据决定性地显示对于早期胚胎发育需要Oct4表达，且其正确水平是关键的，正如同ESC的多能性依赖于Oct4表达水平的确切范围(Stefanovic S & Puceat M(2007)Cell Cycle 6，8-10)。

表7.试验的胚胎数目和对每种条件进行的实验次数概述

实施例5

OCT4的基因调节

为了分析Oct4功能的机制，我们比较了在mid-2-细胞期Oct4敲低胚胎的全局基因表达谱与Ccna2敲低的作用和未注射的对照。目标是鉴定与在mid-2-细胞期胚胎基因组激活的第一主要波动同时发生的差异基因表达(Hamatani T，Carter MG，Sharov AA，&Ko MS(2004)Dev Cell 6，117-1317；Wang QT，等人(2004)Dev Cell 6，133-1448)(表8，A和B，9，A和B)。由无监督算法分析显示，胚胎样品根据实验条件聚集，这进一步支持了基因敲低的特异性和非随机作用(图14，图A)。以0.05的随机阈值错误检测率(FDR)，与响应于细胞周期蛋白A2敲低而改变表达的基因数目相比，Oct4-调节的基因组大五倍(图14，图B)。低表达相对于过表达的Oct4-敲低基因组的不同大小表示，Oct4可能主要是活化而不是抑制转录(图14，图B)。基于mESC染色质免疫沉淀(ChIP)数据或Oct4-结合位点的基因组序列分析，一些Oct4候选靶基因此前已经被鉴定为假定的Oct4靶(Zhou Q，Chipperfield H，Melton DA，&Wong WH(2007)Proc Natl Acad Sci U S A 104，16438-16443)(表10)。

细胞周期蛋白A2-调节的基因的列表富集在编码用于染色体修饰和重构(p＝0.005)、核苷酸代谢(p＝0.01)和染色体组织(p＝0.01；表11A和B)的因子的基因中。Oct4-调节的基因对于翻译(p＝1.1×10^-4)和RNA加工功能(p＝3.0×10^-5)(表11，C和D)显著富集。比较我们的数据与小鼠ESC中公开的Oct4-调节的网络表示，Oct4具有独特和特异性的转录后和翻译调节功能，该功能是由其控制编码真核翻译起始因子(Eif)中的亚基的基因包括Eif3c和Eif3b而介导的。有趣地，这两种Eif亚基从酵母到人类是进化上保守的，包括在构成最大的Eif复合体即哺乳动物Eif3的功能核心的六个亚基之中(Masutani M，Sonenberg N，Yokoyama S，& Imataka H(2007)Embo J 26，3373-3383)。除了其胚胎-特异性功能以外，Oct4还控制编码转录后调节物Dppa5和Piwil2(也称为Mili)的基因表达，如同对ESC那样(数据未显示)。Dppa5是一种胚胎-、生殖细胞-和ESC-特异性的RNA-结合蛋白，其在母系-胚胎转变中的作用未知。然而，Piwil2和与其结合的pi-RNA因其在成熟小鼠卵母细胞中调节反转录转座子的作用而闻名(Watanabe T，等人(2008)Nature 453，539-543.26)。总之，我们的数据表示，除了其在多能细胞类型之间共有的保守功能以外，Oct4在控制编码转录后调节物的基因中具有独特、发育阶段-特异性的作用。

表8A：与未注射的胚胎相比在Oct4-MO-注射的胚胎中具有更高表达水平的基因(在实施例部分之后)

表8B：与未注射的胚胎相比在Oct4-MO-注射的胚胎中具有更低表达水平的基因(在实施例部分之后)

表9A：与未注射的胚胎相比在Ccna2-MO-注射的胚胎中具有更高表达水平的基因(在实施例部分之后)

表9B：与未注射的胚胎相比在Ccna2-MO-注射的胚胎中具有更低表达水平的基因(在实施例部分之后)

表10：基于基因组序列分析或小鼠ESC染色质沉淀(ChIP)数据具有推定的Oct4结合位点的Oct4候选靶基因

表11A.在Ccna2敲低模型中下调的基因中富集的功能种类

表11B.在Ccna2敲低模型中上调的基因中富集的功能种类

GOBPID P-值描述

GO：0044262 7.1E-4 细胞糖类代谢

表11C.在Oct4敲低模型中下调的基因中富集的功能种类

表11D.在Oct4敲低模型中上调的基因中富集的功能种类

实施例6

OCT4在1-至2-细胞期的功能

为了理解Oct4在重编程早期胚胎中的作用，我们检查了其在胚胎基因组激活和母系转录物降解中的作用。总之，Oct4调节与基因调节的整个过程所需基本机制相关的基因表达，包括牵涉所有三种RNA聚合酶的转录、翻译、RNA加工，诸如调节多腺苷酸化和mRNA降解蛋白(表12)。来自发育基因诸如Six1、巢蛋白和Hoxa3的高水平mRNA表示Oct4对其阻遏是需要的，而正常被快速降解的过量水平的母系转录物诸如Zar1和Nobox1表示Oct4敲低干扰mRNA降解机制。因此，Oct4具有发育阶段-和细胞-特异性功能，在标记母系-胚胎转变的过程中具有重要作用。

为了进一步限定Oct4-调节的基因网络，我们选择了代表转录、转录后和信号传导功能的42种基因用于q-PCR检验。我们分析了单Oct4-MO-注射胚胎和对照胚胎的RNA，并集中于在Oct4敲低中低表达的基因。去除关于对其存在技术问题的3种基因的数据后，基于利用线性模型的分析适当地测量39种基因的表达变化(参见方法和材料)。这其中，34种或～87％显示在Oct4敲低中预计的方向的表达水平改变(图14，图C和图15)，而包括Sox2的5种基因未改变(数据未显示)。34种基因中的21种或～62％由q-PCR显示统计学显著的差异表达(p＜0.05或更小)，而注射对照MO未改变检验的任何基因的表达(数据未显示)。因此，我们证实Oct4直接或间接地调节编码在1-至2-细胞期转录和转录后调节物整个谱的基因。

我们的单-胚胎数据允许我们不仅仅验证我们的基因芯片数据。利用包括汇集的细胞或胚胎的样品的方法产生代表检验的所有细胞平均值的相对基因表达，但不能区分被一致地差异调节的基因与具有朝向随机改变的趋势的基因；类似地，未识别出表达独特转录组的罕见逸出胚胎(Bengtsson M，Stahlberg A，Rorsman P，&Kubista M(2005)Genome Res 15，1388-1392；Chang HH，等人(2008)Nature 453，544-547；Warren L，Bryder D，Weissman IL，&Quake SR(2006)Proc Natl Acad Sci U S A 103，17807-17812)。通过在单胚胎水平分析定量表达数据，我们能够进行这种区分。我们假定其相对表达在单胚胎之间一致的基因具有成为基因调节网络中关键节点的较高可能性，预计基因调节网络以一致和可预测方式响应于干扰。这组基因限制于其差异表达(由阈值周期差ΔC_T表示)ΔC_T大于单胚胎之间的表达差异(由平均值的标准误差s.e.m.表示)的基因。我们在Oct4-调节的基因网络中提出一种层次，其中29种基因基于其增加的s.e.m.或胚胎间差异和在这一网络中推测的减少的生物显著性排序(图16，图A)。总之，我们以定量方式鉴定了这一网络的可能关键节点并对其分级。

数据显示，在母系-胚胎转变的独特发育环境中，伴随着大量mRNA降解和显著的重编程，Oct4控制许多转录调节物的表达。Oct4还维持牵涉在转录后控制中的许多基因诸如Eif3c、Papola、Piwil2、Eif3b、Eif4e、Rbm3和Cpsf4的表达。经由其对转录调节物和转录后调节物二者的影响，Oct4可直接或间接影响早期发育程序期间的许多关键过程，诸如染色质重构、表观遗传调节、凋亡、细胞周期调节和信号传导(图16，图B)。

表12：在转录、翻译、RNA加工、染色质重构、信号传导、凋亡和细胞周期中起作用的候选Oct4-调节的基因

实施例6

确定活产事件概率

在美国，730万对伴侣患有临床不育，对其每年进行多于～120,000个IVF治疗周期。IVF是许多不育伴侣的最有效治疗，但它主要是经验主义的，对于一些伴侣尽管多次尝试而可能不导致活产。IVF治疗改革了医生能够帮助低生育力患者的方式，但在过去十年间使用自体卵母细胞的成功率似乎已经达到一个坪值。由于平均每个周期的花费是12,000美元，仅IVF治疗就用掉健康护理付款人(大多数是这些伴侣自己)每年多于10亿美元。然而，IVF的决策过程可以是令人畏惧的，因为IVF咨询和管理决定通常基于女性的实足年龄进行，没有标准化的方式来为了卵巢储备和胚胎质量的不同估计值调整。进一步，认为护理质量在IVF诊所之间变化，但因为不存在科学和严格地限定的患者预后分层，头对头(head-to-head)比较是不可能的。对于身体上、感情上和财政上有要求的治疗，患者可能觉得当决定是否开始或重复IVF治疗时是在掷骰子。因此，在患者-或自身-选择IVF时可能具有不一致，以致一些具有真正差的预后的患者可能发展不切实际的期望，而具有真正好的预后的患者可能错失有效治疗的机会。尽管许多出版物已经报告了与IVF结果显著相关的变量，包括女性患者的实足年龄，但不清楚其相对于结果的贡献，我们甚至较不确定如何将这些发现直接应用于咨询患者。

因此，在实施例中我们应用MART来分析从2003年到2006年，3338个新的、非卵母细胞供体IVF周期和其相关胚胎(包括冷藏胚胎的随后移植)的更大、四年数据集的二分的活产结果。重要地，来自1,879个新的、首次周期的关于临床诊断、治疗响应和胚胎发育参数的57个变量用于以无偏方式产生预测模型，没有基于之前的文献预选择变量。我们鉴定出决定活产结果的四种预后因素--胚泡百分比(胚泡比率)、胚胎总数(胚胎数目)、所需促性腺素的总量(TG)和子宫内膜厚度(EndoTh)。当已知这四种预后变量时，其它变量，诸如年龄和第3天8-细胞期胚胎数目的预后贡献是任选的。最后，结果显示我们的方法和发现可如何应用于立即改进患者咨询和管理方案，和这些严格地限定的预后标准可如何鼓励我们的一致努力以改进质量保证和减少多胎妊娠比率。

从2003年1月1日到2006年12月31日，共进行5037个IVF治疗，各年之间的每年容量相当。这其中，3347个是使用患者自身卵母细胞的新IVF周期，满足纳入标准。在施加排除标准后，保留3338个周期，其中1879个是第一-IVF周期(C1)，778个是对在C1没有活产结果和返回其第二治疗的患者进行的第二-IVF周期(C2)；312个是第三-IVF周期(C3)；369个周期是第四、第五和第六周期，未分析(图17和图18)。

随后分别分析C1、C2和C3的数据。总之，41％的胚胎具有发育适当细胞数目的8个分裂球，而17％的胚胎具有≤4个细胞，33％具有5-7个细胞，9％具有多于8个细胞(图19)。这一IVF中体外人类胚胎发育谱与之前的报告一致。进一步，C1、C2和C3中体外培养第3天时10,687、3,932和1,573个胚胎形成的分裂球的数目没有显著差异，这表示胚胎发育在前三个周期之间是相当的(p＝0.6；图19)。

我们仅使用C1数据来产生预测模型，因为患者因为多种原因退出，对其没有对照(图18)，我们不希望显著预后因素被周期数目遮盖；我们不知道退出率在预后不同的各患者亚组之间是否相当。与其它报告一致，没有活产的显著数目患者在各个不成功的周期后退出，没有返回进行随后的治疗。尽管如此，C2和C3数据用于检验预测模型对于随后的治疗是否有效。

与活产结果相关联的变量

我们首先集中于满足所有纳入和排除标准的1879个C1周期和相关的10,687个胚胎。我们系统地检查了57个变量的每一个与活产结果的关联。基于数据输入的质量和完整性而不是基于此前的科学或临床知识来选择这些变量。逐对逻辑回归证实许多变量与活产结果的显著关联，这些变量包括患者年龄、男性伴侣的年龄、第3天FSH、和此前临床流产数目(p＜0.05)(表13)。如所预期的，卵巢储备下降(DOR)是一种基于此前非-IVF不育治疗或氯米芬攻击实验的卵巢响应差的临床诊断，与活产结果高度负相关(p＜0.0001)，而趋向于增加卵巢响应的多囊性卵巢综合征的诊断与活产正相关(p＜0.0001)。

表13.变量和其与ⅣF活产结果的关联.

脚注：

由逻辑回归检验每个变量与IVF活产结果的关联，获得估计值、估计值的标准误差(S.E.)、p-值、平均值和标准偏差(S.D.)。连续变量和分类变量的结果分别列在表1A和表1B中。

¹正估计值和负估计值分别指示与阳性妊娠和阴性妊娠结果关联。

²此前临床妊娠的数目，由阳性血清人类绒毛膜促性腺素(hCG)或妊娠检测限定。

³此前37周足月分娩的次数。

⁴流产是指在怀孕5周时或5周后发育停滞或临床流产。包括看起来无关的季节作为阴性对照。

我们注意到，许多对变量诸如年龄和使用促性腺素的总量，是彼此高度相关的(表14)。尽管这些发现与推测的在卵巢老化、卵巢激素产生和卵质量之间复杂和知之甚少的生物机制一致，这些相互作用未能由ANOVA利用卡方统计检验充分研究(数据未显示)，可能因为它们不是以线性方式相互作用，或多种条件可能影响相互作用的性质。

我们选择由

构建提升的分类树来识别非冗余预后变量而分析数据和产生预测模型。是用于识别预测结果的变量的交互结构的可靠方法。

中交叉验证、参数选择提升和模型评价的使用还保留了简洁性并避免过度拟合。最后，MART不假设相互作用不存在还是存在或相互作用的性质。

表14A和14B.每对变量之间的相关性.

表14A

表14B

IVF治疗时间点-特异性预后因素和模型

与我们便于实际生活决策的目标一致，我们使用了MART的提升的树来产生三个预测模型，其每一个利用在制定IVF计划和治疗期间的特定时间点可获得的变量。如由图20的图表所示，Pre-IVF模型限于主要涉及患者的基线特征、临床诊断的21个变量；除了Pre-IVF模型中使用的9个变量以外，Pre-卵母细胞采集(Pre-OR)模型利用涉及患者对卵巢刺激的响应的相同的21个变量，共30个变量；除了涉及胚胎发育、与移植或低温贮藏相关的胚胎参数的数据以外，Post-IVF模型使用Pre-IVF和Pre-OR中的所有变量，共57个变量。

Pre-IVF模型.对1879位C1患者关于在开始IVF治疗之前已知的21个连续变量和分类变量的MART分析(参见表13)显示，仅患者年龄和卵巢储备下降(DOR)的诊断的每一个、以及其相互作用预测了活产结果。在我们的中心，DOR常规地用于描述显示在控制的卵巢过度刺激/子宫内授精(COH/IUI)治疗中对促性腺素的卵巢刺激响应差的历史的患者。尽管DOR的存在是LB的负预测值，其仅与群体的～12％有关。将其余患者根据年龄分层。然而，该模型识别的年龄阈值(即，40.5、42.5和46.5)大大不同于文献中随机和通常使用的阈值(ref)(即，＜35、36-37、38-40、41-42、＞42)。总之，5个患者亚组(此后称为群体)被该模型以LB率为21％、39％、27％、17％和4％为222个(所有C1患者的12％)、690个(37％)、176个(9％)、581个(31％)和199个(11％)患者分别区分(图21A)。

Pre-OR模型.在这一模型中，以MART分析在从包括1879个C1患者的相同群体采集卵母细胞时已知的30个变量。识别三种独立预后因素-所需促性腺素的总量(TG)、年龄和子宫内膜厚度(EndoTh)。再次地，尽管已经报告这些预后因素的每一种与LB结果相关，我们首次客观地限定其阈值和其可能的相互作用的性质，这对临床应用是关键的。总之，这一模型鉴定出关于其LB率跨2％、51％、28％、32％、18％、37％和8％的7个独特群体，为群体(Pop)1至7中26个(所有C1患者的1.4％)、387个(21％)、58个(3％)、200个(11％)、662个(35％)、141个(8％)和405个(22％)患者(图21B)。除了准确分析的群体以外，显著的发现是具有EndoTh＜7.05mm(Pop 1)、按照所有3个预后因素进展差的患者(Pop 5)；和年龄＞44.5的患者(Pop 7)LB结果的机会极小。Pop 1、5和7的简单组合显示，1119或～60％所有的C1患者具有非常低的LB率13.5％。

Post-IVF模型.Post-IVF模型由MART基于表1所列的所有57个变量产生。注意，这一分析局限于1879个C1患者中的1664个，因为215个患者未完成IVF治疗而具有“周期取消”，主要因为次优的卵巢响应。四种显著的预后因素-胚泡比率、胚胎数目、TG和EndoTh足以区分6个群体，对于群体1至6中的361个(分析患者的19％)、96个(5.5％)、643个(40％)、316个(19％)、198个(12％)和95(6％)个患者LB率是7％、39％、17％、54％、36％和72％(图21C)。

对返回患者和独立数据集的模型验证.

我们通过在包括C1未能导致活产而返回在778个第2周期(C2)和312个第3周期(C3)中重复治疗的患者的相关数据集中检验各群体之间的活产率是否显著不同，验证了我们的模型。为了进一步验证我们的结果，我们还检验了包括来自在2007年进行IVF治疗的343个非冗余患者的C1数据的独立数据集。(参见图22)有趣地，我们注意到总的IVF患者群体的组成在周期和数据集之间变化。

我们通过ANOVA卡方检验检验了群体之间的差异活产率，这揭示了群体之间的差异LB结果在来自2003-2006年数据集的C2和C3以及来自2007年的独立数据集的C1中保持显著不同，Pre-IVF、Pre-OR和Post-IVF模型的每一种分别具有p-值1.17E-50、8.69E-71和1.64E-96(图23)。

然后我们以不同方式验证了我们的模型，通过检验每个预后-限定的群体的活产率在2003-2006年数据的C1、C2、C3之间(此后称为周期间)、和2007年的C1与2003-2006年数据集的C1之间是否稳定和未改变。周期间比较显示，所有群体对Pre-OR和Post-IVF模型保持类似；在Pre-IVF模型中，仅Pop 2和Pop 4显示其活产率在周期之间变化(p＝0.02)。(参见表15周期间比较的p-值。)进一步，2003-2006年与2007年数据集之间的群体比较指示，Pre-IVF和Post-IVF模型、以及大多数Pre-OR模型保持恒定和高度可重复(p≥0.5)；Pre-OR模型的Pop 1和6具有在两个数据集之间不同的活产结果。

表15.比较基于年龄的对照模型与跨每个年龄组的人群的每个Pre-IVF、Pre-OR和Post-IVF模型之间的活产率。

总之，我们的结果显示所有三个模型有效地分层具有差别活产率的患者，通过预后来分层的这种能力在随后的周期和独立数据集中是可重复的，尽管总的IVF患者群体的组成变化。进一步，我们证实每个模型中使用的预后分层和活产预测在独立数据集和在返回患者的重复周期中是可重复和验证的。

模型比年龄更特异性地预测活产结果.

我们检验了这些预测模型是否比基于年龄的对照模型(此后称为对照)更好和更特异性地限定患者群体。(参见方法关于基于年龄的对照模型详情。)与对照对五个年龄分类＜35、35-37、38-40、41-42和≥43的每个分类预测的活产率相比，我们显示群体-特异性、观察到的活产结果(图24A-C)。在这里，年龄分类由辅助生殖技术(SART)国家注册协会(the Society for Assisted Reproductive Technologies(SART)national registry)和大多数文献(ref)使用的常规标准来限定。这些比较强调了年龄高估或低估活产率的趋势。例如，对照模型倾向于在Pre-IVF模型的Pop 1、Pre-OR模型的Pop 5和7、以及Post-IVF模型的Pop 1和3中高估活产率(图24A-C)。与Pre-OR模型相比，对照模型还倾向于在Pop 2和3、以及Pop6的年龄组41-42和≥43中低估活产率，而与Post-IVF模型相比，年龄趋向于低估Pop 4和6。

我们将Pre-IVF、Pre-OR和Post-IVF模型的每一个关于在五个年龄分类中的每一个的活产率与对照相比较。Pre-OR和Post-IVF模型二者在跨所有五个年龄组的群体比对照模型显著更好地预测活产率(p-值从0.04到0.5E-16，参见表15关于这些比较的所有p-值)。在Pre-IVF模型中，其中年龄是关键的预后因素，Pre-IVF模型在年龄组38-40比对照更好地预测结果，可能是因为其还考虑到卵巢储备下降的诊断(p＝0.01)。总的说来，在进行第一新的IVF周期的患者中，17.7％的患者将通过利用Pre-IVF模型获得更准确和个人化的活产结果预测，76％的患者将从利用Pre-OR模型受益。Post-IVF模型的功用是在第一治疗未导致活产的情况，便于关于随后的IVF治疗作出决策，后来更深入地分析其用作随后的周期的预测工具。

预后分层预测随后的和累计活产率

我们想知道，对于没有从C1获得活产的患者，C1中的群体分配是否预测C2中的活产率和C2和C3的累计活产率。这些疑问准确地提出了常见的场景，即一对伴侣需要决定在不成功的周期后是否重复IVF治疗。我们通过基于Post-IVF模型将患者分配到群体，随后追踪患者在C2和C3的结果而解决了这些疑问。我们考虑了观察到的和假定的累计活产率二者。观察到的累计比率是基于返回进行C2和C3的实际患者保守计算的；分子(nominator)是C2和C3中活产数目，分母是C2周期总数。假定的累计比率是基于在C2或C3具有活产结果的概率计算的，并假设退出的患者与返回的患者没有不同；因此，其不受选择进行C3的患者的有限数目影响。特别地，分配到Pop 1和3的C1导致观察到的累计活产率分别是15.1％和18.4％，分配到Pop 5的是27.5％。相反，Pop 2、4和6分别具有高得多的累计活产率56.7％、42.9％和75％；假定的累计活产率具有朝向略高的趋势(图25)。因此，基于C1中预后因素的群体分配再次将IVF群体限定为在C2和C3具有不同和可预测累计活产率的亚组。

识别预选患者变量的相对重要性的梯度提升分析

我们使用梯度提升器(gradient boosted machine)(GBM)进行分析来确定所有三个模型中每个变量对活产结果的“相对影响”。简言之，我们对Pre-IVF、Pre-OR和Post-IVF模型的1879、1879和1664个新周期分别进行了10倍交叉验证。树的最佳数目对于Pre-IVF、Pre-OR和Post-IVF模型分别是4677、8680和10,745；对每个模型分析了25,000个树(即，多于所需的最小值)。结果显示在表16A、16B和16C。将变量按照递减的相对影响/重要性分级，以使最重要的变量被分级到前面。每个模型中相对影响的数字加起来是100。

这些GBM输出包含数千个树，这不能被直观化，且对于更科学和临床的讨论在概念上过于抽象。因此，我们选择了前面的变量用于进一步分析以构建可以用Rpart直观化的更简单的树模型。更简单的树模型的益处是，它们对于科学家、临床医师和民众在概念上更容易理解；可表征不同的亚群体并进行进一步分析以解决具体问题，并探索模型的功用。

表16A、16B和16C.变量列表和其分别在Pre-IVF、Pre-OR和Post-IVF模型中确定活产结果的相对重要性.

表16A：Pre-IVF模型

表16B：Pre-OR模型

表16C：Post-IVF模型

实施例7

对正常或异常人类胚胎确定分子指纹

我们成功地检验了一组基因在处于1-细胞、4-细胞和8-细胞期的对照冷藏-融化的人类胚胎的解离的分裂球中的表达。(患者对研究捐献了这些对照胚胎，因为他们已经完成了家庭。)我们通过考虑标准偏差和平均值二者来分析数据。对1-细胞、4-细胞和8-细胞期的基因芯片实验结果提供在图25-30。这些结果显示基因表达分析在单细胞水平以及同时检查表达许多基因的功用。如此，结果显示，胚胎的指纹分析可用于提供可以改进对随后的IVF周期活产结果的预测的信息。

前述的仅仅是说明本发明的原则。要理解的是，本领域技术人员能够设计各种方案，其虽然没有在本文明确地描述或显示，但实现了本发明的原理并被包括在本发明的主旨和范围之内。此外，在本文叙述的所有实例和条件性语言旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为改进现有技术所贡献的概念，不应被视为限制到这种特别叙述的实例和条件。此外，在本文叙述的本发明的原理、方面和实施方案以及其特定的实施例的所有陈述涵盖其结构和功能等同物。另外，这种等同物包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，不考虑结构而实现相同的功能所开发的任何元件。因而，本发明的范围并非限制于在本文显示和描述的示范性实施方案。而是，本发明的主旨和范围由所附的权利要求书表现。

Claims

1.一种为体外受精程序评价女性受治疗者的方法，包括：

从女性受治疗者获得信息项以提供所述女性受治疗者的谱，其中每个信息项与预选的患者变量有关；

利用基于所述预选的患者变量的算法比较所述女性受治疗者的所述谱与已知指示对体外受精程序的响应度的已知谱图的文库，

其中所述比较提供为体外受精程序对所述女性受治疗者的评价。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外受精程序是所述女性受治疗者的至少第二次体外受精程序。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外受精程序包括确定用于植入的胚胎数。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外受精程序提供活产事件。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述女性受治疗者是体外受精前(pre-IVF)程序患者。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述预选的患者变量包括年龄、卵巢储备下降、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、多囊卵巢病、季节、原因不明的女性不育、自然流产次数、年份、女性不育的其它原因、此前妊娠次数、此前足月分娩次数、子宫内膜异位症、输卵管病、输卵管结扎、男性不育症、子宫肌瘤、输卵管积水或男性不育症原因。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述女性受治疗者是外科手术前(pre-OR)程序患者。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述预选的患者变量包括年龄、子宫内膜厚度、卵母细胞总数、施用促性腺素的总量、洗涤后活动精子总数、洗涤前活动精子总数、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、采精、配偶年龄、季节、自然流产次数、原因不明的女性不育、此前足月分娩次数、年份、此前妊娠次数、女性不育的其它原因、子宫内膜异位症、男性不育症、输卵管结扎、多囊卵巢病、输卵管病、来自供者的精子、输卵管积水、子宫肌瘤或男性不育症原因。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述女性受治疗者是体外受精后(post-IVF)程序患者。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述预选的患者变量包括胚泡发育速度、胚胎总数、施用促性腺素的总量、子宫内膜厚度、短方案、每个胚胎的平均细胞数、所用导管类型、移植的8细胞胚胎百分比、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、洗涤前活动精子数、洗涤后活动精子数、胚胎平均等级、胚胎移植日、季节、自然流产次数、此前足月分娩次数、口服避孕药、采精、未受精卵百分比、在4细胞期停滞的胚胎数、移植后第3天的紧密化、正常受精百分比、异常受精卵百分比、正常和成熟卵母细胞百分比、此前妊娠次数、年份、多囊卵巢病、原因不明的女性不育、输卵管病、仅男性不育症、男性不育症原因、子宫内膜异位症、女性不育的其它原因、子宫肌瘤、输卵管结扎、来自供者的精子、输卵管积水、ICSI表现或辅助孵化。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括获得有关至少两个预选的患者变量的信息项。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括获得有关至少五个预选的患者变量的信息项。

13.根据权利要求12所述的方法，其中预选的患者变量被提供相对于其它预选的患者变量的加权相对重要性。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述预选的患者变量包括年龄、胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平、移植的8细胞胚胎数。

15.根据权利要求1所述的方法，还包括确定一种或多种不育指示基因的表达水平，并比较所述表达水平与已知指示对体外受精程序的响应度的对照基因表达谱。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述不育指示基因包括Oct4、Eif3c、Papola、Piwil2、Eif3b、Eif4b、Rbm3和Cpsf4。

17.根据权利要求15所述的方法，其中一种或多种不育指示基因的所述表达水平通过使用

动态阵列、RT-PCR或全转录组测序进行。

18.根据权利要求15所述的方法，其中一种或多种不育指示基因的所述表达水平是对胚胎确定。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述胚胎在受精后处于停滞发育。

20.根据权利要求15所述的方法，其中一种或多种不育指示基因的所述表达水平是对卵母细胞确定。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述卵母细胞在受精后处于停滞发育。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述比较所述女性受治疗者的所述谱包括应用判定规则。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述数据分析算法包括使用分类树。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述数据分析算法是非参数的。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述数据分析算法检测特征值分布的差异。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述非参数的算法包括使用Wilcoxon符号秩检验。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述数据分析算法包括使用多重累计回归树或通过梯度提升器(GBM)。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述数据分析算法是逻辑回归。

29.一种为体外受精程序评价女性受治疗者的方法，包括：

确定一种或多种不育指示基因的表达水平；

利用基于所述预选的患者变量的算法比较所述女性受治疗者的所述谱与已知指示对体外受精程序的响应度的已知谱图的文库；和

比较所述一种或多种不育指示基因的所述表达水平与已知指示对体外受精程序的响应度的对照基因表达谱，

其中所述比较所述女性受治疗者的所述谱与所述一种或多种不育指示基因的所述表达水平提供为体外受精程序对所述女性受治疗者的评价。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述体外受精程序是所述女性受治疗者的至少第二次体外受精程序。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述体外受精程序包括确定用于植入的胚胎数。

32.根据权利要求29所述的方法，其中所述体外受精程序提供活产事件。

33.根据权利要求29所述的方法，其中所述体外受精程序提供活产事件。

34.根据权利要求29所述的方法，其中所述女性受治疗者是体外受精前(pre-IVF)程序患者。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述预选的患者变量包括年龄、卵巢储备下降、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、多囊卵巢病、季节、原因不明的女性不育、自然流产次数、年份、女性不育的其它原因、此前妊娠次数、此前足月分娩次数、子宫内膜异位症、输卵管病、输卵管结扎、男性不育症、子宫肌瘤、输卵管积水或男性不育症原因。

36.根据权利要求29所述的方法，其中所述女性受治疗者是外科手术前(pre-OR)程序患者。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述预选的患者变量包括年龄、子宫内膜厚度、卵母细胞总数、施用促性腺素的总量、洗涤后活动精子总数、洗涤前活动精子总数、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、采精、配偶年龄、季节、自然流产次数、原因不明的女性不育、此前足月分娩次数、年份、此前妊娠次数、女性不育的其它原因、子宫内膜异位症、男性不育症、输卵管结扎、多囊卵巢病、输卵管病、来自供者的精子、输卵管积水、子宫肌瘤或男性不育症原因。

38.根据权利要求29所述的方法，其中所述女性受治疗者是体外受精后(post-IVF)程序患者。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述预选的患者变量包括胚泡发育速度、胚胎总数、施用促性腺素的总量、子宫内膜厚度、短方案、每个胚胎的平均细胞数、所用导管类型、移植的8细胞胚胎百分比、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、洗涤前活动精子数、洗涤后活动精子数、胚胎平均等级、胚胎移植日、季节、自然流产次数、此前足月分娩次数、口服避孕药、采精、未受精卵百分比、在4细胞期停滞的胚胎数、移植后第3天的紧密化、正常受精百分比、异常受精卵百分比、正常和成熟卵母细胞百分比、此前妊娠次数、年份、多囊卵巢病、原因不明的女性不育、输卵管病、仅男性不育症、男性不育症原因、子宫内膜异位症、女性不育的其它原因、子宫肌瘤、输卵管结扎、来自供者的精子、输卵管积水、ICSI表现或辅助孵化。

40.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法包括获得有关至少两个预选的患者变量的信息项。

41.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法包括获得有关至少五个预选的患者变量的信息项。

42.根据权利要求41所述的方法，其中预选的患者变量被提供相对于其它预选的患者变量的加权相对重要性。

43.根据权利要求29所述的方法，其中所述预选的患者变量包括年龄、胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平和移植的8细胞胚胎数。

44.根据权利要求29所述的方法，其中所述不育指示基因包括Oct4、Eif3c、Papola、Piwil2、Eif3b、Eif4b、Rbm3和Cpsf4。

45.根据权利要求29所述的方法，其中一种或多种不育指示基因的所述表达水平通过使用

动态阵列、RT-PCR或全转录组测序进行。

46.根据权利要求29所述的方法，一种或多种不育指示基因的所述表达水平是对胚胎确定。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述胚胎在受精后处于停滞发育。

48.根据权利要求29所述的方法，其中一种或多种不育指示基因的所述表达水平是对卵母细胞确定。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述胚胎在受精后处于停滞发育。

50.根据权利要求29所述的方法，其中所述比较所述女性受治疗者的所述谱包括应用判定规则。

51.根据权利要求29所述的方法，其中所述数据分析算法包括使用分类树。

52.根据权利要求29所述的方法，其中所述数据分析算法是非参数的。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述数据分析算法检测特征值分布的差异。

54.根据权利要求52所述的方法，其中所述非参数的算法包括使用Wilcoxon符号秩检验。

55.根据权利要求29所述的方法，其中所述数据分析算法包括使用多重累计回归树或通过梯度提升器(GBM)。

56.根据权利要求29所述的方法，其中所述数据分析算法是逻辑回归。

57.一种用于在为体外受精程序评价女性受治疗者中分析数据的系统，包括：

计算环境；

输入装置，所述输入装置与所述计算环境连接以从用户接收数据，其中接收的数据包括来自女性受治疗者的信息项以提供所述女性受治疗者的谱，其中每个信息项与预选的患者变量有关，

输出装置，所述输出装置与所述计算环境连接以向用户提供信息；和

计算机可读存储介质，其中存储至少一种算法以提供比较所述女性受治疗者的所述谱与已知指示对体外受精程序的响应度的已知谱图的文库，

其中所述系统提供可用于生成报告的结果，所述报告提供为体外受精程序评价女性受治疗者的数据分析。

58.根据权利要求57所述的系统，其中所述计算环境包括用户本地的本地计算机和在用户远程位置的远程计算机，其中所述本地计算机与所述远程计算机经由网络连接，且其中所述计算机可读存储介质设在所述远程计算机上。

59.根据权利要求57所述的系统，其中所述输入装置是个人计算装置或Smartphone装置。

60.根据权利要求57所述的系统，其中输入装置与所述计算装置的所述连接是经由有线连接或无线连接。

61.根据权利要求57所述的系统，其中所述无线连接是经由无线LAN连接、蓝牙连接协议、ZigBee连接协议、射频连接协议或手机连接协议。

62.根据权利要求61所述的系统，其中所述手机连接是经由码分多址(CDMA)或经由全球移动通信系统(GSM)。

63.根据权利要求57所述的系统，其中所述体外受精程序是所述女性受治疗者的至少第二次受精程序。

64.根据权利要求57所述的系统，其中所述体外受精程序包括确定用于植入的胚胎数。

65.根据权利要求57所述的系统，其中所述体外受精程序提供活产事件。

66.根据权利要求57所述的系统，其中所述体外受精程序提供活产事件。

67.根据权利要求57所述的系统，其中所述女性受治疗者是体外受精前(pre-IVF)程序患者。

68.根据权利要求57所述的系统，其中所述预选的患者变量包括年龄、卵巢储备下降、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、多囊卵巢病、季节、原因不明的女性不育、自然流产次数、年份、女性不育的其它原因、此前妊娠次数、此前足月分娩次数、子宫内膜异位症、输卵管病、输卵管结扎、男性不育症、子宫肌瘤、输卵管积水或男性不育症原因。

69.根据权利要求57所述的系统，其中所述女性受治疗者是外科手术前(pre-OR)程序患者。

70.根据权利要求69所述的系统，其中所述预选的患者变量包括年龄、子宫内膜厚度、卵母细胞总数、施用促性腺素的总量、洗涤后活动精子总数、洗涤前活动精子总数、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、采精、配偶年龄、季节、自然流产次数、原因不明的女性不育、此前足月分娩次数、年份、此前妊娠次数、女性不育的其它原因、子宫内膜异位症、男性不育症、输卵管结扎、多囊卵巢病、输卵管病、来自供者的精子、输卵管积水、子宫肌瘤或男性不育症原因。

71.根据权利要求57所述的系统，其中所述女性受治疗者是体外受精后(post-IVF)程序患者。

72.根据权利要求71所述的系统，其中所述预选的患者变量包括胚泡发育速度、胚胎总数、施用促性腺素的总量、子宫内膜厚度、短方案、每个胚胎的平均细胞数、所用导管类型、移植的8细胞胚胎百分比、第3天促卵泡激素(FSH)水平、体重指数、洗涤前活动精子数、洗涤后活动精子数、胚胎平均等级、胚胎移植日、季节、自然流产次数、此前足月分娩次数、口服避孕药、采精、未受精卵百分比、在4细胞期停滞的胚胎数、移植后第3天的紧密化、正常受精百分比、异常受精卵百分比、正常和成熟卵母细胞百分比、此前妊娠次数、年份、多囊卵巢病、原因不明的女性不育、输卵管病、仅男性不育症、男性不育症原因、子宫内膜异位症、女性不育的其它原因、子宫肌瘤、输卵管结扎、来自供者的精子、输卵管积水、ICSI表现或辅助孵化。

73.根据权利要求57所述的系统，其中所述方法包括获得有关至少两个预选的患者变量的信息项。

74.根据权利要求57所述的系统，其中所述方法包括获得有关至少五个预选的患者变量的信息项。

75.根据权利要求74所述的系统，其中预选的患者变量被提供相对于其它预选的患者变量的加权相对重要性。

76.根据权利要求57所述的系统，其中所述预选的患者变量包括年龄、胚胎总数、分裂停滞率、8细胞胚胎数、第3天促卵泡激素(FSH)水平和移植的8细胞胚胎数。

77.根据权利要求57所述的系统，其中接收的数据还包括一种或多种不育指示基因的表达水平。

78.根据权利要求77所述的系统，其中所述不育指示基因包括Oct4、Eif3c、Papola、Piwil2、Eif3b、Eif4b、Rbm3和Cpsf4。

79.根据权利要求77所述的系统，其中一种或多种不育指示基因的所述表达水平通过使用

动态阵列、RT-PCR或全转录组测序进行。

80.根据权利要求77所述的系统，其中一种或多种不育指示基因的所述表达水平是对胚胎确定。

81.根据权利要求80所述的系统，其中所述胚胎在受精后处于停滞发育。

82.根据权利要求77所述的系统，其中一种或多种不育指示基因的所述表达水平是对卵母细胞确定。

83.根据权利要求82所述的系统，其中所述胚胎在受精后处于停滞发育。

84.根据权利要求57所述的系统，其中所述比较包括应用判定规则。

85.根据权利要求57所述的系统，其中所述数据分析算法包括使用分类树。

86.根据权利要求57所述的系统，其中所述数据分析算法是非参数的。

87.根据权利要求86所述的系统，其中所述数据分析算法检测特征值分布的差异。

88.根据权利要求86所述的系统，其中所述非参数的算法包括使用Wilcoxon符号秩检验。

89.根据权利要求57所述的系统，其中所述数据分析算法包括使用多重累计回归树或通过梯度提升器(GBM)。

90.根据权利要求57所述的系统，其中所述数据分析算法是逻辑回归。