CN102112594A - 细胞培养系统的样品端口 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞培养系统，包括用于在生长培养基中培养生物细胞的培养室和用于测量废生长培养基中信号的传感器，其中所述培养室被提供在中等尺寸生物反应器平台中，所述中等尺寸生物反应器平台具有用于生长培养基的流入流的入口开口和用于废生长培养基的流出流的出口开口，所述废生长培养基与可松脱式采用的所述传感器的样品端口流体连通。此外，本发明公开了一种用于测量来自细胞培养系统中的培养室的废生长培养基的流出流的方法。

Description

细胞培养系统的样品端口

技术领域

本发明涉及一种用于培养生物细胞的细胞培养系统和一种用于测量废生长培养基中信号的传感器，其中培养室被提供在中等尺寸生物反应器平台中，该中等尺寸生物反应器平台具有入口开口和与可松脱式采用的传感器的样品端口流体连通的出口开口。本发明进一步涉及一种测量来自细胞培养系统中培养室的流出流的方法；所测量的信号可用于调节培养室中的条件。

背景技术

当前在用于胚胎培养的体外受精(IVF)中所用的方法依赖于在静止条件下于培养皿中培养胚胎。这种方法是劳动密集的，因为更换生长培养基需要大量的人工操作。人工操作总会有引入污染的风险，而且静止条件与体内条件的相似性不高，其难以满足胚胎不断改变的需求。与当前体外静止条件相比，体内胚胎处于不断改变的环境，而且一个发育阶段中胚胎的需求可能与另一个发育阶段中胚胎的需求有很大不同。一个发育阶段的体内条件甚至可能对后面发育阶段的胚胎有害。

基于静止的培养皿培养系统的一些缺点可以通过在能够向胚胎灌注适合其发育阶段的生长培养基的培养系统中培养胚胎而避免。这种系统应该有与胚胎尺寸相匹配的适当尺寸并且更近似于体内条件。此外，以小规模进行运作是重要的，以最小化此类哺乳动物细胞通常所需的昂贵的生长培养基的消耗。

现在许多所谓的微流体设备已经被描述用于进行各种类型的分析或用于培养细胞。这些设备常常用各种原理制造，这些原理通常受到二十世纪七十年代基于硅的微电子学技术的发展的启发。微流体应用的实例为DNA分析，涉及的原理如用于例如检测单核苷酸多态性的聚合酶链反应或使用例如毛细管电泳法的蛋白质分析。

然而，“真正的”微流体设备(例如具有约100μm或更小直径的流体通道)确实具有许多缺点，其中一些缺点对于为灌注型操作设计的细胞培养设备特别明显。正如从Hagen-Poiseuille方程可见，在有液流的例如100μm通道中压力降变得很大，对于欲在此规模操作的泵提出了高要求，因为这样的泵必须能对抗相当大的反压而精确地配出很小的体积。由于这个原因，在此规模经常使用所谓的电渗流产生液流，其中，在盐水溶液中通过暴露于巨大的电位下生成液流。但是这样的电渗流不适于涉及活(哺乳动物)细胞的系统。

微流体中遇到的另一个问题是关于“与外界的连接”的问题。生物学实验室中所用的大部分设备，如泵和分析设备，比微流体设备大得多以至于两个级别的整体形成变得问题重重。如250μm直径(容易得到的)这样小的管与芯片的连接点对于实验室工作人员而言难以操作，而且可能迅速引入几倍于微流体系统体积大小的死体积。这个问题对于灌注型细胞培养设备尤其重要，其中操作复杂性和流体在连接至微流体系统的管中的长滞留时间增加了逆流污染的风险。在培养哺乳动物胚胎的情况下，培养时间可能达五天或更长。

当用灌注型细胞培养系统进行操作时，希望能够快速地分析存在于培养室中的生长条件，使得可使用分析结果来修正反馈机制中的条件。例如，当参数值，如pH值或温度或化学实体存在与否接近限定的极限时，可能需要改变条件以使参数值远离极限值，或调节条件以匹配细胞的发育状态。为了提供这种反馈机制，微生物反应器可安装整体形成的传感器。整体形成的传感器的一些应用和实例已描述在文献中。

因此，例如WO07/044699描述了一种微型生物反应器，其用于在代谢工程研究领域中建立商业上相关的生产生物体尤其是微生物菌株的平行研究。WO07/044699的生物反应器的生长室中的整体形成的传感器使传感器的信号在反馈控制仪器中用于通过从储存器中注射液体来调整生长室中的环境条件，通常是pH值。

WO07/044699的微型生物反应器的基本原理使得它们通过向生长室中脉冲液体以维持恒定的环境条件而适于进行分批补料型细胞发酵。但是，液体的脉冲式供应和储存器的相对于生长室尺寸而言的有限尺寸(即15-25μL)使系统不适于进行长期类似灌注的操作，如恒化培养或向室中细胞连续供应培养基(即由于25μL的储存器尺寸和～270nL的脉冲大小，有不到100次的脉冲可用)。

Petronis等(2006，BioTechniques 40：368-376)描述了用于HeLa细胞的长期培养的微流体生物反应器设备。此设备由热塑性聚合材料构建并含有整体形成的氧化锡铟膜以加热生长室。所述室还包括温度传感器和允许在传感器和加热元件之间协作的带有电脑的仪器，从而可以用反馈的方式控制室的温度。Petronis等(2006)的生物反应器的小尺寸使得能够迅速控制室中的温度。

以上实例全部采用整体形成的传感器。然而，整体形成的传感器有相当多的缺点。上述系统中细胞的监测受限于由整体形成的传感器所限定的参数，且此类系统不灵活。例如，细胞的不可预期的反应需要分析本体或参数，这在制备生物反应器和整体形成的传感器时是不可预测的。因此，希望这样的系统，其中可使用位于生物反应器外部的传感器分析任何给定的参数。

而且，在微生物反应器中传感器的整体形成可使得微生物反应器的制备过于昂贵和复杂。如果出于医学目的而意欲再利用具有整体形成的传感器的微生物反应器时，由于不同患者使用间的污染风险导致难以获得权威机构如FDA或CE的许可。因此，如果再使用微生物反应器时，实验间交叉污染的风险导致人们希望丢弃微生物反应器。如果生产具有不同类型的传感器的生物反应器以使系统更灵活(传感器的类型对特定类型的细胞培养并不全需要)，与单位费用相关的考虑将特别明显。而且，对于培养再注入患者的细胞，如用于再生医学、免疫治疗和IVF目的生长的细胞，特别希望一次性生物反应器。

相反，WO07/044938描述了一种用于精确取一或多微升或纳升体积样品的微流体取样系统。WO07/044938描述了在弹性聚(二甲基-硅氧烷)(PDMS)中构建的系统，所述系统包括与多个开关连接的入口端口，其中开关可引导测量体积的流体样品经由通道进入样品孔。开关通过提供流体流来移动流体样品的通道可操作地连接其中一个开关，其中测量体积的环可净化来自系统的样品流体。系统也可包括多个输出端口，所述输出端口通过提供流体流来移动流体样品的通道可操作地连接样品孔。因此，换句话说，WO07/044938描述了一种用于收集大量特定样品孔中来自流体流的测量体积的样品的微流体设备。然而，WO07/044938的设备具有复杂的缺点，这点从制造前景和操作期间均可见。设备的设计导致体系中潜在的死体积，这使得需要在样品收集期间清洗设备的通道。如果将从收集样品获得的分析结果用于反馈控制，这些原则会引起延迟。

因此，本发明的目的是提供一种用于培养生物细胞的简单且便宜的细胞培养系统，所述细胞培养系统包括培养室，该培养室可灵活允许分析在细胞培养期间，特别是来自培养室下游的培养基内含物，以最大程度降低培养室的污染风险。本发明的另一个目的是所述设备在适用于哺乳动物胚胎的规模和时间上适用于灌注型操作。本发明的另一个目的是所述设备是一次性地，在其制备期间不会对环境产生过度的压力。

发明内容

本发明涉及一种细胞培养系统，包括用于在生长培养基中培养生物细胞的培养室和用于测量废生长培养基中信号的传感器，其中所述培养室被提供在中等尺寸生物反应器平台中，所述中等尺寸生物反应器平台具有用于生长培养基流入流的入口开口和用于废生长培养基的流出流的出口开口，所述废生长培养基与可松脱式采用的所述传感器的样品端口流体连通。所述出口开口可与被提供在所述平台中的流出通道流体连通，使得所述传感器可用在与所述流出通道的所述废生长培养基流体连通的所述样品端口中。通过将样品端口置于所述培养室的下游，能够使用所述样品端口中的传感器分析来自所述培养室的液体流。此仪器特别适用于灌注有液体如生长培养基或培养基的培养室。在这种情况下，所述培养室具有用于流入液体的入口开口和用于流出液体的出口开口，使得所述培养室可被液体灌注。然而，所述样品端口也可与分批操作的培养室一起使用。在两种操作原理中，将所述样品端口置于所述培养室的下游将最大程度减小所述培养室被病菌或病原体污染的风险，因为所述液体流将迫使病菌远离所述培养室。

废培养基将经由所述通道被从所述培养室送至所述样品端口，其中所述液体可使用传感器分析。在反馈机制中，分析结果可随后用于修正供应到细胞的培养基成分。所述液体流从所述样品端口被引导至可位于所述生物反应器平台外部的废物容器中。在一个实施方式中，所述生物反应器平台中的全部室、储存器、培养室、样品端口容器和废物容器采用向上开孔的形式。这些室中的一个或多个可进一步包括一层水不混溶性液体。

所述传感器可松脱式用在所述样品端口中。这为分析来自所述培养室的流出液体提供了灵活性，因为任何可利用的传感器可用在所述分析中。同样，所述流出液体的分析不限于单个传感器，因为与所述样品端口中液体接触的传感器可容易被另一个传感器所替代。所述传感器可为能提供用于分析生物细胞培养的相关参数的任何可利用的传感器。与大多数细胞如哺乳动物细胞、细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或植物细胞相关的参数为pH值、电导率、溶解氧(O₂)、二氧化碳(CO₂)、葡萄糖、流速、温度和光密度。更特定的参数为个体营养物、维生素、信号分子、激素、代谢物、蛋白质或酶。核酸如DNA或RNA也为相关的。所述传感器可基于任何类型的信号起作用。例如，所述传感器能够记录电学信号、光学信号、荧光信号等，且感兴趣的实体可直接或间接测量。

样品端口被构建为使得其为来自所述培养室的液体流提供物理通路。来自所述培养室的液体流的物理通路允许所述液体与所述传感器接触，即所述传感器可采用在所述样品端口中，以便用所述传感器分析或测量所述液体。因此，与具有整体形成的传感器的生物反应器系统相反，所述样品端口允许用任何可利用的传感器分析所述液体。由此，可再次使用所述传感器，使得能够构建便宜且一次性的生物反应器平台。或者，也能够经由所述样品端口取样品，以用于外部分析。

所述细胞培养室的所述样品端口可包括容器，所述容器具有用于来自所述培养室的所述流出通道的第一开口和用于排出所述废生长培养基的废物通道的第二开口。因此，可限制液体的量，以使所述容器中仅保留给定传感器所需的液体量。而且，传感器进行的分析也可因此很好反映出所述培养室中的当前条件，因为废培养基可在分析后从所述样品端口中去除。

样品端口容器也可包括用于另一入口通道的第三开口，该另一入口通道允许向所述样品端口引入与来自所述培养室的与所述流出流不同的液体。可使用另一这类入口以稀释来自所述培养室的流出流，以使所述流出流中的分析物浓度在给定的传感器的检测范围内，或所述流出流的体积可通过加入不同液体来增加。另一入口也允许在所述样品端口中原位清洗或校准传感器。

在一个实施方式中，所述样品端口整体形成在所述中等尺寸生物传感器平台上。通过根据此实施方式的细胞培养系统，可在所述液体离开所述培养室后立即进行所述液体流的分析。由于所述培养室和所述样品端口间的短暂延迟，允许获得如快速代谢的细胞的快速分析结果，此处其可能与快速变化的培养条件相关。

在另一个实施方式中，根据本发明的细胞培养系统包括用于培养生物细胞的两个或更多个室，其中每个室与所述样品端口分离的流体连通。在此实施方式中，因此可使用单个传感器来分析来自各个所述培养室的流出流。所述样品端口，例如具有样品端口容器的样品端口被定位成从两个或更多个细胞培养室接收流出流，其中每个细胞培养室具有用于废生长培养基的流出流的出口开口，所述出口开口与所述样品端口流体连通。两个或更多个细胞培养室的出口开口可各自与流出通道流体连通，所述流出通道提供所述样品端口与所述流出通道的废生长培养基的流体连通。在此实施方式中，如上所述，优选所述样品端口具有用于另一入口通道的开口，以允许向所述样品端口引入与来自所述培养室的流出流不同的液体。因此，可使用在所述样品端口中可采用的单一传感器来分析来自两个或更多个细胞培养室的分离的流出流；当存在样品端口的另一入口通道时，能够在分析来自细胞培养室的流出流之间可清洗或校准传感器。例如，在使用如水或缓冲液清洗所述传感器之前，可使用传感器在样品端口中分析来自第一细胞培养室，且仍处于所述样品端口中的流出流，并分析来自第二细胞培养室的流出流。

可在相同的中等尺寸生物反应器平台中提供两个或更多个培养室，或可在单个生物反应器平台中提供室。同样，培养室可共享相同来源的生长培养基/培养基，如培养室与用于生长培养基的相同的储存器流体连通，或每个培养室可具有单独的生长培养基/培养基来源。对于此实施方式，相关地是在各个培养室和样品端口之间流体连通是分离的，这是指在细胞培养系统中，来自一个培养室的流出流可独立于来自另一个培养室的流出流进行分析。

在一个实施方式中，样品端口可具有开口(如向上开口)的容器，所述容器可进一步包括一层水不混溶性液体(如油)。一层水不混溶性液体将最大程度降低液体的污染风险，而且此层也可限制溶剂从液体中蒸发，以此帮助保持在样品端口中待分析的液体的成分。

样品端口也可包括可闭合构件或弹性膜。可闭合构件或弹性膜对颗粒污染物(如病菌或病原体)提供附加的保护，同时仍提供与样品端口的物理通路。可闭合元件可采用铰接盖或滑动盖的形式，因此样品端口的容器中的液体可通过打开盖来获取。弹性膜优选由具有自密封能力的材料制成。由此，液体可通过用适当装配的传感器，如用针等刺穿膜来获取，使得一旦移除传感器，膜的自密封能力将产生作用。

根据本发明的细胞培养系统可具有流出通道，所述流出通道的一端被连接到培养室的出口开口，另一端被连接到联接装置，样品端口被连接到在远端具有互补联接装置的软管，从而确保将来自流出通道的废培养基输送至样品端口。当样品端口在中等尺寸生物反应器平台外部时，培养室和样品端口之间的此流体连通原则特别有利。由于互补联接装置，此原则允许中等尺寸生物反应器平台与培养室和样品端口快速联接。例如，中等尺寸生物反应器平台可被包括于装配在细胞培养系统的筒中，使得系统中筒的插入将提供互补联接装置间的联接，以此保证来自流出通道的废培养基输送至样品端口。联接装置在流出通道和软管间可采用在流出通道和软管之间的联接凹凸型联接(如钥-锁联接)的形式，联接，其中所述软管例如装配到通道的端部中。联接装置也可包括向上的开孔，使得流出通道在培养室的出口开口和此向上的开孔之间提供流体连通。互补联接装置然后可包括插入到向上开孔中的例如采用管(如内径0.5mm或0.25mm的特氟龙管)形式的软管。随后，液体从向上的开孔吸入特氟龙管将确保将废培养基从流出通道输送至样品端口。位于生物反应器平台外部的样品端口可进一步包括用于控制温度的装置，如用于加热或冷却的peltier元件、加热线圈、采用液体或气体等的热交换器。样品端口的温度控制装置可优选控制样品端口的温度，其独立于细胞培养室的温度。

而且，根据本发明的另一实施方式，无菌过滤器存在于培养室的流出通道和样品端口之间的废培养基的流中。无菌过滤器可包括孔径约0.1μm至约0.5μm，如0.22μm或0.45μm的过滤器。无菌过滤器可包括在上述联接装置的任一个中，或其可整体形成入软管或作为软管的一部分。无菌过滤器的位置不重要，只要基本上从培养室至样品端口的全部废培养基通过过滤器。

细胞培养系统的中等尺寸生物反应器平台可包括与培养室流体连通的一个或多个培养基储存室。与具有从外部储存器供应培养基的培养室的中等尺寸生物反应器平台相比，包括在中等尺寸生物反应器平台内的培养基储存器可最大程度降低培养室的污染风险。当中等尺寸生物反应器平台包括培养基储存器时，细胞培养系统也可包括将来自储存器的流提供至培养室的装置。这类装置可采用适合的泵的形式，该适合泵可被整体形成至中等尺寸生物反应器平台中，或在中等尺寸生物反应器平台的外部但整体形成至细胞培养系统中。在另一个实施方式中，中等尺寸生物反应器平台包括两个或更多个培养基储存器，其中储存器经由不同导管与培养室流体连通。不同导管允许从两个或更多个储存器中的任一个或其组合向培养室提供培养基。此生物反应器平台特别适用于在灌注条件下培养细胞。因为生物反应器平台具有多个储存器，所以其可以根据细胞的当前条件调节供应给细胞的培养基成分。

生物反应器平台优选由一种或多种热塑性聚合物，如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、环烯烃共聚物或聚苯乙烯(PS)构建，但是也可使用其它材料如金属、玻璃或陶瓷，。

流入和流出样品端口的液体流可通过向流出通道提供液体驱动力来控制。此液体驱动力可由泵提供，或在细胞培养系统包括若干向上开口的室的情况下，由上水平面相对于水平平面之差产生的虹吸作用提供。

根据本发明的细胞培养系统可被包括在闭合罩中以确保内稳态。此闭合罩可包括舱室，其供应气体以产生围绕中等尺寸生物反应器平台的空气层流，如垂直围绕中等尺寸生物反应器平台的空气层流，在舱室的底部分段中具有空气入口且在顶部分段处具有空气出口。当细胞培养系统包括单独的生物反应器平台时，此系统可具有用于每个生物反应器平台的舱室。空气层流也可以被水平定向围绕中等尺寸生物反应器平台。当中等尺寸生物反应器平台包括培养室和可选地一个或多个向上开口的储存室时，可进一步控制空气层流的气体成分，以调节气体如CO₂或O₂扩散入室中。闭合罩也可包括温度调节系统，如具有温度调节元件的金属块。

细胞培养系统也可包括数据处理单元，其能够分析来自传感器的信号并将此信号转换为分析结果。此系统也能够在如显示器上向操作者显示分析结果，所述操作者可使用此结果在如反馈机制中修改中等尺寸生物反应器平台的操作参数。

细胞培养系统可进一步包括用于控制培养室操作参数的装置，其中数据处理单元能够将命令发送至控制单元，控制单元能够调节装置以控制操作参数。操作参数可包括供应至培养室的培养基的化学成分、培养室中液体的流速、生物反应器平台的温度、培养室中的pH值、生物反应器平台周围的气体成分等。将根据每个参数的性质来控制操作参数。例如，流速可使用整体形成的泵或外部泵控制，温度可使用如加热块控制，培养基成分可通过改变包括不同培养基的多个储存室之间的流速来修改，培养室的pH值可通过改变向上开口的培养室上的气体组成如CO₂含量来调节。系统也能够自动应用反馈机制中来自传感器的信号。

在另一方面，本发明涉及测量来自本发明细胞培养系统中培养室的废生长培养基的流出流的方法，包括步骤：在培养室中提供生物细胞；向所述培养室灌注通过所述培养室的所述入口开口进入并通过所述出口开口离开的生长培养基；将所述废生长培养基输送至样品端口；使所述流出通道的所述废生长培养基接触所述传感器；和测量所述废生长培养基中的信号。该方法可另外包括在测量信号的基础上，调节所述培养室中条件的步骤。

操作者或控制单元可使用来自传感器或来自所得分析结果的信号，以评价细胞的条件，并在信号或分析结果以及细胞条件的基础上，操作者可选择对培养室条件做适当修改。例如，可调节温度以维持恒定温度或达到较高或较低温度。同样，可改变化学成分或pH值，或可采取若干步骤以保持这些参数为恒定值。

因此，从传感器获得的信号可被采用以在反馈机制中修改供应给培养室中细胞的培养基成分。可采用反馈机制来维持细胞的稳态条件，或可调节细胞的条件以引起细胞内变化。例如，可监测来自培养室的液体中组分的浓度，使得如果组分的浓度接近预定极限值，可修改供应给细胞的培养基的成分以维持浓度在所需范围内。同样，特定组分的出现和检测可导致调节所供应的培养基的成分，以引起细胞内变化。

附图说明

现将参照以下附图来更详细地描述本发明，其中：

图1示意性地示出根据本发明的细胞培养系统的侧视图。

图2示意性地示出根据本发明的另一实施方式的细胞培养系统的侧视图。

图3示意性地示出根据本发明的另一实施方式的细胞培养系统的侧视图。

图4示意性地示出根据本发明的另一实施方式的细胞培养系统的侧视图。

图5显示自上方察看的根据本发明的一个实施方式的室和通道的布局。

图6示意性地示出具有数据处理单元和控制单元的细胞培养系统。

图7a显示本发明的中等尺寸生物反应器平台的透视图。

图7b显示具有本发明的中等尺寸生物反应器平台的细胞培养系统的照片。

具体实施方式

本发明涉及一种用于在生长培养基中培养生物细胞的生物培养系统和一种用于测量样品端口中信号的传感器，以及一种分析来自培养室的流出流的方法。

本发明的术语“生物反应器”涵盖适于培养生物细胞的系统和设备。公开的生物反应器尤其适于哺乳动物细胞。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞为与体外受精相关的细胞，所述细胞将包括精子、卵母细胞和/或胚胎。然而，对本领域技术人员而言将显而易见的是，所述生物反应器平台还可以用于其它哺乳动物细胞类型，如干细胞或免疫系统细胞，如单核细胞、树突细胞、T细胞等。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞为人细胞。此外，本发明中公开的中等尺寸生物反应器平台还可用于培养除哺乳动物细胞以外的细胞类型。例如，在本文公开的生物反应器平台中还可培养细菌、酵母、真菌、植物或昆虫细胞。

本发明含义中的生物反应器将包括与样品端口流体连通的培养室。生物反应器也可包括用于培养基的储存室。在本发明的上下文中，术语“培养基”是指任何液体，其可被供给培养室中所培养的细胞以控制细胞的条件。因此，“培养基”可指包含盐、缓冲组分、营养物、诱导细胞内作用的因子(如分化等)、或单纯的缓冲剂而无营养物等的生长培养基。通常可以说培养基是指其中未培养过细胞的液体。

在本发明的上下文中，术语“中等尺寸”意指涵盖这样的尺寸范围，其中通道的最小尺寸处于约100μm到约3mm的范围，尽管通道还可能包含收缩部。同样，培养室可以具有约500μm到约5mm或更深的深度，并且最大的水平尺寸可以为从约1mm到约50mm。储存室的尺寸必须足够在灌注条件下培养细胞。总而言之，中等尺寸流体系统中的流体将在层流条件下流动，并且只要系统中包含的流体在层流条件下流动，具有不同于上面所定义的通道或室的流体系统可以称为“中等尺寸”。

根据本发明的中等尺寸生物反应器平台的样品端口和其可选的容器具有足以允许传感器接触容器中液体的尺寸。在一个实施方式中，样品端口向上开口，且通过将传感器插入液体中来简单地使其接触液体。除了尺寸上与传感器尺寸匹配之外，容器可被设计尺寸以获得通过容器的特定线性流速。例如，希望增加容器相对于与培养室流体连通的流出通道的横截面积，以降低流过容器的液体的线性速度。因此，可修改流过容器的液体的停留时间，以在需要时匹配传感器的要求。

本发明的生物反应器平台适于在灌注条件下操作。上下文中术语“灌注”是指通常连续流被应用于设备的培养室。此连续流不局限于某一流速，而在使用本发明的生物反应器平台的实验过程期间可使用几种不同的流速。虽然适合的流速为约1μL/h至约200μL/min或更高，但是也可使用更低的流速。典型的流速为约5、7.5、10、12.5、15或20μL/h。流可在脉冲中产生；以少量脉冲，以每次脉冲小体积，如0.5μL、1μL等的如1、2、3或至多10次脉冲，每次时间间隔，如每分钟或每小时，如每小时1μL的1次脉冲，流在实践中以连续流进行。应该强调的是，如有必要所述的流也可被停止，例如用于进行涉及培养室的内容物的各种操作。此外，还要考虑允许生物细胞静止的中间操作。

以允许物理进入液体的方式构建样品端口，所述液体来自样品端口的容器中的培养室。在上下文中，术语“物理进入”是指可以将传感器插入到容器的液体中，以使传感器接触液体。培养室也可允许使用适合的装置来物理进入，以插入或去除来自培养室的一种或多种细胞，或操作已存在于培养室中的细胞。当传感器被设计以允许通过将传感器插入至向上开口的室中、通过穿透弹性膜、通过在打开盖后被插入等(适用于给定传感器)来允许传感器接触样品端口中的液体时，传感器可被称为在样品端口是“可采用的”。而且，传感器也可从样品端口移走，因此样品端口可被称为用于“松脱式采用”传感器。

一方面，本发明包括“数据处理单元”。此术语是指电脑或类似设备，其能够收集来自系统中的传感器的信号，并将它们转换为操作者能够理解的数据，即分析结果。数据处理单元还可包括显示器或类似物以显示此分析结果。通常，传感器可读取观测值，如光学信号，如光强度或基于如参比电极的电信号，并将其转换为电信号。当数据处理单元接受此电信号时，其可与对应于已知参数值的标准对比，并在适当单元中转换为分析结果，以分析结果呈现。

数据处理单元还可能够将命令发送至用于控制中等尺寸生物反应器平台中操作参数的“控制单元”。这些命令可基于来自传感器的信号或分析结果，并将作为电信号被发送至控制单元。来自传感器的信号可比作被送至控制单元的包含一列命令的指令组，以响应给定参数值。例如，pH值的增加可产生增加向上开口的培养室上的CO₂浓度的命令，因此增加液体的CO₂浓度，并因此降低培养室内的pH值。用于IVF目的的适合pH值在7.2和7.5之间，特别地最佳pH值在7.25至7.45的范围内。也可由操作者向控制单元下命令，以改变培养室中的条件。

本发明的细胞培养系统1包括用于在生长培养基22中培养生物细胞21的培养室2和用于测量废生长培养基中信号的传感器3，其中培养室2被提供在中等尺寸生物反应器平台10中，中等尺寸生物反应器平台10具有用于生长培养基的流入流的入口开口23和用于废生长培养基的流出流的出口开口24，所述废生长培养基与可松脱式采用的传感器3的样品端口5流体连通。在一个实施方式中，出口开口24与提供在平台10中的流出通道4流体连通，传感器3可采用在与流出通道4的废生长培养基流体连通的样品端口5中。样品端口5可进一步包括具有用于来自培养室2的流出通道4的第一开口52和用于排出废生长培养基的废物通道6的第二开口53的容器51。

样品端口容器51也可包括用于另一入口通道的第三开口(未显示)。此另一入口通道允许将与来自培养室2的流出流不同的液体(如水、缓冲液、校准液、用于清洁传感器的液体等)引入样品端口5中。可将水(如蒸馏水、去矿物质水、milli-Q水等)引入样品端口容器51中，以稀释来自培养室2的流出流的内容物；此步骤可适用于将目标分析物的浓度调节为适用于分析物传感器的浓度范围。也可加入水以增加样品端口容器51中液体的体积。例如，可加入水以增加体积，使得其适用于通过特定传感器(如pH电极)分析。在前面情况中，重要地是控制所加入的水量，以计算来自培养室的流出流的分析物浓度。在后面情况中，也希望加入特定量的水，虽然在此情况中来自培养室的流出流包括缓冲液，但适当稀释流出流将不显著改变pH值。例如，在加入水以将体积调节至约30-100μL或更高以允许使用标准pH电极测量pH值之前，可持续一段时间收集流的体积以达到所需体积(如约15μL)。典型的流速可为5、7.5、10、12.5、15或20μL/h，且可从流速计算收集时间。对于一些参数(如pH值)的分析，收集的准确体积不很重要。然而，体积应足够用于分析。由于生长培养基中存在缓冲液，所以尽管加入水，所记录的pH值将密切地反映来自培养室的流出流的pH值。另一个出口也将允许传感器(如pH电极)被清洗或原位校准，而无需将传感器从样品端口移开。

中等尺寸生物反应器平台10可由其中限定有培养室2和通道4的基片11构建。基片优选为热塑性聚合物，如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、环状烯烃共聚物或聚苯乙烯(PS)，且在优选的实施方式中，至少培养室2的底部和可选的储存室8在电磁波谱可视区内对光线透明。在另一个优选的实施方式中，底部材料对紫外光谱内，如在250和400nm之间的光线也是透明的。基片11也可包括其它材料，如金属、玻璃或陶瓷，或基片11可包含若干种材料的组合。例如，包括组成室和通道的结构的聚合材料可被胶合或附接至载玻片，如显微镜载玻片。室和通道也可限定在聚二甲基硅氧烷(PDMS)基片上，所述基片可被附接至更硬材料的载玻片上。例如，可浇铸或模制具有室和通道的PDMS基片，且在固化后，基片的一个表面可用氧等离子体处理，随后附接至载玻片。

样品端口5也可由与基片11的一般特性相同的基片11’构建。容器51被构建为基板11上的培养室2。

样品端口5的容器51可对周围环境开放，且在一个实施方式中，容器51包括向上的开孔。在容器51中，通过将传感器3插入液体，此开放性允许传感器3接触液体，如来自培养室2的液体的流出流。通常需要确保控制经由流出通道4进入容器51的液体的流动以及经由废物通道6离开容器51的液体的流动。当两个通道4和6中存在基本上相等的流速时，容器51中将存在相对于液体水平面的稳定态。通道4和6中的流速可使用一个或多个泵(未显示)来控制；如果样品端口5也为整体形成的，如蠕动型或微环齿轮泵可整体形成在生物反应器平台中，或泵可位于外部。

当中等尺寸生物反应器平台包括向上开口的培养室2时，培养室2中的培养基可具有一层水不混溶性液体25，如石蜡油。此水不混溶性液体25可随后在培养室2上形成封闭物，防止溶剂从培养室2中蒸发，并进一步允许通过调节培养室2上CO₂的压力来控制pH值。

位于外部的泵，如蠕动泵、活塞泵、注射泵、膜泵、隔膜泵、齿轮泵、微环(microannular)齿轮泵或任何其他适当类型的泵可为入口开口23提供正相对压力，因此将来自培养室2的液体分配入流出通道4中并进一步进入样品端口5中。相反，可对废物通道6施加负相对压力，由此将液体经由流出通道4从培养室2吸入样品端口5。也可在安装有适合泵的细胞培养系统1中提供这种各自的正和负相对压力。

如果若干向上开口的室(如储存室8和培养室2以及可选地具有容器51的样品端口5)包括在相同的中等尺寸生物反应器平台中，室之间上表面水平面与水平平面的差将决定室之间的压力差。此压力差将使得在较高水平面处的液体向具有较低上表面水平面的室虹吸。在本发明的上下文中，提供液体驱动力的这种原理被称为“虹吸作用”。

当中等尺寸生物反应器平台10具有培养室2，培养室2中液体的水平面比位于培养室2下游样品端口5的容器51的水平面更高，而培养室2下游样品端口5的容器51的水平面比位于整体形成在中等尺寸生物反应器平台10上或在中等尺寸生物反应器平台10外部的样品端口5下游的废物容器中(未显示)液体水平面更高时，将形成液体驱动力，驱动液体流从培养室5至容器51，并从容器51至废物容器，同时保持容器51中的液体水平面基本上恒定。通过布置培养室2上游的储存室8，其中此储存室8具有比培养室52更高的液体水平，此原理也可被扩展。使用此虹吸作用提供的液体驱动力也可通过位于外部或整体形成的泵来增补。例如，可增加储存器8上的空气压力，或液体可从容器51或废物容器中吸出，导致流从储存室8至培养室2，进一步至容器51并进入废物容器。这样可将培养室2和容器51中液体水平面保持在恒定状态。

在中等尺寸生物反应器平台的一个实施方式中(未显示)，样品端口进一步包括提供物理进入容器的可闭合元件或弹性膜。此构造允许进入容器，同时保持最低的污染风险。中等尺寸生物反应器平台的可闭合元件可具有铰接或滑动的盖子的形式，且弹性膜可具有自密封能力。因此，通过打开铰接或滑动的盖子并将传感器插入容器内的液体中，可使样品端口的容器接触传感器。可用尖锐物体穿透弹性膜，特别是具有自密封能力的弹性膜，以使传感器接触容器内的液体。

在图3所示的优选实施方式中，细胞培养系统1具有流出通道4，其一端4’连接培养室2的出口开口24且另一端4’连接联接装置41，且样品端口5连接在远端7’具有互补联接装置71的软管7，确保将来自流出通道4的废培养基输送至样品端口5。图3显示向上开孔形式的联接装置41，软管7的远端7’插入开孔中，使得远端7’代表互补联接装置71。软管优选为0.5mm或0.25mm内径的特氟龙管。若干种类的连接系统很容易获得，如MikrolabAarhus A/S(Aar-hus，Denmark)提供的那些，以将软管7与样品端口5连接。样品端口5优选在中等尺寸生物反应器平台10的外部。这使得包含培养室2的中等尺寸生物反应器平台10可独立于传感器3构建，使得便宜的中等尺寸生物反应器平台10可构建、使用和使用后丢弃，而样品端口5中可能较昂贵的传感器3可多次使用。在图3的实施方式中，来自培养室2的细胞21等难以到达样品端口5中的传感器3。然而，无菌过滤器72可优选存在于培养室2的流出通道4和样品端口5之间废培养基的流中。这类过滤器72可具有约0.1μm至约0.5μm，如0.22μm或0.45μm的孔径。具有这些特征的过滤器同样易于商购。

在图5所示的本发明的另一个优选实施方式中，中等尺寸生物反应器平台10分别具有两个用于生长培养基的储存室8a，b，所述储存室8a，b分别经由不同通道81，82与用于生物细胞21的培养室2流体连通。不同通道81和82可经由支管83与培养室2流体连通，或它们可直接连接培养室2(未显示)。储存室8a，b和培养室2优选向上开口。当这些储存室是向上开口时，其中的含水液体可各自具有一层水不混溶性液体，如石蜡油。水不混溶性液体可在向上开口的室2，8a，b上形成封闭物。此封闭物将防止颗粒如病菌或病原体污染，防止溶剂从室蒸发并提供热绝缘层。重要地是，水不混溶性液体层将允许气体如CO₂或O₂扩散进入或离开室内的含水液体。控制CO₂在室上可用于控制室内含水液体的pH值，因为高CO₂压力将降低液体的pH值，然而低CO₂压力可允许pH值增加。

培养室2经由流出通道4与联接装置41流体连通，其同样位于中等尺寸生物反应器平台10上。联接装置41连接软管7上的互补联接装置。软管7将液体流，即废培养基从培养室2送至样品端口5。

本发明的中等尺寸生物反应器平台不限于单个培养室。在一些实施方式中，中等尺寸生物反应器平台包括若干培养室；当存在多个培养室时，它们可以一个或多个组排列。一个组中的室可与用于液体流的通道串联，且多个组可与用于液体流的通道并联。当设计生物反应器平台以利用上述虹吸作用时，生物反应器平台也可包括多个培养室。中等尺寸生物反应器平台可应用单个样品端口，使得来自培养室的全部液体流被引入同一样品端口，或每组串联的培养室可具有样品端口。当多个培养室连接同一样品端口时，所分析的液体可代表培养室的平均值。

在特定实施方式中，细胞培养系统包括用于培养生物细胞的两个或更多个室，其中每个室与样品端口分离的流体连通。每个室和样品端口之间不连续的流体连通允许单独分析室中的流出流。在本文中，两个或更多个室也可指两组或更多组培养室，其中对于每组，流出通道与样品端口流体连通。例如，细胞培养系统可包括如2至10个(如6个)生物反应器平台，其中每个生物反应器平台包括与细胞培养室或一组如4至20个(如12个)串联连接的细胞培养室流体连通的用于生长培养基的储存器(如1个储存器或2个储存器)。当生物反应器平台包括细胞培养室的串联组时，每组将通常用于相同来源的细胞。因此，例如，对于IVF用途，培养室组可包括来自同一患者的卵母细胞。生物反应器平台的串联培养室将与联接装置流体连通，这允许与互补联接装置连接并将来自培养室或培养室组的流出流送至样品端口；样品端口优选位于中等尺寸生物反应器平台的外部。虽然优选样品端口具有不同于来自培养室的流出流的液体的入口通道，但本发明其它实施方式的上述全部变形可等同于此实施方式。单独的生物反应器平台允许来自不同个体的细胞如胚胎或肝细胞等单独培养，以避免来自不同个体间的细胞接触。例如，可防止从单个个体的细胞分泌的信号分子如激素、细胞因子、趋化因子等影响来自另一个体的细胞。

用在细胞培养系统中的单独的生物反应器平台可进一步包括鉴定提供生物反应器平台中所培养细胞的个体的装置。例如，每个生物反应器平台可具有标记或编码，如彩色编码、编号、识别码、RFID芯片等，这能够简单确认生物反应器平台和其内容物。

当细胞培养系统包括单独的生物反应器平台，且这些生物反应器平台经由上述联接互补联接与样品端口液体连通时，可将生物反应器平台与样品端口连接和断开，而不影响细胞培养系统中的任何其它生物反应器平台。因此，可在彼此独立的单独的生物反应器平台中培养细胞。例如，在包括如六个生物反应器平台的细胞培养系统中，可将六个平台中的每个在任何时间插入细胞培养系统中，并经由联接互补联接与样品端口连接。这允许细胞培养方法如IVF过程的起始独立于IVF过程中所经过的时间点，所述IVF过程在细胞培养系统的其它生物反应器平台中进行。

包括多个单独的生物反应器平台的本发明的细胞培养系统可仅使用单个样品端口来分析来自各个平台的培养室的流出流。当需要分析时，可将来自各个生物反应器平台的流，即来自培养室的流出流引至样品端口。当对一个流出流进行分析时，可将来自另一个生物反应器平台的流出流引至样品端口以用于分析。如果样品端口包括用于引入不同于流出流的液体的样品端口的其它入口通道(如上所述)，在分析之间，可进一步样品端口中的传感器。

在本发明的细胞培养系统中，中等尺寸生物反应器平台的室不限于特定形状。然而，在优选的实施方式中，可通常将室的形状描述为具有基本圆形周长的圆柱形。此周长的直径可大于或小于圆柱体的高度。圆柱体的高度将通常等于垂直轴。在一个实施方式中，圆柱形培养室的直径可为约2至约6mm，如约2.5mm或4mm，且在另一个实施方式中，其可为约20至约30mm，如约25mm。这些圆柱形培养室的深度可为约0.5至约2mm，如约1.5mm。储存室和废物室将通常具有比培养室更深的深度，通常约6mm。在整个培养周期中，储存室通常具有足以用培养基灌注培养室的体积。因此，在一个实施方式中，储存室体积为培养室体积的至少10倍。在另一个实施方式中，储存室体积为培养室体积的至少100倍。

在其它实施方案中，培养室可通常为盒形。此盒形可通常采用具有矩形边的平坦盒的形式，或此盒可接近立方体。在一个实施方式中，培养室可具有约5至约10mm的宽度，且长度至多为约50mm。此盒形培养室的深度可为约0.5至约2mm。

本发明中等尺寸生物反应器平台的通道和室可通过将第一基片层与第二基片层连接来形成，所述第一基片层包括与通道和室对应的结构。因此，通过连接层中的基片在两个基片之间形成通道，且室可对应于层的厚度。中等尺寸生物反应器平台不限于两个基片层。在特定实施方式中，可使用多个基片，其中每个基片可包括与通道和室相适应的结构。可随后将层中的这些多个基片连接，以组装为中等尺寸生物反应器平台。

可使用任何适合的方法构建与基片中通道和室对应的结构。在优选的实施方式中，基片材料为热塑性聚合物，且适合的方法包括研磨、微研磨、钻孔、切割、激光烧蚀、热模压、注塑和微注塑。注塑和微注塑为优选的技术。这些和其它技术是本领域公知的。这些通道也使用适合的方法，如浇铸、模制、软平版印刷等在其它基片材料中构建。

基片材料可使用任何适合的方法连接。在优选的实施方式中，基片材料为热塑性聚合物，且适合的连接方法包括涂胶、溶剂粘合、夹紧、超声焊接和激光焊接。

中等尺寸生物反应器平台的优选实施方式包括两个6mm深的储存室，每个直径为14mm和12mm。两个流出通道从每个储存室通向两个单独的支管。通道从每个直管通向第一个六个培养室串，使得两组(每组六个培养室)与储存室并联连接。每个培养室具有2.5mm的直径和1.5mm的深度。通道从两个串联的各个最后培养室通向7.9mm的直径和6mm的深度的另一室中。此室起到联接装置的功能，软管可插入其中以将流出流从培养室送至远离平台的样品端口。培养室在25mm直径圆环内以3×4的方式排列。基片限定4.5mm高度的壁，和对应于25mm圆环的内表面。此内表面进一步限定用于水不混溶性液体的孔，使得培养室将共享由水不混溶性液体形成的单个封闭物。

细胞培养系统可包括在闭合罩中以确保内稳态，且此系统可包括能够分析来自传感器的信号并将此信号转换为分析结果的数据处理单元。细胞培养系统也可包括用于控制培养室中操作参数的装置，其中数据处理单元能够将命令送至控制单元，其能够调节装置以控制操作参数。图6图示了包括在闭合罩9中的细胞培养系统1。闭合罩9可为由聚合材料或金属制成的适合大小的盒子。

可向闭合罩9提供气体以产生围绕生物反应器平台10的空气层流113。此“空气层流”113描述了这样的情况，空气以几乎没有湍流的模式流经闭合罩9，这些条件可用于使空气中漂浮的特别物质远离细胞培养系统1的室2、8、5，特别是远离向上开口的室，以此将室中细胞和培养基的污染最小化。在一个实施方案中，将空气层流113从生物反应器平台10的下面的闭合罩9提供至生物反应器平台10上面的一个或多个出口，使得空气基本按向上的方向运动。另一个实施方案中，空气层流沿生物反应器平台表面定向流动，即以基本水平方向流动。空气层流113可由空气组成，但是在一优选的实施方案中CO₂的含量相对于空气增加到例如约2-10％，或更优选5％。在其他实施方案中，O₂的含量也可增加或降低。空气层流的压力与环境空气的压力基本相同。但是，所述压力相对于环境空气优选是增加的。当空气层流113的CO₂或O₂或其他气体的含量增加时，该气流可以进一步被控制，从而可以调节细胞培养系统1的室2、8、5中液体的pH值。空气层流的线性流速通常在50μm/s到0.1m/s范围内。

系统1的数据处理单元100可具有使用者界面102和用于显示分析结果的显示器103。数据处理单元100也可具有能够调节装置以控制系统操作参数的控制单元101。控制单元101可接收来自数据处理单元100的命令，所述命令可由操作者输入使用者界面102，这使得操作者能够人工控制操作参数，如通道和室中的流速、来自不同储存器的流的分布、温度、CO₂压力、空气层流、pH值等。可建立控制单元101以全自动、预定顺序事件的方式、或由来自系统1的传感器3的信号确定的全自动顺序事件的方式、人工操作顺序的事件的方式，或这些操作原理的任意组合的方法来控制细胞培养系统1的操作参数值。

细胞培养系统1与生物反应器平台1的基片11可具有气密性连接，使得形成可独立控制压力的单独的舱室107。此舱室107优选形成在向上开口的储存室和废物容器上。这允许对生物反应器平台1的储存室施加正相对压力，和/或对废物容器施加负相对压力。使用这种压力将使得液体从一个或多个储存室向培养室流动，和从培养室向样品端口且随后向废物容器流动。对储存器施加的对储存室为正相对压力的气体可具有任意组成。因此，气体可为空气，或其可与如2-10％CO₂，优选5％CO₂预混，和/或其可为含2-20％O₂的三种成分气体(trigas)。

系统1可包括一个或多个泵105，所述泵可通过空气入口与舱室107或废物通道6流体连通。舱室107封闭储存室8，因此可以增加储存器8内液体上的压力，并引起从储存器至培养室2的流动。与废物通道6连通的泵105将引起从培养室2进入样品端口5的液体流动。在若干储存室存在的情况下，系统1可包括用于每个储存室8的泵105，或其可包括单个泵105，或泵105的数量可落入这两个值之间。在系统具有的泵105少于储存室数量的情况下，系统1也可包括适合的值(未显示)，使得能够根据储存器的内容物来控制提供给中等尺寸生物反应器平台10的培养室2的液体的组成。可以仅使用与废物通道连接的泵105来产生流动，在此情况下，舱室107必须有空气入口以用于系统1内液体的流动。如果存在更多储存室从一个储存器的流动可通过堵塞此空气入口开口来堵塞。泵105可为活塞泵、注射泵、膜泵、隔膜泵、或用于泵气体或液体的任何其它适合类型的泵。

细胞培养系统1也可装配系统111以调节中等尺寸生物反应器平台10的温度。温度调节系统111可进一步包括与数据处理单元100联接的一个或多个温度传感器106，使得能够经由控制单元101控制温度。温度调节系统111可包括如金属块如铝块，其适合容纳生物反应器平台10并包括导电线圈、帕尔贴(peltier)元件、用于加热和/或冷却液体的管等。在优选的实施方式中，控制单元装配有具有加热元件111和温度传感器106的铝块；此温度传感器连接数据处理单元100。在另一个优选的实施方式中，系统1装配有包含加热元件111的透明材料如玻璃的块。在此实施方式中，数据处理单元100可在所谓模型预测控制(MPC)算法中使用来自温度传感器106的信号，通过控制提供给加热元件的能量以精确调节中等尺寸生物反应器平台10的温度。

除了此温度传感器106外，系统1还可装配有光检测和观察系统。优选安装光检测和观察系统以观察培养室，但也可观察样品端口的容器。这些光系统能包括光源108，如发光二极管(LED)、电灯泡、汞灯、激光等，适合的过滤器109和光检测器110。LED为可发出白光的类型，或它们可为发出波长相对窄范围光的类型。后一种类型的LED适用于测量对应于LED特征的波长的光密度，或适用于激发荧光实体以发射特征波长的光，其可随后作为荧光信号检测。或者，当汞灯与适合的光过滤器109和光检测器110联接时，其也为用于检测荧光信号的适合部件。

在优选的实施方式中，细胞培养系统1装配有为观察培养室2而布置的数字或光学显微镜104。数据处理单元100的显示器103可通过从显微镜106传出的信号来观察和监测培养室2和其内容器。在另一个实施方式中，系统1进一步包括可视化软件，产生空气层流113的气体供应器和调节中等尺寸生物反应器平台10温度的加热/冷却系统111，所述可视化软件能够监测培养室2中的任何细胞生长，并根据细胞的形态向控制施加给储存器8和/或样品端口5的废物通道6的压力的泵105发送命令。细胞的形态可包括细胞的数量、尺寸、形状或方向或它们的组合。形态也可包括来自光学检测系统的荧光信号或比色信号。

数据处理单元100能够收集来自传感器3以及可选的温度传感器106的信号，和由显微镜104和光检测器110产生的信号，并将命令送至控制单元101以控制培养室2的操作参数，如控制液体流的流速，如来自不同储存室的流速比，以适当调节温度和/或空气层流。这些操作参数的控制可基于预定按顺序发生的一系列事件，或命令可基于反馈型环路中，来自培养室2、温度传感器106和/或光检测器110的液体中由传感器3测量的信号。在此情况下，应用预定的命令序列，这可包括如以一定速率持续一些天向胚胎灌注来自一个储存器的生长培养基，随后更换为来自另一储存器的生长培养基，以相同或不同流速在剩余培养时间内持续灌注，全部时间内保持温度在37℃。

操作参数的控制也可包括利用来自传感器3、温度传感器106和/或光检测器110的更复杂的命令组。例如，当来自传感器3或观察的信号表明事件已出现在培养室中时，指令组可包括用于控制单元101的指令，以回应此事件并保持稳定的操作参数值如pH值、温度或向培养室2灌注的营养物等参数，或指令组可包括用于控制单元101的指令，以向培养室2中的细胞发生新的一组条件。因此，这些条件可包括如来自不同储存器的流的流速、温度、pH值、分布等参数。

使用来自传感器3、温度传感器106和/或光检测器110的信号确定操作参数的仪器的实例可以为，如果温度传感器3或106显示温度超出设定区间，则控制单元101将发送命令至温度调节系统111以加热或冷却中等尺寸生物反应器平台10，以使温度再次回到设定区间。同样，pH值传感器3显示pH值偏离设定范围，气体供应可以例如被调节，以使增加量的CO₂被施用到包含中等尺寸生物反应器平台10的闭合罩9。O₂、葡萄糖和其他代谢产物(丙酮酸盐和乳酸盐)和能量(ATP/ADP)的水平也可用于控制操作参数。

无论操作原理如何，数据处理单元100可生成从系统1的传感器3、温度传感器106和/或光检测器110收集的信号的临时日志。此临时日志还可包含例如中等尺寸生物反应器平台10的培养室2中的事件的信息或用于控制系统1的允许参数的命令。临时日志可有利地与来自中等尺寸生物反应器平台上10的RFID标签(未显示)的信息相结合，在一个实施方案中，系统1包括读取RFID-标签的设备(未显示)。此方式使临时日志可容易地与含有关于培养室2中细胞来源的信息如提供细胞的人的名字和身份、以及操作者身份的数据标签相联系。

系统1可简单地设计为容纳单个中等尺寸生物反应器平台10。但是，另一个实施方案中，在一个系统1中，系统1可包含如至多六个中等尺寸生物反应器平台10。

在本发明的细胞培养系统1中，优选将生物反应器平台10设计为适合于系统1的筒的形式，其中系统包括样品端口5。将筒插入系统1中适当设计的座等将确保生物反应器平台10正确地连接，即气密性连接在基片11之间形成，形成与泵105连接的舱室107。同样，相对于可选的显微镜104来正确地布置培养室2，且样品端口5与传感器3成行排列，以使传感器3接触样品端口5的容器51中的液体。

将含有生物反应器平台10的筒插入细胞培养系统1中的底座中将进一步确保控制单元温度调节系统111和生物反应器平台10之间的有效热传递。当筒插入系统1中时，作为系统1一部分的任何光学检测或监控系统将与中等尺寸生物反应器平台10中的培养室2或通道适当地对准。

因此，适配于适当设计的细胞培养系统1的包含在筒中的中等尺寸生物反应器平台10的应用，使得中等尺寸生物反应器平台1和系统1之间快速联接。对于操作者而言，筒的正确插入优选是很明显的。

另一方面，本发明涉及一种测量来自本发明细胞培养系统中培养室的废生长培养基的流出流的方法，包括步骤：在培养室中提供生物细胞，向培养室灌注从培养室入口开口进入并从出口开口离开的生长培养基，将废生长培养基输送至样品端口，使流出通道的废生长培养基接触传感器，和测量废生长培养基中的信号。所述方法可进一步包括在测量信号的基础上，调节培养室中条件的步骤。

在本发明的细胞培养系统中，样品端口位于培养室的临近和下游，且此分析提供充分测量所培养细胞的培养基中内容物的方法。此方法适于任何类型的生物细胞，如哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞或细菌细胞。在优选的实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞，特别地，哺乳动物细胞为与体外受精(IVF)相关的细胞，且所述细胞将包括精子、未受精或受精的卵母细胞和/或胚胎。但是，对本领域技术人员而言显而易见的是，所述生物反应器平台还可以用于其它哺乳动物细胞类型，如干细胞或免疫系统细胞如单核细胞、树突细胞、T细胞等等。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞为人细胞。当计划将所培养的哺乳动物细胞如用于IVF用途的未受精或受精的卵母细胞，或用于再生医学或免疫治疗的干细胞或免疫细胞返回至个体特别是人时，重要地一点是传感器不直接接触细胞。

除了这些目的外，本发明中公开的中等尺寸生物反应器平台还可用于培养哺乳动物细胞以外的细胞类型。例如，在本文公开的生物反应器平台中还可培养和分析细菌、酵母、真菌、植物或昆虫细胞。

典型的细胞培养过程和本发明中等尺寸生物反应器平台中所培养细胞的相关测量和分析最初包括选择设计适当，用于具体待培养细胞类型的中等尺寸生物反应器平台。对于IVF过程，中等尺寸生物反应器平台通常将具有两个或更多个储存室。这些储存室中的每个将充满代表受精卵母细胞生长期间不同生长需要的不同的培养基，使得在培养期间的任何时间对卵母细胞补加适当的培养基组成。卵母细胞的生长培养基是本领域公知的，代表是购自MediCultA/S(Jyl-linge，Denmark)的培养基。

当储存室充满时，将初始培养基组成用于培养室。在一个实施方式中，中等尺寸生物反应器平台包括向上开口的储存器和培养室；水不混溶性液体层现在可用于这些室中的含水液体。适合的水不混溶性液体为生物源的油或脂肪，如植物油等，或矿物油或合成油，如石蜡油。优选透明的水不混溶性液体。特别优选石蜡油。水不混溶性液体将在室上形成封闭物，这将防止颗粒如病菌或病原体污染，防止溶剂从室蒸发，提供热绝缘层。含水液体的pH值也可通过控制室上CO₂的压力来控制；向上开口的室上的气体可为空气，其可与如2-10％CO₂预混的空气，和/或其可为含2-20％O₂的三种成分气体(trigas)。

在将生物细胞如受精的卵母细胞置于培养室内前，中等尺寸生物反应器平台的温度可调节至如37℃。生物细胞将灌注来自储存器之一或它们的组合且适合细胞的培养基组成。典型的流速将为约每小时1μL或更高。当培养室灌注来自储存室的培养基时，可直接引起液体从培养室向样品端口的流动；也需要如通过使用整体形成的泵或使用外部泵将液体主动泵至或移至样品端口。在优选的实施方式中，培养室底部是透明的，使得在培养期间可通过显微镜观察细胞。当建立液体向样品端口流动时，适当的传感器可接触样品端口的容器中的液体，所述液体表示培养室内细胞的培养条件。任何可用的传感器可用在测量中，且生物细胞培养中通常关注的参数为pH值、电导率、溶解氧(O₂)、二氧化碳(CO₂)、葡萄糖、流速、温度和光密度。传感器也能够测量特定参数，如单个营养物、维生素、代谢物、信号分子、激素、酶或蛋白质，如细胞因子或趋化因子。核酸如DNA或RNA也是传感器测量的相关参数。。蛋白质或核酸也可“大量”测量，其中具体实体不单独测量，如其与测量蛋白质、DNA或RNA的总浓度相关。同样，其它类型的化合物如碳水化合物也可大量分析。

在使传感器接触样品端口内的液体后，传感器将测量液体以获得分析结果。分析结果将提供与细胞培养条件有关的信息。考虑到培养室和样品端口之间的短距离，此信息可被视为代表一种或多种细胞的当前条件。分析结果现可被如操作者使用或通过自动过程使用，作为决定是否需要对培养条件进行任何调整或修改的基础。例如，如果操作参数如pH值或温度的值接近预定极限值，可采用步骤来保持此值在预定限制内。如果pH值增加，向上开口的培养室上CO₂含量会增加，以此增加培养基中CO₂的含量并降低pH值(反之依然)。温度可使用包括中等尺寸生物反应器平台的温度调节单元来调节。也需要调整提供给培养室内细胞的培养基组成。例如，分析结果中所示的化合物浓度可通过调节来自不同储存器2的培养基组成来调节。

实施例

本发明将在以下非限定性实施例中做进一步描述。

实施例1中等尺寸生物反应器平台的构建

由两层基片材料组成的原型中等尺寸生物反应器平台采用2D绘图软件Auto-CAD LT(Autodesk，San RafaeL，CA，USA)进行设计。

该生物反应器平台显示在图7中，且包括两个深度6mm且直径分别为14mm和12mm的储存室，直径2.5mm和深度1.5mm的12个培养室，以及另一个直径7.9mm和深度6mm的室。这些室通过注塑模制创建在黑色聚(甲基丙烯酸酯)(PMMA)的上基片材料中；基片的总尺寸为74×7.4mm²。在片的底部，使用Synrad Fenix Marker CO2-1aser(Synrad Inc.，Mukilteo，WA，USA)创建(直径约500μm)的通道。随后将制得的基片激光焊接至相同尺寸的透 明PMMA基片。透明PMMA基片由

GmbH&Co.(Plexiglas XT20070，

GmbH&Co.，Darmstadt，DE)提供；包含储存器的层为约5mm厚，剩余全部为1.5mm厚。在烧蚀前，将AutoCADLT设计转换为封装的(encapsulated)post-script文件并导入控制Synrad Fenix Marker CO₂-激光的WinMark Pro软件中。用本领域技术人员公知的激光设置进行烧蚀。

在80℃经适当的退火处理防止PMMA基片应力开裂后，使用能产生高强的～800nm激光的FisbaFLSIron激光扫描器(Fisba Optik AG，St.Gallen，瑞士)将透明基片与包含室的黑色基片的底面焊接在一起。焊接期间，采用由对激光透明的玻璃制成的虎钳对基片适当加压。有效焊接的最佳激光设置为本领域技术人员所公知的。

所焊接的基片限定了室间的通道，使得两个流出通道从每个储存室通向两个单独的支管。通道从每个直管通向第一个六个培养室串，使得两组(每组六个培养室)与储存室并联连接。

每个培养室具有2.5mm的直径和1.5mm的深度。通道从两个串联的各个最后培养室通向7.9mm的直径和6mm的深度的另一室中。此室起到联接装置的功能，软管可插入其中以将流出流从培养室送至远离平台的样品端口。培养室在25mm直径圆环内以34的方式排列。基片限定4.5mm高度的壁，和对应于25mm圆环的内表面。此内表面进一步限定用于水不混溶性液体的孔，使得培养室将共享由水不混溶性液体形成的单个封闭物。

实施例2细胞培养系统的构建

机械加工两个铝块，以支持适当大小闭合罩中(约10×7×3cm³大小)的两个块间的实施例1的中等尺寸生物反应器平台。

上铝块被加工成刚好容纳生物反应器平台，并在它的与中等尺寸生物反应器平台出口相应位置的上层块上钻孔(直径1mm)。扩大孔的开口以容纳O型橡胶圈(内径(ID)1mm)，并且出口孔装有一根内径0.5mm的聚四氟乙烯管，其与上铝块下表面中舱室内的微尺寸pH-电极连接，以限定样品端口。样品端口进一步连接2mL注射泵。pH-电极与传感器板(sensorboard)连接，传感器板进一步与运行LabView(版本8，National Instruments，Austin，Texas，USA)的电脑连接。

将底部铝块体进一步加工以容纳加热线圈，其与直流电供应器连接。将电子温度传感器整体形成入铝块中。用于加热元件的电子控制和温度传感器都与传感器板连接。客户定制的LabView应用软件执行基于温度传感器中的输入来控制温度的模型预测控制(MPC)算法。两个铝块经由铰链机构彼此连接，使得能将中等尺寸生物反应器平台置于下块中的温度调节元件上。通过关闭铰链机构，可将上铝块中的特氟龙管插入中等尺寸生物反应器平台上的连接室中，以建立用于将液体从培养室送至样品端口的连接。

全部泵的控制经由传感器板从LabView由应用软件进行。

由此创建的细胞培养系统显示在图7b中，其显示在所插入的中等尺寸生物反应器平台的开口位置内的上和下铝块；特氟龙管在连接室上的上铝块的底侧上可见。

实施例3细胞培养系统的构建

在细胞培养系统的另一种设计中，下铝块体进一步包括层式气流供应。这由具有水平缝隙(1mm高和30mm宽)的管组成，该缝隙位于对应于具有培养室的生物反应器平台末端(如图7所示)，以在培养腔室上方引入宽度与腔室宽度相似的水平层式气流。该管具有进入点(位于上铝块的外表面)，该进入点用来连接到空气供应，例如含5％CO₂的空气。

实施例4细胞培养系统的应用

按照实施例1所述制备中等尺寸生物反应器平台。培养基储存器中充满胚泡培养用的生长培养基(分别为培养基“A”和“B”)，并用培养基A预处理细胞培养室。然后将石蜡油层施加到各个向上开口的室中，并将平台放到具有实施例2所述上块和实施例3所述下块的铝容器(housing)中。系统温度设定为37℃，含5％CO₂的空气流以大约1L/h的速度施加到空气供应系统，以平衡生物反应器平台中的生长培养基，并提供在腔的开放表面上方的层式空气流。

在接下来的一天，将一个受精后的卵母细胞放到各个培养腔室中，关闭细胞培养系统。7.5μL/h的流被提供到培养腔室中，以供应新鲜培养基，并去除代谢废物。每2小时将15μl的废物流引至样品端口并测量pH值。数据加工单元，用LabView应用代表，监测培养过程的进展并记录pH值和温度。MPC算法用来将温度控制在37℃，通过经由空气供应调节含CO₂空气流来以相似的算法保证pH值保持在7.25至7.45之间。

该细胞培养过程持续3天，根据预定的程序控制培养基的成分，即A和B培养基的比例。还用该仪器进行了持续5天的细胞培养过程。

Claims (20)

1.一种细胞培养系统，包括用于在生长培养基中培养生物细胞的培养室和用于测量废生长培养基中信号的传感器，其中所述培养室被提供在中等尺寸生物反应器平台中，所述中等尺寸生物反应器平台具有用于生长培养基的流入流的入口开口和用于废生长培养基的流出流的出口开口，所述废生长培养基与可松脱式采用的所述传感器的样品端口流体连通。

2.如权利要求1所述的细胞培养系统，其中所述出口开口与被提供在所述平台中的流出通道流体连通。

3.如权利要求1或2所述的细胞培养系统，其中所述样品端口包括容器，所述容器具有用于来自所述培养室的所述流出通道的第一开口和用于排出所述废生长培养基的废物通道的第二开口。

4.如权利要求3所述的细胞培养系统，其中所述样品端口容器包括用于另一入口通道的第三开口，该另一入口通道允许向所述样品端口引入与来自所述培养室的与所述流出流不同的液体。

5.如前述任一项权利要求所述的细胞培养系统，其中所述传感器能够测量pH值、电导率、溶解氧(O₂)、二氧化碳(CO₂)、葡萄糖、流速、温度和/或光密度。

6.如前述任一项权利要求所述的细胞培养系统，其中所述传感器能够测量营养物、维生素、信号分子、激素、代谢物、蛋白质或酶、和/或诸如DNA或RNA的核酸。

7.如前述任一项权利要求所述的细胞培养系统，其中所述传感器能够记录电学信号、光学信号或荧光信号。

8.如前述任一项权利要求所述的细胞培养系统，其中所述样品端口被整体形成在所述中等尺寸生物反应器平台上。

9.如权利要求2至7中任一项所述的细胞培养系统，其中所述流出通道的一端被连接到所述培养室的所述出口开口，另一端被连接到联接装置，所述样品端口被连接到在远端具有互补联接装置的软管，从而确保将来自所述流出通道的废培养基输送至所述样品端口。

10.如权利要求9所述的细胞培养系统，其中所述样品端口位于所述中等尺寸生物反应器平台外部。

11.如权利要求9或10的细胞培养系统，其中无菌过滤器存在于所述培养室的所述流出通道和所述样品端口之间的废培养基的流中。

12.如前述任一项权利要求所述的细胞培养系统，包括用于培养生物细胞的两个或更多个室，其中每个室与所述样品端口分离的流体连通。

13.如权利要求12所述的细胞培养系统，其中用于培养生物细胞的两个或更多个室被提供在单独的生物反应器平台中。

14.如权利要求9至13中任一项所述的细胞培养系统，其中所述生物反应器平台被包括于装配在所述细胞培养系统的筒中。

15.如权利要求14所述的细胞培养系统，其中所述生物反应器平台被包括在舱室中，所述舱室包括用于在所述中等尺寸生物反应器平台周围产生空气层流的气体供应器。

16.如前述任一项权利要求所述的细胞培养系统，进一步包括数据处理单元，该数据处理单元能够分析来自所述传感器的信号并将所述信号转换为分析结果。

17.如前述任一项权利要求所述的细胞培养系统，进一步包括控制所述培养室中的操作参数的装置，其中所述数据处理单元能够将命令发送至控制单元，该控制单元能够调节所述装置以控制操作参数。

18.一种用于测量来自根据权利要求1至17中任一项所述的细胞培养系统中的培养室的废生长培养基的流出流的方法，包括步骤：

在所述培养室中提供生物细胞；

灌注所述培养室，使生长培养基通过所述培养室的所述入口开口进入并通过所述出口开口离开；

将所述废生长培养基输送至样品端口；

使样品端口的所述废生长培养基接触所述传感器；和测量所述废生长培养基中的信号。

19.如权利要求18中所述的方法，进一步包括在所述测量信号的基础上，调节所述培养室中条件的步骤。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中生物细胞为哺乳动物细胞，诸如精子、卵母细胞、胚胎、干细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞。

Images