CN102101866A

CN102101866A - 十字孢碱卤代衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102101866A
Application number: CN2010105417874A
Authority: CN
Inventors: 朱伟明; 庄以彬; 王乂; 刘培培
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2010-11-04
Publication date: 2011-06-22

Abstract

本发明涉及十字孢碱卤代衍生物及其制备方法和应用。本发明从十字孢碱(星形孢菌素)出发，经化学反应制备了上述结构新颖的化合物。经实验证实，该类化合物具有较强的肿瘤细胞毒活性和蛋白激酶C(PKC)抑制活性，可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

Description

十字孢碱卤代衍生物及其制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种具有蛋白激酶C(PKC)抑制活性并具有抗肿瘤作用的卤代吲哚咔唑生物碱，本发明公开了其制备方法，及其在肿瘤治疗的应用。

背景技术：

癌症(恶性肿瘤)是危害人类生命健康的重大疾病，其发病率每年成上升趋势；到2010年，癌症已超过心血管疾病，成为世界上致死率最高的疾病和医学上的最大难关。在癌症的药物治疗探索中，分子靶向药物已成为当今抗癌药物研发的主要趋势。2004年，全球癌药市场规模已突破240亿美元，占全球药品市场总销售额的4.5％，年增长17％；2007年全球抗癌药市场规模已突破414亿美元，2008年猛增至480亿美元，2009年达到550亿美元，成为市场份额最大的药物。其中，分子靶向药物已成为了全球抗癌药物市场中增长最快的单元，市场份额则将由2005的23％提高到2010的53.6％！研究表明，蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)在多种肿瘤细胞中高表达，对肿瘤细胞的生长、增殖和分化起重要作用，是重要的细胞信号传导分子(Jussi K.，Vesa A.，Juha P.，Protein kinase C(PKC)family in cancer progression，Cancer Lett.2006，235，1-10；Hoffman J.The potential for isoenzyme-selective modulation of protein kinase C，FASEB J.1997，11：649-669；Czifra G.T.I.，Marincsák R.，et al Insulin-like growth factor-I-coupled mitogenic signaling in primary culturedhuman skeletal muscle cells and in C2Cl2 myoblasts.A central role of protein kinase C δ.Cell Signal 2006，18：1461-1472；Steinberg S.F.，Distinctive activation mechanisms and functions for protein kinase C δ.Biochem2004，384：449-459.)。因此，一些能够封闭PKC活性、阻断细胞因子与受体结合、或干扰细胞信号传导通路的PKC的小分子抑制剂可以开发为新一代的抗肿瘤药物。目前已有6种吲哚咔唑生物碱类PKC抑制剂(如PKC412和UCN-01)进入了Ⅰ-Ⅲ期临床研究，其中Lestaurtinib(Cephalon公司)已被FDA于2006年4月核准作为孤儿药(患者人数少于20万人或盛行率小于万分之一)，用于治疗急性骨髓性白血病(AML)(ClinicalTrials.gov(a service of the US National Institutes of Health).Available at http://clinicaltrials.gov；Further information available at http://www.cephalon.com；Undevia S.D.，Vogelzang N.J.，et al，Phase Ⅰ clinicaltrial of CEP-2563 dihydro chloride，a receptor tyrosine kinase inhibitor，in patients with refractory solid tumors.Invest.New Drugs，2004，22，449-458.)，表明此类化合物具有广阔的成药前景。研究表明：卤素原子的引入可以提高小分子化合物抑制剂和蛋白酶的结合力(Yunxiang Lu，Ting Shi，et al，Halogen Bondings，A NovelInteraction for Rational Drug Design？J.Med.Chem.2009，52，2854-2862)。为了获得活性更好、毒性更低的化合物，我们对吲哚咔唑生物碱——十字孢碱(星形孢菌素)进行卤代修饰，合成了一系列新的具有细胞毒和PKC抑制活性的卤代十字孢碱衍生物。

发明内容：

本发明旨在提供一类吲哚咔唑类卤代化合物，它们对肿瘤细胞以及调节肿瘤细胞代谢、增长、生殖和分化的关键激酶——蛋白激酶C(PKC)具有良好的抑制活性，从而治疗与之相关的肿瘤，是潜在的、极具成药前景的治疗癌症的药物。

本发明的目的还在于提供一类新的十字孢碱卤代衍生物的制备方法及其新衍生物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗癌药物中的用途。本发明合成了一类十字孢碱的卤代衍生物，其结构如式Ⅰ、式Ⅱ所示：

式Ⅰ 式Ⅱ

其结构特征是：式Ⅰ、式Ⅱ化合物的基本骨架分别为十字孢碱，其中R₁＝-X，-CF₃；R₂R₃＝-H₂，＝O，-H、-OH，-H、-X；X＝-F，-Cl，-Br，-I；药学上可接受的有机或无机酸的盐，包括盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、杏仁酸、苹果酸、樟脑磺酸等；前药形式如磷酸酯、氨基甲酸酯等，当以这种形式给药时，其在体内转变为活性形式起效。

优选的本发明化合物是所述的式Ⅰ化合物1～4及式Ⅱ化合物5，其中R₁＝-F，-Cl，-Br，-I，-CF₃；R₂R₃＝-H₂，-H、-OH，＝O；X＝-Cl，结构式分别为：

上述发明中优选的十字孢碱的卤代衍生物是由十字孢碱与含卤苯甲酰试剂和苯磺酰试剂经下列化学合成方法制备而得：

本发明采用MTT和SRB法测试了式Ⅰ、式Ⅱ化合物对HL-60和A549细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，式Ⅰ、式Ⅱ化合物对HL-60、A549肿瘤细胞有较好的增殖抑制作用。因此本发明的式Ⅰ、式Ⅱ化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。

采用荧光偏振法测试了化合物对PKCβⅡ的抑制活性，结果表明式Ⅰ、式Ⅱ化合物对PKCβⅡ具有一定的抑制作用，其中优选的化合物4对PKCβⅡ的IC₅₀值约0.024μM，故本发明的式Ⅰ、式Ⅱ化合物可用作靶向抗肿瘤药物。

本发明的药物可以通过口服给药和注射给药，也适合其它的给药方式，如经皮给药等。药物可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂或口服液或无菌胃肠外悬液等液体制剂形式。还有大或小容量注射剂、冻干粉剂等针剂形式。上述剂型的药物均可按照药学领域的常规方法制备。

本发明的式Ⅰ、式Ⅱ化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗，载体包括药学领域常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

式Ⅰ、式Ⅱ化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式Ⅰ、式Ⅱ化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。

具体实施方式：

【实施例1】化合物1～5的制备

化合物1的制备

氩气保护下，在25mL两口烧瓶中，加入十字孢碱(46.6mg，0.1mmol)，用3mL二氯甲烷溶解，滴加过量的三乙胺，然后加入对氟苯甲酰氯，室温搅拌反应0.5h，加水终止反应，二氯甲烷萃取，并用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸干，后经过纯甲醇凝胶柱分离，得产物化合物1(53.8mg)，收率91.5％。¹H NMR(CDCl₃)：δ9.45(d，1H，J＝8.2Hz，H-4)，7.87(d，1H，J＝7.8Hz，H-11)，7.78(d，1H，J＝7.8Hz，H-8)，7.48(t，1H， J＝7.8Hz，H-10)，7.46(t，1H，J＝7.3Hz，H-2)，7.43(br t，2H，J＝7.3，H-2″/6″)，7.37(t，1H，J＝7.3Hz，H-9)，7.33(t，1H，J＝7.3Hz，H-3)，7.21(d，1H，J＝7.3Hz，H-1)，7.10(br t，2H，J＝7.3Hz，H-3″/5″)，6.94(br s，1H，H-6)，6.66(br s，1H，H-1′)，5.17(d，1H，J＝7.8Hz，H-4′)，4.97(d，1H，J＝16.0Hz，H-7a)，4.93(d，1H，J＝16.0Hz，H-7b)，4.21(s，1H，H-3′)，2.84(s，3H，4′-OCH3)，2.72(br m，1H，H-2′a)，2.65(br m，1H，H-2′b)，2.53(s，3H，3′-NCH₃)，2.45(s，3H，H-6′)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ173.5(C，C-5)，171.5(C，3′-NCO)，163.6(C，d，¹J_C-F＝247.2Hz，C-4′)，136.6×2(C，C-11a/13a)，132.5(C，C-12a)，132.2(C，C-7a)，130.6(C，C-1″)，129.4×2(CH，d，³J_C-F＝6.9Hz，C-2″/6″)，126.9(CH，C-2)，126.4(C，C-12b)，125.5(CH，C-4)，125.1(CH，C-10)，124.8(C，C-4a)，123.7(C，C-7c)，121.6(CH，C-9)，120.6(CH，C-8)，120.2(CH，C-3)，119.2(C，C-4c)，116.3(C，C-7b)，115.8×2(CH，d， ²J_C-F＝13.7Hz，C-2″/6″)，114.6(C，C-4b)，112.4(CH，C-11)，107.8(CH，C-1)，94.7(C，C-5′)，84.8(CH，C-1′)，82.4(CH，C-4′)，60.5(CH₃，4′-OCH₃)，49.8(CH，C-3′)，46.1(CH₂，C-7)，34.6(CH₃，3′-NCH₃)，29.2(CH₃，C-6′)，28.2(CH₂，C-2′)；ESI-MS m/z 589.2[M+H]⁺。

化合物2的制备

氩气保护下，在25mL两口反应瓶中，加入化合物1(29.9mg，0.05mmol)，用1mL甲醇溶解，然后加入氯代丁二酰亚胺(7.5mg，0.056mmol)，室温搅拌反应2h，加水终止反应，二氯甲烷萃取，并用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸干，后经过凝胶柱分离(纯甲醇洗脱)，得产物化合物2(10.5mg)，收率33.2％。¹H NMR(CDCl₃)：δ9.42(s，1H，H-4)，7.89(d，1H，J＝7.8Hz，H-11)，7.77(d，1H，J＝7.3Hz，H-8)，7.48(t，2H，J＝7.8Hz，H-2/10)，7.43(br t，2H，J＝7.3，H-2″/6″)，7.37(t，1H，J＝7.8Hz，H-9)，7.35(d，1H，J＝7.8Hz，H-1)，7.11(t，2H，J＝7.3Hz，H-3″/5″)，7.10(br s，1H，H-6)，6.74(br s，1H，H-1′)，5.20(d，1H，J＝7.8Hz，H-4′)，4.98(br s，2H，H-7)，4.22(s，1H，H-3′)，2.86(s，3H，4′-OCH₃)，2.74(dt，1H，J＝3.2，12.5Hz，H-2′a)，2.63(dt，1H，J＝3.2，12.5Hz，H-2′b)，2.57(s，3H，3′-NCH₃)，2.44(s，3H，H-6′)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ173.0(C，C-5)，171.5(C，3′-NCO)，163.6(C，d， ¹J_C-F＝247.2Hz，C-4′)，136.5×2(C，C-11a/13a)，132.8(C，C-12a)，132.1(C，C-7a)，130.4(C，C-1″)，129.3×2(CH，d，³J_C-F＝6.9Hz，C-2″/6″)，127.1(C，C-3)，126.1(CH，C-2)，125.7(CH，C-4)，125.4(CH，C-10)，124.7(C，C-4a)，124.6(C，C-7c)，121.7(CH，C-9)，120.8(CH，C-8)，119.2(C，C-4c)，115.9×2(CH，d，²J_C-F＝13.7Hz，C-3″/5″)，115.4(C，C-7b)，115.0(C，C-4b)，112.4(CH，C-11)，108.6×2(CH，C-1)，94.8(C，C-5′)，84.7(CH，C-1′)，82.5(CH，C-4′)，60.5(CH₃，4′-OCH₃)，49.8(CH，C-3′)，46.0(CH₂，C-7)，34.5(CH₃，3′-NCH₃)，29.2(CH₃，C-6′)，28.1(CH₂，C-2′)；ESI-MS m/z 623.3[M+H]⁺。

化合物3的制备

氩气保护下，在25mL两口反应瓶中，加入化合物1(29.9mg，0.05mmol)，用1mL DMSO溶解，然后加入0.03mL 2N NaOH溶液，室温搅拌反应4h，加水终止反应，乙酸乙酯萃取，并用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸干，后经过凝胶柱分离(纯甲醇洗脱)，得化合物3(8.8mg)，收率28.6％。¹H NMR(CDCl₃)：δ9.29(d，1H，J＝7.7Hz，H-4)，8.51(d，1H，J＝7.7Hz，H-11)，7.76(d，1H，J＝7.7Hz，H-8)，7.50(t，1H，J＝8.2Hz，H-10)，7.49(t，2H，J＝8.2Hz，H-2)，7.44(br t，2H，J＝7.3，H-2″/6″)，7.37(t，1H，J＝7.7Hz，H-11)，7.36(t，1H，J＝7.7Hz，H-9)，7.36(t，1H，J＝7.7Hz，H-3)，7.25(d，1H，J＝7.7Hz，H-1)，7.11(br t，2H，J＝7.7，H-3″/5″)，6.71(br s，1H，H-6)，6.50(br s，1H，H-1′)，5.19(d，1H，J＝8.2Hz，H-4′)，4.27(s，1H，H-3′)，2.87(s，3H，4′-OCH₃)，2.74(br m，1H，H-2′a)，2.68(br m，1H，H-2′b)，2.54(s，3H，3′-NCH₃)，1.67(s，3H，H-6′)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ173.3(C，C-5)，171.5(C，3′-NCO)，163.6(C，d，¹J_C-F＝247.2Hz，C-4″，136.5×2(C，C-11a/13a)，132.5(C，C-12a)，132.2(C，C-7a)，130.6(C，C-1″)，129.5×2(CH，d，³J_C-F＝6.9Hz，C-2″/6″)，126.7(CH，C-2)，126.4(C，C-12b)，125.5(CH，C-4)，125.2(CH，C-10)，124.9(C，C-4a)，123.8(C，C-7c)，121.6(CH，C-9)，120.6(CH，C-8)，120.3(CH，C-3)，119.2(C，C-4c)，116.3(C，C-7b)，115.8×2(CH，d，²J_C-F＝13.7Hz，C-2″/6″)，114.6(C，C-4b)，112.4(CH，C-11)，107.6(CH，C-1)，94.7(C，C-5′)，84.8(CH，C-1′)，82.5(CH，C-4′)，79.4(CH，C-7)，60.5(CH₃，4′-OCH₃)，49.8(CH，C-3′)，34.5(CH₃，3′-NCH₃)，29.2(CH₃，C-6′)，28.2(CH₂，C-2′)；ESI-MS m/z 604.2[M+H]⁺。

化合物4的制备

方法一：氩气保护下，在25mL两口反应瓶中，加入十字孢碱(46.6mg，0.1mmol)，用3mL二氯甲烷溶解，滴加过量的三乙胺，然后加入4-三氟甲基苯甲酰氯，反应0.5h，加水终止反应，二氯甲烷萃取，并用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸干，后经过凝胶柱分离(纯甲醇洗脱)，得产物化合物4-triflurobenzoylstaurosporine(4a，58.9mg)，收率92.3％。在充入氧气的25mL两口反应瓶中，加入化合物 4a(32.0mg，0.05mmol)，用2mL DMSO溶解，加入过量的叔丁醇钾，室温反应6小时，加水终止反应，乙酸乙酯萃取三次，真空蒸干，后经过凝胶柱分离(纯甲醇洗脱)，得产物4(28.1mg)，收率85.9％。

方法二：在充入氧气的25mL两口反应瓶中，加入十字孢碱(46.6mg，0.1mmol)，用3mLDMSO溶解，加入过量的叔丁醇钾，室温反应6小时，加水终止反应，乙酸乙酯萃取三次，真空蒸干，后经过凝胶柱分离(纯甲醇洗脱)，得产物化合物7-oxostaurosporine(4b)(42.5mg)，收率88.6％。氩气保护下，在25mL两口反应瓶中，加入化合物4b(48.0mg，0.1mmol)，用3mL二氯甲烷溶解，滴加过量的三乙胺，然后加入4-三氟甲基苯甲酰氯，反应0.5h，加水终止反应，二氯甲烷萃取，并用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸干，后经过凝胶柱分离(纯甲醇洗脱)，得产物化合物4(59.5mg)，收率91.3％。

4-Triflurobenzoylstaurosporine(4a)，¹H NMR(CDCl₃)：δ9.46(d，1H，J＝7.8Hz，H-4)，7.83(d，1H，J＝7.3Hz，H-11)，7.76(d，1H，J＝8.2Hz，H-8)，7.68(d，2H，J＝7.7Hz，H-2′/6″)，7.51(d，2H，J＝7.7Hz，H-3″/5″)，7.46(t，1H，J＝7.3Hz，H-10)，7.45(t，1H，J＝7.3Hz，H-2)，7.38(t，1H，J＝7.8Hz，H-9)，7.32(t，1H，J＝7.3，H-3)，7.17(d，1H，J＝7.8，H-1)，7.11(br s，1H，H-6)，6.61(dd，1H，J＝4.6，9.2Hz，H-1′)，5.18(d，1H，J＝7.8Hz，H-4′)，4.93(d，2H，J＝16.5Hz，H-7)，4.18(s，1H，H-3′)，2.77(s，3H，4′-OCH₃)，2.70(dt，1H，J＝3.2Hz，12.4Hz，H-2′a)，2.61(dt，1H，J＝3.2，12.4Hz，H-2′b)，2.53(s，3H，3′-NCH₃)，2.40(s，3H，H-6′).¹³C NMR(CDCl₃)：δ173.5(C，C-5)，170.9(C，3′-NCO)，139.7(C，C-11a)，138.6(C，C-13a)，136.6(C，C-12a)，132.6(C，C-7a)，131.9(C，q，²J_C-F＝34.3Hz，C-4″)，130.5(C，C-1″)，127.3×2(CH，C-2″/6″)，126.9(CH，C-2)，126.4(C，C-12b)，125.8×2(CH，C-3″/5″)，125.5(CH，C-4)，125.1(CH，C-10)，124.8(C，C-4a)，123.8(C，q，¹J_C-F＝270.0Hz，4″-CF₃)，123.7(C，C-7c)，121.6(CH，C-9)，120.6(CH，C-8)，120.2(CH，C-3)，119.3(C，C-4c)，116.3(C，C-7b)，114.6(C，C-4b)，112.3(CH，C-11)，107.8(CH，C-1)，94.6(C，C-5′)，84.7(CH，C-1′)，82.3(CH，C-4′)，60.5(CH₃，4′-OCH₃)，49.7(CH，C-3′)，46.1(CH₂，C-7)，34.3(CH₃，3′-NCH₃)，29.1(CH₃，C-6′)，28.1(CH₂，C-2′)；ESI-MS m/z 639.2[M+H]⁺。

7-Oxostaurosporine(4b)，¹H NMR(DMSO-d₆)：δ11.04(s，1H，H-6)，9.21(d，1H，J＝8.8Hz，H-4)，9.08(d，1H，J＝7.7Hz，H-8)，8.03(d，1H，J＝8.8Hz，H-11)，7.71(d，1H，J＝8.8Hz，H-2)，7.60(d，1H，J＝7.7Hz，H-10)，7.51(d，1H，J＝7.7Hz，H-3)，7.41(t，1H，J＝7.7Hz，H-9)，7.33(t，1H，J＝7.7Hz，H-1)，6.77(br s，1H，H-1′)，4.14(br s，1H，H-4′)，3.38(s，1H，H-3′)，3.36(s，3H，4′-OCH₃)，2.55(m，2H，H-2′)，2.34(s，1H，3′-NCH₃)，1.22(s，3H，H-6)；¹³C NMR(DMSO-d₆)：δ171.4(C，C-5)，171.2(C，C-7)，142.1(C，C-11a)，139.2(C，C-13a)，132.3(C，C-12a)，131.7(C，C-12b)，127.5(CH，C-2)，126.5(CH，C-10)，126.4(CH，C-4)，125.6(CH，C-8)，124.4(C，C-4a)，122.8(C，C-7c)，121.2(CH，C-3)，121.1(CH，C-9)，120.6(C，C-4c)，120.2(C，C-7a)，117.2(C，C-7b)，116.4(C，C-4b)，115.8(CH，C-11)，109.2(CH，C-1)，92.1(C，C-5′)，84.5(CH，C-1′)，81.3(CH，C-4′)，57.4(CH₃，4′-OCH₃)，51.5(CH，C-3′)，33.6(CH₃，3′-NCH₃)，30.4(CH₃，C-6′)，30.1(CH₂，C-2′)；ESI-MS m/z 481.1[M+H]⁺。

化合物4，¹H NMR(CDCl₃)：δ9.33(d，1H，J＝7.7Hz，H-4)，9.17(d，1H，J＝7.8Hz，H-8)，7.91(d，2H，J＝7.7Hz，H-2′/6″)，7.71(t，1H，J＝7.4Hz，H-2)，7.65(t，1H，J＝7.8Hz，H-10)，7.63(t，1H，J＝7.8Hz，H-9)，7.52(t，2H，J＝7.7Hz，H-3″/5″)，7.51(br s，1H，H-6)，7.41(t，1H，J＝7.8Hz，H-3)，7.40(d，1H，J＝7.8Hz，H-11)，7.11(d，1H，J＝7.4Hz，H-1)，6.60(dd，1H，J＝3.7，9.2Hz，H-1′)，4.56(dd，1H，J＝5.5，12.4Hz，H-4′)，3.83(s，1H，H-3′)，2.74(s，3H，4′-OCH₃)，2.47(dt，1H，J＝3.2，10.8Hz，H-2′a)，2.42(s，3H，3′-NCH₃)，2.38(dt，1H，J＝3.2，10.8Hz，H-2′b)，2.26(s，3H，H-6′).¹³C NMR(CDCl₃)：δ169.8(C，C-5)，169.6(C，C-7)，167.8(C，3′-NCO)，139.3(C，C-11a)，139.2(C，C-13a)，137.8×2(C，C-12a)，133.2×2(CH，C-4/8)，131.4(C，q，²J_C-F＝34.3Hz，C-4″)，130.3(C，C-1″)，129.6×2(CH，C-2″/6″)，127.0×2(CH，C-3″/5″)，126.5(CH，C-3)，126.3(CH，C-9)，123.8(C，q，¹J_C-F＝270.0Hz，4″-CF₃)，122.5(C，C-4a)，121.4(CH，C-2)，121.3(CH，C-10)，121.0(C，C-7c)，119.4(C，C-7a)，117.4(C，C-4c)，116.3(C，C-7b)，114.7(C，C-4b)，111.3(CH，C-11)，108.2(CH，C-1)，94.7(C，C-5′)，86.0(CH，C-1′)，82.5(CH，C-4′)，60.1(CH₃，4′-OCH₃)，51.9(CH，C-3′)，30.7(CH₃，3′-NCH₃)，28.9(CH₃，C-6′)，28.3(CH₂，C-2′)；ESI-MS m/z 653.2[M+H]⁺。

化合物5的制备

氩气保护下，在25mL两口反应瓶中，加入十字孢碱(46.6mg，0.1mmol)，用3mL二氯甲烷溶解，滴加过量的三乙胺，然后加入对碘苯磺酰氯，室温搅拌反应6h，加水终止反应，二氯甲烷萃取，并用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸干，后经过凝胶柱分离(纯甲醇洗脱)，得产物化合物5(62.1mg)，收率84.8％。 ¹H NMR(CDCl₃)：δ9.42(d，1H，J＝7.8Hz，H-4)，7.99(d，2H，J＝6.9Hz，H-2″/6″)，7.89(d，1H，J＝7.8Hz， H-11)，7.72(d，1H，J＝8.3Hz，H-8)，7.61(d，2H，J＝6.9Hz，H-3″/5″)，7.48(t，1H，J＝7.3Hz，H-2)，7.45(t，1H，J＝7.3Hz，H-10)，7.37(t，1H，J＝7.8Hz，H-3)，7.35(t，1H，J＝7.8Hz，H-9)，7.10(d，1H，J＝8.2，H-1)，6.61(br s，1H，H-6)，6.57(dd，1H，J＝4.6，9.2Hz，H-1′)，4.99(d，1H，J＝16.5Hz，H-7a)，4.92(d，1H，J＝16.5Hz，H-7b)，4.50(ddd，1H，J＝1.9，5.5，12.8Hz，H-4′)，3.96(s，1H，H-3′)，2.72(s，3H，4′-OCH₃)，2.47(s，1H，3′-NCH₃)，2.45(dt，1H，J＝3.2，12.4Hz，H-2′a)，2.43(s，3H，H-6′)，2.45(dt，1H，J＝3.2，12.4Hz，H-2′a)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ173.1(C，C-5)，138.7×2(CH，C-3″/5″)，138.4(C，C-1″)，136.4×2(C，C-11/13a)，132.4(C，C-12a)，130.3(C，C-7a)，128.3×2(CH，C-2″/6″)，126.8(CH，C-2)，126.2(C，C-12b)，125.5(CH，C-4)，125.2(CH，C-10)，124.7(C，C-4a)，123.6(C，C-7c)，121.5(CH，C-9)，120.7(CH，C-8)，120.2(CH，C-3)，119.2(C，C-4c)，116.3(C，C-7b)，114.6(C，C-4b)，112.2(CH，C-11)，107.6(CH，C-1)，100.5(C，C-4″)，94.6(C，C-5′)，86.5(CH，C-1′)，82.3(CH，C-4′)，60.3(CH₃，4′-OCH₃)，52.1(CH，C-3′)，45.8(CH₂，C-7)，30.7(CH₃，3′-NCH₃)，29.1(CH₃，C-6′)，28.1(CH₂，C-2′)；ESI-MS m/z 733.3[M+H]⁺。

【实施例2】抗肿瘤活性的测试

1细胞毒活性

1.1测试方法

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中合成的单体化合物1～5。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。

细胞系及细胞的继代培养：活性测试采用A549和HL-60细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。

本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对HL-60癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。活性测试时，取对数生长期的HL-60细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5×10⁴个细胞的细胞悬液，按每孔200μL接种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，每孔加入2μL不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μL DMSO溶解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。

本发明采用SRB法，测试评价了被测试样品对A549癌细胞增殖的抑制活性。SRB是一种蛋白质结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其结合产物在515nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。取对数生长期的A549和BEL7402，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×10⁵个细胞的细胞悬液，按每孔200μL接种于96孔板中，每孔加入2μL不同浓度的样品溶液，32℃下培养17h。然后每孔加入80％三氯醋酸50μL，置于4℃固定1h，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50μL并在室温静置30min。用1％醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150μL Tris缓冲液(10mmol/L，pH 10.5)溶解蛋白结合染料，在520nm处测定其吸收度。按照IR％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。

1.2实验结果

由活性测试结果发现，卤族原子取代的十字孢碱类化合物1～5具有较强的肿瘤细胞增殖抑制活性，其对抑制HL-60和A549细胞增殖的IC₅₀分别为0.8、0.9、86.1、1.2、2.1和0.6、0.4、8.5、1.4、0.8μM，其中氟代衍生物的活性最强。

2PKC抑制活性测试：利用荧光偏振方法，测试化合物对蛋白激酶PKCβⅡ的抑制活性，结果表明化合物4对PKCβⅡ具有明显抑制作用，其IC₅₀值约0.024μM。

3结论

化合物1～5对人来源的癌细胞具有细胞增殖抑制作用，其中化合物1、2、4和5对HL-60和A549细胞表现出较强的抑制活性，化合物4还具有较强的PKCβⅡ的抑制活性，预示着其在预防和治疗恶性肿瘤药物方面具有广泛的前景。因此，本发明的式Ⅰ、式Ⅱ化合物可作为抗肿瘤剂(即抗癌药物)用于癌症的治疗，也可作为细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。

附图说明：

图1是化合物的化学结构通式图；图2是5个代表性化合物的化学结构式图；图3是化合物的制备路线图。

Claims

1.式Ⅰ、式Ⅱ化合物

式Ⅰ 式II

其中R₁＝-X，-CF₃；R₂R₃＝-H₂，＝O，-H、-OH，-H、-X；X＝-F，-Cl，-Br，-Ⅰ。

2.权利要求1所述的式Ⅰ、式Ⅱ化合物的药学上可接受的有机或无机酸的盐。例如可以由盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、杏仁酸、苹果酸、樟脑磺酸以及类似的已知可以接受的酸形成盐。

3.权利要求1所述的式Ⅰ、式Ⅱ化合物的前药形式，如磷酸酯、氨基甲酸酯等，当以这种形式给药时，其在体内转变为活性形式起效。

4.权利要求1所述的式Ⅰ、式Ⅱ化合物，其中化合物1-5的其中R₁＝-F，-Cl，-Br，-Ⅰ，-CF₃；R₂R₃＝-H₂，-H、-OH，＝O；X＝-Cl，结构式分别为：

5.权利要求1所述的十字孢碱卤代衍生物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：十字孢碱(星形孢菌素)与卤代苯甲酰化试剂发生酰化反应得到通式Ⅰ中R₁为卤原子取代的该类化合，含X化合物经芳环卤代含R₁的化合物得到，含R₂R₃的化合物可有含R₁的化合物氧化得到。

6.权利要求1所述的吲哚咔唑衍生物(Ⅱ)的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：十字孢碱(星形孢菌素)与卤代苯磺酰化试剂发生磺酰化反应得到通式Ⅱ中R₁为卤原子取代的该类化合，含X化合物经芳环卤代含R₁的化合物得到，含R₂R₃的化合物可有含R₁的化合物氧化得到。

7.权利要求5所述的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：①将十字孢碱溶于二氯甲烷，然后加入三乙胺，与不同的卤代苯甲酰化试剂发生酰化反应得到通式Ⅰ中R₁为卤原子取代的该类化合；②所得含R₁基团的十字孢碱衍生物在甲醇溶剂中与卤代丁二酰亚胺室温下发生卤代反应得到含X的该类衍生物；③所得含R₁基团的十字孢碱衍生物用试剂如O₂、DMSO、t-BuOK、NaOH氧化可得到含R₂R₃为-H、-OH和＝O的该类化合物；或制备顺序颠倒：先将十字孢碱氧化、再发生芳环卤代、最后酰化得到该类化合物；④得到含R₂R₃为-H、-OH的该类化合物与PX₃或POX₃反应可得到含R₂R₃为-H、-X(X＝Cl、Br、Ⅰ)的该类化合物，与DAST反应可得到含R₂R₃为-H、-F的该类化合物。

8.权利要求6所述的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：①将十字孢碱溶于二氯甲烷，然后加入三乙胺，与不同的卤代苯磺酰化试剂发生磺酰化反应得到通式Ⅱ中R₁为卤原子取代的该类化合；②所得含R₁基团的十字孢碱衍生物在甲醇溶剂中与卤代丁二酰亚胺室温下发生卤代反应得到含X的该类衍生物；③所得含R₁基团的十字孢碱衍生物用试剂如O₂、DMSO、t-BuOK、NaOH氧化可得到含R₂R₃为-H、-OH和＝O的该类化合物；或制备顺序颠倒：先将十字孢碱氧化、再发生芳环卤代、最后磺酰化得到该类化合物；④得到含R₂R₃为-H、-OH的该类化合物与PX₃或POX₃可得到含R₂R₃为-H、-X(X＝Cl、Br、Ⅰ)的该类化合物，与DAST反应可得到含R₂R₃为-H、-F的该类化合物。

9.权利要求1所述的式Ⅰ、式Ⅱ化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂及其在制备抗肿瘤药物中的用途。