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CN102066401A - 蛋白质制品 - Google Patents

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CN102066401A
CN102066401A CN2009801239163A CN200980123916A CN102066401A CN 102066401 A CN102066401 A CN 102066401A CN 2009801239163 A CN2009801239163 A CN 2009801239163A CN 200980123916 A CN200980123916 A CN 200980123916A CN 102066401 A CN102066401 A CN 102066401A
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millis
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protein
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CN2009801239163A
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J·杰泽克
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Arecor Ltd
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Abstract

一种包括生物分子的组合物，所述的生物分子易于发生聚合作用、二聚作用或者水解作用，其中所述的离子强度低于40毫摩(mM)。

Description

蛋白质制品
发明的领域
本发明涉及很多种类的分子的稳定性。特别是，本发明涉及蛋白质以及其他生物分子的稳定，其中所述的蛋白质以及其他生物分子表现出二聚物或者具有更高分子量的物种的形成。本发明同样涉及到很多种类的分子的稳定，从小分子到复杂的超分子系统，特别是这样一种分子的稳定性，其中存在于所述的分子或者所述的系统的两个共轭部分之间的键的水解是一项问题。本发明涉及到分子在水性系统中的稳定性，例如在一种水溶液中，在水性凝胶形式中或者在非液态例如存在有游离水或结合水的固态中，例如在冷冻条件下或者经过水分的部分去除之后，其中所述的部分去除是通过例如干燥或者冷冻干燥的方式实现的。
发明的背景
许多生物分子，例如蛋白质，是不稳定的并且当被储存时易于发生结构的分解以及随之发生的活性的损失，特别是在水溶液中。在蛋白质的分解作用中涉及到的过程可以被划分为物理的(即，以非共价相互作用为基础的过程，例如四级结构的损失，三级或者次级结构的损失，聚合，表面吸附)以及化学的(即，涉及到一种共价变化的过程，例如脱氨基过程，水解，氧化，二硫键的不规则性等等)。所述的分解过程的速率通常情况下与温度成比例。蛋白质因此在一般情况下在较低的温度下更为稳定。同样的分解作用原理一般情况下可以被应用到其他生物分子以及更为复杂的超分子系统中，其中所述的超分子系统是由离散数量的组合的分子亚单元或者成分所组成的。
分子的物理不稳定性以及化学不稳定性在许多应用中都是一个特别的问题，其中所述的应用例如是意在用于治疗的应用。
蛋白质以及其他生物分子所具有的一种特别的稳定性问题是二聚物或者具有更高分子量的物种(HMWS)的形成，特别是在当它们被用于进行治疗时，其中两个或者多个分子发生聚合并且形成具有较大分子量的个体。这种聚合作用可以是可逆的或者不可逆的，这取决于发生在所述的蛋白质分子间的相互作用的性质。在蛋白质的聚合作用中可以发生许多不同类型的非共价相互作用，例如发生在所述蛋白质分子中的阳性带电部分与阴性带电部分之间的离子相互作用，或者发生在所述的蛋白质表面上的疏水区域之间的疏水性相互作用。在罕见的情形中，甚至共价相互作用也能够促进蛋白质的聚合作用，其中所述的共价相互作用例如是二硫键。尽管所述的不同类型的相互作用可以进行组合，通常情况下一种特定的类型是在所述的高分子量物种(HMWS)形成的过程中所述的支配力量。因此，例如，一些蛋白质能够形成高分子量物种(HMWS)主要归因于离子相互作用，而其他蛋白质主要归因于疏水性相互作用。能够驱动所述的高分子量物种(HMWS)的形成的条件是变化的，这种变化依赖于所涉及到的支配性的相互作用。因此，可以利用不同的条件将不同蛋白质的高分子量物种(HMWS)的形成速率进行最小化。
可以通过各种不同的技术对高分子量物种(HMWS)的形成进行测量，其中所述的技术例如是体积排阻色谱。可以通过各种不同的光散射技术或者显微镜评价或者视觉评价的方式对大聚合物的形成进行跟进。
聚合作用在治疗性生物分子的制品中是一个特别的问题。尽管所述的聚合形式通常与所述蛋白质的天然形式是对等的，尤其是在可逆的情况下，但高分子量物种(HMWS)的形成代表着存在于监管部门批准的方法中的一个相当大的障碍。
许多不同类型的分子，从小分子到复杂的超分子系统，所具有的另外一个特别的问题是存在于所述分子或者所述系统中的两个共轭部分之间的键的断裂。这种不期望的过程的例子包括：在许多基于多糖的疫苗中(例如，b型流感嗜血杆菌疫苗)，多糖半族从一种载体蛋白质上的断裂，或者是一种融合蛋白质(例如，Etanercept)的关键结构域之间的断裂。酸水解或者碱水解通常情况下是这样的分解过程的机制。
水解是一种化学反应，在水解的过程中一个水分子裂解成为氢离子以及氢氧根离子，上述离子继续参与一种特定的共价键的断裂。水解需要有水的存在并且已知是一种依赖pH的过程。然而，来自于分子中的质子的传递同样可以被纳入到所述的水解断裂的机制中去。
发明概述
本发明是基于下述的发现，发现了小分子、大分子的水性制品中所具有的几种令人期望的参数，其中所述的大分子例如是蛋白质以及超分子系统。本发明的应用导致了这样的分子或者系统所具有的稳定性发生了可能相当大的提升。在一些方面，本发明的应用能够导致对储存过程中的二聚物以及高分子量物种(HMWS)的形成发生了令人期望的减少。在其他方面，本发明的应用能够导致致使不稳定的水解过程的速率发生了令人期望的降低。
发明的描述
在本发明中使用到的所述术语“小分子”涵盖了具有50-2000道尔顿(Da)的分子量的任意化学结构的分子。
在本发明中使用到的所述术语“大分子”涵盖了具有高于2000道尔顿(Da)的分子量的任意化学结构的分子。大分子在通常情况下将是具有聚合性质的，但是本发明并不局限于所述的聚合性的大分子。
在本发明中使用到的所述术语“蛋白质”涵盖了由单个多肽构成的分子或者分子复合物，包括两个或者多个多肽的分子或者分子复合物，以及包括一个或者多个多肽以及一个或者多个非多肽半族的分子或者分子复合物，其中所述的非多肽半族例如是酶活动基，辅助因子等等。所述的术语“多肽”意在涵盖包括共价连接的非氨基酸半族的多肽，例如糖基化多肽，脂蛋白等等。
在本发明中使用到的所述术语“超分子系统”涵盖了由离散数量的组合的分子亚单元或者成分所组成的任何系统。
在本发明中使用到的所述术语“用于进行治疗的物质”涵盖了意在用于进行临床试验或者被批准作为一种医疗设备的一部分或者作为一种药物产品而进行研发的任何物质。
在本发明中使用到的所述术语“高分子量物种”涵盖了通过一种天然形式的物种的聚合作用而形成的任何物种，其中所述的天然形式的物种例如是一种蛋白质。所述术语涵盖了可溶性的以及不可溶性的聚合形式。
在本发明中使用到的所述术语“取代缓冲剂”涵盖了在一种具有指定pH的组合物中存在的任何添加剂，其中所述的添加剂能够进行质子的交换并且在所述组合物的存储的指定温度范围内具有高于或者低于所述组合物的pH至少1个单位的解离常数(pKa)值。向生物制品中施用取代缓冲剂的技术在WO 2008/084237中进行了描述，上述文献的内容在本发明中被引入作为参考。在上述说明书中，对取代缓冲剂所具有的重要性，以及存在于传统缓冲剂和取代缓冲剂之间的差别进行了描述。
在本发明中使用到的所述术语“离子强度”是作为溶液中所有离子的浓度的下述函数来使用的：
I = Σ X = 1 n c x z x 2
其中Cx是离子x的摩尔浓度(摩尔升-3)，zx是离子cx的电荷的绝对值。所述的加和覆盖了存在于所述溶液中的全部离子。
许多蛋白质以及其他的生物分子在储存的过程中经受聚合的过程，即，高分子量物种(HMWS)的形成，特别是在水溶液中时。聚合作用在通常情况下是由非共价相互作用来促使的，其中所述的非共价相互作用例如是发生在各个蛋白质分子的表面上的氨基酸残基之间电荷-电荷相互作用或者疏水性相互作用。所述的氨基酸侧链所具有的电荷以及所述的疏水性均是依赖于pH的。例如，组氨酸残基(解离常数为大约6.1)在pH小于6.1时主要以所述的带电荷形式存在并且在pH大于6.1时主要以所述的不带电荷的形式存在，所述的不带电荷的形式被认为比所述的带电荷的形式具有更强的疏水性。因此，蛋白质以及其他的生物分子发生聚合的趋势同样依赖于pH。因此，为了使所述的蛋白质形成二聚物或者高分子量物种(HMWS)的趋势最小化，对所述制品所具有的pH进行优化是重要的。然而，除了pH之外，还有其他参数对于使所述的蛋白质以及其他生物分子发生聚合的趋势最小化而言同样是非常重要的。这样的参数可以存在相当程度的变化，这取决于所述的聚合过程所具有的性质。本发明致力于研究这样的参数。如果所述的蛋白质被保持在与聚合作用相关的最佳pH下，这些参数所具有的重要性可能相对较低，但是如果所述的蛋白质必须被保持在一个远离所述最佳水平的pH下，则这些参数的重要性是非常显著的，例如出于对可接受性进行调整的原因或者为了获得提高的稳定性。
本发明所具有的与降低蛋白质以及其他生物分子的高分子量物种(HMWS)的形成速率有关的一个优选的特征是：将下述存在于蛋白质或者其他生物分子或者超分子系统制品中的下述配制特征所进行的组合：
●最小离子强度：将所述制品所具有的离子强度保持在最小，例如小于40毫摩，优选的小于20毫摩，最为优选的小于10毫摩。
●使用一种带电荷的物种，其中包括一种相当大的非极性(疏水性)区域，例如是一种苯核或者是一种具有四个或更多个碳原子的脂肪链。可以被有效的用在根据本发明所述的蛋白质组合物中的这样的两性分子化合物的优选的例子是苯甲酸，特别是它的离子形式(苯甲酸根离子)。
●任选的，取代缓冲剂的使用，用以维持所需的pH：所述的制品中在本质上不含有传统的缓冲剂，其中所述的传统缓冲剂即为：在所述组合物的存储的指定温度范围内具有存在于所述组合物的pH的1个单位范围内的解离常数(pKa)值的化合物，并且在所述的制品中包括一种或者多种添加剂(取代缓冲剂)，所述的添加剂能够与所述的生物分子进行质子的交换并且在所述组合物的存储的指定温度范围内具有高于或者低于所述组合物的pH至少1个单位的解离常数(pKa)值；在生物制品中施用所述的取代缓冲剂的技术在PCT/BG2007/000082中进行了描述。
通过将这些配制参数进行组合，可以在本质上降低所述的不期望的高分子量物种(HMWS)的形成速率。优选的，将所述的制品保持在一定的pH之下，在所述的pH下所述高分子量物种(HMWS)的形成速率是最小的。可以通过试验的方式对最佳pH进行确立。然而，本发明可以适用于远离这样的pH最佳水平的pH。
本发明特别适用于对那些在治疗中进行使用的物质进行稳定。
所述的二聚物或者高分子量物种(HMWS)的形成非常可能涉及到疏水性相互作用。这意味着存在于两种或者多种蛋白质分子的表面上的疏水性区域能够发生相互作用并且参与到非共价结合的相互作用中。这导致了逐渐的聚合作用。不希望受到理论的限制，意识到下述的事实是有用的：已经知晓所述的疏水键的形成是热动力学驱动的，所述的驱动是通过增加所述系统的熵值来实现的，其中通过消除发生在所述的疏水性区域与周围的水性环境之间的不利的相互作用的方式来增加所述系统的熵值。重要的是，如果在所述的水性环境中存在一种高浓度的带电物种，所述的熵值的增加将是更高的。出于这种原因，与在较低的离子强度下相比，所述的高分子量物种(HMWS)的形成可能在较高的离子强度下进行的更加容易，如果所述的高分子量物种(HMWS)的形成主要通过疏水性相互作用来促使的话。如果所述的蛋白质不能被保持在一种与最小的聚合作用相关的最佳pH的条件下，这种情形格外适用。
一种通常的治疗性蛋白质制品或者其他的生物分子制品中含有缓冲剂(例如磷酸盐，组氨酸或者柠檬酸盐)以及下述辅料中的一种或者多种：张力调节剂(例如无机盐或者氨基酸)，表面活性剂(例如聚山梨醇酯80)以及糖类或者多元醇(例如这趟或者甘露醇)。这些缓冲剂以及辅料中有许多以相当大的程度构成了所述的水性制品所具有的离子强度。因此意在用于治疗的所述的蛋白质制品通常情况下具有相对高的离子强度，例如高于100毫摩，高于150毫摩或者高于200毫摩。可以确信低离子强度在对蛋白质的聚合的最小化作用方面所具有的重要性还没有被认识到，尤其是所述的蛋白质被维持在与聚合作用相关的最佳pH的范围之外的时候其所具有的重要性，特别是在治疗性蛋白质的商业化制品中。
因此，在一个方面，本发明公开了一种用于将蛋白质或者其他生物分子的二聚物的形成作用或者高分子量物种(HMWS)的形成作用进行最小化的方法，特别是那些用于进行治疗的这样的分子，所述的方法通过将所述的蛋白质放置于一个具有最小离子强度的某种pH条件下的制品中的方式来实现，其中所述的离子强度例如是小于30毫摩，优选的为小于15毫摩，最为优选的为小于10毫摩。当所述的蛋白质被维持在与聚合作用相关的最佳pH的范围之外的时候，例如出于获得提高的溶解度的时候，这种方法是格外有效的。
在本发明中的另外一个方面，一种水性组合物，包括一种蛋白质或者其他的生物分子，所述的蛋白质或者其他的生物分子的pH被调整到一个特定的数值，在这样的pH下具有二聚物形成或者高分子量物种(HMWS)形成的降低的速率，其进一步的特征在于所述组合物所具有的离子强度小于30毫摩，优选的小于15毫摩，最为优选的小于10毫摩。可以使用非离子物种将这种的组合物所具有的摩尔渗透压浓度调整到一个所需的水平上，其中所述的非离子物种例如是糖类或者糖醇。
在一种治疗性蛋白质的制品中，在通常情况下需要具有某种浓度的离子物种来作为缓冲剂。因此，本发明可能引发这样的问题：在使聚合作用的速率最小化的同时确保足够的缓冲能力。这样的问题可以通过如下的方式对作为缓冲剂的离子物种的具体选择的方式来解决：因为一种离子物种所具有的离子强度与这个物种所具有的电荷的平方成比例，与单价离子相比，多价离子能够更加强烈的对离子强度产生相当程度上的影响。因此与所述的多价离子相比，单价离子作为缓冲剂的使用是优选的，从而在确保一定程度的缓冲能力的同时使所述组合物所具有的离子强度最小化。
因此，在本发明中的另外一个方面，一种水性组合物，包括一种蛋白质或者其他的生物分子，所述的蛋白质或者其他的生物分子的pH被调整到一个特定的数值，在这样的pH下具有二聚物形成或者高分子量物种(HMWS)形成的降低的速率，其进一步的特征在于所述组合物在本质上不含有多价离子并且所述组合物所具有的离子强度小于30毫摩，优选的小于15毫摩，最为优选的小于10毫摩。可以使用非离子物种将这种的组合物所具有的摩尔渗透压浓度调整到一个所需的水平上，其中所述的非离子物种例如是糖类或者糖醇。
已经通过试验手段表明了：如果存在于这样的蛋白质组合物中的至少一种所述的带电物种中包括相当程度的非极性(疏水性)区域，这是有益的，其中所述的非极性(疏水性)区域例如是苯核或者具有四个或更多个碳原子的脂肪链。这样的两性分子化合物的使用能够进一步的降低所述的二聚物形成或者高分子量物种(HMWS)形成的速率。可以被有效的用在根据本发明所述的蛋白质组合物中的这样的两性分子化合物的优选的例子是苯甲酸，特别是它的离子形式(苯甲酸根离子)。苯甲酸包括一种羧基基团以及一种非极性的苯核，其中所述的羧基基团在pH大于4.2时主要是带电荷的。它同样是一种已经批准可以被用于治疗性制品中的辅料。不希望受到理论的限制，可以确信苯甲酸以及类似类型的辅料所具有的有益作用归因于其与所述蛋白质的疏水性区域发生的结合，同时将电荷暴露在所述的水溶液中，其中与所述蛋白质的疏水性区域的结合是经由所述的苯核进行的。因此一个电荷被导入到所述蛋白质所具有的疏水性区域中，其降低了所述的疏水性区域参与到疏水性相互作用中去的趋势。这导致了蛋白质聚合速率的降低。
因此，在本发明中的另外一个方面，一种水性系统，包括一种蛋白质或者其他的生物分子，所述的蛋白质或者其他的生物分子的pH被调整到一个特定的数值，在这样的pH下具有二聚物形成或者高分子量物种(HMWS)形成的降低的速率，其进一步的特征在于(i)所述组合物所具有的离子强度小于30毫摩，优选的小于15毫摩，最为优选的小于10毫摩，并且(ii)所述组合物中包括一种带电荷的化合物，所述的化合物中含有一个广泛的疏水性区域，所述的区域例如是苯核或者是具有四个或更多个碳原子的脂肪链。在这样的组合物中苯甲酸离子是优选的辅料。可以使用不带电荷的物种将这种的组合物所具有的摩尔渗透压浓度调整到一个所需的水平上，其中所述的不带电荷的物种例如是糖类或者糖醇。
在另外一个方面，本发明公开了一种用于将一种蛋白质或者其他的生物分子的二聚物的形成作用或者高分子量物种(HMWS)的形成作用最小化的方法，所述的方法是通过下述方式来实现的：(i)将所述的蛋白质放置于一种具有最小离子强度的某种pH条件下的制品中，其中所述的离子强度例如是小于30毫摩，优选的为小于15毫摩，最为优选的为小于10毫摩，并且(ii)向所述的组合物中添加一种离子化合物，所述的离子化合物中含有一种广泛的疏水性区域，所述的区域例如是苯核或者是具有四个或更多个碳原子的脂肪链。当所述的蛋白质被维持在与聚合作用相关的最佳pH的范围之外的时候，例如出于获得提高的溶解度的时候，这种方法是格外有效的。
除了通过减少高分子量物种(HMWS)的形成来提高生物分子的稳定性之外，本发明同样致力于研究通过降低所述的水解过程的速率来提高治疗性分子的稳定性，其中所述的水解过程例如是酰胺键或者酯键的断裂。
水解作用是许多不同类型的分子所存在的显著的稳定性问题，其中所述的分子从小分子到复杂的超分子系统。这样的不期望的过程的例子包括：在许多基于多糖的疫苗中(例如，b型流感嗜血杆菌疫苗)，多糖半族从一种载体蛋白质上的断裂，或者是融合蛋白质(例如，Etanercept)的关键结构域之间的断裂。酸水解或者碱水解通常情况下是这样的分解过程的机制。
水解作用同样可以作为更为复杂的过程的机制中的一个部分，其中所述的更为复杂的过程例如是天冬酰胺的脱氨基作用或者天冬氨酸盐的异构化作用。本发明因此同样适用于在包括水解作用作为它们的分子机制中的一个部分的过程中对各种不同分子的稳定化。
水解作用是一种化学反应，在水解的过程中一个水分子裂解成为氢离子以及氢氧根离子，上述离子继续参与一种特定的共价键的断裂。已知水解作用是一种非常依赖pH的过程。然而，来自于除了水以外的分子中的质子的传递同样可以被纳入到所述的水解断裂的机制中去。一般而言已知水解作用强烈的依赖于pH。因此，为了降低所述的水解速率，对pH进行最优化是至关重要的。然而，其他的配制参数能够为所述的水解速率带来进一步的降低。本发明致力于研究另外的关键性的配制参数，这些参数可以被用来对很多种类的分子以及更为复杂的系统的制品所具有的水解过程的速率进行进一步的降低。
本发明所具有的与降低水解速率有关的另外一个优选的特征是：将下述存在于一种特定分子或者一种更为复杂的系统的制品之中的下述配制特征所进行的组合：
●最小离子强度：将所述制品所具有的离子强度保持在最小，例如小于40毫摩，优选的小于20毫摩，最为优选的小于10毫摩。
●取代缓冲剂的使用，用以维持所需的pH：所述的制品中在本质上不含有传统的缓冲剂，其中所述的传统缓冲剂即为：在所述组合物的存储的指定温度范围内具有存在于所述组合物的pH的1个单位范围内的解离常数(pKa)值的化合物，并且在所述的制品中包括一种或者多种添加剂(取代缓冲剂)，所述的添加剂能够与其他分子进行质子的交换并且在所述组合物的存储的指定温度范围内具有高于或者低于所述组合物的pH至少1个单位的解离常数(pKa)值；在生物制品中施用所述的取代缓冲剂的技术在WO 2008/084237中进行了描述。
通过将这些配制参数进行组合，可以在本质上降低所述的不期望的水解过程的速率。优选的，将所述的制品保持在一定的pH之下，在所述的pH下所述的水解速率是最小的。可以通过试验的方式对最佳pH进行确立。然而，本发明可以适用于远离这样的pH最佳水平的pH。
本发明特别适用于对那些在治疗中进行使用的物质进行稳定。
在一个方面，本发明公开了一种用于将分子或者超分子系统的水解过程的速率进行最小化的方法，所述的方法通过将所述的分子或者所述的系统放置于一个具有最小离子强度的某种pH条件下的制品中的方式来实现，其中所述的离子强度例如是小于40毫摩，优选的为小于20毫摩，最为优选的为小于10毫摩。优选的，所述的组合物所具有的pH被调整到一定的水平上，在这种水平上所述的不期望的水解过程的速率是最小的。
在本发明中的另外一个方面，一种水性组合物，包括一种分子或者超分子系统，所述的分子或者超分子系统的pH被调整到一个特定的数值，其进一步的特征在于所述组合物所具有的离子强度小于40毫摩，优选的小于20毫摩，最为优选的小于10毫摩。可以使用非离子物种将这种的组合物所具有的摩尔渗透压浓度调整到一个所需的水平上，其中所述的非离子物种例如是糖类或者糖醇。优选的，所述的组合物所具有的pH被调整到一定的水平上，在这种水平上所述的不期望的水解过程的速率是最小的。
在一种治疗性蛋白质的制品中，在通常情况下需要具有某种浓度的离子物种来作为缓冲剂或者抗氧化剂。因此，本发明可能引发这样的问题：在使水解作用的速率最小化的同时确保足够的缓冲能力。这样的问题可以通过如下的方式来解决：使用一种单价离子作为缓冲剂或者抗氧化剂，同时对多价离子进行避免，从而在确保一定程度的缓冲能力的同时使所述组合物所具有的离子强度最小化。因此，在本发明中的另外一个方面，一种水性组合物，包括一种分子或者超分子系统，所述的分子或者超分子系统的pH被调整到一个特定的数值，其进一步的特征在于所述组合物在本质上不含有多价离子并且所述组合物所具有的离子强度小于40毫摩，优选的小于20毫摩，最为优选的小于10毫摩。可以使用非离子物种将这种的组合物所具有的摩尔渗透压浓度调整到一个所需的水平上，其中所述的非离子物种例如是糖类或者糖醇。优选的，所述的组合物所具有的pH被调整到一定的水平上，在这种水平上所述的不期望的水解过程的速率是最小的。
已经通过试验手段表明了：为了进一步的降低所述的水解速率，使用取代缓冲剂同时使所述的组合物保持在本质上不含有传统的缓冲剂的方式是有益的。因此，在本发明中的另外一个方面，一种水性组合物，包括一种分子或者超分子系统，所述的分子或者超分子系统的pH被调整到一个特定的数值，其进一步的特征在于所述组合物在本质上不含有传统的缓冲剂并且包括一种或者多种添加剂，所述的添加剂能够与所述的蛋白质进行质子的交换并且在所述组合物的存储的指定温度范围内具有高于或者低于所述组合物的pH至少1个单位的解离常数(pKa)值；所述的组合物所具有的离子强度小于40毫摩，优选的小于20毫摩，最为优选的小于10毫摩。可以使用非离子性的物种将这种的组合物所具有的摩尔渗透压浓度调整到一个所需的水平上，其中所述的非离子性的物种例如是糖类或者糖醇。优选的，所述的组合物所具有的pH被调整到一定的水平上，在这种水平上所述的不期望的水解过程的速率是最小的。
各种不同的水解过程是通过在所述的断裂位点上的质子的传递来进行催化的，其中所述的质子的传递是通过除了水以外的分子来促使的，其中所述的分子例如是缓冲剂分子。不希望受到理论的限制，可以确信：在倾向于发生水解断裂的组合物分子中使用取代缓冲剂来代替传统的缓冲剂所产生的益处是将所述的质子的传递速率最小化，其中所述的质子来自于传统的缓冲剂分子或者来自于所述的断裂位点。
本发明通过下述实施例来进行描述：
实施例1
使用下述的体积排阻色谱方法对一种α-葡萄糖苷酶溶液(12.5毫克/毫升)中的高分子量物种(HMWS)的形成进行跟进：所述的流动相为含有150毫摩氯化钠的25毫摩的磷酸钠(pH6.2)。在进行使用之前对所述的流动相进行过滤。所述的液相色谱仪(Agilent 1100系列)装配有一个214纳米的探测器，保护柱以及一个7.8x 300毫米的BioSep SEC-S2000柱。将所述的流动速率维持在0.45毫升/分钟。注入20微升α-葡萄糖苷酶的水性样本。所述的高分子量物种的水平被表示为：洗脱时间短于所述的主峰的洗脱时间的所有峰值的总峰面积相对于所述的主峰面积的百分比。
在25℃下，在有4毫摩的TRIS缓冲剂存在的条件下对所述的聚合速率进行研究。所述的TRIS缓冲剂所具有的缓冲强度在pH小于6.5的条件下是最小的，但是在这种pH条件下由所述的相对浓缩的酶本身能够产生足够的缓冲能力。发现了在使高分子量物种(HMWS)的形成作用最小化方面所述的最佳pH在6.5左右。在较低以及较高的pH下所述的聚合速率均为更高。离子强度的增加导致了高分子量物种(HMWS)速率的显著增加，特别是在所述的最佳pH的范围之外时(表格1)。因此，尽管在pH为6.5时，所述的离子强度的增加仅仅导致了所述聚合速率的中等程度的增加，但在较高以及较低的pH下所述的增加是相当高的。
表格1
在有4毫摩的TRIS缓冲剂以及指定浓度的氯化钠存在的条件下，在25℃下(3周)在α-葡萄糖苷酶的水性制品中(12.5毫克/毫升)高分子量物种(HMWS)的形成(％)
Figure BPA00001279480800161
实施例2
使用在实施例1中描述的体积排阻色谱方法在25℃以及40℃下(2周)对苯甲酸在α-葡萄糖苷酶溶液(12.5毫克/毫升)中对高分子量物种(HMWS)的形成速率所产生的影响进行了研究。在有2毫摩的TRIS缓冲剂存在的条件下对所述的聚合速率进行研究。除了苯甲酸和/或TRIS之外，在所述的制品中不存在其他带电荷的物种。
在25℃(表格2)以及40℃下，所述的苯甲酸的存在均表现出对高分子量物种(HMWS)的形成速率的降低。与在所述的最佳pH(pH6.5)的条件下相比，在pH7.5下这种效果更为显著，即，远离与最小聚合作用相关的最佳pH的pH。
表格2
在有TRIS缓冲剂(2毫摩)存在的条件下，在存在或者不存在苯甲酸(2毫摩)的条件下，于25℃下(4周)在α-葡萄糖苷酶的水性制品中(12.5毫克/毫升)高分子量物种(HMWS)的形成(％)
  PH  不含有2毫摩的苯甲酸  含有2毫摩的苯甲酸
  6.5  1.93  0.92
  7.0  2.23  0.83
  7.5  2.40  0.98
表格3
在有TRIS缓冲剂(2毫摩)存在的条件下，在存在或者不存在苯甲酸(2毫摩)的条件下，于40℃下(2周)在α-葡萄糖苷酶的水性制品中(12.5毫克/毫升)高分子量物种(HMWS)的形成(％)
  PH  不含有2毫摩的苯甲酸  含有2毫摩的苯甲酸
  6.5  16.82  3.76
  7.0  18.16  3.80
  7.5  25.09  4.08
实施例3
多糖抗原(多聚核糖基-核糖磷酸盐，PRP)从一种载体蛋白质上的水解是b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗存在的一个显著的问题。所述的水解程度可以被表示为存在于所述制品中的游离(即，未与载体蛋白发生结合的)多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)形式的百分比。所述的方法是基于：游离的多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)从结合的多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)中的分离以及随后通过所述的Bial反应在两个部分中进行的多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)的量化(参见Kabat EA，Mayer M于1961年在Experimental immunochemistry《试验免疫化学》Springfield，IL：C Thomas，第526-37中发表的文章Carbohydrate estimation《碳水化合物的评估》)。在这里所描述的试验中，通过利用脱氧胆酸盐对b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗进行沉淀的方式从所述结合的多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)中分离出所述游离的多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)。在此之后利用苔黑素染料进行消化以及分析，其目的在于确定存在于每一个部分中的核糖部分。遵循下述的操作步骤：将纯样本(200微升；50微克/毫升)移液至一个微离心管内。使用200微升的分析用水作为空白。向每个管中添加80微升的脱氧胆酸盐(0.1％重量/体积)并且之后进行涡流搅拌。在此之后对它们进行培养(30分钟，在+4℃下)。经过这次培养之后，向每个管中加入盐酸(50微升，1M)。对所有的管进行涡流处理并且之后于+4℃下进行离心(在5.2g下进行45分钟)。同时在冷藏室内在每一种情形下除去165微升的上清液，并且将其放置于一个微量离心管内。在此之后去除剩余的上清液并且丢弃。通过添加分析用水(35微升)使每个上清液的体积达到200微升。所述的上清液现在可以被用于进行游离核糖的分析。在室温下，向每一个球体中添加氢氧化钠(0.1M，200微升)。对所述的球体进行涡流处理并且使用移液管对其进行搅拌从而将其溶解。在每一种情形中将上述球体溶液的一半(100毫升)等分在一个新的微量离心管内并且利用分析用水(100微升)将所述的体积补足至200微升。所述的球体溶液现在可以被用于进行核糖的分析，其中所述的核糖是与糖蛋白发生结合的核糖。在通风橱内并且在戴手套的条件下，向所述的上清液以及所述的球体溶液中均加入存在于10毫摩盐酸中的200微升的氯化铁。在此之后在每一种情形中向所述的混合液中添加20微升的苔黑素染料(10％的纯乙醇溶液)并且在95℃下进行40分钟的培养。在培养之后立即将所述的管在装有冷水(+4℃)的烧杯内进行冷却。将其中的内含物转移到透明试管内并且在670纳米下测量所述的吸光度。上述获得的数值必须减去适当的空白数值。上清液将除去所述的上清液空白并且所述的球体数值将除去所述的球体空白(这种差异归因于在所述的球体样本中的脱氧胆酸盐的存在，所述的脱氧胆酸盐能够对所述的吸光值产生影响)。得到的数值可以之后被用在下述的等式中：
％游离的核糖＝(吸光度-上清液)/(吸光度-上清液+吸光度-球体)x 100
目前许多商业购买获得的b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗产品(例如HibTITER，Wyeth)可以被配制在0.9％的盐水中作为所述的关键制品成分。已经表明：如果所述的疫苗在pH为6左右的条件下在一种低离子强度的环境下进行配制，可以达到稳定性的显著提高。在这种情形下使用组氨酸作为一种缓冲剂并且使用不带电荷的1，2-丙二醇作为一种张力调节剂。在40℃下对稳定性进行研究。在40℃下培养3周之后，在目前市售的b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗制品(盐水，pH大约为6)中可以观察到游离多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)的超过20％的增加，并且在40℃下培养13周之后，可以观察到超过60％的增加。相反的，在40℃下培养3周之后，在基于低离子强度的组氨酸制品中仅观察到游离的多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)的11％的增加，并且在40℃下培养13周之后仅观察到40％的增加。然而，如果使用一种取代缓冲剂对所述的低离子强度的组氨酸缓冲剂制剂进行替代，可以达到最佳的稳定性，其中所述的取代缓冲剂是以三(氨基甲基)羟基甲烷(10毫摩)以及乳酸钠(10毫摩)的组合为基础的。在40℃下培养3周之后，可以在这样的制品中观察到游离的多聚核糖基-核糖磷酸盐(PRP)的小于5％的增加，并且在40℃下培养13周之后，可以观察到小于25％的增加。

Claims (20)

1.一种包括生物分子的组合物，其中所述的生物分子易于发生聚合作用，二聚化作用或者水解作用，其中所述的离子强度小于40毫摩。
2.根据权利要求1中所述的组合物，其中所述的离子强度小于20毫摩。
3.根据权利要求1中所述的组合物，其中所述的离子强度小于10毫摩。
4.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其是水性的。
5.根据权利要求4中所述的组合物，其在本质上不含有二价离子。
6.根据权利要求4或者权利要求5中所述的组合物，其中包括一种两性分子辅料，所述的两性分子辅料具有一种带电荷的区域以及一种非极性区域。
7.根据权利要求6中所述的组合物，其中所述的非极性区域是一种苯核或者一种具有至少四个碳原子的脂肪链。
8.根据权利要求6中所述的组合物，其中所述的两性分子辅料是苯甲酸。
9.根据权利要求4至8中任意一项中所述的组合物，其在本质上不含有传统的缓冲剂并且包括一种或者多种添加剂(取代缓冲剂)，其中所述的添加剂(取代缓冲剂)能够与所述的生物分子进行质子的交换并且具有高于或者低于所述组合物的pH至少1个单位的解离常数(pKa)值。
10.一种水性组合物，其中包括一种生物分子，三(氨基甲基)羟基甲烷以及苯甲酸或者乳酸盐阴离子。
11.根据权利要求10中所述的组合物，其中所述的三(氨基甲基)羟基甲烷的浓度为2至20毫摩并且所述的苯甲酸的浓度为2至20毫摩。
12.根据权利要求10中所述的组合物，其中所述的三(氨基甲基)羟基甲烷的浓度为2至20毫摩并且所述的乳酸盐阴离子的浓度为2至20毫摩。
13.根据权利要求10至12中任意一项中所述的组合物，其具有5.5至8.0的pH。
14.根据权利要求13中所述的组合物，其具有6.0至7.5的pH。
15.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中所述的生物分子是一种蛋白质。
16.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中所述的生物分子是一种疫苗。
17.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中进一步的包括一种糖或者糖醇。
18.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中进一步的包括一种生理学可接受性的螯合试剂。
19.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中进一步的包括一种生理学可接受性的去垢剂。
20.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，用于治疗的用途。
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