[go: up one dir, main page]

CN102065851A - 治疗真菌、酵母和霉菌感染的纳米乳剂 - Google Patents

治疗真菌、酵母和霉菌感染的纳米乳剂 Download PDF

Info

Publication number
CN102065851A
CN102065851A CN2009801229072A CN200980122907A CN102065851A CN 102065851 A CN102065851 A CN 102065851A CN 2009801229072 A CN2009801229072 A CN 2009801229072A CN 200980122907 A CN200980122907 A CN 200980122907A CN 102065851 A CN102065851 A CN 102065851A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oil
nanoemulsion
species
acid
sodium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801229072A
Other languages
English (en)
Inventor
詹姆斯·R·贝克
玛丽·R·弗拉克
玛丽·乔蒂
乔伊丝·A·萨克利夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanobio Corp
Original Assignee
Nanobio Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanobio Corp filed Critical Nanobio Corp
Publication of CN102065851A publication Critical patent/CN102065851A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/186—Quaternary ammonium compounds, e.g. benzalkonium chloride or cetrimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/906—Drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明涉及治疗和完全治愈人类受试者中真菌、酵母菌和/或霉菌感染的方法，所述方法包括将抗真菌纳米乳剂组合物局部施用于有需要的人类受试者。

Description

治疗真菌、酵母和霉菌感染的纳米乳剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年4月25日提交的美国临时专利申请第61/048,075号的优先权、2008年8月1日提交的美国临时专利申请第61/129,962号的优先权和2008年11月18日提交的美国临时专利申请第61/115,879号的优先权，上述美国临时专利申请公开的内容通过引用全部并入本文。
技术领域
本发明涉及治疗、杀死和/或抑制人类受试者中真菌、酵母菌和霉菌病原体生长的方法，所述方法包括将具有抗真菌、抗酵母菌和/或抗霉菌性质的纳米乳剂组合物局部施用于有需要的人类受试者。本发明还涉及治疗、预防和/或完全治愈人类受试者中真菌、酵母菌和霉菌感染的方法，所述方法包括将具有抗真菌、抗酵母菌和/或抗霉菌性质的纳米乳剂组合物局部施用于有需要的人类受试者。
背景技术
A.真菌/酵母菌/霉菌感染
真菌导致人类中各种各样的疾病。虽然一些真菌导致限于皮肤和毛发的最外层的感染(浅表性真菌病)，但是其他真菌通过渗透至皮肤、毛发和指甲的角质化层并触发宿主中的病理改变来导致皮肤的真菌病。皮下的真菌病导致真皮、皮下组织、肌肉和筋膜中的感染，并且常常是慢性的。全身性真菌病首先在肺部产生并可导致身体其他器官系统中的继发感染。具有免疫系统缺陷的患者常常易于患上伺机性真菌病。
皮肤真菌包括红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)和须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，它们是造成皮肤的真菌感染或皮肤癣菌病(dermatophytose)的原因。足癣(Tinea pedis)是脚趾之间最常显现的皮肤感染，导致受感染的皮肤的鳞屑、剥落和发痒。也可产生水泡和皮肤开裂，从而导致掉皮组织暴露、红斑、疼痛、肿胀和炎症。第二种足癣被称为软鞋足癣，其特征在于慢性足底红斑伴有扩散过度皮肤角化的轻微鳞屑，所述过度皮肤角化可以是无症状的或瘙痒的。其他类型足癣包括炎性/水疱和溃疡性足癣。感染可能波及身体的其他区域，感染本身显现为躯干、手臂和腿上带有抬升边缘的环形鳞状蚀斑、脓疱和水泡(圆癣，Tinea corporis)、手掌和手指指间的鳞状皮疹(手癣，Tinea manuum)、腹股沟和耻区的红斑病变(股癣，Tinea cruris)、胡须部和颈部区域的红斑、鳞屑和脓疱(须癣，Tinea barbae或面癣，Tinea faciale)，或头皮中圆形秃露的鳞状斑块(头癣，Tinea capitis)。花斑癣(Tinea versicolor)也称为变色性皮癣，是影响皮肤的正常色素沉着的皮肤常见真菌感染，产生小的、脱色的斑块。甲癣(Tinea unguium)是指甲的皮肤真菌感染的另一个术语。继发性细菌感染可从真菌感染发展而来。
癣是非常常见的，特别是在儿童之中，可通过皮肤与皮肤的接触，以及通过与诸如发刷之类的污染物品的接触，或通过与感染的个体使用同一个马桶座圈来传播。当被感染的癣是传染性癣时，甚至在它们显示疾病症状之前，癣容易传播。诸如摔跤之类的接触性运动的参与者具有通过皮肤与皮肤的接触获得真菌感染的风险。
癣是中度传染性的。在家畜，特别是农畜，犬和猫以及甚至诸如仓鼠或豚鼠之类的小的宠物中，癣也是常见的感染。当人类紧密接触这些动物时，人类可从这些动物感染癣(通常也称为“环癣”)。癣也可通过直接接触和通过与脱落的皮肤薄片的长时间接触(例如，共用衣服或室内尘埃)从其他人类获得。
在人群中癣的最公知的病征是出现一个或一个以上具有明确边缘的红色抬升的痒的斑块，这与玫瑰糠疹(Pityriasis rosea)的预示性皮疹没有不同。这些斑块常常中心更浅，外观呈现由黑色素增多引起的围绕圆周的着色过度的环形。如果感染区域涉及头皮或胡须区域，那么秃露的斑块可变得明显。感染的区域可能发痒一段时间。
有时癣感染可导致远离实际感染的一部分身体中的皮肤病变。这样的病变被称为“皮肤真菌疹”。病变本身是无真菌的，并且通常在实际感染治疗之后消失。最常见的实例是由脚的真菌感染引起的手上出疹。皮肤真菌疹实质上是真菌的一般性过敏反应。
因而，诸如小孢子菌(Microsporum)属物种、毛癣菌属(Trichophyton)物种、表皮癣菌属(Epidermophyton)物种和念珠菌属物种之类的真菌和酵母菌可导致持续的和难以治疗的感染。
小孢子菌属物种的实例包括犬小孢子菌(M.canis)和石膏样小孢子菌(M.gypseum)。小孢子菌属是引起皮肤癣菌病的几种真菌之一。皮肤癣菌病是用于定义毛发、皮肤或指甲中由任何皮肤真菌物种引起的感染的一般术语。类似于其他皮肤真菌，小孢子菌具有降解角蛋白的能力，因而可以驻留在皮肤和皮肤的附件中，并保持为非侵害性的。注意的是，小孢子菌属物种主要感染毛发和皮肤。犬小孢子菌是犬和猫中环癣的主要原因，是引起人类中偶发的皮肤癣菌病的动物源真菌物种，特别是引起拥有猫和狗的儿童的发癣的动物源真菌物种。
毛癣菌属物种的皮肤感染主要发生在颈背部、头皮或胡须。毛癣菌属物种感染的症状包括发炎的头皮病变、发炎的颈部病变、发炎的胡须部病变、瘢痕和永久的毛发丧失。毛癣菌属物种的实例包括红色毛癣菌(T.rubrum)、断发毛癣菌(T.tonsurans)和须癣毛癣菌(T.mentagrophytes)。
断发毛癣菌是真菌的人源毛内癣菌物种，在欧洲、南美洲和美国其引起流行性皮肤癣菌病。它感染一些动物，并且其生长需要硫胺。在美国它是发癣最常见的原因，发癣形成黑色斑点，在该黑色斑点处毛发在皮肤表面折断。红色毛癣菌是真菌，是足癣(“香港脚”)、股癣和癣(环癣)最常见的起因。红色毛癣菌是引起手指甲真菌感染的最常见的皮肤真菌。然而大多数真菌皮肤感染会发炎并难以治疗，存在着真菌感染导致死亡的报告。具体而言，须癣毛癣菌皮肤感染迁移到淋巴结、睾丸、脊椎和中枢神经系统(CNS)。用灰黄霉素、两性霉素B、克霉唑和转移因子治疗不起效，最终导致受试者死亡(Hironaga et al.，J.Clin.Microbiol.，2003；5298-5301.)。须癣毛癣菌是皮肤真菌群中真菌指甲感染的第二普遍来源。
表皮癣菌属(Epidermophyton)含有两个物种：絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)和斯托克表皮癣菌(Epidermophyton stockdaleae)。已知斯托克表皮癣菌是不致病的，这使得絮状表皮癣菌成为引起人类感染的唯一物种。絮状表皮癣菌是不同的健康个体中皮肤癣菌病的常见起因之一。它感染皮肤(圆癣、股癣、足癣)和指甲(甲癣)。感染限于表皮的无生命的角化层，因为该真菌缺乏穿透免疫活性宿主的活体组织的能力。由任何皮肤真菌散布的感染不太可能局限于对角质化组织的感染。然而，在患有白塞氏综合征的免疫损害的患者中已报道了侵入性絮状表皮癣菌感染。与皮肤癣菌病的所有形式一样，絮状表皮癣菌感染是可传播的，并且通常通过接触、特别是共用淋浴和体育设备来传播。
念珠菌属(Candida)物种的实例包括白色念珠菌(C.albicans)、近平滑(C.parapsiliosis)和克鲁斯氏念珠菌(C.krusei)。患有慢性皮肤粘膜念珠菌病的患者可发展为指甲的念珠菌感染。念珠菌属物种可侵入早先通过感染或外伤而损伤的指甲，并导致甲周区域和甲床下方的感染。甲褶出现红斑、膨胀和触痛，伴有偶见的排出物。疾病引起表皮的损失、指甲营养不良、甲松离，伴有侧面甲褶周围的变色。在甲癣的所有形式中，指甲出现各种损害和变形。
由以上讨论的真菌和酵母菌引起的真菌感染的具体实例是甲癣(指甲感染)。由于真菌感染在毛囊根中或指甲本身下方，影响指甲或头皮的真菌感染特别难以治疗。
甲癣是甲床的慢性、持续性真菌、酵母菌和/或霉菌感染，其引起指甲的增厚和变色，有时伴有疼痛和失能。这种真菌感染影响25％的成年人，发生率随着年龄而提高，以致于在超过50岁的成年人中发病率是40％。根据在Podiatry Today中所报道的研究，在美国超过3千5百万人患有甲癣，高达50％受该疾病影响的人没有接受治疗。
甲癣对患者的社会性、职业性和情绪功能有显著的影响。困窘的感受可使患者排斥在社会或工作环境中的互动，在这些环境中他们不愿意显出他们的手或脚。而且，受甲癣感染的免疫损害的宿主尤其具有发生继发性细菌感染的风险。
甲癣(指甲感染)可由皮肤真菌、酵母菌或非皮肤癣菌霉菌引起。甲癣主要由包括毛癣菌属物种、表皮癣菌属物种和小孢子菌属物种在内的皮肤真菌引起。具体而言，甲癣可由皮肤真菌红色毛癣菌(90％)、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、奥杜盎氏小孢子菌(Microsporum audouinii)、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、堇色毛癣菌(Trichophyton violaceum)、许兰氏毛癣菌(Trichophyton schoenleinii)、断发毛癣菌和诸如支顶孢属(Acremonium)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)、交链孢霉(Alternia)物种、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、Epiccocum nigrum、茎点霉属(Phoma)物种、毛壳属(Chaetomium)物种、弯孢属(Curvularia)物种、足放线病菌属(Scedosporium)物种、Onychocola canadensis和暗色柱顶孢(Scytalidiumdimidiatum)之类的霉菌引起。念珠菌属物种引起51％至70％的手指甲感染。
远端的指甲下的甲癣(DSO)是甲癣的最常见形式，可在脚趾甲、手指甲或两者中发生。感染从侵入甲床开始，由此指甲与甲床分离并引起指甲板与甲床分离(甲松离)和指甲下区域增厚。当细菌和/或霉菌的超感染发生时，指甲板变为黄棕色。
近端指甲下的甲癣(PSO)在AIDS患者中非常常见。真菌侵入甲床沟，穿透进入处在下方的新形成的指甲板。远端的指甲保持正常，直到疾病的晚期。感染引起皮肤增厚(指甲下的皮肤角化过度症)、指甲变白(白甲病)、近端甲松离和指甲单元的破坏。
白色浅表性甲癣(WSO)是甲癣的较少见的形式，其在指甲板的表面层开始，逐渐地侵入更深层。全营养不良性甲癣是所有类型的甲癣中的末期阶段。
此外，念珠菌属物种，特别是白色念珠菌，在慢性甲沟炎的发展中起到病因学作用，慢性甲沟炎是手指甲或脚趾甲周围的软组织的常见感染，其中细菌可作为共同病原体。无波动的肿胀、红斑和甲褶触痛是慢性甲沟炎的特征。最终，指甲板变厚并脱色伴有显著的横脊，表皮和甲褶可从指甲板分离，形成各种微生物侵入的空隙。
长期以来甲癣是最难治疗的真菌感染之一。指甲生长花费的时间长度、指甲板的不可透性、甲床和甲板之间感染的位置是干扰根除影响这些组织的真菌病原体的主要因素。因而，症状的根除是非常缓慢的，可花费整年或更长时间。局部抗真菌剂由于它们的抗真菌谱可能限于皮肤真菌和由于抗真菌剂有限的穿透指甲而具有低效力。抗真菌剂的全身性治疗显示了40％或更高的复发率并且具有显著的风险，包括肝脏和/或心脏毒性，以及有害的药物相互作用。因而，非常需要可选择的、更有效的治疗真菌、酵母菌和/或霉菌感染(例如甲癣)的方法。
B.真菌、酵母菌和霉菌感染的常规治疗选择
真菌、酵母菌和霉菌感染的常规治疗包括局部和口服药物。口服施用的药物一般比局部施用的药物更有效，但是由于口服施用的药物全身地而不是局部地起作用，口服施用的药物的副作用可能更严重得多。
口服施用的抗真菌剂药物的实例包括，但不限于：灰黄霉素、咪唑(联苯苄唑、氯苄甲咪唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、酮康唑、异康唑、咪康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑)、三唑(氟康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑)、特比萘芬和苯并咪唑(噻苯咪唑)。提供了这些药物的几种详细说明。
灰黄霉素(Fulvicin-U/F
Figure BPA00001278043200061
Grifulvin V和Gris-PEG
Figure BPA00001278043200063
)是用于治疗动物癣和人癣的口服施用的药物，所述动物癣和人癣包括诸如股癣、足癣和癣之类的皮肤感染以及头皮、手指甲和脚趾甲的真菌感染(甲癣)。
灰黄霉素作为口服的片剂、胶囊和液体出现。通常一天服用一次，或可以一天服用两到四次。虽然症状可以在数天内改善，但对于皮肤感染而言，必须服用药物2到4周，对于毛发和头皮感染而言，必须服用药物4到6周，对于脚感染而言，必须服用药物4到8周，对于手指甲感染而言，必须服用药物3到4个月，对于脚趾甲感染而言，必须服用药物至少6个月。灰黄霉素副作用的实例包括麻疹、皮疹、意识模糊、眩晕和/或晕厥、腹泻、口渴、疲劳、头痛、常规活动的性能损伤、无法入睡或保持睡眠、恶心和/或胃痛、鹅口疮(口腔的酵母菌感染)、上腹痛、呕吐、肿胀、痒、手或足震颤、味觉丧失和对醇类敏感。此外，灰黄霉素可能是诱导突变的致畸物，可降低口服避孕药的有效性。
盐酸特比萘芬(Lamisil
Figure BPA00001278043200064
Terbisil
Figure BPA00001278043200065
Zabel)是合成的烯丙胺抗真菌剂。它在性质上是高度亲脂性的，倾向于在皮肤、指甲和脂肪组织中积累。特比萘芬主要对真菌的皮肤真菌群体有效。作为1％乳膏剂或粉剂，它用于浅表性皮肤感染，例如股癣、足癣和其他类型的癣(环癣)。口服的250mg片剂常常处方用于治疗由于皮肤真菌甲癣而引起的脚趾甲或手指甲的甲癣。真菌指甲感染可位于指甲下基质中的深部，局部施用的治疗不能以足够的量穿透。对于手指甲真菌而言，口服特比萘芬片剂通常每天服用一次持续6周，对于脚趾甲真菌而言，一天服用一次持续12周。该片剂可导致肝脏毒性，因此就这点而警告患者，并且可用肝功能测试来监测。此外，盐酸特比萘芬可诱导或加重亚急性的皮肤红斑狼疮。伊曲康唑胶囊可用于治疗手指甲和/或脚趾甲的真菌感染。伊曲康唑口服溶液用于治疗口腔和咽喉的酵母菌感染，以及患有发烧和一些其他感染病征的患者中的怀疑的真菌感染。伊曲康唑属于称为氮杂茂的一类抗真菌剂。它通过抑制麦角固醇生物合成起效，麦角固醇是真菌膜的主要成分。
伊曲康唑作为口服的胶囊剂和溶液(液体)出现。伊曲康唑胶囊通常与全餐一起每天服用一到三次持续至少3个月。当伊曲康唑胶囊用于治疗手指甲的真菌感染时，它们通常每天服用两次持续一周，完全不服用持续三周，然后每天服用两次再持续一周。伊曲康唑溶液通常每天空腹服用一次或两次持续1到4周或更久。如果正在服用伊曲康唑来治疗指甲感染，指甲可能不会看起来变健康，直到新的指甲长出。这可能需要6至9个月来生长新的手指甲，需要12至18个月来生长新的脚趾甲。
伊曲康唑具有许多严重的副作用。例如，伊曲康唑可导致充血性心力衰竭(心脏不能泵送充足的血液通过身体的病症)。其他副作用包括腹泻或便溏、便秘、胀气、胃疼、烧心、溃疡或牙龈出血、口腔内或周围的溃疡、头痛、眩晕、出汗、肌肉疼痛、性欲或能力降低、神经质、抑郁、鼻涕和其他感冒症状、不平常的梦、过度疲劳、食欲不振、胃不适、呕吐、皮肤或眼睛发黄、小便黄赤、浅色大便、手或足的震颤、发烧、寒战、或其他感染症状、排尿频繁或痛苦、不受控的摇手、皮疹、麻疹、痒、呼吸或吞咽困难。此外，伊曲康唑口服溶液中的成分之一导致一些类型的实验动物中的癌症。不知道的是服用伊曲康唑溶液的人是否具有提高的发生癌症的风险。
酮康唑(Nizoral
Figure BPA00001278043200071
)作为口服片剂出现。它通常一天服用一次。酮康唑用于治疗真菌感染。酮康唑最常用于治疗通过血流可波及身体的不同部分的真菌感染，例如口腔、皮肤、泌尿道和血液的酵母菌感染，以及在皮肤上或在肺中并且可散布整个身体的一些真菌感染。酮康唑也被用于治疗不能用其他药物治疗的皮肤或指甲的真菌感染。酮康唑属于一类氮杂茂抗真菌剂。它通过减缓引起感染的真菌的生长来起效。
酮康唑可导致肝脏损伤。此外，与酮康唑相关的其他副作用包括胃疼、抑郁、皮疹、麻疹、痒、呼吸或吞咽困难以及自杀倾向。此外，服用高剂量酮康唑的前列腺癌的少数患者在他们开始进行药物治疗之后不久死亡。不知道他们是死于他们的疾病，还是使用酮康唑治疗，还是其他原因。
泊沙康唑(Noxafil
Figure BPA00001278043200081
)作为口服悬浮液(液体)出现。每个剂量应当与全餐或液体营养增补剂一起服用(这可能是有问题的，因为根据这种说明的患者顺应性趋近60％或更低)。也可获得泊沙康唑的片剂形式。800毫克/天的口服剂量(分为两次或四次剂量)已经被用于治疗各种真菌感染。口服和局部泊沙康唑已经用于治疗腐皮镰刀菌(Fusarium solani)角膜炎和内眼炎，起始口服剂量为200毫克每天四次，与泊沙康唑悬浮液(10mg/0.1毫升)的每小时眼部局部施用结合(Sponsel等人，2002)。当泊沙康唑用于治疗口腔和咽喉的酵母菌感染时，通常每天服用一次或两次。泊沙康唑用于预防抗感染能力减弱的人的严重的真菌感染。泊沙康唑也用于治疗口腔和咽喉的酵母菌感染，包括不能用其他药物成功地治疗的酵母菌感染。泊沙康唑属于一类称为氮杂茂的抗真菌剂，通过抑制麦角固醇生物合成减慢真菌生长。泊沙康唑可产生副作用，例如，发烧、头痛、寒战或发抖、眩晕、虚弱、手、脚、踝或小腿肿胀、腹泻、呕吐、胃疼、便秘、烧心、体重损失、皮疹、痒、背部或肌肉疼痛、唇、口腔或咽喉的溃疡、难以入睡或保持睡眠、焦虑、出汗增多、鼻出血、咳嗽、不平常的擦伤或出血、极端的疲劳、缺少能量、食欲不振、恶心、胃的右上部疼痛、皮肤或眼睛发黄、流感样症状、小便黄赤、浅色的大便、禁食、心跳不规则、突然意识丧失、呼吸急促和排尿减少。
伏立康唑(Vfend
Figure BPA00001278043200082
)作为口服片剂和悬浮液(液体)出现。它通常每12小时空腹、餐前至少1小时或餐后1小时服用。伏立康唑用于治疗严重的真菌感染，例如侵入性的曲霉病(在肺部开始并通过血流散布到其他器官的真菌感染)和食道念珠菌病(酵母菌样真菌感染，其可引起口腔和咽喉中的白色斑块)。伏立康唑属于一类称为氮杂茂的药物，通过抑制麦角固醇生物合成减慢真菌生长。伏立康唑可导致副作用，例如，模糊或视力异常、辨色困难、对强光敏感、腹泻、呕吐、头痛、眩晕、口干、面部潮红、发烧、寒战或发抖、快速心跳、快速呼吸、意识模糊、胃不适、极端疲劳、不平常的擦伤或出血、缺少能量、食欲不振、胃的右上部分疼痛、皮肤或眼睛发黄、流感样症状、幻觉、胸痛、皮疹、麻疹、痒、呼吸或吞咽困难以及手、足、踝或小腿肿胀。
氟康唑作为口服片剂和悬浮液(液体)出现。它通常一天服用一次。氟康唑用于治疗真菌感染，包括阴道、口腔、咽喉、食道、腹部(胸和腰之间的区域)、肺部、血液和其他器官的酵母菌感染。氟康唑属于一类称为氮杂茂的抗真菌剂，通过抑制麦角固醇生物合成减慢真菌生长。氟康唑可导致副作用，例如，头痛、眩晕、腹泻、胃疼、烧心、品尝食物的能力改变、胃不适、极端的疲劳、不平常的擦伤或出血、缺少能量、食欲不振、胃的右上部分疼痛、皮肤或眼睛发黄、流感样症状、小便黄赤、淡色的大便、癫痫发作、皮疹、麻疹、痒、面部、咽喉、舌、唇、眼睛、手、脚、踝或小腿肿胀、呼吸或吞咽困难。
局部抗真菌药物包括环吡酮胺、含有咪康唑的药物(Daktarin，Micatin & Monistat)、克霉唑(Canesten，Hydrozole)、布替萘芬(Lotrimin Ultra，Mentax)、特比萘芬(Lamisil)、阿莫罗芬(Curanail，Loceryl，Locetar和Odenil)、萘替芬(Naftin)和托萘酯(Tinactin)。也可用于消除真菌感染的其他抗真菌药物为对羟基苯甲酸乙酯、氟胞嘧啶、水杨酸、二硫化硒和十一烯酸。以下描述了几种示范性的局部抗真菌剂。
环吡酮胺(也称为Batrafen
Figure BPA00001278043200091
Loprox
Figure BPA00001278043200092
Penlac
Figure BPA00001278043200093
和Stieprox
Figure BPA00001278043200094
)是局部皮肤使用的合成的抗真菌剂，其对三价金属阳离子具有高亲和力。在进一步阐明环吡酮胺的作用机制而进行的研究中，筛选和测试了几种酿酒酵母突变体。药物治疗和突变两者的作用的解释结果表明，环吡酮胺可通过几种机制发挥其作用，靶向参与细胞代谢的各种成分的多个蛋白质，所述细胞代谢包括DNA复制、DNA修复和细胞转运(Leem et al.，“The Possible Mechanism of Action of Ciclopirox Olamine in the Yeast Saccharomyces cerevisiae，”Mol.Cells.，15(1)：55-61(2003))。
环吡酮胺作为溶液出现，施用于指甲和紧密环绕指甲的皮肤以及指甲下的皮肤。它通常一天施用一次。环吡酮胺用于改善指甲的状况，但是它不能完全地治愈指甲真菌。此外，在受感染的指甲的任何症状得以改善之前，可持续使用环吡酮胺6个月或更久。环吡酮胺不应与在用环吡酮胺局部溶液治疗的指甲上的指甲油或其他指甲化妆产品一起使用(这可能是患者希望的)。此外，环吡酮胺局部溶液可能着火，因而这种药物不应接近热源或明火(例如香烟)使用。与环吡酮胺相关的副作用包括，但不限于，应用位置发红、刺激、痒、灼烧、水泡、肿胀、或应用位置渗液、受感染的指甲或邻近区域疼痛、指甲变色或形状改变和指甲向内生长。
酮康唑乳膏剂(Nizoral
Figure BPA00001278043200101
)用于治疗圆癣(环癣；引起身体的不同部分上红色鳞状皮疹的真菌皮肤感染)、股癣、足癣、花斑癣(引起胸部、背部、手臂、腿或颈部的褐色或淡色斑点的真菌感染)和皮肤的酵母菌感染。处方的酮康唑香波用于治疗花斑癣。酮康唑属于一类氮杂茂抗真菌药物。
酮康唑可引起副作用，例如，毛发质地的改变、头皮上的水泡、皮肤干燥、痒、油性或干燥的毛发或头皮、应用位置刺激、痒或刺痛，皮疹、麻疹、呼吸或吞咽困难，以及应用位置发红、触痛、肿胀、疼痛或发热。
C.纳米乳剂
与纳米乳剂相关的在先教导在美国专利第6,015,832号中描述，其涉及灭活革兰氏阳性细菌、细菌孢子或革兰氏阴性细菌的方法。所述方法包括使细菌灭活的(或使细菌孢子灭活的)乳剂与革兰氏阳性细菌、细菌孢子或革兰氏阴性细菌接触。美国专利第6,506,803号涉及使用乳剂杀死或中和人体之上或之中的微生物病原(例如，细菌、病毒、孢子、真菌)的方法。美国专利第6,559,189号涉及净化样品(人体、动物、食物、医疗设备，等等)的方法，包括使纳米乳剂与样品接触。所述纳米乳剂，当与细菌、病毒、真菌、原生动物或孢子接触时，杀死病原体或使病原体失去能力。在水性介质中，抗微生物纳米乳剂一般包括季铵化合物、乙醇/甘油/PEG之一、油和表面活性剂。美国专利第6,635,676号涉及两种不同的组合物和通过用任一所述组合物处理样品来净化样品的方法。组合物1包含抗细菌、病毒、真菌、原生动物和/或孢子的抗微生物的乳剂。所述乳剂包含油和季铵化合物。美国专利第7,314,624号涉及诱导免疫原的免疫反应的方法，包括用免疫原和纳米乳剂的组合经由粘膜表面来治疗受试者。所述纳米乳剂包含油、乙醇、表面活性剂、季铵化合物和蒸馏水。US-2005-0208083-A1和US-2006-0251684-A1涉及具有优选尺寸的液滴的纳米乳剂。US-2007-0054834-A1涉及包含季铵卤化物的组合物和使用所述组合物治疗感染病症的方法。所述季铵化合物可作为乳剂的部分来提供。最后，US-2007-0036831-A1涉及包含抗炎症剂的纳米乳剂。
本领域中需要改善受真菌感染影响的患者的治疗选择，所述真菌感染包括脚趾甲、手指甲和皮肤的真菌感染。具体地，本领域中需要完全地消灭脚趾甲、手指甲和皮肤的真菌感染的高效杀菌剂。本发明满足了这些需求。
发明内容
本发明提供了用于治疗和/或预防人类受试者中真菌、酵母菌和/或霉菌病原体感染的方法和组合物，所述方法包括将纳米乳剂局部或皮内施用于所述人类受试者，其中所述真菌或酵母菌病原体是毛癣菌属(Trichophyton)物种、表皮癣菌属(Epidermophyton)物种、念珠菌属(Candida)物种、小孢子菌属(Microsporum)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、拟青霉属(Paecilomyces)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、支顶孢属(Acremonium)物种、毛壳属(Chaetomium)物种、茎点霉属(Phoma)物种、帚霉属(Scopulariopsis)物种、柱霉属(Scytalidium)物种、链格孢属(Alternaria)物种、附球菌属(Epicoccum)物种、弯孢霉属(Curvularia)物种，或其任何组合。用于治疗这些属的任何物种的感染的方法和组合物被本发明涵盖。
所述纳米乳剂包含具有平均直径小于约1000nm的液滴，所述纳米乳剂液滴包含水相、至少一种油、至少一种表面活性剂和至少一种有机溶剂。
所述毛癣菌属物种可以是，例如，阿耶罗毛癣菌(T.ajelloi)、同心性毛癣菌(T.concentricum)、马毛癣菌(T.equinum)、意瑞奈斯毛癣菌(T.erinacei)、淡黄毛癣菌(T.flavescens)、光辉毛癣菌(T.gloriae)、趾间毛癣菌(T.interdigitale)、麦格毛癣菌(T.megnini)、须毛癣菌(T.mentagrophytes)、豆形毛癣菌(T.phaseoliforme)、红色毛癣菌(T.rubrum)、许兰毛癣菌(T.schoenleini)、猴毛癣菌(T.simii)、苏丹奈斯毛癣菌(T.soudanense)、土毛癣菌(T.terrestre)、断发毛癣菌(T.tonsurans)、范布鲁西米氏毛癣菌(T.vanbreuseghemii)、疣状毛癣菌(T.verrucosum)、紫色毛癣菌(T.violaceum)、或杨德氏毛癣菌(T.yaoundei)。所述表皮癣菌属物种可以是，例如，絮状表皮癣菌(E.floccosum)或斯托克表皮癣菌(E.stockdaleae)念珠菌属物种可以是，例如，白色念珠菌(C.albicans)、近平滑念珠菌(C.parapsiliosis)、克柔念珠菌(C.krusei)、热带念珠菌(C.tropicalis)、光滑念珠菌(C.glabrata)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)、乳酒念珠菌(C.kefyr)、高里念珠菌(C.guilliermondii)或杜氏念珠菌(C.dubliniensis)。所述小孢子菌属物种可以是，例如，犬小孢子菌(M.canis)、石膏样小孢子菌(M.gypseum)、奥杜安小孢子菌(M.audouini)、鸡禽小孢子菌(M.gallinae)、铁锈色小孢子菌(M.ferrugineum)、扭曲小孢子菌(M.distortum)、矮小小孢子菌(M.nanum)、库克小孢子菌(M.cookie)或范布瑞西米小孢子菌(M.vanbreuseghemii)。附球菌属物种可以是，例如，黑附球菌(E.nigrum)。曲霉属物种可以是，例如，聚多曲霉(A.sydowii)、土曲霉(A.terreus)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)、烟曲霉(A.fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)、棒曲霉(A.clavatus)、灰绿曲霉群(A.glaucus group)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)、焦曲霉(A.ustus)或花斑曲霉(A.versicolor)。拟青霉属物种可以是，例如，淡紫拟青霉(P.lilacinus)或宛氏拟青霉(P.variotii)。镰刀菌属物种可以是，例如，尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)或半裸镰刀菌(F.semitectum)。毛壳菌属物种可以是，例如，C.atrobrunneum、粪生毛壳菌(C.funicola)、球毛壳菌(C.globosum)或C.strumarium。帚霉属物种可以是，例如，短帚霉(S.brevicaulis)、S.candida、S.koningii、顶孢帚霉(S.acremonium)、黄帚霉(S.flava)、S.cinerea、S.trigonospora、布朗氏帚霉(S.brumptii)、S.chartarum、暗色帚霉(S.fusca)或S.asperula。柱霉属物种可以是，例如，暗色柱霉(S.dimidiatum)、透明柱霉(S.hyalinum)、S.infestans、日本柱霉(S.japonicum)或木生柱霉(S.lignicola)。链格孢属物种可以是，例如，交链格孢(A.alternate)、A.chartarum、石竹链格孢(A.dianthicola)、A.geophilia、感染链格孢(A.infectoria)、匍柄链格孢(A.stemphyloides)或极细链格孢(A.teunissima)。弯孢霉属物种可以是，例如，短孢弯孢霉(C.brachyspora)、暗色弯孢霉(C.clavata)、膝弯孢霉(C.geniculata)、新月弯孢霉(C.lunata)、苍白弯孢霉(C.pallescens)、塞内加尔弯孢霉(C.senegalensis)或疣状弯孢霉(C.verruculosa)。
令人惊讶地发现在治疗由毛癣菌属物种、表皮癣菌属物种、念珠菌属物种、小孢子菌属物种、曲霉属物种、拟青霉属物种、镰刀菌属物种、支顶孢属物种、毛壳菌属物种、茎点霉属物种、帚霉属物种、柱霉属物种、链格孢属物种、附球菌属物种和/或弯孢霉属物种引起的感染方面局部施用的纳米乳剂与口服施用的常规抗真菌剂治疗一样有效或比口服施用的常规抗真菌剂治疗更有效。这是重要的，因为相对于口服施用从而产生的全身性活性，由局部施用而产生的局部的位点特异性活性是极为优选的。如在背景技术部分中提到的，全身性的抗真菌药物具有许多副作用，一些副作用是非常严重的。
待治疗的患者可遭受真菌、酵母菌和/或霉菌感染，例如，癣感染、皮肤癣菌病和/或皮肤癣菌瘤(dermatophytoma)。此外，真菌或酵母菌感染可以是足癣、甲癣、圆癣、股癣、发癣、手癣、须癣、面癣、花斑癣或真菌角膜炎。在本发明的一个方面，患者可患有甲癣。
所述纳米乳剂包含具有平均粒径小于约1000nm的液滴，所述纳米乳剂包含水、至少一种油、至少一种表面活性剂和至少一种有机溶剂。在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂中存在的表面活性剂是阳离子表面活性剂。在本发明的另一实施方式中，所述纳米乳剂进一步包含螯合剂。在本发明的一种实施方式中，本发明的纳米乳剂或从本发明的纳米乳剂衍生的那些样品被稀释。然后，可测试稀释的样品以确定它们是否维持了期望的功能，例如，表面活性剂浓度、稳定性、粒径和/或抗感染活性(例如，抗真菌活性)。
在一些实施方式中，其他的活性剂，例如，抗真菌剂、抗酵母菌剂或抗霉菌剂，被掺入所述纳米乳剂来改善活性剂的吸收。优选地，所述第二活性剂是抗真菌剂，例如，盐酸特比萘芬(TBHC)或咪康唑。然而，在治疗甲癣中有用的任何适合的或期望的活性剂可掺入所述纳米乳剂来实现皮肤和软组织中的抗真菌活性。
优选地，用于局部或皮内施用的纳米乳剂是任何药学上可接受的剂型形式，包括但不限于，软膏剂、乳膏剂、乳剂、乳液、凝胶、液体、生物粘附性凝胶、喷雾、香波、气雾剂、膏剂、泡沫、防晒剂、胶囊、微囊，或是物体或载体的形式，例如，绷带、插入物、注射器样敷涂器、阴道栓剂、粉剂、滑石粉或其他固体、香波、清洁剂(驻留和洗去的产品)以及有助于渗透表皮、真皮和角蛋白层的药剂。所述纳米乳剂能够有效地治疗、预防和/或治愈毛癣菌属物种、表皮癣菌属物种、念珠菌属物种、小孢子菌属物种、曲霉属物种、拟青霉属物种、镰刀菌属物种、支顶孢属物种、毛壳菌属物种、茎点霉属物种、帚霉属物种、柱霉属物种、链格孢属物种、附球菌属物种、弯孢霉属物种或其任何组合的感染，而不被全身吸收并且没有上皮刺激。
本发明的纳米乳剂可以是杀真菌的或抑真菌的(例如，对于皮肤真菌的每种分离物)，并且对真菌分生孢子、菌丝、菌丝体和孢子有效。
在本发明的一种实施方式中，本发明的纳米乳剂提供了待治疗病症的真菌学的痊愈。
上述一般说明和以下的附图简要说明以及详细说明是示范性的和说明性的，意在提供进一步解释本发明要求保护的内容。根据以下本发明的详细说明，对于本领域技术人员而言其他目的、优点和新颖特征将是显而易见的。
附图说明
图1显示了将纳米乳剂递送进入皮肤，包括纳米乳剂在毛囊和皮脂腺内部的定位，图1A显示了皮肤横截面，箭头指出皮脂腺和毛囊；图1B显示了荧光下的有荧光素而没有纳米乳剂的皮肤横截面，以及图1C显示了荧光下的有荧光素和纳米乳剂的皮肤横截面，箭头指出毛囊和皮脂腺。
图2显示了将纳米乳剂递送进入皮肤，包括纳米乳剂从毛囊和皮脂腺向真皮和表皮的横向扩散，图2A显示了皮肤横截面，箭头指出毛囊；附图2B显示了荧光下的有荧光素而没有纳米乳剂的皮肤横截面，以及附图2C显示了荧光下的有荧光素和纳米乳剂的皮肤横截面，箭头指出毛囊和皮脂腺。
图3图示比较了对于红色毛癣菌的真菌分离物，本发明的纳米乳剂的杀真菌效果和目前用于治疗真菌感染的其他抑真菌药物的效果，表示为最小抑制浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)值。(A)纳米乳剂(“NB-002”，在水性介质中包含大豆油、作为非离子表面活性剂的吐温20
Figure BPA00001278043200141
乙醇、作为阳离子表面活性剂的氯化十六烷基吡啶(CPC)、EDTA和水)；(B)特比萘芬；(T)环吡酮胺(C)；(D)伊曲康唑。
图4说明了本发明的纳米乳剂对甲癣的作用机制。
图5图示说明了，在用(A)载体；(B)包含0.25％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次；(C)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于一次；和(D)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次治疗之后，由受训的研究人员评估的新的未受影响的指甲的线性生长的进展。纳米乳剂治疗组显示出新的、未受影响的指甲的生长的明显进展。
图6图示说明了，在用(A)载体；(B)包含0.25％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次；(C)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于一次；和(D)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次治疗之后，通过面积法评估的新的未受影响的指甲的线性生长的进展。纳米乳剂治疗导致新的、未受影响的指甲的生长的明显进展。
图7图示说明了，在用(A)载体；(B)包含0.25％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次；(C)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于一次；和(D)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次治疗之后，通过平面几何分析，受影响的指甲的面积的逐渐减小。纳米乳剂治疗使得受影响指甲的面积的逐渐减小。
图8比较了与用Penlac
Figure BPA00001278043200151
治疗相比，用根据本发明的纳米乳剂治疗停止后8周或更久获得的真菌学治愈率。
图9显示了本发明的示范性的纳米乳剂(NB-002)针对稀有的甲癣真菌病原体的抗真菌性的图表。
图10显示了随时间根据本发明的纳米乳剂对红色毛癣菌的生存力的影响(菌丝和微小分生孢子)。在左侧(10A)显示了纳米乳剂(4×MIC)和对比物(16xMIC)对红色毛癣菌NBD031菌丝体的生存力的影响，在右侧显示了对微小分生孢子的影响(10B)。测试的对比物是伊曲康唑(菱形)；特比萘芬(正方形)；环吡酮胺(三角形)；和纳米乳剂(X)。检测的下限是100cfu。
图11显示了本发明的示范性的纳米乳剂(NB-002)对红色毛癣菌、须毛癣菌和絮状表皮癣菌的杀真菌活性，图11A显示了红色毛癣菌NBD030菌丝体(无处理)的扫描电镜照片；图11B显示了在室温下用100μg/ml本发明的示范性的纳米乳剂(NB-002)处理1小时之后的菌丝体(50×MIC)(2,000×放大率)；图11C显示了没有处理的红色毛癣菌微小分生孢子(箭头)的扫描电镜照片；和图11D显示了在用本发明的示范性的纳米乳剂(NB-002)在室温下处理1小时之后(12.5μg/ml≈6×MIC)红色毛癣菌微小分生孢子(箭头)的扫描电镜照片(5,000×放大率)。
图12显示了在室温下用本发明的示范性的纳米乳剂(NB-002)(～50×MIC)处理1小时之后红色毛癣菌菌丝的扫描电镜照片(11,000×放大率)。
图13显示了在24小时将纳米乳剂递送进入人类尸体皮肤。图13A显示了在对人类尸体皮肤的单次施用之后，包含0.3％w/v氯化十六烷基吡啶(CPC)的纳米乳剂和包含0.3％w/v水性氯化十六烷基吡啶(CPC)的对照组合物吸收进入表皮的比较。图13B显示了在对人类尸体皮肤的单次施用之后，包含0.3％w/v氯化十六烷基吡啶(CPC)的纳米乳剂和包含0.3％w/v水性氯化十六烷基吡啶(CPC)的对照组合物吸收进入真皮的比较。与胶束CPC相比，纳米乳剂液滴的独特结构产生了显著的皮肤渗透。
图14显示了根据本发明的纳米乳剂中存在的不同浓度的阳离子表面活性剂对吸收进入猪皮肤的表皮和真皮的影响。图14A显示了在包含0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％w/v氯化十六烷基吡啶(CPC)的纳米乳剂的单次施用和三次施用之后吸收进入表皮的比较。图14B显示了在包含0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％w/v氯化十六烷基吡啶(CPC)的纳米乳剂的单次施用和三次施用之后吸收进入真皮的比较。
图15显示了在施用TBHC制剂两次之后，与Lamisil
Figure BPA00001278043200161
乳膏剂(Lamisil是包含TBHC的非纳米乳剂组合物)相比，当将化合物掺入纳米乳剂时包含盐酸特比萘芬(TBHC)的纳米乳剂吸收进入猪皮肤的表皮表现出TBHC的吸收显著改善。
图16显示了在施用TB制剂两次之后，与Lamisil
Figure BPA00001278043200163
乳膏剂(Lamisil
Figure BPA00001278043200164
是包含TB的非纳米乳剂组合物)相比，当化合物掺入纳米乳剂时包含盐酸特比萘芬(TBHC)的纳米乳剂吸收进入猪皮肤的真皮表现出TBHC的吸收显著改善。图17显示了与在非纳米乳剂制剂(LotriminAF喷雾溶液)中局部施用的MCZ相比，局部施用掺入纳米乳剂中的MCZ(BID给药)之后，在24小时家猪皮肤表皮中咪康唑(MCZ)的含量表现出当MCZ掺入纳米乳剂时显著改善了MCZ递送进入表皮。
图18显示了与在非纳米乳剂制剂(Lotrimin
Figure BPA00001278043200166
AF喷雾溶液)中局部施用的MCZ相比，局部施用掺入纳米乳剂中的MCZ(BID给药)之后，在24小时家猪皮肤真皮中咪康唑(MCZ)的含量表现出当MCZ并入纳米乳剂中时显著改善了MCZ递送进入真皮。
图19说明了实施例13中描述的利用人类尸体皮肤的横向扩散研究的尺寸，两个同心的玻璃环限定了5.27cm2的外部给药区域、3.3cm2的中间区域和0.5cm2的内部区域。
图20说明了实施例13中描述的横向扩散研究的设计。根据横向扩散研究的设计，腔室内部存在的CPC的唯一给药途径是渗透进入皮肤样品并横向地移动通过组织。
图21图示了与包含0.5％w/v氯化十六烷基吡啶(CPC)水溶液的对照组合物(图21A)相比，包含0.5％w/v氯化十六烷基吡啶(CPC)的根据本发明的纳米乳剂(图21B)，利用人类尸体皮肤的横向扩散研究的结果。描绘了24小时期间横向扩散的结果，对于水性CPC溶液成分而言，进入中间区域具有最小的横向扩散，内部区域中没有显示横向扩散。相比之下，当施加0.5％纳米乳剂时，中间和内部区域明显地测量到横向扩散。
图22图示了实施例13中描述的横向扩散研究结果，其中在所有三个区域(外部给药区域、中间区域和内部区域)中表现出表皮组织内的0.5％纳米乳剂和0.25％纳米乳剂的转运(CPC的测量用作纳米乳剂的递送标志)。在外部给药区域中纳米乳剂的施用之后24小时，在0小时和8小时，在表皮的外部、中间和内部区域中检测到可测量数量的纳米乳剂，其超过4μg/g纳米乳剂的最小杀真菌浓度(MFC90)。
图23图示了实施例13中描述的横向扩散研究结果，其中在所有三个区域(外部给药区域、中间区域和内部区域)中表现出真皮组织内的0.5％纳米乳剂和0.25％纳米乳剂的转运(CPC的测量用作纳米乳剂的递送的标志)。在外部给药区域中纳米乳剂的施用之后24小时，在0小时和8小时，在真皮的外部、中间和内部区域中检测到可测量数量的纳米乳剂，其超过4μg/g纳米乳剂的最小杀真菌浓度(MFC90)。
图24图示了在外部给药区域中的单次施用之后24小时，在表皮内测试的0.5％纳米乳剂的横向扩散，在外部、中间和内部区域中检测到可测量数量的纳米乳剂(CPC的测量作为纳米乳剂的递送的标志)。
图25图示了在外部给药区域中的单次施用之后24小时，在真皮内测试的0.5％纳米乳剂的横向扩散，在外部、中间和内部区域中检测到可测量数量的纳米乳剂(CPC的测量作为纳米乳剂的递送的标志)。
具体实施方式
本发明提供了用于治疗、预防和/或治愈人类受试者中真菌、酵母菌和/或霉菌感染的方法和组合物，所述方法包括将纳米乳剂局部或皮内施用于所述人类受试者。真菌、酵母菌和/或霉菌病原体可以是任何已知的真菌、酵母菌和/或霉菌病原体，包括本文描述的任何这样的病原体。在示范性的方法和组合物中，所述病原体是毛癣菌属物种、表皮癣菌属物种、念珠菌属物种、小孢子菌属物种、曲霉属物种、拟青霉属物种、镰刀菌属物种、支顶孢属物种、毛壳菌属物种、茎点霉属物种、帚霉属物种、柱霉属物种、链格孢属物种、附球菌属物种、弯孢霉属物种或其任何组合。本发明涵盖治疗由这些属的任何物种引起的感染的方法和组合物。
毛癣菌属物种的实例包括阿耶罗毛癣菌、同心性毛癣菌、马毛癣菌、意瑞奈斯毛癣菌、淡黄毛癣菌、光辉毛癣菌、趾间毛癣菌、麦格毛癣菌、须毛癣菌、豆形毛癣菌、红色毛癣菌、许兰毛癣菌、猴毛癣菌、苏丹奈斯毛癣菌、土毛癣菌、断发毛癣菌、范布鲁西米氏毛癣菌、疣状毛癣菌、紫色毛癣菌和杨德氏毛癣菌。
表皮癣菌属物种的实例包括絮状表皮癣菌(旧物种的废弃异名包括E.clypeiforme、E.clypeiforme、E.inguinale、E.plicarum、Acrothecium floccosum、Trichophyton cruris、Trichophyton floccosum、Trichophyton inguinale、Trichophyton intertriginis和Trichothecium floccosum)和斯托克表皮癣菌。
念珠菌属物种的实例包括白色念珠菌、近平滑念珠菌(C.parapsiliosis)和克鲁斯氏念珠菌。念珠菌属是一种酵母菌，它是全球伺机性真菌病最常见的起因。它也是人类皮肤和粘膜的常见定殖者。念珠菌属包括约154个物种。在这些物种之中，有六种在人类感染中最常被分离。而白色念珠菌是最丰富的和重要的物种，热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和葡萄牙念珠菌也作为念珠菌属感染的致病病原体被分离。其他念珠菌属物种包括乳酒念珠菌、高里念珠菌和杜氏念珠菌。重要地是非白色念珠菌属物种(例如，光滑念珠菌和克柔念珠菌)的感染近来增加(Abi-Said等人“The epidemiology of hematogenous candidiasis caused by different Candida species，”Clin.Infect.Dis.，24：1122-1128(1977)；Aisner等人“Torulopsis glabrata infections in patients with cancer：Increasing incidence and relationship to colonization，”Am.J.Med.，61：23-28(1976)；Arif等人，“Techniques forinvestigation of an apparent outbreak of infections with Candida glabrata，”J Clin Microbiol.，34：2205-9(1996))。接受氟康唑预防的患者特别有风险发生氟康唑抗性克柔念珠菌和光滑念珠菌菌株的感染。(Barchiesi等人，“Emergence of oropharyngeal candidiasis caused by non-albicans species of Candida in HIV-infected patients(letter)，”Eur.J.Epidemiol.，9：455-456(1993)。尽管如此，在感染中遇到的念珠菌属物种的多样性正在扩大，在过去很少起作用的其他物种的出现现在是可能的。由念珠菌属物种引起的感染一般被称为念珠菌病。念珠菌病的临床谱极其多样。身体的几乎任何器官或全身可受到影响。念珠菌病可以是浅表性的和局部的，或是深层和散布的。散布的感染起因于来自主要感染位置的血行播散。白色念珠菌是所有物种中最为病原性的并且是最常遇到的物种。它附着于宿主组织，产生分泌性天冬氨酰蛋白酶和磷脂酶以及从酵母菌转化成菌丝形态的能力是它的致病性的主要决定因素。
小孢子菌属包括17种常规物种。在这些物种之中，最重要的是：奥杜安小孢子菌、鸡禽小孢子菌(M.gallinae)、铁锈色小孢子菌、扭曲小孢子菌(M.distortum)、矮小小孢子菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、库克小孢子菌(M.cookie)和范布瑞西米小孢子菌(M.vanbreuseghemii)。小孢子菌属是引起皮肤癣菌病的三个属之一。皮肤癣菌病是用于定义毛发、皮肤、指甲中由任何皮肤真菌物种而引起的感染的一般术语。类似于其他皮肤真菌，小孢子菌属具有降解角蛋白的能力，因而可以驻留在皮肤和皮肤的附件中，并保持为非侵害性。和角蛋白酶一样，真菌的蛋白酶和弹性蛋白酶可以作为毒力因子。值得注意的是，除了不感染毛发的桃色小孢子菌(Microsporum persicolor)以外，小孢子菌属物种主要感染毛发和皮肤。指甲感染不那么常见。感染的病理取决于物种的天然储备。土源性物种(Geophilic spp.)是经由与土壤接触获得的。动物源性物种从感染的动物传播。直接或间接的(经由污染物)人类与人类间的传播涉及人源物种。可以观察到无症状的携带。和其他健康的宿主一样，免疫受损的患者也可受到感染。
曲霉属包括超过185种物种。约20个物种迄今为止被报道作为人类中伺机性感染的致病病原体。在这些物种之中，烟曲霉是最常分离的物种，之后是黄曲霉和黑曲霉。棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和花斑曲霉是较不常见地作为伺机性致病病原体被分离的其他物种。在所有丝状真菌之中，曲霉属通常是从侵入性感染中最常分离的一种。它是继念珠菌属之后伺机性真菌病中第二常见的真菌。可以涉及人体中几乎任何器官或全身。可能发生甲癣、鼻旁窦炎、脑曲霉病、脑膜炎、心内膜炎、心肌炎、肺曲霉病、骨髓炎、耳霉菌病、内眼炎、皮肤曲霉病、肝脾曲霉病以及曲霉真菌血症和播散性曲霉病。(Arikan等人，“Primary cutaneous aspergillosis in human immunodeficiency virus-infected patients：Two cases and review，”Clin.Infect.Dis.，27：641-643(1998)；Denning，D.W.，“Invasive aspergillosis，”Clin.Infect.Dis.，26：781-803(1998)；Gefter，W.B.，“The spectrum of pulmonary aspergillosis，”Journal of Thoracic Imaging，7：56-74(1992)；Gumbo等人，“Aspergillus valve endocarditis in patients without prior cardiac surgery，”Medicine，79：261-268(2000)；Gupta等人，“Combined distal and lateral subungual and white superficial onychomycosis in the toenails，”J.Am.Acad.Dermatol.，41：938-44(1999)；Katz等人，“Ocular aspergillosis isolated in the anterior chamber，”Ophthalmology，100：1815-1818(1993))由于导管和其他设备而引起的曲霉病的医院内发生也是可能的。医院环境中的结构构成了在尤其是嗜中性白细胞减少的患者中发生曲霉病的主要风险。曲霉属物种还可以是在由于肺结核、结节病、支气管扩张、肺尘埃沉着病、关节强硬性脊椎炎或赘生物而产生的早先发展的肺部空腔中的局部定殖者，表现为不同的临床实体，称为曲霉瘤。曲霉瘤还可存在于肾脏中。
拟青霉属含有几个物种。最常见的是淡紫拟青霉和宛氏拟青霉。拟青霉属物种可导致人类中的各种感染。这些感染有时称为拟青霉病。由于拟青霉而导致的角膜溃疡、角膜炎和内眼炎可能在延长佩戴隐形眼镜或眼部手术之后发生。(Pettit等人，“Fungal endophthalmitis following intraocular lens implantation.A surgical epidemic，”Arch.Ophthalmol.，98：1025-1039(1980).)拟青霉属是免疫受损的宿主中出现的伺机性真菌病的致病病原体之一。(Groll等人，“Uncommon opportunistic fungi：new nosocomial threats，”Clin.Microbiol.Infect.，7：8-24(2001))直接的皮肤接种可导致这些感染。(Orth等人，“Outbreak of invasive mycoses caused by Paecilomyces lilacinus from a contaminated skin lotion，”Ann.Intern.Med.，125：799-806(1996))这些感染可涉及人体几乎任何器官或全身。软组织(Williamson等人，“Successful treatment of Paecilomycesvarioti infection in a patient with chronic granulomatous disease and a review of Paecilomyces species infections，”Clin.Infect.Dis.，14：1023-1026(1992))、肺部(Byrd等人，“Paecilomyces variotii penumonia in a patient with diabetes mellitus，”J.Diabetes Complic.，6：150-153(1992))和皮肤感染(Orth等人；Safdar，A.，“Progressive cutaneous hyalohyphomycosis due to Paecilomyces lilacinus：Rapid response to treatment with caspofungin and Itraconazole，”Clin.Infect.Dis.，34：1415-1417(2002))、蜂窝组织炎(Jade等人，“Paecilomyces lilacinus cellulitis in an immunocompromised patient，”Arch.Dermatol.，122：1169-70(1986))、甲癣(Fletcher等人，“Onychomycosis caused by infection with Paecilomyces lilanicus，”Br.J.Dermatol.，139：1133-1135(1998))、鼻旁窦炎(Gucalp等人，“Paecilomyces sinusitis in an immunocompromised adult patient：Case report and review，”Clin.Infect.Dis.，23：391-393(1996)；Rockhill等人，“Paecilomyces lilacinus as the cause of chronic maxillary sinusitis，”J.Clin.Microbiol.，11：737-739(1980))、中耳炎(Dhindsa等人，“Chronic supparative otitis media caused by Paecilomyces variotii，”J.Med.Vet.Mycol.，33：59-61(1995))、心内膜炎(Haldane等人，“Prosthetic valvular endocarditis due to the fungus Paecilomyces，”Can.Med.Assoc.J.，111：963-5，968(1974))、骨髓炎(Cohen-Abbo等人，“Multifocal osteomyelitis caused by Paecilomyces varioti in a patient with chronic granulomatous disease，”Infection，23：55-7(1995))、腹膜炎(Rinaldi等人，“Paecilomyces variotii peritonitis in an infant on automated peritoneal dialysis，”Pediat.Nephrol.，14：365-366(2000))和导管相关的真菌血症(Tan等人，“Paecilomyces lilacinus catheter-related fungemia in an immunocompromised pediatric patient，”J.Clin.Microbiol.，30：2479-2483(1992))都已经被报道。
与作为常见的植物病原体一样，镰刀菌属是人类中浅表性感染和全身感染的致病病原体。由于镰刀菌属物种而产生的感染被统称为镰刀菌病。最有毒力的镰刀菌属物种是腐皮镰刀菌(Mayayo等人，“Experimental pathogenicity of four opportunist Fusarium species in a murine model，”J.Med.Microbiol.，48：363-366(1999))。外伤是由于镰刀菌属菌株而发生皮肤感染的主要诱因。另一方面，在免疫抑制的宿主，尤其是在嗜中性白细胞减少患者中和移植患者中，发生传播性伺机性感染(Vartivarian等人，“Emerging fungal pathogens in immunocompromised patients：classification，diagnosis，and management，”Clin.Infect.Dis.17：S487-91(1993)；Venditti等人，“Invasive Fusarium solani infections in patients with acute leukemia，”Rev.Infect.Dis.，10：653-660(1988))。在实体器官移植之后镰刀菌感染易于保持在局部并且比在患有血液恶性肿瘤的患者和骨髓移植患者中发生的镰刀菌感染具有更好的结果(Sampathkumar等人，“Fusarium infection after solid-organ transplantation，”Clin.Infect.Dis.，32：1237-1240(2001))。已经报道了由于镰刀菌物种引起的角膜炎(Tanure等人，“Spectrum of fungal keratitis at Wills Eye Hospital，Philadelphia，Pennsylvania，”Cornea，19：307-12(2000))、内眼炎(Louie等人，“Endogenous endophthalmitis due to Fusarium：case report and review，”Clin.Infect.Dis.，18：585-8(1994))、中耳炎(Wadhwani等人，“Fungi from otitis media of agricultural field workers，”Mycopathologia，88：155-9(1984))，甲癣(Romano等人，“Skin and nail infections due to Fusarium oxysporum in Tuscany，Italy，”Mycoses，41：433-437(1998))、皮肤感染(Romano等人)，特别是烧伤创口的感染，足分枝菌病、鼻旁窦炎、肺部感染(Rolston，K.V.I.，“The spectrum of pulmonary infections in cancer patients，”Curr.Opin.Oncol，13：218-223(2001))、心内膜炎、腹膜炎、中央静脉导管感染、脓毒性关节炎、传播性感染和真菌血症(Yildiran等人，“Fusarium fungaemia in severely neutropenic patients，”Mycoses，41：467-469(1998))。
支顶孢属是真菌性白色颗粒足分枝菌病的致病病原体之一。还报道了由于支顶孢属而引起的甲癣、角膜炎、内眼炎、心内膜炎、脑膜炎、腹膜炎和骨髓炎的罕有病例。已知这种真菌在免疫受损的患者，例如骨髓移植接受者中引起伺机性感染。有时观察到由于支顶孢属物种而引起的人工植入物感染。
毛壳菌属含有几个物种。最常见的有C.atrobrunneum、粪生毛壳菌、球毛壳菌和C.strumarium。毛壳菌属物种属于引起全称为暗色丝孢霉病的感染的真菌。已经在免疫受损的宿主中报道了由于Chaetomium atrobrunneum而引起的致命的深度真菌病。也可由毛壳菌属物种引起脑脓肿、腹膜炎、皮肤病变和甲癣。
茎点霉属含有几个物种。从人类感染分离的大部分菌株没有被鉴定为物种水平。茎点霉属物种是暗色丝孢霉病的罕见病因之一。感染通常在外伤之后发生，免疫抑制是发生感染的主要风险因素。这些感染可能是皮肤的、皮下的、角膜或(罕有地)全身性的。
最常见的帚霉属物种是短帚霉。其他非色素的物种包括S.candida、S.koningii、顶孢帚霉和黄帚霉。暗色或棕色成员包括S.cinerea、S.trigonospora、布朗氏帚霉、S.chartarum、S.fusca和S.asperula。帚霉属物种可导致人类中的各种感染。它是引起甲癣，特别是脚指甲的甲癣的真菌之一。已经报道了由于帚霉属物种而引起的皮肤病变、足分枝菌病、侵入性的鼻旁窦炎、角膜炎、内眼炎、肺部感染、心内膜炎、脑脓肿和传播性感染。侵入性帚霉感染主要在免疫受损的宿主，例如骨髓移植接受者中见到。这些感染是高度致命的。
柱霉属物种包括暗色柱霉、S.hyalinum、S.infestans、日本柱霉和木生柱霉。柱霉属物种是指甲或皮肤感染的偶见的病原体。也注意到皮下或传播性感染的一些病例。
链格孢属目前含有约50个物种。在这些之中，A.alternata是从人类感染中最常分离的一种。而A.chartarum、石竹链格孢、A.geophilia、感染链格孢、匍柄链格孢和A.teunissima是从感染分离的其他链格孢属物种，某些被报道为致病病原体的链格孢属菌株仍未具体说明。链格孢属物种特别是在具有免疫抑制的患者中，例如，骨髓移植患者中作为伺机性病原体出现。它们是暗色丝孢霉病的致病病原体之一。已经报道了由于链格孢而引起的甲癣、鼻旁窦炎、溃烂的皮肤感染和角膜炎，以及内脏感染和骨髓炎的病例。在免疫活性的患者中，链格孢定殖于鼻旁窦，导致慢性肥大性鼻旁窦炎。在免疫受损的患者中，定殖可最终发展为侵入性疾病。它是农田工作者中中耳炎的致病病原体之一。
弯孢霉属含有几个物种，包括短孢弯孢霉(C.brachyspora)、暗色弯孢霉、膝弯孢霉、新月弯孢霉、苍白弯孢霉、塞内加尔弯孢霉和疣状弯孢霉。新月弯孢霉是人类和动物中最普遍的疾病起因。弯孢霉属物种属于暗色丝孢霉病的致病病原体。伤口感染、足分枝菌病、甲癣、角膜炎、过敏性鼻旁窦炎、大脑脓肿、大脑炎、肺炎、过敏性支气管肺疾病、心内膜炎、透析相关的腹膜炎和传播感染可由弯孢霉属物种引起。新月弯孢霉是最常遇到的物种。重要地，感染可在具有完整免疫系统的患者中发生。然而，类似于几种其他的真菌属，弯孢霉属近来也作为感染免疫受损的宿主的伺机性病原体出现。
由这些病原体引起的真菌感染是广泛的，目前可用的治疗具有显著的局限性和/或有限的成功。例如，红色毛癣菌是引起足癣(香港脚)、股癣(股癣)和皮肤癣菌病(环癣)最常见的真菌。由红色毛癣菌引起的其他常见的皮肤疾病包括，但不限于：发癣(头皮的真菌毛囊炎)、须癣(胡须的真菌毛囊炎)、马约基肉芽肿(腿的真菌毛囊炎)和甲癣。虽然红色毛癣菌是引起手指甲真菌感染的最常见的皮肤真菌，但是还存在其他的皮肤真菌。须毛癣菌是皮肤真菌组群中第二常见的真菌指甲感染病源。
圆癣是通常热的、潮湿气候中更为常见的感染。红色毛癣菌是全球最常见的传染原，是47％的圆癣病例的病源。断发毛癣菌是全球分布的人源性真菌，其引起皮肤、指甲和头皮的炎性或慢性非炎性细小鳞状病变。断发毛癣菌是导致发癣的最常见的皮肤真菌，具有人源性发癣感染的人更可能发生相关的圆癣。因此，由断发毛癣菌引起的圆癣的发病率正在提高。犬小孢子菌是第三常见的致病微生物，与14％的圆癣感染相关。参见：http://emedicine.medscape.com/article/1091473-overview.
近来有报道在非免疫受损患者和免疫受损患者中由非皮肤癣菌霉菌引起的真菌感染增加(Malani等人，“Changing epidemiology of rare mould infections：implications for therapy，”Drugs，67：1803-1812(2007)；Tosti等人，J.Am.Acad.Dermatol.，42：217-224(2000))。这样的生物体包括但不限于：曲霉属物种、镰刀菌属物种、足放线病菌属物种、拟青霉属物种、帚霉属物种、柱霉属物种、毛壳菌属物种、链格孢属物种、支顶孢属物种和弯孢霉属物种。
纳米乳剂包含具有平均直径小于约1000nm的液滴，所述纳米乳剂液滴包含水相、至少一种油、至少一种表面活性剂和至少一种有机溶剂。“局部”应用可以是施用于任何浅表皮肤结构、毛发、毛干、毛囊、眼睛或其任何组合。
在一些实施方式中，在指甲周围、指甲下方、穿过指甲或通过指甲中的缺损来扩散的纳米乳剂包含另外的活性剂。优选的，第二活性剂是抗真菌剂。
待治疗的患者可遭受真菌、酵母菌和/或霉菌感染，例如，癣感染、皮肤癣菌病和皮肤癣菌瘤。此外，所述真菌、酵母菌和/或霉菌感染可以是足癣、甲癣、圆癣、股癣、发癣、手癣、须癣、面癣、花斑癣或真菌角膜炎。在本发明的一个方面，患者可患有甲癣。
在本发明的一种实施方式中，待治疗、预防或治愈的真菌感染是甲癣。在本发明的这个方面中，局部施用是施用于感染的指甲、感染的指甲周围的皮肤或其组合，在施用之后，所述纳米乳剂在指甲周围、在指甲之下、穿过指甲、通过指甲中的缺损、或其组合来扩散。
用于治疗皮肤和/或指甲的真菌/酵母菌/霉菌感染的常规药物中存在的难题之一是真菌指甲感染一般位于指甲板下方的深部，甚至进入指甲基质，局部施用的常规治疗极难或不能以足够的量穿透指甲以产生治疗有效的处理。口服施用的药物可解决局部施用治疗中存在的这个难题，但是口服施用的药物全身起作用，因而，可导致不期望的毒性，例如，肝脏毒性。向患者警告了这一点并可用肝功能测试来监测患者。全身性药物可在谱系上有限制，不能覆盖引起甲癣的所有真菌、酵母菌和霉菌。
惊讶地发现局部施用的纳米乳剂与口服施用的常规抗真菌剂治疗相比，在治疗由毛癣菌属物种、表皮癣菌属物种、念珠菌属物种、小孢子菌属物种、曲霉属物种、拟青霉属物种、镰刀菌属物种、支顶孢属物种、毛壳菌属物种、茎点霉属物种、帚霉属物种、柱霉属物种、链格孢属物种、附球菌属物种、弯孢霉属物种或其任何组合引起的感染方面一样有效或更有效。这是重要的，因为相对于口服施用药物而产生的全身性活性，当局部施用时产生局部的位点特异性活性是极为优选的。如在背景技术部分提到的，全身性的抗真菌药物具有许多副作用，一些是非常严重的。
此外，纳米乳剂可施用于诸如指甲之类的覆盖感染的阻挡物并可在诸如指甲之类的覆盖感染的阻挡物周围施用，在施用之后，所述纳米乳剂迁移(或横向在下方扩散)到阻挡物之下来有效地到达感染处并消灭感染。获得这种结果而没有全身性的吸收，因为在治疗的受试者的血浆中没有发现可测量数量的纳米乳剂(通过测量在纳米乳剂中存在的任何诸如阳离子表面活性剂之类的表面活性剂或洗涤剂是否被吸收到血流中来测定)。
本发明的纳米乳剂包含FDA批准用于人类消费的表面活性剂和“公认安全的”(GRAS)常见的食品物质。纳米乳剂的制剂中使用的成分全部列于批准的药物产品中的无活性成分的FDA的目录中。
本发明的纳米乳剂的图解作用机制在图4中描绘。具有平均直径小于约1000nm的纳米乳剂液滴可施用于受感染的指甲周围的皮肤和组织。在图4中描绘了脚趾甲。纳米乳剂液滴通过皮肤毛孔/浅表皮肤结构、近中心和外侧的甲褶和指甲下方，迁移到达真菌、酵母菌或霉菌感染的位置。发明人不希望受到理论的限制，认为纳米乳剂液滴裂解真菌菌丝、细胞和孢子，从而“杀死”真菌、霉菌或酵母菌。
具体地，图3图示比较了对于红色毛癣菌的真菌分离物，本发明的纳米乳剂的杀真菌的效果和目前用于治疗真菌感染的其他抑真菌药物的效果，表示为最低抑菌浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)值。(A)纳米乳剂(“NB-002”)；(B)特比萘芬；(C)环吡酮胺；和(D)伊曲康唑。当用于治疗真菌感染时，环吡酮胺是局部施用，而特比萘芬和伊曲康唑是口服施用的药物。令人惊讶地，通过比较显示了本发明的纳米乳剂针对红色毛癣菌是杀真菌的，而环吡酮胺、特比萘芬和伊曲康唑针对红色毛癣菌仅仅是抑真菌的。与特比萘芬和伊曲康唑的口服和全身作用相比，即使纳米乳剂是局部施用，上述比较结果也是确切的。纳米乳剂的MIC和MFC(有时也称为“MLC”)值基本上是相等的，这意味着作用机制是杀真菌(MFC∶MIC比值小于或等于四)。然而，例如特比萘芬的药物的MIC和MLC值相差大于四倍，这意味着药物不总是杀真菌。与抑真菌剂的治疗相比，杀真菌剂的治疗是更加理想的，因为杀真菌剂可更加有效的完全“治愈”感染以及防止感染复发。
例如，图11显示了示范性的纳米乳剂(NB-002，包含水性介质、大豆油、作为非离子表面活性剂的吐温20
Figure BPA00001278043200261
、乙醇、作为阳离子表面活性剂的氯化十六烷基吡啶(CPC)、EDTA和水)对生长的菌丝和孢子的作用。图11A显示了在纳米乳剂施用之前的菌丝，图11B和图12显示了在纳米乳剂施用之后的菌丝。在纳米乳剂施用之后，纳米乳剂液滴与菌丝细胞表面相互作用，导致形成气泡(凸出)。类似地，图11C显示了在纳米乳剂施用之前的孢子，图11D显示了纳米乳剂施用之后的孢子。图11D清楚地显示了施用根据本发明的纳米乳剂导致孢子的裂解和破坏。时间-杀死实验验证了用纳米乳剂处理的菌丝或孢子是非存活的(图10)。
纳米乳剂包含具有平均直径小于约1000nm的液滴，所述纳米乳剂包含水相、至少一种油、至少一种表面活性剂或洗涤剂和至少一种有机溶剂。在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂中存在的表面活性剂是阳离子表面活性剂。本发明的纳米乳剂中可存在一种以上表面活性剂或洗涤剂。例如，所述纳米乳剂可以包含阳离子表面活性剂与非离子表面活性剂的组合。在本发明的另一实施方式中，所述纳米乳剂进一步包含螯合剂。“局部”施用可以是施用于任何浅表皮肤结构、毛发、毛干、毛囊、眼睛或其任何组合。本发明的有机溶剂和水相可以是非磷酸盐式溶剂。在本发明的一些实施方式中，诸如阳离子表面活性剂之类的表面活性剂被用作“标记物”来测量吸收进入表皮和真皮的纳米乳剂(参见例如图13和图14)。
在一些实施方式中，也将除了纳米乳剂之外的活性剂，例如，抗真菌剂、抗酵母剂或抗霉菌剂掺入所述纳米乳剂来实现促进活性剂的吸收，从而提高所述活性剂在组织中的杀死效果(图15至图18)。
所述纳米乳剂包含高能量纳米尺寸的液滴，其渗透皮肤毛孔和毛囊进入表皮和真皮，在表皮和真皮中接触时杀死真菌(或病毒、细菌、霉菌，等等)。参见图1至图2和图13。具有适合尺寸的液滴可渗透皮肤毛孔和毛囊，但是可被上皮细胞之间的紧密连接隔绝，因而不破坏组织基质或进入血管。这减小了皮肤刺激和全身吸收，但是也提供了在表皮和真皮组织中具有高生物利用度而不导致破坏正常上皮基质的组合物。例如，本文描述的数据确认了本文所述的纳米乳剂经由毛囊途径扩散通过角质层，积累在表皮和真皮组织中而不破坏正常的上皮基质。在表皮和真皮中达到的纳米乳剂的浓度大大高于抗感染活性所需的浓度。
理论上，纳米乳剂液滴通过膜去稳定作用杀死真菌、病毒、霉菌、酵母菌等等，其中，所述纳米乳剂液滴与细胞外表面相互作用，引起裂解。例如，纳米乳剂液滴已经显示了附着于诸如红色毛癣菌之类的真菌的菌丝体，看起来与细胞表面融合，形成气泡，从而导致死亡(图10至图12)。发现本文所述的纳米乳剂对菌丝的形态和生存力具有显著效果，甚至在最小的暴露时间之后具有显著效果。此外，由于本发明的纳米乳剂在非生长条件下进行测试(菌丝和小分生孢子悬浮于水中)，它们不需要重复起效。由于理论上纳米乳剂具有经由真菌细胞表面的去稳定作用的“接触时杀死”的作用机制，它们不可能产生抗性；列举了显示不会发生自发抗性、或自发抗性不稳定的实验(实施例7)。
此外，已经显示了本发明的纳米乳剂在组织平面内横向扩散(图21至图25)到没有表皮损伤的感染位置。具体地，以下实施例描述了根据本发明的纳米乳剂沿着组织平面横向扩散到距离皮肤施用位置约1cm的感染位置。这使得能够治疗存在于阻挡物之下的感染，例如，人类手指甲或脚趾甲。这对于甲癣的治疗特别具有吸引力，在甲癣中皮肤真菌感染处在指甲板之下。因而，纳米乳剂不依赖于渗透而有效的穿过指甲板。
此外，实施例显示了包含另外的活性剂的纳米乳剂横向扩散到不直接位于施用位置之下的区域(实施例12至14)。适合的活性剂包括但不限于，任何抗真菌剂，包括但不限于任何适合的抗真菌剂种类，包括但不限于：(1)聚烯抗真菌剂，例如，那他霉素、龟菌素、非律平、制霉菌素、两性霉素B和坎底辛；(2)咪唑抗真菌剂，例如，咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、联苯苄唑、布康唑、芬替康唑、异康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑；(3)三唑抗真菌剂，例如，氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑、瑞扶康唑、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑；(4)烯丙胺抗真菌剂，例如，特比萘芬、阿莫罗芬、萘替芬和布替萘芬；(5)棘白菌素抗真菌剂，例如，阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净；(6)其他抗真菌剂，例如，苯甲酸(具有抗真菌性质，但是必须与角质层分离剂，例如维特飞尔德药膏(Whitfield’s Ointment)、环吡酮胺、托萘酯、十一烯酸、氟胞嘧啶(或5-氟胞嘧啶)、灰黄霉素和卤普罗近联合)；以及(7)可选药剂，例如，大蒜素(从压碎的大蒜产生的)、茶树油(SIO 4730，“白千层属的油，萜品烯-4-醇型”)、香茅油、碘(卢戈尔氏溶液)、柠檬草、橄榄叶子、橙油、玫瑰草油、广藿香、香柠桃木、蒜楝木种子油、椰子油、锌(锌膳食增补剂或天然食物来源，包括南瓜籽和小鸡豌豆)以及硒((硒膳食增补剂或天然食品来源，包括巴西坚果)。这使得能够治疗存在于阻挡物(例如，人类手指甲或脚趾甲)之下的感染。这对于甲癣的治疗特别具有吸引力，在甲癣中皮肤真菌感染处在指甲板之下。因而，纳米乳剂不必依赖于渗透而有效的穿过指甲板。
在本发明的另一实施方式中，真菌、酵母菌和/或霉菌病原体不表现出对根据本发明的纳米乳剂产生抗性(实施例7)。具体而言，如在以下的实施例中描述的，当观察到对根据本发明的纳米乳剂的表型抗性时，所测试的分离物都不是稳定对抗纳米乳剂。这与本文所述的和实施例中描述的本发明的纳米乳剂均一的杀真菌活性是一致的。
本发明的又一益处是本文所述的纳米乳剂提供了广泛覆盖来对抗引起甲癣的所有主要病原体，所述主要病原体包括但不限于：红色毛癣菌、须毛癣菌和絮状表皮癣菌。参见实施例1。具体而言，本发明的示范性的纳米乳剂与常规的抗真菌药物(伊曲康唑、特比萘芬和环吡酮胺)在杀死红色毛癣菌、须毛癣菌和絮状表皮癣菌方面的比较说明，所述纳米乳剂在杀死引起甲癣的主要病原体方面与常规的抗真菌药物一样有效或比常规的抗真菌药物更有效。参见实施例1。
此外，如在实施例6中描述的，根据本发明的纳米乳剂还表现出针对所有非皮肤癣菌霉菌的广泛有效性，所述非皮肤癣菌霉菌例如曲霉属物种、拟青霉属物种、镰刀菌属物种、支顶孢属物种、帚霉属物种、足放线病菌属物种、柱霉属物种、链格孢属物种、黑附球菌、弯孢霉属物种、茎点霉属物种和毛壳菌属物种。此外，所述纳米乳剂显示了针对较不常见的诸如疣状毛癣菌和Trichophyton soundanense之类的皮肤真菌物种的活性。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂中存在的表面活性剂是阳离子表面活性剂。本发明的纳米乳剂中可存在一种以上表面活性剂或洗涤剂。例如，纳米乳剂可以包含阳离子表面活性剂与非离子表面活性剂的组合，或与阴离子的和/或两性离子的和/或阳离子表面活性剂的组合和/或它们的任何组合。在本发明的另一实施方式中，所述纳米乳剂进一步包含螯合剂。“局部”应用可以是施用于任何浅表皮肤结构、毛发、毛干、毛囊或其任何组合。本发明的有机溶剂和水相可以是非磷酸盐式溶剂。
在本发明的另一方法中，描述了杀死或预防有需要的人类受试者中的真菌、霉菌或酵母菌病原体的方法，所述方法包括将纳米乳剂局部施用于所述人类受试者。所述局部施用是施用于阻挡物周围的皮肤，真菌、酵母菌和/或霉菌感染存在于阻挡物下方，阻挡物下方的皮肤具有真菌、酵母菌和/或霉菌感染或感染恶化的风险，并且所述纳米乳剂在所述阻挡物周围、在所述阻挡物之下、通过所述阻挡物中的缺损或其组合扩散。所述阻挡物可以是指甲、增稠的角质层、毛干、毛囊或其任何组合。纳米乳剂包含具有平均直径小于约1000nm的液滴，所述纳米乳剂包含水相、至少一种油、至少一种表面活性剂或洗涤剂和至少一种有机溶剂。
纳米乳剂本身具有抗真菌活性，并且不需要与其他活性剂联合来获得治疗有效性。然而，在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂可以进一步包含在治疗、治愈或缓解甲真菌病感染方面有用的一种或一种以上其他活性剂，包括但不限于添加另一种抗真菌剂。
用于治疗皮肤和/或指甲的甲癣或真菌/酵母菌/霉菌感染的常规药物中所存在的难题之一是真菌指甲感染一般位于指甲板下方的深部，甚至进入指甲基质，局部施用的常规治疗极难以足够的量渗透或不能渗透甲床和基质来产生治疗有效的处理。口服施用的药物可以解决局部施用治疗中存在的这个难题，但是口服施用的药物全身起作用，因而，可以导致肝脏毒性。向患者警告这一点，并可用肝功能测试来监测。全身性药物还在谱系方面有限制，不能覆盖引起甲癣或其他癣感染的所有真菌、酵母菌和霉菌。
令人惊讶地，本发明涉及以下发现，本发明的纳米乳剂可以在诸如指甲之类的覆盖感染的阻挡物周围施用，在施用之后，所述纳米乳剂迁移到阻挡物的下方(或在下方横向地扩散)，有效到达感染处并消灭感染。此外，获得这种结果而没有全身性吸收，因为在治疗的受试者的血浆中没有发现可测量数量的纳米乳剂(通过测量在纳米乳剂中存在的诸如阳离子表面活性剂之类的任何表面活性剂或洗涤剂是否被吸收到血流中来测定)。
在本发明的一种实施方式中，本发明的纳米乳剂向待治疗的病症提供了真菌学治愈(即，用于治疗真菌感染和/或甲癣)。例如，在本发明的方法中，本文所述的纳米乳剂可以提供真菌学治愈，这定义为在停止治疗后1周、停止治疗后2周、停止治疗后3周、停止治疗后4周、停止治疗后5周、停止治疗后6周、停止治疗后7周、停止治疗后8周、停止治疗后9周、停止治疗后10周、停止治疗后11周、停止治疗后12周、停止治疗后1个月、停止治疗后2个月、停止治疗后3个月、停止治疗后4个月、停止治疗后5个月或停止治疗后6个月显微镜检查为阴性结果并且培养物检查为阴性结果。这与抗真菌感染的常规局部治疗(例如Penlac)形成对比，所述抗真菌感染的常规局部治疗提供了在停止治疗后最小的真菌学治愈。在本发明的另一实施方式中，在用本发明的纳米乳剂治疗后，至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％、至少约26％、至少约27％、至少约28％、至少约29％或至少约30％的受治疗的患者群体根据任何上述治疗时间间隔(即，停止治疗后1周、停止治疗后2周，等等)，表现出治疗的真菌感染和/或甲癣的真菌学治愈。在本发明的又一实施方式中，与使用常规的非纳米乳剂局部抗真菌治疗(例如Penlac
Figure BPA00001278043200311
)所获得的真菌学治愈率相比，本发明的纳米乳剂提供了改善的真菌学治愈率。在本发明的一些实施方式中，与常规的非纳米乳剂治疗(例如Penlac
Figure BPA00001278043200312
)相比，根据本发明的纳米乳剂获得的真菌学治愈与常规的非纳米乳剂治疗的真菌治愈之间的差异是25％或更高、50％或更高、75％或更高、100％或更高、125％或更高、150％或更高、175％或更高、200％或更高、225％或更高、250％或更高、275％或更高、300％或更高、325％或更高、350％或更高、375％或更高、400％或更高、425％或更高、450％或更高、475％或更高或500％或更高。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂包含：(a)水相；(b)约1％的油到约80％的油；(c)约0.1％的有机溶剂到约50％的有机溶剂；(d)约0.001％的表面活性剂或洗涤剂到约10％的表面活性剂或洗涤剂；(e)约0.0005％到约1.0％的螯合剂；或(f)其任何组合。在本发明的另一实施方式中，所述纳米乳剂包含：(a)约10％的油到约80％的油；(b)约1％的有机溶剂到约50％的有机溶剂；(c)以约0.1％到约10％的量存在的至少一种非离子表面活性剂；(d)以约0.01％到约2％的量存在的至少一种阳离子试剂；(e)约0.0005％到约1.0％的螯合剂；或(f)其任何组合。所述纳米乳剂可以进一步包含另外的活性剂，例如，抗真菌剂。
在本发明的又一实施方式中，所述纳米乳剂另外包括至少一种适合的或理想的在治疗甲癣中有用的活性剂。所述活性剂可以以治疗有效量存在，例如，约0.1％至约99％、约3％至约80％、约5％至约60％、约10％至约50％或其任何组合(例如，约3％至约10％)。
纳米乳剂中存在的每种成分的量是指治疗性的纳米乳剂，而不是体外待测试的纳米乳剂。这是重要的，因为体外测试的纳米乳剂，例如，在实施例中描述的纳米乳剂，一般比要用于治疗用途(例如局部使用)的纳米乳剂具有更低浓度的油、有机溶剂、表面活性剂或洗涤剂，以及螯合剂(如果存在的话)。这是因为体外试验不需要纳米乳剂液滴横贯皮肤或其他阻挡物。对于局部(或皮内的)应用而言，成分的浓度必需更高以产生治疗性的纳米乳剂。然而，体外测试的纳米乳剂中使用的每种成分的相对量适合于治疗使用的纳米乳剂，因而，可成比扩大体外量以制备治疗组合物，并且体外数据可很好的预示局部施用成功。
A.定义
在此使用如在下文和整个申请中阐述的几个定义来描述本发明。
本文使用的“约”会被本领域普通技术人员理解，并且其在一定程度上依赖于使用该词的语境而变化。如果对于本领域普通技术人员而言在使用该词的语境中不清楚该术语的使用时，“约”是指具体术语的正负10％。
术语“缓冲液”或“缓冲剂”是指当将其添加至溶液中时使得该溶液抵抗pH值的改变的物质。
术语“螯合物”或“螯合剂”是指具有可用于键合至金属离子的孤对电子的一个以上原子的任何物质。
术语“稀释”是指利用由PBS或水(例如diH2O)或其他水溶性成分构成的水性系统，将本发明的纳米乳剂或由本发明的纳米乳剂衍生的那些纳米乳剂稀释到期望的浓度。
术语“亲水亲油平衡指数”和“HLB指数”是指表面活性剂分子化学结构与它们的表面活性相关的指数。HLB指数可以通过Meyers(Meyers，Surfactant Science and Technology，VCH Publishers Inc.，New York，pp.231-245[1992]，通过引用并入本文)所描述的多种经验公式来计算。如本文使用的，表面活性剂的HLB指数是在McCutcheon′s Volume 1：Emulsifiers and Detergents North American Edition，1996(通过引用并入本文)中分配给表面活性剂的HLB指数。商售的表面活性剂的HLB指数为0到约70或更高。在水中具有高溶解度和增溶性质的亲水性表面活性剂处在上述数值范围的高值一端，而在水中具有低溶解度、在油中是水的良好增溶剂的表面活性剂处在上述数值范围的低值一端。
本文使用的术语“纳米乳剂”包括分散体或液滴，以及其他脂质结构，当与水不混溶的油相与水相混合时，所述其他脂质结构可由驱动非极性残基(即，长烃链)远离水和驱动极性头部基团朝向水的疏水力来形成。这些其他脂质结构包括，但不限于：单层、稀少层(paucilamellar)和多层脂质囊泡、胶束和薄层相。所述液滴具有小于约1000nm的平均直径。
本文使用的术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于宿主(例如，动物或人)时基本上不产生不利的过敏反应或免疫反应的组合物。这样的制剂包括任何药学上可接受的剂型。本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包被、润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)、等渗剂和吸收延迟剂、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)，等等。
当涉及“稳定的纳米乳剂”时，术语“稳定的”是指所述纳米乳剂保持其作为乳剂的结构。期望的纳米乳剂结构，例如，可由期望的尺寸范围、乳剂科学的宏观观察结果(是否可见一个或一个以上层、是否可见沉淀)、pH值以及一种或一种以上成分的稳定浓度来表征。
本文使用的术语“受试者”是指通过本发明的组合物待治疗的生物体。这样的生物体包括动物(驯养的动物物种，野生动物)和人类。
术语“表面活性剂”是指具有极性头部基团和疏水性的尾部的任何分子，所述极性头部基团积极地倾向于被水溶剂化，所述疏水性的尾部不易被水溶剂化。术语“阳离子表面活性剂”是指具有阳离子头部基团的表面活性剂。术语“阴离子表面活性剂”是指具有阴离子头部基团的表面活性剂。
本文使用的术语“全身活性药物”被广泛地使用来表明其施用不必靠近感染源并且其含量可在远离施用位置的位置测出的物质或组合物(例如，口服施用药物，其中药物的含量在血流中或在组织或器官中发现)。
本文使用的术语“局部地”是指本发明的组合物施用于皮肤或感染的组织和粘膜细胞和组织的表面(例如，肺泡、口腔、舌、舌下、咀嚼粘膜或鼻粘膜，以及中空器官或身体空腔中的其他组织和细胞)。
本文使用的术语“局部活性剂”是指被施用于皮肤或粘膜表面的本发明的组合物。会在受试者的施用(接触)位置之处或附近产生期望的药理学结果。
B.本发明的纳米乳剂的性质
本发明提供了在有需要的人类受试者中杀死引起真菌、酵母菌和/或霉菌感染的真菌、酵母菌和/或霉菌病原体的方法，其中所述真菌、酵母菌和/或霉菌病原体是毛癣菌属物种、表皮癣菌属物种、念珠菌属物种、小孢子菌属物种、曲霉属物种、拟青霉属物种、镰刀菌属物种、支顶孢属物种、毛壳菌属物种、茎点霉属物种、帚霉属物种、柱霉属物种、链格孢属物种、附球菌属物种和/或弯孢霉属物种，或其组合。所述方法包括将治疗有效量的纳米乳剂局部或皮内施用于人类或动物受试者。
此外，本发明的纳米乳剂在局部施用之后，能够穿透天然阻挡物，所述天然阻挡物通常对抗人体中其他局部施用的药剂的渗透。本发明的纳米乳剂有效地治疗和/或控制真菌、酵母菌、病毒和/或霉菌感染，而不被全身地吸收和/或引起对施用位置的明显刺激。所述纳米乳剂液滴横贯皮肤毛孔和毛囊。此外，因为已经突破了天然的皮肤阻挡物，所述纳米乳剂可以被损伤的或患病的皮肤、外侧或近中心甲褶和/或甲床部分吸收。根据本发明的纳米乳剂不完全依靠渗透指甲到达真菌感染的位置、甲床和/或基质。所述纳米乳剂通过杀死或抑制真菌、酵母菌和/或霉菌病原体的生长，引起真菌、酵母菌和/或霉菌病原体失去致病性或其任何组合来有效地治疗真菌、酵母菌和/或霉菌感染。
本发明的纳米乳剂有效地治疗和/或控制真菌、酵母菌和/或霉菌感染，而不被全身吸收和/或引起对施用位置的明显刺激。
纳米乳剂可以是针对真菌、酵母菌和/或霉菌病原体的杀真菌剂、抑真菌剂或其组合。在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂具有窄分布的MIC(最小抑制浓度)和MFC(最小杀真菌浓度)值。当纳米乳剂是杀真菌剂时，纳米乳剂的MIC和MFC相差小于或等于四倍。当纳米乳剂是抑真菌剂时，纳米乳剂的MIC和MFC相差大于四倍。参见图3。MFC有时称为MLC(最小致死浓度)。
例如，图3图示比较了对于红色毛癣菌的真菌分离物，本发明的纳米乳剂的杀真菌效果和目前用于治疗真菌感染的其他抗真菌药物的效果，表示为最小抑制浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)值。(A)纳米乳剂(“NB-002”)；(B)特比萘芬；(C)环吡酮胺；和(D)伊曲康唑。对于红色毛癣菌的不同的临床分离物，纳米乳剂是持续杀真菌的(MFC∶MIC比例≤4)，而其他抗真菌药物产生抑真菌的(MFC∶MIC＞4)或杀真菌的效果。与抑真菌治疗相比，杀真菌治疗是更加理想的，因为杀真菌剂在完全“治愈”感染以及防止感染复发方面更有效得多，并且不依赖于功能性免疫系统。
此外，纳米乳剂对于真菌、酵母菌和/或霉菌病原体可以是治疗有效的。优选的，所述纳米乳剂是杀真菌的或抑真菌的，并且对于真菌分生孢子、菌丝和菌丝体、酵母菌单倍和二倍细胞、和霉菌以及其任何组合是有效的。针对毛癣菌属物种、针对表皮癣菌属物种、小孢子菌属物种的约0.25μg阳离子试剂/mL到约100μg阳离子试剂/mL的MIC值，或针对念珠菌属物种的约0.25μg阳离子试剂/mL到约32μg阳离子试剂/mL的MIC值表明纳米乳剂抑制真菌或酵母菌或霉菌的生长。在本发明的示范性的实施方式中：
(1)生物体是毛癣菌属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(2)生物体是表皮癣菌属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(3)生物体是念珠菌属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(4)生物体是小孢子菌属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(5)生物体是曲霉属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(6)生物体是拟青霉属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(7)生物体是镰刀菌属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(8)生物体是支顶孢属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(9)生物体是毛壳菌属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(10)生物体是茎点霉属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(11)生物体是帚霉属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(12)生物体是柱霉属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(13)生物体是链格孢属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(14)生物体是附球菌属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；或
(15)生物体是弯孢霉属物种，MIC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml，和/或MFC从约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml。
本发明的纳米乳剂是安全的并可以成功地治疗和/或完全治愈真菌、酵母菌和/或霉菌感染，而不引起明显的皮肤刺激或被全身吸收。所述纳米乳剂结合至真菌细胞表面，杀死或抑制细胞的生长并防止感染的生长/传播。进一步，本发明的纳米乳剂杀死真菌的休眠孢子或菌丝，因而限制了疾病复发的可能性。
C.本发明的纳米乳剂的稳定性
本发明的纳米乳剂在约40℃和约75％的相对湿度下可以是稳定的，持续至少约1个月的时间、至少约3个月的时间、至少约6个月的时间、至少约12个月的时间、至少约18个月的时间、至少约2年的时间、至少约2.5年的时间或至少约3年的时间。
在本发明的另一实施方式中，本发明的纳米乳剂在大约25℃和约60％的相对湿度下可以是稳定的，持续至少约1个月的时间、至少约3个月的时间、至少约6个月的时间、至少约12个月的时间、至少约18个月的时间、至少约2年的时间、至少约2.5年的时间、或至少约3年的时间、至少约3.5年的时间、至少约4年的时间、至少约4.5年的时间或至少约5年的时间。
在本发明的另一实施方式中，本发明的纳米乳剂在大约4℃下可以是稳定的，持续至少约1个月的时间、至少约3个月的时间、至少约6个月的时间、至少约12个月的时间、至少约18个月的时间、至少约2年的时间、至少约2.5年的时间、至少约3年的时间、至少约3.5年的时间、至少约4年的时间、至少约4.5年的时间、至少约5年的时间、至少约5.5年的时间、至少约6年的时间、至少约6.5年的时间、或至少约7年的时间。
D.真菌感染
待治疗、预防和/或治愈的真菌、酵母菌和/或霉菌感染可以是癣感染、皮肤癣菌病或皮肤癣菌瘤。本文所述的真菌感染包括但不限于人类指甲、甲床、指甲基质、指甲板的感染、甲沟炎、慢性甲沟炎，等等。待治疗、预防和/或治愈的这些病症的具体实例包括但不限于足癣、甲癣、圆癣、股癣、发癣、手癣、须癣、面癣、花斑癣、甲癣、真菌角膜炎或其任何组合。
本文定义的甲癣是引起指甲的增厚和变色、有时伴有疼痛和失能的甲床的慢性持续性真菌感染。甲癣可以由，例如，皮肤真菌或丝状真菌引起，所述皮肤真菌或丝状真菌例如，毛癣菌属物种、表皮癣菌属物种、镰刀菌属物种、曲霉属物种、拟青霉属物种、支顶孢属物种、柱霉属物种、帚霉属物种、足放线病菌属物种、链格孢属物种、附球菌属物种、弯孢霉属物种、茎点霉属物种、毛壳菌属物种和小孢子菌属物种。
E.病原体
在本发明中涉及的真菌感染由毛癣菌属物种、表皮癣菌属物种、念珠菌属物种、小孢子菌属物种、曲霉属物种、拟青霉属物种、镰刀菌属物种、支顶孢属物种、毛壳菌属物种、茎点霉属物种、帚霉属物种、柱霉属物种、链格孢属物种、附球菌属物种、弯孢霉属物种或其组合引起。本发明涵盖治疗这些属的任何物种引起的感染的方法和组合物。
在本发明的一种实施方式中，用本发明的纳米乳剂待治疗、预防和/或治愈的真菌、酵母菌和/或霉菌感染由下列菌引起：红色毛癣菌、断发毛癣菌、须毛癣菌、苏丹奈斯毛癣菌、疣状毛癣菌、阿耶罗毛癣菌、同心性毛癣菌、马毛癣菌、意瑞奈斯毛癣菌、淡黄毛癣菌、光辉毛癣菌、趾间毛癣菌、麦格毛癣菌、豆形毛癣菌、许兰毛癣菌、猴毛癣菌、土毛癣菌、断发毛癣菌、范布鲁西米氏毛癣菌、紫色毛癣菌、杨德氏毛癣菌、絮状表皮癣菌、斯托克表皮癣菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、乳酒念珠菌、高里念珠菌、杜氏念珠菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、奥杜安小孢子菌、鸡禽小孢子菌、铁锈色小孢子菌、扭曲小孢子菌、矮小小孢子菌、库克小孢子菌、范布瑞西米小孢子菌、黑附球菌、聚多曲霉、土曲霉、黑曲霉、土曲霉、烟曲霉、黄曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉、花斑曲霉、淡紫拟青霉、宛氏拟青霉、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、半裸镰刀菌、Chaetomium atrobrunneum、粪生毛壳菌、球毛壳菌、Chaetomium strumarium、短帚霉、Scopulariopsis candida、Scopulariopsis koningii、顶孢帚霉、黄色帚霉、灰质帚霉、Scopulariopsis trigonospora、布朗氏帚霉、Scopulariopsis chartarum、暗色帚霉、Scopulariopsis asperula、暗色柱霉、透明柱霉、Scytalidium infestans、日本柱霉、木生柱霉、交链格孢、纸链格孢、石竹链格孢、Alternaria geophilia、感染链格孢、匍柄链格孢、极细链格孢、短孢弯孢、暗色弯孢霉、膝弯孢霉膝弯孢霉、新月弯孢霉、苍白弯孢霉、塞内加尔弯孢霉、疣状弯孢霉或其任何组合。
本文定义的霉病包括但不限于由下列物质引起的感染：真菌支顶孢属物种、曲霉属物种(例如，聚多曲霉、土曲霉、黑曲霉)、镰刀菌属物种(例如，尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、半裸镰刀菌)、帚霉属物种(例如，短帚霉)、足放线病菌属物种、链格孢属物种、淡紫拟青霉、Epiccocum nigrum、茎点霉属物种、毛壳菌属物种、弯孢霉属物种和柱霉属物种(例如，暗色柱霉)。
本文定义的酵母菌包括但不限于引起酵母菌感染的念珠菌属物种，所述感染包括甲周区域和甲床下方的区域的感染、甲癣、指甲营养不良、甲松离和慢性甲沟炎。此外，皮肤的念珠菌感染可以在手指、脚趾、肛门周围、阴茎、下垂的乳房下方、或在生殖器皮肤皱襞之间发生。念珠菌属物种的实例包括但不限于白色念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌。
F.纳米乳剂
本文定义的术语“纳米乳剂”是指分散体或液滴或任何其他脂质结构。本发明中所涉及的典型的脂质结构包括，但不限于，单层、稀少层(paucilamellar)和多层脂质囊泡、胶束和薄层相。
本发明的纳米乳剂包含液滴，所述液滴的平均直径小于约1,000nm、小于约950nm、小于约900nm、小于约850nm、小于约800nm、小于约750nm、小于约700nm、小于约650nm、小于约600nm、小于约550nm、小于约500nm、小于约450nm、小于约400nm、小于约350nm、小于约300nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm或其任何组合。在一种实施方式中，所述液滴具有大于约125nm以及小于或等于约300nm的平均直径。在不同的实施方式中，所述液滴具有大于约50nm或大于约70nm，以及小于或等于约125nm的平均直径。
1.水相
所述水相可以包含任何类型的水相，包括但不限于，水(例如，H2O、蒸馏水、自来水)和溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)。在一些实施方式中，所述水相包含pH值为约4到10、优选地为约6到8的水。所述水可以是去离子的(在下文中“DiH2O”)。在一些实施方式中，所述水相包含磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)。所述水相可以进一步是无菌的和无热原的。
2.有机溶剂
本发明的纳米乳剂中的有机溶剂包括但不限于：C1-C12醇类、二醇、三醇、二烷基磷酸酯、诸如三-n-丁基磷酸酯之类的三烷基磷酸酯、其半合成衍生物及其组合。在本发明的一个方面，所述有机溶剂是选自非极性溶剂、极性溶剂、质子溶剂或非质子溶剂的醇类。
用于纳米乳剂的适合的有机溶剂包括但不限于：乙醇、甲醇、异丙醇、甘油、中链甘油三酯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、乙酸、正丁醇、丁二醇、香料醇类、异丙醇、正丙醇、甲酸、丙二醇、甘油、山梨醇、工业用甲醇变性酒精、三乙酰甘油酯、己烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、1，4-二氧杂环、四氢呋喃、二氯甲烷、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酸、其半合成衍生物，以及其任何组合。
3.油相
本发明的纳米乳剂中的油可以是任何化妆品或药学上可接受的油。所述油可以是挥发性的或非挥发性的，可以选自：动物油、植物油、天然油、合成油、烃类油、硅氧烷油、其半合成的衍生物及其组合。
适合的油包括但不限于：矿物油、角鲨烯油、香味油、硅油、精油、水不溶的维生素、异丙基硬脂酸酯、硬脂酸丁酯、辛基棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、十三烷醇山嵛酯、二异丙基己二酸酯、癸二酸二辛酯、薄荷基氨基苯甲酸酯、十六烷基碘苯腈辛酸酯、辛基水杨酸酯、十四烷酸异丙酯、新戊二醇二癸酸酯鲸蜡醇、Ceraphyls
Figure BPA00001278043200401
癸基油酸酯、二异丙基己二酸酯、C12-15烷基乳酸酯、十六烷基乳酸酯、月桂基乳酸酯、异硬脂醇新戊酸酯、十四烷基乳酸酯、异鲸蜡醇硬脂酰硬脂酸酯、辛基十二醇硬脂酰硬脂酸酯、烃类油、异链烷烃、流体石蜡、异构十二烷、矿脂、摩洛哥坚果油、加拿大芥花油、辣椒油、椰子油、玉米油、棉花子油、亚麻籽油、葡萄籽油、芥子油、橄榄油、棕榈油、棕榈坚果油、花生油、松籽油、罂粟籽油、南瓜子油、米糠油、红花油、茶油、块菌油、植物油、杏(仁)油、希蒙德木油(加州希蒙得木种子油)、葡萄籽油、夏威夷果油、麦芽油、杏仁油、菜籽油、葫芦油、大豆油、芝麻油、榛子油、玉米油、向日葵油、大麻籽油、白檀香油(bois oil)、kuki坚果仁油、鳄梨油、核桃油、鱼油、刺柏子油、多香果油、桧油、籽油、杏仁籽油、茴香子油、芹菜子油、枯茗籽油、肉豆蔻籽油、叶油、罗勒叶油、月桂叶油、肉桂叶油、荔枝草叶油、桉树叶油、柠檬草叶油、白千层叶油、奥杜那干酪叶油、广藿香叶油、薄荷叶油、松叶油、迷迭香叶油、绿薄荷叶油、茶树叶油、百里香叶油、鹿蹄草叶油、花油、春黄菊油、鼠尾草油、丁香油、天竺葵花油、牛膝草花油、茉莉花油、熏衣草花油、松红梅花油、Marhoram花油、橙花油、玫瑰花油、依兰树花油、栲皮油、肉桂皮油、桂皮油、黄樟树皮油、桐油、樟木油、柏木油、玫瑰木油、檀香油、地下茎(姜)桐油、松香油、兰丹油、没药油、果皮油、香柠檬果皮油、葡萄柚果皮油、柠檬果皮油、石灰果皮油、橙皮油、柑桔皮油、根油、缬草油、油酸、亚油酸、油醇、异硬脂醇、其半合成衍生物和其任何组合。
所述油可以进一步包含硅氧烷成分，例如，挥发性的硅氧烷成分，所述挥发性的硅氧烷成分可以是硅氧烷成分中的溶胶油，或可以与其他硅氧烷和非硅氧烷、挥发性的和非挥发性油结合。适合的硅氧烷成分包括但不限于：甲基苯基聚硅氧烷、西甲硅氧烷、二甲基硅氧烷、苯基三甲基硅氧烷(或其有机改性的形式)、聚硅氧烷的烷基衍生物、十六烷基二甲硅氧烷、月桂基三甲硅氧烷、聚硅氧烷的羟基化的衍生物，例如，聚二甲基硅氧烷醇、挥发性硅氧烷油、环状和线性的硅氧烷、环甲硅氧烷、环甲硅氧烷的衍生物、六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、挥发性的线性二甲聚硅氧烷、异十六烷、异二十烷、异二十四烷、聚异丁烯、异辛烷、异十二烷、其半合成衍生物和其组合。
挥发性油可以是有机溶剂，或者挥发性油可以是除有机溶剂之外还存在的挥发性油。适合的挥发性的油包括但不限于：萜烯、单萜、倍半萜、排气剂、甘菊环烃、薄荷醇、樟脑、侧柏酮、百里香酚、橙花醇、芳樟醇、苎烯、香叶醇、紫苏子醇、橙花叔醇、法呢醇、依兰烯、没药醇、法呢烯、驱蛔萜、土荆芥油、香茅醛、柠檬醛、香茅醇、母菊奥、蓍草、愈创烯、甘菊、其半合成衍生物或其组合。
在本发明的一个方面，硅氧烷成分中的挥发性油不同于油相中的油。
4.表面活性剂/洗涤剂
本发明的纳米乳剂中的表面活性剂或洗涤剂可以是药学上可接受的离子型表面活性剂、药学上可接受的非离子表面活性剂、药学上可接受的阳离子表面活性剂、药学上可接受的阴离子表面活性剂、或药学上可接受的两性离子表面活性剂。
示范性的有用的表面活性剂在Applied Surfactants：Principles and Applications.Tharwat F.Tadros，Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA，Weinheim ISBN：3-527-30629-3中描述，通过引用将其特别地并入本文。
进一步，所述表面活性剂可以是药学上可接受的离子聚合物表面活性剂、药学上可接受的非离子聚合物表面活性剂、药学上可接受的阳离子聚合物表面活性剂、药学上可接受的阴离子聚合物表面活性剂或药学上可接受的两性离子聚合物表面活性剂。聚合物表面活性剂的实例包括但不限于，具有多个(至少一个)聚环氧乙烷(PEO)侧链的聚(甲基丙烯酸甲酯)主干的接枝共聚物，聚羟基硬脂酸、烷氧基化的烷基酚甲醛缩合物、具有脂肪酸疏水物的聚亚烷基二醇修饰的聚酯、聚酯、其半合成衍生物、或其组合。
表面活性剂(surface active agent或surfactant)是两亲性分子，其由连接至极性或离子型亲水性部分的非极性疏水性部分组成，所述非极性疏水性部分通常是含有8至18个碳原子的直链或支链烃或氟碳化合物链。所述亲水性部分可以是非离子型、离子型或两性离子型。在水相环境中烃链与水分子微弱地相互作用，而极性或离子头部基团通过偶极或离子偶极相互作用与水分子强烈地相互作用。根据亲水基团的性质，表面活性剂被分成阴离子型、阳离子型、两性离子型、非离子型和聚合物表面活性剂。
适合的表面活性剂包括，但不限于：包含9到10个乙二醇单元的乙氧基化的壬基酚、包含8个乙二醇单元的乙氧基化的十一醇、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、乙氧基化氢化蓖麻油、月桂基硫酸钠、环氧乙烷和环氧丙烷的两嵌段共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、基于环氧乙烷和环氧丙烷的四功能嵌段共聚物、甘油基单酯、甘油基癸酸酯、甘油基辛酸酯、甘油基椰油酸酯、甘油基芥酸酯、甘油基羟基硬脂酸酯、甘油基异硬脂酸酯、甘油基羊毛脂酸酯、甘油基月桂酸酯、甘油基亚油酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基油酸酯、甘油基PABA、甘油基棕榈酸酯、甘油基蓖麻醇酸酯、甘油基硬脂酸酯、甘油基巯基乙酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二油酸脂、甘油基二肉豆蔻酸酯、甘油基二硬脂酸酯、甘油基倍半油酸酯、甘油基硬脂酸酯乳酸酯、聚氧乙烯十六烷基/硬脂酰基醚、聚氧乙烯胆固醇醚、聚氧乙烯月桂酸酯或二月桂酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或二硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯硬脂酰基醚、聚氧乙烯十四烷基醚、类固醇、胆固醇、β谷固醇、没药醇、醇的脂肪酸酯、十四烷酸异丙酯、脂肪-异丙基n-丁酸酯、异丙基n-己酸酯、异丙基n-癸酸酯、异丙基棕榈酸酯、辛基十二基肉豆蔻酸酯、烷氧基化的醇类、烷氧基化的酸、烷氧基化的酰胺、烷氧基化的糖类衍生物、天然油和蜡的烷氧基化的衍生物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、壬苯醇醚-14、PEG-8月桂酸酯、PEG-6可可酰胺、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、PEG40羊毛脂、PEG-40蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪醚、甘油基二酯、聚氧乙烯硬脂酰基醚、聚氧乙烯十四烷基醚和聚氧乙烯月桂基醚、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、甘油基二硬脂酸酯、其半合成衍生物或其混合物。
其他适合的表面活性剂包括但不限于：非离子的脂质，例如，甘油基月桂酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、其半合成衍生物和其混合物。
在其他实施方式中，所述表面活性剂是具有约2个到约100个基团的聚氧乙烯头部基团的聚氧乙烯脂肪醚、或具有R5--(OCH2CH2)y-OH结构的烷氧基化的醇类，其中R5是具有约6个到约22个碳原子的分支或不分支的烷基基团，y为约4至约100，优选地，为约10至约100。优选地，所述烷氧基化的醇类是R5是月桂基基团且y的平均值为23的物质。
在不同的实施方式中，所述表面活性剂是烷氧基化的醇类，其是羊毛脂醇的乙氧基化的衍生物。优选地，羊毛脂醇的乙氧基衍生物是羊毛脂醇醚-10(laneth-10)，其是平均乙氧基化值为10的羊毛脂醇的聚乙二醇醚。
非离子型表面活性剂包括但不限于：乙氧基化的表面活性剂、乙氧基化的醇类、乙氧基化的烷基酚、乙氧基化的脂肪酸、乙氧基化的单烷醇酰胺(monoalkaolamide)、乙氧基山梨糖醇酐酯、乙氧基化脂肪氨基、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、二(聚乙二醇二[咪唑羰基])、壬苯醇醚-9、二(聚乙二醇二[咪唑羰基])、Brij
Figure BPA00001278043200431
35、Brij
Figure BPA00001278043200432
56、Brij
Figure BPA00001278043200433
72、Brij
Figure BPA00001278043200434
76、Brij
Figure BPA00001278043200435
92V、Brij
Figure BPA00001278043200436
97、Brij
Figure BPA00001278043200437
58P、Cremophor
Figure BPA00001278043200438
EL、十乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、n-癸基α-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、n-十二烷酰-N-甲基葡糖酰胺、n-十二烷基α-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十二烷基醚、七乙二醇单十四烷基醚、正十六烷基β-D-麦芽糖苷、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油烯基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、来自皂树皮的皂角苷、Span
Figure BPA00001278043200441
20、Span
Figure BPA00001278043200442
40、Span
Figure BPA00001278043200443
60、Span
Figure BPA00001278043200444
65、Span
Figure BPA00001278043200445
80、Span85、Tergitol 15-S-12、Tergitol 15-S-30、Tergitol 15-S-5、Tergitol 15-S-7、Tergitol 15-S-9、Tergitol NP-10、Tergitol NP-4、Tergitol NP-40、Tergitol NP-7、Tergitol NP-9、Tergitol、Tergitol TMN-10、Tergitol TMN-6、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、Triton X-207、Triton
Figure BPA00001278043200447
X-114、TritonX-165、Triton
Figure BPA00001278043200449
X-305、Triton
Figure BPA000012780432004410
X-405、Triton
Figure BPA000012780432004411
X-45、Triton
Figure BPA000012780432004412
X-705-70、TWEEN
Figure BPA000012780432004413
20、TWEEN
Figure BPA000012780432004414
21、TWEEN40、TWEEN
Figure BPA000012780432004416
60、TWEEN
Figure BPA000012780432004417
61、TWEEN
Figure BPA000012780432004418
65、TWEEN
Figure BPA000012780432004419
80、TWEEN
Figure BPA000012780432004420
81、TWEEN
Figure BPA000012780432004421
85、泰洛沙泊、n-十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、其半合成衍生物或其组合。
此外，所述非离子表面活性剂可以是泊洛沙姆。泊洛沙姆是由聚氧乙烯嵌段其后连接聚氧丙烯嵌段其后连接聚氧乙烯嵌段构成的聚合物。聚氧乙烯和聚氧化丙烯的平均单元数根据与聚合物相关的数字而改变。例如，最小的聚合物，泊洛沙姆101，由平均2个单元的聚氧乙烯嵌段、平均16个单元的聚氧化丙烯嵌段、以及平均2个单元的聚氧乙烯嵌段组成。泊洛沙姆从无色液体和膏剂到白色的固体。在化妆品和个人护理产品中，泊洛沙姆用于皮肤清洁剂、沐浴产品、香波、护发素、嗽口水、眼睛卸状物和其它皮肤和头发产品的制剂中。泊洛沙姆的实施包括但不限于：泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182二苯甲酸酯。
适合的阳离子表面活性剂包括但不限于：季铵化合物、烷基三甲基氯化铵化合物、二烷基二甲基氯化铵化合物、阳离子的含卤素化合物，例如，氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、二甲基二十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、Girard试剂T、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、N，N′，N-聚氧乙烯(10)-N-牛羊脂-1，3-二氨基丙烷、溴苄嘧棕胺、三甲基(十四烷基)溴化铵、1，3，5-三嗪-1，3，5(2H，4H，6H)-三乙醇、1-癸基铵、N-癸基-N，N-二甲基-氯化物、二癸基二甲基氯化铵、2-(2-(p-(二异丁基)甲酚)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、2-(2-(p-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、烷基1或3苯甲基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉氯化物、烷基二(2-羟乙基)苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(100％C12)、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(50％C14、40％C12、10％C16)、烷基二甲基3，4-二氯苯甲基氯化铵(55％C14，23％C12，20％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(41％C14，28％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(47％C12，18％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(55％C16，20％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(58％C14，28％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(60％C14，25％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61％C11，23％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61％C12、23％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(65％C12，25％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(67％C12，24％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(67％C12、25％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(90％C14、5％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(93％C14、4％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(95％C16、5％C18)、烷基二癸基二甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-18)、二烷基的二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵(90％C14、5％C16、5％C12)、烷基二甲基乙基溴化铵(混合的烷基和烯基基团，如在大豆油的脂肪酸中一样)、烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵(60％C14)、烷基二甲基异丙基苯甲基氯化铵(50％C12、30％C14、17％C16、3％C18)、烷基三甲基氯化铵(58％C18、40％C16、1％C14、1％C12)、烷基三甲基氯化铵(90％C18、10％C16)、烷基二甲基(乙基苯甲基)氯化铵(C12-18)、二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基甲基苯甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、二异癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基二(2-羟乙基)辛基氯化氢铵、十二烷基二甲基苯甲基氯化铵、十二烷基氨基甲酰基甲基二甲基苯甲基氯化铵、十七基羟基乙基咪唑啉氯化物、六氢-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三嗪、Myristalkonium氯化物(和)Quat RNIUM 14、N，N-二甲基-2-羟基丙基氯化铵聚合物、n-十四烷基二甲基苯甲基氯化铵一水合物、辛基癸基二甲基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苯甲基氯化铵、氧基二乙烯基二(烷基二甲基氯化铵)、三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵、三甲氧基甲硅烷基季铵盐、三甲基十二烷基苯甲基氯化铵、其半合成衍生物和其组合。
示范性的含卤素的阳离子化合物包括，但不限于：十六烷基吡啶卤化物、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化膦、十二烷基三甲基卤化铵，或十四烷基三甲基卤化铵。在一些特定的实施方式中，适合的阳离子的含卤素化合物包括，但不限于，氯化十六烷基吡啶(CPC)、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基苄基二甲基氯化铵、溴化十六烷吡啶(CPB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基三丁基溴化膦、十二烷基三甲基溴化铵和十四烷基三甲基溴化铵。在特别优选的实施方式中，所述含卤素的阳离子化合物是CPC，然而本发明的组合物不限于具有特定的含阳离子化合物的制剂。
适合的阴离子表面活性剂包括但不限于：羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸钠盐、胆酸、牛或绵羊胆汁、去氢胆酸、去氧胆酸、去氧胆酸、去氧胆酸甲酯、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多库酯钠盐、甘氨去氧胆酸钠盐、甘氨胆酸水合物、合成的甘氨胆酸钠盐水合物，合成的甘氨去氧胆酸一水合物、甘氨去氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸乙酯、N-十二烷基肌氨酸钠盐、N-十二烷基肌氨酸溶液、N-十二烷基肌氨酸溶液、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、Lugol溶液、4型Niaproof 4、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二烷基磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、2-溴乙烷磺酸钠、胆酸钠水合物、络胆酸钠、去氧胆酸钠、去氧胆酸钠一水合物、十二烷基硫酸钠、无水己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、无水戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、牛磺去氧胆酸钠盐一水合物、牛磺猪去氧胆酸钠盐水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛磺熊去氧胆酸钠盐、Trizma十二烷基硫酸酯、TWEEN
Figure BPA00001278043200472
80、熊去氧胆酸、其半合成衍生物和其组合。
适合的两性离子表面活性剂包括但不限于：N-烷基甜菜碱、月桂基氨基丙基二甲基甜菜碱、烷基二甲基甘氨酸盐、N-烷基氨基丙酸酯、最小值98％(TLC)的CHAPS、最小值98％(TLC)的CHAPS、最小值98％(TLC)的用于电泳的CHAPS、CHAPSO、最小值98％的CHAPSO、用于电泳的CHAPSO、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基十八烷基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基辛基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基棕榈基铵)丙烷磺酸盐，其半合成衍生物和其组合。
在一些实施方式中，所述纳米乳剂包含阳离子表面活性剂，其可以是氯化十六烷基吡啶。在本发明的其他实施方式中，所述纳米乳剂包含阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂的浓度是小于约5.0％和大于约0.001％。在本发明的又一实施方式中，所述纳米乳剂包含阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂的浓度选自：小于约5％、小于约4.5％、小于约4.0％、小于约3.5％、小于约3.0％、小于约2.5％、小于约2.0％、小于约1.5％、小于约1.0％、小于约0.90％、小于约0.80％、小于约0.70％、小于约0.60％、小于约0.50％、小于约0.40％、小于约0.30％、小于约0.20％或小于约0.10％。进一步，所述纳米乳剂中阳离子试剂的浓度是大于约0.002％、大于约0.003％、大于约0.004％、大于约0.005％、大于约0.006％、大于约0.007％、大于约0.008％、大于约0.009％、大于约0.010％或大于约0.001％。在一种实施方式中，所述纳米乳剂中阳离子试剂的浓度是小于约5.0％和大于约0.001％。
在本发明的另一实施方式中，所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂。所述非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂，例如，聚山梨酸酯(Tween)，例如，聚山梨酸酯80或聚山梨酸酯20。在一种实施方式中，所述非离子表面活性剂的浓度为约0.05％到约7.0％，或所述非离子表面活性剂的浓度为约0.5％到约4％。在本发明的又一实施方式中，所述纳米乳剂包含与非离子表面活性剂结合的、浓度为约0.01％到约2％的阳离子表面活性剂。
5.活性剂
任选地，除了纳米乳剂之外，将提供缓解或治疗效果的、诸如抗真菌剂、抗酵母剂或抗霉菌剂之类的第二活性剂掺入所述纳米乳剂中，来实现改善活性剂的吸收或提供累加/协同作用、或缩短治疗持续时间。在治疗、治愈或缓解甲真菌病感染、真菌感染或甲癣方面有用的任何活性剂可掺入纳米乳剂中，包括但不限于添加另一抗真菌剂。
示范性的活性剂包括，但不限于：(1)氮杂茂(咪唑)，(2)抗代谢物，(3)烯丙胺，(4)吗啉，(5)葡聚糖合成抑制物(化学物家族：棘白菌素)，(6)聚烯，(7)benoxaborales，(8)其他抗真菌/甲癣剂，和(9)新类型的抗真菌甲癣剂。
氮杂茂的实例包括，但不限于：联苯苄唑、克霉唑、益康唑、咪康唑、噻康唑、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、普拉康唑、瑞扶康唑、泊沙康唑和伏立康唑。抗代谢物的实例包括但不限于，氟胞嘧啶。烯丙胺的实例包括但不限于：特比萘芬、萘替芬和阿莫罗芬。葡聚糖合成抑制物的实例包括但不限于：卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。聚烯的实例包括但不限于：两性霉素B、制霉菌素和匹马菌素。benoxaborale的实例是AN2690。抗真菌/甲癣剂的其他实例包括但不限于灰黄霉素和环吡酮胺。最后，新类型的抗真菌/甲癣剂的实例包括但不限于粪壳菌素衍生物和尼柯霉素。
6.其他成分
适于在本发明的纳米乳剂中使用的其他化合物包括但不限于一种或一种以上溶剂，例如，有机磷酸盐式溶剂、填充剂、着色剂、药学上可接受的赋形剂、防腐剂、pH调节剂、缓冲剂、螯合剂，等等。所述其他化合物可以混合到预先乳化的纳米乳剂中，或所述其他化合物可以添加到待乳化的原始混合物中。在这些实施方式的一些中，一种或一种以上其他化合物在纳米乳剂组合物即将使用之前混合到已有的纳米乳剂组合物中。
本发明的纳米乳剂中适合的防腐剂包括但不限于：氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、苯甲醇、氯己定、咪唑基脲、苯酚、山梨酸钾、苯甲酸、溴硝丙二醇、氯甲酚、对羟苯甲酸酯、苯氧乙醇、山梨酸、α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟茴醚、丁基化羟基甲苯、抗坏血酸钠、二(p-氯苯基二胍)己烷、3-(-4-氯苯氧基)-丙烷-1，2-二醇、甲基和甲基氯异噻唑啉酮、焦亚硫酸钠、柠檬酸、依地酸，其半合成衍生物和其组合。其他适合的防腐剂包括，但不限于，苯甲醇、氯己定(二(p-氯苯基二胍)己烷)、氯苯甘醚(3-(-4-氯苯氧基)-丙烷-1，2-二醇)、Kathon CG(甲基和甲基氯异噻唑啉酮)、对羟苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基羟基苯甲酸酯)、苯氧乙醇(2-苯氧乙醇)、山梨酸(山梨酸钾、山梨酸)、Phenonip(苯氧乙醇、甲基、乙基、丁基、丙基对羟苯甲酸酯)、Phenoroc(苯氧乙醇0.73％，对羟基苯甲酸甲酯0.2％，对羟苯甲酸丙酯0.07％)、Liquipar Oil(异丙基、异丁基、丁基对羟基苯甲酸酯)、Liquipar PE(70％苯氧乙醇，30％liquipar oil)、Nipaguard MPA(苯甲醇(70％)、甲基和丙基对羟苯甲酸酯)、Nipaguard MPS(丙二醇、甲基和丙基对羟苯甲酸酯)、Nipasept(甲基、乙基和丙基对羟苯甲酸酯)、Nipastat(甲基、丁基、乙基和丙基对羟苯甲酸酯)、Elestab 388(丙二醇中的苯氧乙醇加氯苯甘醚和对羟基苯甲酸甲酯)和Killitol(7.5％氯苯甘醚和7.5％对羟基苯甲酸甲酯)。
纳米乳剂可以进一步包含至少一种pH值调节剂。本发明的纳米乳剂中适合的pH值调节剂包括但不限于：二乙醇胺、乳酸、单乙醇胺、三乙醇胺、氢氧化钠、磷酸钠，其半合成衍生物和其组合。
此外，所述纳米乳剂可以包含螯合剂。在本发明的一种实施方式中，所述螯合剂的量为约0.0005％到约1.0％。螯合剂的实例包括但不限于：肌醇六磷酸、多聚磷酸、柠檬酸、葡糖酸、乙酸、乳酸、乙撑二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)和二巯丙醇和其组合。优选的螯合剂是乙二胺四乙酸。
所述纳米乳剂可以包含缓冲剂，例如，药学上可接受的缓冲剂。缓冲剂的实例包括但不限于：2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(≥99.5％(NT))，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(≥99.0％(GC))，L-(+)-酒石酸(≥99.5％(T))，ACES(≥99.5％(T))，ADA(≥99.0％(T))，乙酸(≥99.5％(GC/T))，用于萤光的乙酸(≥99.5％(GC/T))，用于分子生物学的乙酸铵溶液(H2O中约5M)，用于萤光的乙酸铵(≥99.0％(根据干物质计算的，T))，碳酸氢铵(≥99.5％(T))，柠檬酸二铵(≥99.0％(T))，甲酸铵溶液(H2O中10M)，甲酸铵(≥99.0％(根据干物质计算的，NT))，草酸铵一水合物(≥99.5％(室温))，磷酸氢二铵溶液(H2O中2.5M)，磷酸氢二铵(≥99.0％(T))，磷酸二氢铵溶液(H2O中2.5M)，磷酸二氢铵(≥99.5％(T))，磷酸氢钠铵四水合物(≥99.5％(NT))，用于分子生物学的硫酸铵溶液(H2O中3.2M)，酒石酸二铵溶液(H2O中2M(20℃无色溶液))，酒石酸二铵(≥99.5％(T))，用于分子生物学的BES缓冲盐水(2×浓缩的)，BES(≥99.5％(T))，用于分子生物学的BES(≥99.5％(T))，用于分子生物学的BICINE缓冲溶液(H2O中1M)，BICINE(≥99.5％(T))，BIS-TRIS(≥99.0％(NT))，碳酸氢盐缓冲溶液(＞0.1M Na2CO3，＞0.2M NaHCO3)，硼酸(≥99.5％(T))，用于分子生物学的硼酸(≥99.5％(T))，CAPS(≥99.0％(TLC))，CHES(≥99.5％(T))，乙酸钙水合物(≥99.0％(根据干物质计算，KT))，碳酸钙沉淀(≥99.0％(KT))，柠檬酸三钙四水合物(≥98.0％(根据干物质计算的，KT))，用于分子生物学的柠檬酸盐浓缩溶液(H2O中1M)，无水柠檬酸(≥99.5％(T))，用于萤光的无水柠檬酸(≥99.5％(T))，二乙醇胺(≥99.5％(GC))，EPPS(≥99.0％(T))，用于分子生物学的乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(≥99.0％(T))，甲酸溶液(H2O中1.0M)，Gly-Gly-Gly(≥99.0％(NT))，Gly-Gly(≥99.5％(NT))，甘氨酸(≥99.0％(NT))，用于萤光的甘氨酸(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的甘氨酸(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的HEPES缓冲盐水(2倍浓缩)，HEPES(≥99.5％(T))，用于分子生物学的HEPES(≥99.5％(T))，咪唑缓冲溶液(H2O中1M)，咪唑(≥99.5％(GC))，用于萤光的咪唑(≥99.5％(GC))，用于分子生物学的咪唑(≥99.5％(GC))，脂蛋白重折叠缓冲液，醋酸锂二水合物(≥99.0％(NT))，柠檬酸三锂四水合物(≥99.5％(NT))，MES水合物(≥99.5％(T))，用于萤光的MES一水合物(≥99.5％(T))，用于分子生物学的MES溶液(H2O中0.5M)，MOPS(≥99.5％(T))，用于萤光的MOPS(≥99.5％(T))，用于分子生物学的MOPS(≥99.5％(T))，用于分子生物学的乙酸镁溶液(H2O中约1M)，乙酸镁四水合物(≥99.0％(KT))，柠檬酸三镁九水合物(≥98.0％(根据干物质计算的，KT))、甲酸镁溶液(H2O中的0.5M)，磷酸氢二镁三水合物(≥98.0％(KT))，用于原位杂交的中和溶液，用于分子生物学的草酸二水合物(≥99.5％(RT))，PIPES(≥99.5％(T))，用于分子生物学的PIPES(≥99.5％(T))，磷酸盐缓冲盐水(溶液(高压灭菌的))，磷酸盐缓冲盐水(Western印迹中过氧化物酶共轭物的洗涤缓冲液，10倍浓缩)，无水哌嗪(≥99.0％(T))，D-酒石酸氢钾(≥99.0％(T))，用于分子生物学的乙酸钾溶液，用于分子生物学的乙酸钾溶液(H2O中5M)，用于分子生物学的乙酸钾溶液(H2O中约1M)，乙酸钾(≥99.0％(NT))，用于萤光的乙酸钾(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的乙酸钾(≥99.0％(NT))，碳酸氢钾(≥99.5％(T))，无水碳酸钾(≥99.0％(T))，氯化钾(≥99.5％(AT))，柠檬酸氢钾(≥99.0％(干物质，NT))，柠檬酸三钾溶液(H2O中1M)，甲酸钾溶液(H2O中14M)，甲酸钾(≥99.5％(NT))，草酸钾一水合物(≥99.0％(RT))，无水磷酸氢二钾(≥99.0％(T))，用于萤光的无水磷酸氢二钾(≥99.0％(T))，用于分子生物学的无水磷酸氢二钾(≥99.0％(T))，无水磷酸二氢钾(≥99.5％(T))，用于分子生物学的无水磷酸二氢钾(≥99.5％(T))，磷酸三钾一水合物(≥95％(T))，邻苯二甲酸氢钾(≥99.5％(T))，酒石酸钠钾溶液(H2O中1.5M)，酒石酸钠钾四水合物(≥99.5％(NT))，四硼酸钾四水合物(≥99.0％(T))，四草酸钾二水合物(≥99.5％(RT))，丙酸溶液(H2O中1.0M)，用于分子生物学的STE缓冲溶液(pH 7.8)，用于分子生物学的STET缓冲溶液(pH 8.0)，5，5-二乙基巴比土酸钠(≥99.5％(NT))，用于分子生物学的乙酸钠溶液(H2O中约3M)，乙酸钠三水合物(≥99.5％(NT))，无水乙酸钠(≥99.0％(NT))，用于萤光的无水乙酸钠(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的无水乙酸钠(≥99.0％(NT))，碳酸氢钠(≥99.5％(T))，酒石酸氢钠一水合物(≥99.0％(T))，碳酸钠十水合物(≥99.5％(T))，无水碳酸钠(≥99.5％(根据干物质计算的，T))，无水柠檬酸二氢钠(≥99.5％(T))，柠檬酸三钠二水合物(≥99.0％(NT))，用于萤光的柠檬酸三钠二水合物(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的柠檬酸三钠二水合物(≥99.5％(NT))，甲酸钠溶液(H2O中8M)，草酸钠(≥99.5％(RT))，磷酸氢二钠二水合物(≥99.0％(T))，用于萤光的磷酸氢二钠二水合物(≥99.0％(T))，用于分子生物学的磷酸氢二钠二水合物(≥99.0％(T))，磷酸氢二钠十水合物(≥99.0％(T))，磷酸氢二钠溶液(H2O中0.5M)，无水磷酸氢二钠(≥99.5％(T))，用于分子生物学的磷酸氢二钠(≥99.5％(T))，磷酸二氢钠二水合物(≥99.0％(T))，用于分子生物学的磷酸二氢钠二水合物(≥99.0％(T))，用于分子生物学的磷酸二氢钠一水合物(≥99.5％(T))，磷酸二氢钠溶液(H2O中5M)，焦磷酸二氢二钠(≥99.0％(T))，焦磷酸四钠十水合物(≥99.5％(T))，酒石酸二钠二水合物(≥99.0％(NT))，酒石酸二钠溶液(H2O中1.5M(20℃无色溶液))，四硼酸钠十水合物(≥99.5％(T))，TAPS(≥99.5％(T))，TES(≥99.5％(根据干物质计算的，T))，用于分子生物学的TM缓冲溶液(pH 7.4)，用于分子生物学的TNT缓冲溶液(pH 8.0)，TRIS甘氨酸缓冲溶液(10倍浓缩)，用于分子生物学的TRIS乙酸-EDTA缓冲溶液，，TRIS缓冲盐水(10倍浓缩)，用于电泳的TRIS甘氨酸SDS缓冲溶液(10倍浓缩)，用于分子生物学的浓缩的TRIS磷酸-EDTA缓冲溶液(10倍浓缩)，Tricine(≥99.5％(NT))，三乙醇胺(≥99.5％(GC))，三乙胺(≥99.5％(GC))，三乙基乙酸铵缓冲液(挥发性的缓冲液，H2O中约1.0M)，三乙基磷酸铵溶液(挥发性的缓冲液，H2O中约1.0M)，三甲基醋酸铵溶液(挥发性的缓冲液，H2O中约1.0M)，三甲基磷酸铵溶液(挥发性的缓冲液，H2O中约1M)，用于分子生物学的浓缩的Tris-EDTA缓冲溶液(100倍浓缩)，用于分子生物学的Tris-EDTA缓冲溶液(pH 7.4)，用于分子生物学的Tris-EDTA缓冲溶液(pH 8.0)，Trizma
Figure BPA00001278043200521
乙酸盐(≥99.0％(NT))，Trizma
Figure BPA00001278043200522
碱(≥99.8％(T))，Trizma
Figure BPA00001278043200523
碱(≥99.8％(T))，用于萤光的Trizma
Figure BPA00001278043200531
碱(≥99.8％(T))，用于分子生物学的Trizma
Figure BPA00001278043200532
碱(≥99.8％(T))，Trizma
Figure BPA00001278043200533
碳酸盐(≥98.5％(T))，用于分子生物学的Trizma
Figure BPA00001278043200534
盐酸盐缓冲溶液(pH 7.2)，用于分子生物学的Trizma盐酸盐缓冲溶液(pH 7.4)，用于分子生物学的Trizma盐酸盐缓冲溶液(pH 7.6)，用于分子生物学的Trizma
Figure BPA00001278043200537
盐酸盐缓冲溶液(pH 8.0)，Trizma
Figure BPA00001278043200538
盐酸盐(≥99.0％(AT))，用于萤光的Trizma盐酸盐(≥99.0％(AT))，用于分子生物学的Trizma
Figure BPA000012780432005310
盐酸盐(≥99.0％(AT))和Trizma
Figure BPA000012780432005311
马来酸盐(≥99.5％(NT))。
所述纳米乳剂可以包含一种或一种以上乳化剂来帮助形成乳剂。乳化剂包括在油/水界面处聚集以形成防止两个邻近液滴的直接接触的连续膜的化合物。本发明的一些实施方式特征在于可以容易地用水将纳米乳剂稀释到期望的浓度而不损害它们的抗真菌或抗酵母性质。
G.药物组合物
本发明的纳米乳剂可以配制成药物组合物，其包含治疗有效量的纳米乳剂和药学上可接受的赋形剂，用于局部或皮内施用于有需要的人类受试者。这样的赋形剂是本领域公知的。
用语“治疗有效量”，是指任何数量的纳米乳剂，其通过杀死或抑制真菌、酵母菌和/或霉菌病原体的生长使得所述真菌、酵母菌和/或霉菌病原体失去致病性，或其任何组合来有效治疗真菌、酵母菌和/或霉菌感染。
局部和皮内的施用包括施用于脚趾甲、手指甲、皮肤或粘膜，包括毛发、毛囊、毛干、阴囊、口腔、耳、鼻和眼睛的表面。
局部或皮内施用的药学上可接受的剂型包括但不限于：软膏剂、乳膏剂、液体、洗液、乳剂、凝胶、生物粘附性凝胶、气雾剂、香波、膏剂、泡沫、防晒剂、胶囊、微囊，或是物体或载体的形式，例如，绷带、插入物、注射器样敷涂器、阴道栓剂、粉剂、滑石粉或其他固体、香波、清洁剂(驻留和洗去产品)以及有助于渗透表皮、真皮和角蛋白层的试剂。
皮内施用是指将根据本发明的纳米乳剂注射到皮肤的层之间。皮内施用意在产生皮肤效果，同时保持纳米乳剂的药理学作用定位于渗透和沉积的皮内区域。皮内吸收很少或不发生全身性吸收或积累。
药物组合物可以被配制为立即释放、持续释放、控制释放、延迟释放或其任何组合，进入表皮或真皮，没有全身性吸收。在一些实施方式中，所述剂型可以含有渗透促进剂，用于促进纳米乳剂通过角质层渗透进入表皮或真皮。适合的渗透促进剂包括但不限于，诸如乙醇之类的醇类、甘油三酯和芦荟组合物。渗透促进剂的量可以为按剂型重量计约0.5％到约40％。
在一些实施方式中，用于皮内施用的剂型包含治疗有效量的纳米乳剂并将其施用到靠近真菌或酵母菌或霉菌感染的区域中。
在一些实施方式中，预想了经由包含治疗有效量的纳米乳剂的“贴片”来递送制剂。本文使用的“贴片”包含至少局部剂型和覆盖层，从而所述贴片可以置于待治疗的区域之上。优选地，所述贴片被设计为使通过角质层递送进入表皮或真皮最大化，同时使吸收进入循环系统最小化，并且对皮肤的刺激很小至几乎没有刺激，使滞后时间减小，促进均匀吸收，以及降低机械擦除和脱水。
在粘帖型贴片的药物中使用的粘附剂是本领域公知的。适合的粘附剂包括，但不限于：聚异丁烯、硅氧烷和丙烯酸。这些粘附剂可以在各种条件下起作用，例如，高湿度和低湿度、沐浴、出汗，等等。优选地，所述粘附剂是基于天然或合成的橡胶的组合物；例如，聚丙烯酸酯、聚丁基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚-2-乙基己基丙烯酸酯、聚乙烯乙烯酯、聚二甲硅氧烷或/和水凝胶(例如，高分子量聚乙烯吡咯烷酮和寡聚聚环氧乙烷)。最优选的粘附剂是压力敏感的丙烯酸粘附剂，例如，Durotak
Figure BPA00001278043200541
粘附剂(例如，Durotak
Figure BPA00001278043200542
2052，National Starch and Chemicals)。粘附剂可以含有增稠剂，例如，硅土增稠剂(例如，Aerosil，Degussa，Ridgefield Park，N.J.)或交联剂，例如，乙酰丙酮铝。
适合的释放衬里包括但不限于具有压力敏感释放衬里的薄覆层的、封闭的、不透明的或透明的聚酯薄膜(例如，硅酮-氟硅酮，和全氟化碳聚合物)。
背膜可以是封闭的或可渗透的并且来自合成聚合物，如聚烯烃油聚酯、聚乙烯、聚氯乙烯和聚氨基甲酸酯，或来自天然材料，如棉花、羊毛，等等。诸如合成的聚酯之类的封闭的背膜引起角质层的外层的水化，而非封闭的背膜使该区域呼吸(即，促进水蒸汽从皮肤表面透过)。更优选地，所述背膜是封闭的聚烯烃箔(Alevo，Dreieich，Germany)。聚烯烃箔厚度优选地为约0.6mm到约1mm。
贴片的形状可以是扁平的或三维的、圆形、椭圆形、正方形，并具有凹形或凸形的外部形状，或贴片或绷带可以由使用者利用或不利用其他工具分割成相应的形状。
本发明的纳米乳剂可以利用电泳递送/电泳来施用和/或递送。包括施加电流在内的这样的穿表皮方法是本领域公知的。
例如，通过测量经过治疗的人类受试者的血浆中表面活性剂(例如阳离子表面活性剂)的量可以监测没有全身性吸收。血浆中等于或小于约10ng/ml的表面活性剂的量确认了没有全身性吸收。在本发明的另一实施方式中，纳米乳剂的最小全身性吸收在局部施用之后发生。这样的最小全身性吸收可以通过检测到的受试者的血浆中纳米乳剂中一种或一种以上表面活性剂的浓度小于10ng/mL、小于8ng/mL、小于5ng/mL、小于4ng/mL、小于3ng/mL或小于2ng/mL来确定。
用于局部或皮内施用的药物组合物可以在单次施用中或在多次施用中施加。药物组合物局部或皮内施用每周至少一次、每周至少两次、每天至少一次、每天至少两次、每天多次、每周多次、两周一次、每月至少一次，或其任何组合。所述药物组合物局部或皮内施用持续约一个月的时间、约两个月的时间、约三个月的时间、约四个月的时间、约五个月的时间、约六个月的时间、约七个月的时间、约八个月的时间、约九个月的时间、约十个月的时间、约十一个月的时间、约一年的时间、约1.5年的时间、约2年的时间、约2.5年的时间、约3年的时间、约3.5年的时间、约4年的时间、约4.5年的时间和约5年的时间。在施用之间，可以冲洗施用区域来除去任何残余的纳米乳剂。
优选的，所述药物组合物以约0.001mL/cm2到约5.0mL/cm2的量施用于皮肤区域。示范性的施用量和面积是约0.2mL/cm2。在局部或皮内施用之后，纳米乳剂可以被封闭或半封闭。所述封闭或半封闭可以通过将绷带、聚烯烃薄膜、不可渗透隔挡物或半不可渗透隔挡物覆盖到局部制剂上来进行。优选地，在施用之后，治疗区域用服装覆盖。
H.示范性的纳米乳剂
以下描述了几种示范性的纳米乳剂，然而本发明的方法不局限于这些纳米乳剂的使用。每一种的成分和量可以如本文其他纳米乳剂的制剂中所述的成分和量而变化。除非另作说明，表格中所有浓度按照％w/w来表示。
Figure BPA00001278043200561
以下描述了几种其他的示范性的纳米乳剂。所有这些纳米乳剂显示了具有体外抗真菌活性。如上所述，对于受试者的治疗性局部使用而言，每种成分的浓度将被提高。
Figure BPA00001278043200562
I.感染的清除
在适合的治疗期(例如，6周、12周、24周，或按周度量的等于或小于1年的任何时间段)之后，通过测量未受影响的指甲线性生长的增加或受影响面积的减小，并将这些参数与初始基线比较，可确定感染部分或完全清除。
通过在不同时间间隔从受影响区域采集的样品获得真菌、酵母菌和/或霉菌培养物，或通过用10％KOH处理人类细胞培养物样品并用乳酚棉蓝、Grocott银黄染料、苏木色素或曙红染色使真菌、霉菌或酵母菌显现，也可确定感染的发展或退化状态。KOH使人类细胞中的蛋白质变性；从而仅真菌细胞在显微镜下保持可见。(真菌细胞可以利用其他本领域公知的技术染色/显现。)
要注意的是，体外测试的纳米乳剂(例如，实施例中描述的纳米乳剂)中的油、有机溶剂、表面活性剂和螯合剂(如果存在的话)的浓度比预期想要局部使用的纳米乳剂中存在的油、有机溶剂、表面活性剂和螯合剂(如果存在的话)的浓度更低。这是因为体外研究不需要纳米乳剂液滴横贯皮肤。对于局部(或皮内)使用而言，成分的浓度必需更高以产生治疗效果。然而，体外测试的纳米乳剂中使用的每种成分的相对量适合于待治疗使用的纳米乳剂，因而，可将体外量成比例扩大来制备治疗组合物，体外数据常常预示着局部施用成功。
J.生产方法
本发明的纳米乳剂可以利用典型的乳剂形成技术来形成。参见，例如U.S.2004/0043041。也参见美国专利第6,559,189号、第6,506,803号、第6,635,676号、第6,015,832号和美国专利公开第20040043041号、第20050208083号、第20060251684号和第20070036831号以及WO 05/030172中描述的制造纳米乳剂的方法，所有上述专利文献通过引用具体并入本文。
例如，纳米乳剂可以通过油、纯水、非离子型洗涤剂、有机溶剂和表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂)的高速均质化来形成。在示范性的方法中，油在相对高的剪切力下(例如，利用高水压和机械力)与水相混合，来获得包含具有平均直径小于约1000nm的油滴的纳米乳剂。本发明的一些实施方式采用了具有油相、包含诸如乙醇之类的醇类的纳米乳剂。所述油和水相可以利用任何装置混合，所述装置能够产生足以形成乳剂的剪切力，例如French Presses或高剪切力混合器(例如，FDA批准的高剪切力混合器可从例如Admix，Inc.，Manchester，N.H.获得)。生产这些乳剂的方法在美国专利第5,103,497号和第4,895,452号中描述，通过引用将上述美国专利并入本文。
在示范性的实施方式中，本发明的方法中使用的纳米乳剂包含分散在水性连续相(例如水)中的油性不连续相的液滴。本发明的纳米乳剂是稳定的，甚至在长期保存之后不分解。本发明的一些纳米乳剂当吞咽、吸入或施用于受试者的皮肤时是无毒的和安全的。
本发明的组合物可以大量地生产，在各种温度条件下稳定许多个月。所述纳米乳剂可具有从半固体乳膏剂到稀薄洗液的质地/粘稠性，可用手局部施用于表面上以及喷到表面上。如上所述，至少一部分所述乳剂可以是脂质结构的形式，所述脂质结构包括但不限于：单层、多层、稀少层脂质囊泡、胶束和薄层相。
本发明考虑的是，所描述的纳米乳剂的许多变化将在本发明的方法中有用。为了确定候选物纳米乳剂是否适合用于本发明，分析了三种指标。使用本文所述的方法和标准，可容易地测试候选物乳剂以确定它们是否适合。首先，利用本文描述的方法来制备期望的成分，确定是否可以形成纳米乳剂。如果不能形成纳米乳剂，候选物被排除。第二，候选物纳米乳剂应当形成稳定的乳剂。如果纳米乳剂维持在乳剂形式持续一段足以使其预期使用的时间段，那么纳米乳剂是稳定的。例如，对于要保存、装运等等的纳米乳剂而言，期望的是所述纳米乳剂保持在乳剂形式中持续数月到数年。相对不稳定的典型的纳米乳剂将在一天内失去它们的形式。第三，候选物纳米乳剂应当具有用于其预期用途的效力。例如，本发明的乳剂应当在体外杀死真菌、酵母菌和/或霉菌或使真菌、酵母菌和/或霉菌失去能力达到可检测的水平。为了确定特定的候选纳米乳剂对于期望的真菌、酵母菌和/或霉菌的适用性，将所述纳米乳剂在标准化条件下暴露于所述真菌、酵母菌和/或霉菌以测定MIC。(参见M.Ghannoum，等人.2006.Interlaboratory study of quality control isolates for a broth microdilution method(modified CLSI M38-A)for testing susceptibilities of dermatophytes to antifungals.J Clin Microbiol.44：4353-6或NCCLS.Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts；Approved Standard-Second Edition.NCCLS document M27-A2(ISBN 1-56238-469-4)..NCCLS，940 WestValley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2002或NCCLS.Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi；Approved Standard.NCCLS document M38-A(ISBN 1-56238-470-8).NCCLS，940West Valley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2002)。可选地，真菌、酵母菌或霉菌可以在具有合适的对照样品(例如，阴性对照，例如水)的平行实验中暴露于纳米乳剂一个或多个时段，并测定所述纳米乳剂是否杀死真菌、酵母菌和/或霉菌或使真菌、酵母菌和/或霉菌失去能力，以及到何种程度。
本发明的纳米乳剂可以许多不同类型的容器和递送系统来提供。例如，在本发明的一些实施方式中，所述纳米乳剂以乳膏剂或其他固体或半固体形式提供。本发明的纳米乳剂可掺入水凝胶剂型中。
所述纳米乳剂可以任何适合的容器来递送(例如，递送至受试者或顾客)。可以使用提供所述纳米乳剂的一个或一个以上单次使用剂量或多次使用剂量的适合的容器，用于期望的应用。在本发明的一些实施方式中，所述纳米乳剂以悬浮液或液体形式提供。这些纳米乳剂可以任何适合的容器，包括喷雾瓶(例如，喷雾器、加压喷雾瓶)来递送。
K.实施例
参考以下实施例来进一步描述本发明，仅是为了举例来提供实施例。本发明不局限于所述实施例，而是包括根据本文提供的教导显而易见的所有变化。本文引用的所有公众可获得的文件，包括但不限于美国专利，通过引用具体地并入本文。
实施例
实施例1：纳米乳剂具有针对真菌、酵母菌和/或霉菌感染的有效活性
在体外杀真菌分析中测试根据本发明的纳米乳剂，测定针对与真菌感染相关的实验室和临床皮肤真菌分离物以及几种念珠菌属物种的最小抑制浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)。所述纳米乳剂(“NB-002”)包含水性介质、大豆油、作为非离子表面活性剂的Tween 20
Figure BPA00001278043200591
乙醇、作为阳离子表面活性剂的氯化十六烷基吡啶(CPC)、EDTA和水。
该实施例中使用的纳米乳剂是具有平均直径约200nm的液滴的水包油(o/w)乳剂。CPC存在于油和水相之间的界面处。表面活性剂的疏水尾部分布在油核心中，它的极性的头部基团存在于水相中。通过将水不混溶性的油相混合到水相中而生成的乳剂来生产所述纳米乳剂。所述乳剂被进一步加工来达到期望的粒径。
氯化十六烷基吡啶的化学结构：
Figure BPA00001278043200601
Figure BPA00001278043200602
制备了因连续稀释而含有不同浓度的大豆油、Tween 20、乙醇、CPC和EDTA的10种不同浓度的纳米乳剂，并针对不同的酵母菌或真菌：白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、须毛癣菌、絮状表皮癣菌、断发毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和红色毛癣菌进行测试。一般而言，用于MIC测定所遵循的标准方法利用Ghannoum等人(Ghannoum等人，“Interlaboratory study of quality control isolates for a broth microdilution method(modified CLSI M38-A；CLSI.Reference Method for Broth Dilution Antifungal Suceptibility Testing of Filamentous Fungi：Approved Standard-Second Edition.CLSI document M38-A2.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Instituate；2008)for testing susceptibilities of dermatophytes to antifungals，”J.Clin.Microbiol.，44：4353-6(2006))说明的微升肉汤稀释方法。简言之，使用RPMI 1640培养基，进行分生孢子的血球计数器计数，确保起始的接种物是1-3×103个集落形成单位(cfu)/ml。将含有2倍期望终浓度的每种药物的Premade微量滴定板连续稀释，所述连续稀释如用于测试丝状真菌的临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory Standards Institute)文件中所描述的(NCCLS.Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi；Approved Standard.NCCLS document M38-A(ISBN 1-56238-470-8).NCCLS，940 West Valley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2002)，用2倍最终期望的接种物接种。每个孔中的最终体积是200μl。平板在35℃条件下孵育4天。与对照孔相比，视觉上检查平板的100％生长抑制终点。接种物水平从1-3×103cfu/ml增加到1-3×104cfu/ml，用于测定MFC；还记录了MIC。从没有生长的每个孔(处在MIC和高于该浓度)取出100μl至200μl提供当具有3-log杀死时最少10个至30个菌落/平板。在35℃，4天后在Sabourard Dextrose Agar上测定菌落计数。
将纳米乳剂的MIC(最小抑制浓度)和MFC(最小杀真菌浓度)值与目前使用的抗真菌药物：环吡酮胺、特比萘芬、伊曲康唑、益康唑和灰黄霉素的MIC和MFC值进行比较。参见图3，其图示比较了对于红色毛癣菌的真菌分离物，本发明的纳米乳剂的最小抑制浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)值以及目前用于真菌感染治疗的其他抗真菌药物的作用。(A)纳米乳剂(“NB-002”)；(B)特比萘芬；(C)环吡酮胺；和(D)伊曲康唑。在表3中，显示了用于红色毛癣菌的15种分离物的MIC/MFC范围、MIC50/MFC50和MIC90/MFC90。MIC50/MFC50或MIC90/MFC90是分别抑制50％或90％的真菌、酵母菌或霉菌分离物生长的抗真菌剂的最低浓度，或杀死50％或90％的真菌、酵母菌或霉菌分离物的抗真菌剂的最低浓度。MIC/MFC范围列出了对于研究而言抑制性或致死性的抗真菌试剂的最低和最高浓度。
环吡酮胺(也称为Batrafen
Figure BPA00001278043200611
、Loprox
Figure BPA00001278043200612
、Penlac和Stieprox
Figure BPA00001278043200614
)是用于局部皮肤病学用途的合成抗真菌剂。抗真菌活性通过它的引起下游效应的重要的三价阳离子的螯合作用来产生。盐酸特比萘芬(Lamisil
Figure BPA00001278043200615
、Terbisil
Figure BPA00001278043200616
、Zabel
Figure BPA00001278043200617
)是抑制角鲨烯环氧酶的合成的烯丙胺抗真菌剂，角鲨烯环氧酶是涉及麦角固醇的生物合成的酶。它在性质上是高度亲脂性的，倾向于在皮肤、指甲和脂肪组织中积累。该药物主要对真菌的皮肤真菌群体有效。作为1％乳膏剂或粉剂，它用于浅表性皮肤感染，例如股癣、足癣和其他类型的环癣。口服250mg片剂常常处方用于治疗由于皮肤真菌引起的脚趾甲或手指甲的甲真菌病。伊曲康唑(Sporanox
Figure BPA00001278043200621
)是处方用于患有真菌感染的患者的氮杂茂抗真菌剂，它抑制羊毛甾醇14α-脱甲基酶，它是另一种涉及麦角固醇生物合成的酶。该药物可以口服或通过静脉给于。另一种氮杂茂，益康唑(Pevaryl
Figure BPA00001278043200622
)是用于治疗皮肤真菌病的局部乳膏剂。最后，灰黄霉素(也称为灰黄霉素)是用于治疗皮肤、指甲和头皮的环癣感染的口服施用的抗真菌药物。它与微管蛋白结合并抑制细胞有丝分裂。真菌指甲感染位于指甲下方的深部，甚至位于指甲基质中，这使得局部施用的常规治疗很难或不能以足够的数量渗透。口服施用的药物可导致肝脏毒性，因此就这点警告患者，并且用肝功能测试来监测患者。
表4显示了红色毛癣菌的MIC和MFC值，表示为μg氯化十六烷基吡啶(CPC)/ml。根据它们相应的MFC90/MIC90比值判断，NB-002是杀真菌的，而大部分其他抗真菌剂是抑真菌的。
Figure BPA00001278043200623
表5显示了须毛癣菌的MIC和MFC值，表示为μg氯化十六烷基吡啶(CPC)/ml。根据它们相应的MFC90/MIC90比值判断，NB-002是杀真菌的，而其他抗真菌剂是抑真菌的。
  MIC范围   MFC范围   MIC50   MFC50   MIC90   MFC90
  NB-002   1-4   1-4   2   2   4   4
  环吡酮胺   0.125-1   0.5-＞32   0.5   1   1   16
  特比萘芬   0.0313-0.25   0.0156-＞1   0.0313   0.25   0.125   ＞1
  伊曲康唑   0.0625-0.5   0.25-＞16   0.125   8   0.5   ＞16
  益康唑   0.125-0.25   0.125-＞16   0.25   8   0.25   ＞16
  灰黄霉素   0.25-4   0.25-＞16   0.5   8   2   ＞16
表6显示了絮状表皮癣菌的MIC和MFC范围，表示为μg氯化十六烷基吡啶(CPC)/ml。NB-002看起来对絮状表皮癣菌具有持续活性(MIC/MFC范围分别为2μg/ml至4μg/ml或4μg/ml)，而其他抗真菌剂的MFC的范围显著更宽。
Figure BPA00001278043200631
表7显示了断发毛癣菌和犬小孢子菌的MIC和MFC范围，表示为μg氯化十六烷基吡啶(CPC)/ml。NB-002看起来对两种物种具有持续活性(MIC/MFC范围分别是2μg/ml至4μg/ml或4μg/ml)，而灰黄霉素的断发毛癣菌MFC范围显著更宽。
  MIC范围   MFC范围   MIC范围   MFC范围
  NB-002   2   4-8   0.5-1   1
  特比萘芬   0.008-0.015   0.06-0.12   0.004-0.03   0.06-0.12
  灰黄霉素   0.5-1   8-＞64   ND   ND
表8显示了纳米乳剂NB-002对近平滑念珠菌、克柔念珠菌和石膏样小孢子菌是杀真菌的。
Figure BPA00001278043200641
最后，表9显示了氮杂茂敏感的或氮杂茂抗性的白色念珠菌分离物的MIC和MFC值，表示为μg氯化十六烷基吡啶(CPC)/ml。由于目标位点突变和/或多药物抗性泵，NB-002对氮杂茂敏感的或氮杂茂抗性的白色念珠菌分离物是杀真菌的。
Figure BPA00001278043200642
*所有的分离物是氮杂茂-抗性的；4和6种分离物已分别上调MDR泵或上调麦角固醇生物合成突变。
与显示了最小杀真菌活性或无杀真菌活性的抗真菌试剂相比，纳米乳剂对引起各种真菌和酵母菌感染的三个主要的属：毛癣菌属、表皮癣菌属和念珠菌属物种的MIC和MFC值范围为0.5μg/ml至8μg/ml。进一步的，纳米乳剂(NB-002)对发癣中的两种主要病原体犬小孢子菌和断发毛癣菌具有持续抑真菌活性和杀真菌活性(表10)。
表11显示了对于四种酵母菌/真菌的每一种进行测试的示范性的抗真菌纳米乳剂。除非另作说明，所有浓度表示为％w/w。
Figure BPA00001278043200652
Figure BPA00001278043200661
这些结果清楚地说明了与目前使用的其他抗真菌药物的抑真菌效果相比，本发明的纳米乳剂具有持续的更为杀真菌的活性。
实施例2：纳米乳剂无毒并且不被全身吸收
用包含阳离子表面活性剂和0.25％(w/v)氯化十六烷基吡啶(CPC)的纳米乳剂或包含0.5％(w/v)氯化十六烷基吡啶(CPC)作为阳离子表面活性剂的纳米乳剂对患有晚期脚趾甲的末端指甲下甲真菌病(包括至少5个脚趾甲的甲松离)的二十位受试者随机进行治疗。两种乳剂(％w/w)的组成如下，在表12中显示：纳米乳剂I：(1)15.7％大豆油；(2)1.48％Tween 20；(3)1.68％乙醇，(4)0.27％CPC；(5)80.85％水；和(6)0.019％EDTA；以及纳米乳剂2：(1)31.4％大豆油；(2)2.96％Tween 20；(3)3.37％乙醇，(4)0.53％CPC；(5)61.7％水；和(6)0.037％EDTA。
治疗是向10个脚趾甲和5mm的邻接皮肤每天施用两次持续28天，平均施用次数55次。图4显示了纳米乳剂的图示作用机制，包括纳米乳剂的进入途径。
在第1、3、7、14、21、28和58天，通过不良事件报告和4点分数的真皮刺激的计分来评估安全性。通过基于红斑、干燥/剥落、灼烧/刺痛和发痒对施用位置进行分级，在每次就诊时评价真皮刺激；在标准的计分级别的每个等级中，0＝没有，1＝轻微的，2＝中度的，以及3＝严重的。利用维持在35℃的SB-Phenyl柱子通过高效液相色谱(HPLC)测定在28天治疗期间的14个时点采集的血浆样品中阳离子试剂的全身性药物吸收。
表13概括了接受治疗的人类受试者的人口统计学特征。
Figure BPA00001278043200671
SD＝标准差
表14概括了在研究期间登记的不良事件。没有严重的不良事件或由于不良事件的终止。所有报道的不良事件在严重度方面是轻微到中度的，都不被认为是治疗相关的。最常报道的不良事件是普通感冒症状。
Figure BPA00001278043200672
  感冒症状   1   1
  头部充血   1   0
  胸部充血   1   0
  脚趾甲部分扯掉   0   1
实验中的受试者在实验的任何时间都没有报告任何皮肤刺激，研究人员的真皮刺激计分表明没有来自纳米乳剂的皮肤刺激或来自纳米乳剂的皮肤刺激最小。在每次研究就诊时，研究人员以4分级别来评估皮肤。在大多数受试者中，在研究的任何时间没有感觉。五名受试者在一次或一次以上就诊时有由研究人员评估为轻微的皮肤感觉。这些受试者中的四名(4)在一个或2个研究日中有轻微的感觉，其仅在研究的结束时被辨识。一名(1)受试者在所有的研究就诊中有持续的轻微的感觉。这些发现中没有一个被研究人员认为是临床上显著的。
对于所有受试者和在所有的采样时间点，血浆样品中的CPC低于可定量的界限(1ng/mL)。这些结果清楚地显示了，本发明的纳米乳剂耐受性良好并且无毒，并且不被全身吸收。
实施例3：所述纳米乳剂临床上有效
患有脚趾甲的远端指甲下的甲真菌病(涉及脚趾甲面积的25-65％)的443名受试者参与随机双盲赋形剂对照剂量范围研究，用赋形剂、包含0.25％(w/v)氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂或包含0.5w/v％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂治疗上述443名受试者。两种纳米乳剂的组成(％w/w)如下：纳米乳剂1：(1)15.7％大豆油；(2)1.48％Tween 20；(3)1.68％乙醇，(4)0.27％氯化十六烷基吡啶(CPC)；(5)80.85％水；和(6)0.019％EDTA；和纳米乳剂2：(1)31.4％大豆油；(2)2.96％Tween 20；(3)3.37％乙醇，(4)0.53％氯化十六烷基吡啶(CPC)；(5)61.7％水；和(6)0.037％EDTA。
在所有受试者中，参与研究的受试者的样品的KOH测试和皮肤真菌培养是阳性的，确认了皮肤真菌病原体的存在。治疗是向10个脚趾甲和5mm邻接的皮肤每天施用一次(0.5％)或两次(0.25％和0.5％)持续42周。在治疗24周后评估160位人类受试者中受影响区域的指甲线性生长和百分数(％)。
在图5至图7中显示的结果清楚地说明了与纳米乳剂结合的受影响的指甲区域中，新的未受影响的指甲的线性生长的进展以及受影响指甲的面积的逐渐减小。
特别地，图5图示说明了，在用(A)载体；(B)包含0.25％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次；(C)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于一次和(D)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次治疗之后，由受训的研究人员评估的新的未受影响的指甲的线性生长的进展。
图6图示说明了，在用(A)载体；(B)包含0.25％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次；(C)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于一次和(D)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次治疗之后，由面积法评估的新的未受影响的指甲的线性生长的进展。
图7图示说明了，在用(A)载体；(B)包含0.25％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次；(C)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于一次和(D)包含0.5％氯化十六烷基吡啶的纳米乳剂，每天给于两次治疗之后，由面积法评估的受影响的指甲的面积的逐渐减小。
最后，将根据本发明的的纳米乳剂(“NB-002”)与Penlac
Figure BPA00001278043200691
在提供真菌学治愈方面的有效性进行比较。Penlac
Figure BPA00001278043200692
是FDA批准用于治疗轻度和中度指甲真菌的唯一的局部药物。惊讶地发现在用根据本发明的纳米乳剂(NB-002)治疗42周之后，在没有治疗4-8周(或1-2个月)后，显著百分比的患者群体表现出真菌学治愈。这与用Penlac
Figure BPA00001278043200693
获得的结果相反，其中在42周的治疗之后，在没有治疗4-8周(或1-2个月)之后，很小百分比的治疗的受试者表现出真菌学治愈。参见图8，其中显示了，在停止治疗后8周或更久，根据本发明的纳米乳剂提供了超过25％的真菌学的治愈率。与Penlac
Figure BPA00001278043200694
在停止治疗8周或更久之后产生低于5％的真菌学的治愈的结果相比较，这种结果是出乎意料的和显著的。
实施例4：在高于最小杀真菌浓度1000倍的剂量下所述纳米乳剂用于局部施用是安全的
进行体内安全性研究来确认纳米乳剂对人类使用的安全性。测试的纳米乳剂的组成(％w/w)在表15中示出。
Figure BPA00001278043200701
通过每周施用10mg/mL的纳米乳剂三次连续三周来治疗10只雌性和10只雄性豚鼠，然后一周后挑战性测试6小时以确定纳米乳剂是否导致真皮敏化。真皮毒性研究还在每天施用0.1mg/cm2至1.0mg/cm2纳米乳剂持续9个月的4只雌性和4只雄性迷你猪的组群中进行。
表16概括了研究的结果。
Figure BPA00001278043200702
在比皮肤真菌的MIC/MFC高1000倍的浓度下局部施用不引起豚鼠中的真皮敏化，在迷你猪的9个月的重复剂量真皮研究中没有显示毒性。这些结果清楚地说明了在比最小杀真菌浓度高1000倍的剂量下本发明的纳米乳剂对于局部施用是安全的。
实施例5：纳米乳剂是稳定的
根据ICH指南测试了根据本发明的纳米乳剂的稳定性。测试的纳米乳剂的组成(％w/w)如下(表17)：
Figure BPA00001278043200711
纳米乳剂在40℃/75％相对湿度(RH)条件下在玻璃小瓶中保存6个月，或在室温下(25℃/60％RH)保存36个月。通过一般外观(白色均一的液体没有分离的前兆)、pH值(4至6)、液滴尺寸(＜400nm)和效力来评估纳米乳剂。纳米乳剂中存在的阳离子表面活性剂，氯化十六烷基吡啶，被用作纳米乳剂液滴的效力的报告物，并通过HPLC对所述阳离子表面活性剂进行定量。纳米乳剂通过了稳定性测试的所有指标。
实施例6：纳米乳剂针对稀有的真菌病原体的活性
这个实施例的目的是测试根据本发明的纳米乳剂对甲癣的稀有的真菌病原体的有效性。
制备包含大豆油、作为非离子表面活性剂的Tween 20
Figure BPA00001278043200712
、乙醇、作为阳离子表面活性剂的氯化十六烷基吡啶(CPC)、EDTA和水(“NB-002”)的纳米乳剂。纳米乳剂的液滴具有约200nm的平均直径。尺寸和组成使得所述纳米乳剂选择性地吸收进入毛囊和毛孔。
甲真菌病中的主要病原体是皮肤真菌红色毛癣菌和须毛癣菌。如上所述，根据本发明的纳米乳剂对这两种物种是杀真菌的。在本实验中，测定根据本发明的纳米乳剂对丝状真菌的12个属和毛癣菌属的2个新物种的抗真菌活性。
方法：所有真菌来自患者，他们中的许多患有甲真菌病或其他癣感染。使用临床实验室标准学会(Clinical Laboratory Standards Institute)M 38-A A中描述的方法测定NB-002和比较化合物的最小抑制浓度(MIC)。针对每种真菌分离物测试NB-002的从32μg CPC/ml到0.125μg CPC/ml的两倍连续稀释物。组成范围在表18中列出。
表18.在基于微滴定的MIC测定中测试的NB-002浓度范围的组合物
Figure BPA00001278043200721
结果：NB-002是最持续产生活性的抗真菌剂。这种局部纳米乳剂由于其对帚霉属物种、足放线病菌属物种的效力，其自身与两性霉素B(AmB)、伊曲康唑(ITR)和特比萘芬(TER)相区别，并且它对镰刀菌属物种和拟青霉属物种的活性优于环吡酮胺(CPX)。参见表19和附图9。
aAmB＝两性霉素B；ITR＝伊曲康唑；TER＝特比萘芬；CPX＝环吡酮胺
结论：这些数据扩展了根据本发明的纳米乳剂对可能导致甲癣的稀有的真菌物种的活性。
实施例7：病原体不表现出对纳米乳剂的潜在抗性
本实施例的目的是确定各种皮肤真菌是否表现出对根据本发明的纳米乳剂的潜在抗性。
制备包含水性介质、大豆油、作为非离子表面活性剂的Tween 20
Figure BPA00001278043200732
、乙醇、作为阳离子表面活性剂的氯化十六烷基吡啶(CPC)、EDTA和水的纳米乳剂(NB-002)。(这项研究的纳米乳剂组成的范围在表20中列出)。测定对2倍、4倍和8倍MIC的自发抗性。测定引起甲真菌病的主要病原体中对纳米乳剂和比较化合物的自发抗性。
Figure BPA00001278043200733
Figure BPA00001278043200741
方法：在马铃薯葡萄糖琼脂上生长的来自红色毛癣菌、须毛癣菌、絮状表皮癣菌的临床分离物的接种物(5×103个分生孢子/部位)用于测定纳米乳剂(“NB-002”)、环吡酮胺(C)、特比萘芬(T)和伊曲康唑(I)的基于琼脂的MIC。对化合物产生的抗性通过将107个分生孢子种植于含有2倍、4倍或8倍MIC的RPMI 1640琼脂平板上来测定。测试表型抗性分离物的MIC，并与亲本MIC比较。
结果：从任何药物平板仅获得1至5个分离物。没有分离物的MIC增加超过其亲本的MIC的两倍。
  T.rubrum   NBD031-b   1   0.125   2   4.0   0.016   0.0625   4
  T.rubrum   NBD031-c   T   0.125   1   4.0   0.016   0.0313   4
aE.floc.＝絮状表皮癣菌；T.ment.＝须毛癣菌；T.rubrum＝红色毛癣菌；bT＝特比萘芬；I＝伊曲康唑；C＝环吡酮胺。
结论：对测试的纳米乳剂(NB-002)、环吡酮胺(C)、特比萘芬(T)和伊曲康唑(I)的表型抗性在1-5×10-7出现，但是分离物都不具有稳定抗性。因而，看起来没有预先存在的、对测试的纳米乳剂具有固有抗性的细胞亚群，这与在其他研究中观察到的统一的杀真菌活性一致。
实施例8：纳米乳剂对皮肤真菌菌丝和小分生孢子的杀死活性
本实施例的目的是确定本发明的纳米乳剂对导致甲癣的真菌和酵母菌病原体的可能的作用机制。在本实验中，评估了根据本发明的纳米乳剂对红色毛癣菌的生存力和形态的影响。
制备包含水性介质、大豆油、作为非离子表面活性剂的Tween 20
Figure BPA00001278043200751
乙醇、作为阳离子表面活性剂的氯化十六烷基吡啶(CPC)、EDTA和水的纳米乳剂(NB-002)。纳米乳剂的液滴具有约200nm的平均直径。尺寸和组成使其选择性吸收进入毛囊和毛孔。本实验中测试的纳米乳剂的组成在表22中示出.
方法
时间-杀死实验。对于时间-杀死实验和作用机制的电子显微照片而言，用无菌蒸馏水从在马铃薯葡萄糖琼脂上生长的红色毛癣菌的7天龄培养物中收获小分生孢子，并调节至浓度为106个分生孢子/ml。部分分生孢子的悬浮液团粒化并重悬浮于PRMI 1640培养基中，在室温下过夜生长16小时至18小时使得微小分生孢子的发芽。在发芽之后，通过离心来采集菌丝并重悬浮在蒸馏水中。在与不同浓度的NB-002或比较化合物混合之后，通过在SDA上种植0.1ml的10-1、10-2和10-3稀释物来跟踪微小分生孢子和菌丝体的杀死率持续24小时。在35℃下孵育四天后对集落形成单元进行计数。对照实验测定含有NB-002的样品必需以1∶100稀释来除去残余活性(数据未显示)。
扫描电子显微术：利用无菌蒸馏水从马铃薯葡萄糖琼脂上生长的红色毛癣菌的7天龄培养物中收获真菌菌丝和孢子，并将真菌原液调节至浓度为106个分生孢子/ml。将NB-002时间-杀死研究(50×(100μg CPC/ml)和250×MIC(500μg CPC/ml))过程中不同时点的样品(450μl或450μl的10-1稀释物)与113μl的固定液(在Sorenson缓冲液中的戊二醛的10％水溶液，pH 7.4)混合。将混合物进行涡旋振荡并置于4℃下至少18小时。用于扫描电子显微术的固定样品和样品染色的步骤包括：(1)将样品固定在2.5％戊二醛的Sorenson缓冲液(pH 7.4)中；(2)样品在0.1M Sorensen缓冲液中清洗两次，每次15分钟；(3)将样品固定在1.0％OsO4的Sorenson缓冲液中；(4)样品在0.1M Sorensen缓冲液中清洗两次，每次5分钟；(5)样品在以下每个溶液中每次脱水15分钟：30％EtOH、50％EtOH、70％EtOH、90％EtOH、100％EtOH、100％EtOH；(6)将样品浸入六甲基二硅氮烷(HMDS)中四次，15分钟更换一次HMDS；(7)在HMDS的第四次更换之后取出样品，用恰好足以覆盖组织的HMDS来替换。(8)利用胶体石墨和duco粘结剂的混合物将样品固定在SEM桩上；(9)样品置于真空干燥器中过夜；(10)利用“Polaron”镀金机给样品镀金；(11)样品在“Amray 1910 FE”扫描电子显微镜上进行检测，利用Xstream成像软件进行数字成像。
结果
菌丝和微小分生孢子形式都被NB-002快速杀死(图10至图12)。评估NB-002和比较化合物对来自红色毛癣菌的三种分离物的微小分生孢子和菌丝体的杀真菌活性的动力学。图10显示了对于悬浮在含有4×MIC(16μg/ml)的NB-002或16×MIC的伊曲康唑(16μg/ml)、特比萘芬(4μg/ml)或环吡酮胺(16μg/ml)的水中(非生长条件)的菌丝体或微小分生孢子中的任一种，经过24小时代表性的分离物NBD031的菌落计数降低。在两小时内，对于NBD031和NBD030的菌丝体和微小分生孢子它们两者，NB-002使菌落计数降低了≥3logs；对于菌落计数降低3-log而言(数据未显示)，一种分离物(NBD032)需要与NB-002孵育4小时。在任何时间点其他化合物无一显著地降低任一种皮肤真菌形式(菌丝或微小分生孢子)的菌落计数；例外是，对来自红色毛癣菌NBD032的非生长的菌丝体(而不是微小分生孢子)，环吡酮胺(16×MIC或8μg/ml)在8小时后使菌落计数降低3-log(数据未显示)。
通过扫描电子显微术评估NB-002对红色毛癣菌菌丝和微小分生孢子的形态的作用机制。图11A显示了没有用NB-002处理的红色毛癣菌NBD030菌丝体(菌丝)的扫描电镜照片，图11B显示了在室温下NB-002处理(100μg/ml)1小时之后的扫描电镜照片(2,000×放大率)。注意到沿着菌丝的细胞壁形成气泡；图12显示了在NB-002处理后形成的更高放大率的气泡。图11C和图11D分别是在NB-002处理之前和之后的微小分生孢子(箭头)。在NB-002处理1小时之后，孢子看起来是破裂的空壳。因而，尽管在细胞壁结构方面有差异，NB-002有效地杀死微小分生孢子和菌丝体。
根据本发明的纳米乳剂对红色毛癣菌的分生孢子和菌丝体都是快速杀真菌性的。NB-002不需要真菌是活跃生长的并且NB-002看起来是通过与真菌细胞表面接触“在接触时杀死”，形态上产生气泡并使真菌丧失生存力。这种作用机制与用于治疗甲癣的常规小分子药物，例如，特比萘芬和伊曲康唑的作用机制不同。这些药物对真菌制剂的任一种类型都没有活性(图10)。它们的作用机制是干扰固醇生物合成，可能需要生长中的细胞来抑制生长。环吡酮胺，其机制看起来是混合的，对分生孢子形式没有活性。
实施例9：将纳米乳剂递送进入表皮和真皮
本实施例的目的是比较根据本发明的纳米乳剂向真皮和表皮中的递送，和比较含存在于测试的纳米乳剂中的阳离子表面活性剂的对照组合物的递送。
制备包含19.2％大豆油、作为非离子表面活性剂的1.5％Tween 20
Figure BPA00001278043200771
、2.4％乙醇、作为阳离子表面活性剂的0.3％氯化十六烷基吡啶(CPC)、0.0024％EDTA和76.6％水NB-002纳米乳剂(％w/w)(“NB-002”)。对照组合物包含0.3％w/v水性氯化十六烷基吡啶(CPC)。
将纳米乳剂(NB-002)和对照CPC组合物局部施用于人类尸体皮肤。在24小时后，测量对照CPC组合物和NB-002组合物的表皮和真皮中存在的CPC的量。在图13A和图13B中显示的结果说明了对照CPC组合物实际上没有吸收进入表皮(图13A)或真皮(图13B)。相比之下，纳米乳剂表现出极好地吸收进入表皮(图13A)和真皮(图13B)，在施用后24小时，在表皮中测量到约2500μg/mg组织的CPC，在真皮中测量到约29μg/mg组织的CPC。这些结果说明纳米乳剂结构对于在真皮和表皮中的有效吸收是重要的。
实施例10：在猪表皮和真皮中不同浓度纳米乳剂的递送
本实施例的目的是评估具有不同浓度阳离子表面活性剂的纳米乳剂吸收进入表皮和真皮。制备了五种不同的纳米乳剂。所有的纳米乳剂包含大豆油、作为非离子表面活性剂的Tween 20
Figure BPA00001278043200781
、乙醇、作为阳离子表面活性剂的氯化十六烷基吡啶(CPC)、EDTA和水(“NB-002”)。组成(％w/w)在下表中予以总结。
Figure BPA00001278043200782
在猪皮肤上单次施用之后和三次施用之后测量进入表皮(图14A)和真皮(图14B)的吸收。如图14A所示的结果说明所有的纳米乳剂表现出在单次施用后吸收进入表皮。类似地，如图14B中显示的结果说明了所有的纳米乳剂表现出在单次施用后吸收进入真皮。此外，所有制剂表现出在三次施用之后吸收进入表皮(图14B)。然而，在三次施用之后，包含0.1％w/v CPC的制剂没有表现出吸收进入真皮。
实施例11：利用纳米乳剂将特比萘芬递送进入猪表皮和真皮
本实施例的目的是与由Lamisil
Figure BPA00001278043200791
乳膏剂所代表的常规TBHC制剂相比较，评估进一步包含活性剂盐酸特比萘芬(TBHC)的根据本发明的纳米乳剂体外吸收进入表皮和真皮。猪皮肤用作动物模型。
11.1：体外皮肤模型
体外皮肤模型被证明是用于研究局部施用的化合物的经皮吸收的重要的工具(Franz，TJ，“Percutaneous absorption：on the relevance of in vitro data，”J.Invest.Dermatol.，64：190-195(1975))。该模型利用安装在特别设计的扩散腔室上的切下的皮肤，所述扩散腔室使得皮肤维持在与典型的体内条件相匹配的温度和湿度下。将限定剂量的制剂施用于表皮、皮肤的外表面，并通过监测它在水洗皮肤的真皮表面的接受溶液中的出现率来测量化合物吸收。该方法拥有精确地预测体内经皮吸收动力学的历史先例(Franz TJ，“The finite dose technique as a valid in vitro model for the study of percutaneous absorption in man，”Skin：Drug Application and Evaluation of Environmental Hazards，Current Problems in Dermatology，vol.7，pp 58-68，Simon et al.(Eds)(Basel，Switzerland，S.Karger，1978))。
11.2：盐酸特比萘芬
盐酸特比萘芬是白色细结晶粉末，易溶于甲醇和二氯甲烷，可溶于乙醇，微溶于水。含有250mg TBHC的口服片剂常常处方用于治疗由皮肤真菌甲癣而引起的脚趾甲或手指甲的甲真菌病。作为1％乳膏剂或粉剂，它用于浅表皮肤感染，例如股癣(Tinea cruris)、香港脚(Tinea pedis)和其他类型的环癣(Tinea coporis)。化学结构和物理化学性质如下。
Figure BPA00001278043200801
11.3：研究中所使用的纳米乳剂
制备两种不同的纳米乳剂，它们相应的组成在表24中示出。将这些制剂递送特比萘芬(TBHC)至表皮和真皮的能力与包含1％TBHC的Lamisil
Figure BPA00001278043200802
乳膏剂相比较。这项研究中使用的纳米乳剂是水包油(o/w)乳剂，具有平均直径约200nm的液滴。纳米乳剂中的阳离子表面活性剂氯化十六烷基吡啶(CPC)用作递送的另外的标记物试剂。CPC存在于油和水相之间的界面处。表面活性剂的疏水性的尾部分布在油核心中，它的极性的头部基团存在于水相中。
Figure BPA00001278043200803
11.4：猪皮肤
获自Sinclair Research Center，Inc，Auxvasse，Mo的、2月龄雄性家猪的完全厚度的背部皮肤(～1000μM厚度)用于渗透研究。用解剖刀除去皮下脂肪，皮肤保存在-70℃的铝箔小袋中待用。在使用时，通过将密封小袋置于30℃水中约五分钟来解冻皮肤。解冻的皮肤从小袋中取出，切成圆片(直径30mm)以适于放在渗透腔室的供应侧和接受侧之间。
11.5：Franz扩散池方法：条件、参数、操作
利用体外尸体皮肤限定剂量技术测量经皮吸收。接受区室充满pH值为7的蒸馏水，供应区室保持向环境实验条件敞开。每个池的接受体积是7.7ml/装置，带有磁性搅拌棒。接受区室用水浴和磁力搅拌维持在37℃。通过IR表面温度探针确定的皮肤的表面温度适当地是32℃。
在施用113μL剂量之前使皮肤平衡30分钟。将纳米乳剂制剂利用正位移移液管施加到扩散池的供应腔室的表皮表面。暴露的给药表皮表面积是1.13cm2。第二剂量在8小时后施用。LamisilAT乳膏剂也利用正位移移液管来施用，然后擦入皮肤中持续10秒。乳膏剂也在8小时后施用。首次剂量施用后二十四小时，用1ml的70％乙醇/水溶液清洗皮肤的表面，然后用70％乙醇浸泡的棉签清洁四次。在酒精擦拭之后，除去供应腔室的盖子，从装置上取下皮肤。通过刮擦方法从真皮上除去表皮，将表皮置于称皮重的闪烁管中。对真皮进行穿孔活检，并将真皮置于称皮重的闪烁管中。记录真皮和表皮的重量。将过量的皮肤部分置于带有表面拭子的闪烁管中。
11.6：采样(接受部采样、表皮、真皮、表面拭子/额外的皮肤)
首次剂量施用后二十四小时，用1mL 70％乙醇/水溶液清洗给药区域的表面，用70％乙醇/水溶液浸泡的棉签单独地擦拭几次，从皮肤表面除去全部残余制剂。分析所有表面拭子的CPC含量。
还在24小时从每个池的接受部采样2mL的接受部溶液，并通过0.45μmPTFE(25mm)膜注射过滤器过滤，独立地分析TBHC和CPC。
如上所述采集皮肤样品；记录表皮和真皮组织的重量。用3mL的200酒精标准浓度的完全乙醇提取表皮和真皮组织，超声处理30分钟，通过25mm、0.45μm PTFE膜注射过滤器过滤，独立地分析TBHC和CPC。还分析Lamisil样品的CPC。
11.7：表皮和真皮的计算
产生TBHC或CPC的标准浓度并将TBHC或CPC的标准浓度用于测定给药区域中TBHC或CPC的浓度。每个皮肤区域中CPC或TBHC的含量表示如下：1)数量/湿组织重量(μg/克)±标准差；2)数量/表面积(μg/cm2)±标准差；3)施用剂量的％±标准差。
11.8：1％TBHC/0.3％纳米乳剂制剂的局部施用之后的CPC含量
1％TBHC/0.3％纳米乳剂制剂的CPC渗透研究的结果在表25中示出。
Figure BPA00001278043200821
将用1％TBHC/0.3％纳米乳剂a将CPC标记物递送进入表皮和用0.3％纳米乳剂b将CPC标记物递送进入表皮进行了比较。纳米乳剂制剂中的乙醇浓度看起来促进了将CPC递送进入真皮组织。1％TBHC/0.3％纳米乳剂b制剂的CPC含量比1％/TBHC/0.3％纳米乳剂a制剂的CPC含量高2倍(37.1μg/克相比70.6μg/克)。这个发现与真皮中见到的TBHC含量一致。对于所有制剂而言，在24小时接受区室中发现的CPC的量低于检测水平(5ng/ml)。
11.9：TBHC吸收结果
LamisilAT、1％TBHC/0.3％纳米乳剂a和1％TBHC/0.3％纳米乳剂b的TBHC渗透研究的结果在表26、图15和图16中示出。
Figure BPA00001278043200831
与真皮相比，Lamisil
Figure BPA00001278043200832
乳膏剂递送约12倍的TBHC进入表皮。与真皮相比，1％ TBHC/0.3％纳米乳剂a递送约20倍的TBHC进入表皮。与真皮相比，1％TBHC/0.3％纳米乳剂b递送约8.5倍的TBHC进入表皮。
使用了1％TBHC/0.3％纳米乳剂a和1％TBHC/0.3％纳米乳剂b的表皮中TBHC的含量分别比使用了LamisilAT乳膏制剂的表皮中的TBHC高18.6和15.1倍。使用了1％TBHC/0.3％纳米乳剂a和1％TBHC/0.3％纳米乳剂b的真皮中TBHC的含量分别比使用了LamisilAT乳膏制剂的真皮中的TBHC含量高10.9和20倍。这表明在局部施用含有TBHC的新的纳米乳剂的之后实现了将TBHC更好地递送进入皮肤。因而，纳米乳剂显著地促进了递送TBHC进入表皮和真皮。
实施例12：含咪康唑的纳米乳剂制剂和含硝酸咪康唑的Lotrimin
Figure BPA00001278043200833
喷雾溶液的体外渗透研究
本实施例的目的是研究纳米乳剂制剂向家猪皮肤中递送咪康唑(MCZ)的效力。商业上可获得的Lotrimin AF
Figure BPA00001278043200841
喷雾溶液用作对照。纳米乳剂中的阳离子表面活性剂氯化十六烷基吡啶(CPC)用作纳米乳剂递送的另外的标记物试剂。
咪康唑是咪唑抗真菌剂，通常局部施用于皮肤或粘膜以治愈真菌感染。它通过抑制麦角固醇的合成来起作用，麦角固醇是真菌细胞膜的重要成分。它还被用来对抗利什曼虫属(Leishmania)原生动物的某些物种，利什曼虫属是一种单细胞寄生虫，这些寄生虫在它们的细胞膜中也含有麦角固醇。除了咪康唑的抗真菌和抗寄生虫作用之外，它还具有一些有限的抗细菌性质。咪康唑主要外部用于治疗脚癣、环癣和股癣。内部应用是用于口服或阴道炎(酵母菌感染)。此外，口服凝胶也可以用于唇失调性角唇炎。化学结构和物理化学性质如下。
咪康唑的化学结构：
Figure BPA00001278043200842
Figure BPA00001278043200843
实验
12.1.测试制剂
2％咪康唑/0.3％纳米乳剂的制剂
纳米乳剂测试制剂含有0.3％(0.3％CPC或3mg CPC/ml)的终浓度和2％咪康唑。通过先将咪康唑溶解到乙醇中直至完全溶解然后与水混合，将咪康唑掺入1％纳米乳剂(包含1％CPC)中。将该溶液缓慢地添加到1％纳米乳剂中并轻轻混合，获得含有0.3％纳米乳剂和2％咪康唑的最终产品。通过目视检查和显微镜检查，没有观察到与纳米乳剂混合后咪康唑沉淀的迹象。咪康唑也可在乳剂制剂之前溶于油相。咪康唑纳米乳剂的组成在表28中列出。
Figure BPA00001278043200851
Lotrimin AF
Figure BPA00001278043200852
喷雾溶液含有2％硝酸咪康唑。Lotrimin AF
Figure BPA00001278043200853
喷雾溶液中的无活性的成分包括变性酒精(13％v/v)、椰油酰胺DEA、异丁烯、丙二醇和生育酚(维生素E)。
12.2.表皮和真皮的计算
渗透进入表皮、真皮和接受区室(在首次剂量后24小时)的MCZ的量由HPLC MS/MS来测定。产生MCZ的标准浓度，并用于测定给药区域中MCZ的浓度。每个皮肤区域中CPC或MCZ的含量表示为：(1)数量/表面积(μg/cm2)±标准差；(2)数量/湿组织重量(μg/克)±标准差；(3)施用剂量的％±标准差。
结果和结论
Lotrimin
Figure BPA00001278043200854
AF喷雾溶液和2％MCZ/0.3％纳米乳剂的MCZ渗透研究的结果在表29和图17和图18中示出。
Figure BPA00001278043200861
与将MCZ递送进入真皮相比，商业上可获得的Lotrimin AF喷雾溶液递送约5.6倍的MCZ进入表皮。令人惊讶地，与将MCZ递送进入真皮相比，包含2％MCZ/0.3％NB-00X的纳米乳剂制剂递送约18.6倍的MCZ进入表皮。因而，与Lotrimin AF
Figure BPA00001278043200863
喷雾溶液相比，使用2％MCZ/0.3％纳米乳剂制剂显著提高了将MCZ递送进入表皮和真皮。在24小时后在表皮和真皮中发现使用了Lotrimin喷雾剂的MCZ含量比使用了2％MCZ/0.3％纳米乳剂制剂的MCZ含量低。使用了2％MCZ/0.3％纳米乳剂的表皮中的MCZ含量比使用了Lotrimin AF
Figure BPA00001278043200864
喷雾溶液的表皮中的MCZ含量高30倍。使用了2％MCZ/0.3％纳米乳剂的真皮中的MCZ含量比使用了Lotrimin AF
Figure BPA00001278043200865
喷雾溶液的真皮中的MCZ含量高9倍。因而，与Lotrimin AF
Figure BPA00001278043200866
喷雾溶液相比，利用纳米乳剂制剂提高了将MCZ递送进入表皮和真皮组织。对于所有测试的制剂，在24小时接受区室中发现的MCZ的量低于检测水平(50ng/ml)。
实施例13：纳米乳剂横向地扩散到感染的位点
本实施例的目的是测试纳米乳剂液滴是否可横向地扩散到皮肤中的区域而不直接位于施用位置的下方。
利用切下的人类尸体皮肤在改良的Franz扩散装置中进行体外研究。该研究中使用的纳米乳剂是水包油(o/w)乳剂，具有平均直径约200nm的液滴。用作递送标记物的氯化十六烷基吡啶(CPC)存在于油和水相之间的界面处。部分表面活性剂分布在油核心中，部分存在于水相中。
纳米乳剂测试制剂包含0.25％NB-002或0.5％NB-002。通过将水不混溶性的油相和水相混合，随后高能乳化以获得期望的约200nm的粒径来生成乳剂。水性CPC溶液通过简单的称重CPC并加水直到CPC溶于水相来制备。该研究中使用的纳米乳剂的组成，除非另作说明表示为w/w％，在下表30中给出。
Figure BPA00001278043200871
如以下更详细描述的，将100μl/cm2的NB-002纳米乳剂施加到由两个同心玻璃杯围绕的皮肤的5.27cm2同心表面区域上。参见图19和图20。由于装置设计，可在中间和内部组织中检测CPC的唯一方式是通过纳米乳剂渗透进入给药区域下方的皮肤，横向移动到非给药区域。
非给药区域中的中间区域，CPC的表皮和真皮的浓度分别是700μg/克和150μg/克，内部区域分别是200μg/克组织和100μg/克组织。参见图21至图25。这些数据表明，纳米乳剂从给药区域横向地跨越11mm。在中间和内部区域组织中纳米乳剂的含量实质上高于早先测定的体外杀死真菌的纳米乳剂浓度(4μg/克)。
13.1.实验
改良的扩散池方法
利用体外尸体皮肤限定剂量技术测量经皮吸收。使用低温保存的皮片的(～700μm)人类尸体腹部皮肤，将其于-70℃保存在铝箔小袋中待用。在使用时，通过将密封的小袋置于37℃水中约5分钟来解冻皮肤。从小袋中取出皮肤，然后切成小块以适于放在38mm的渗透孔池上。接受区室充满pH值为7的蒸馏水，供应区室保持向环境实验条件敞开。所有的池安装在扩散装置中，其中通过池外侧的循环水浴将接受部溶液维持在37℃。扩散研究的参数列于表31和图19。
表31.实验参数
Figure BPA00001278043200881
将两个圆形的玻璃腔室使用氰基丙烯酸酯粘合剂(例如，强力胶)粘合，该粘合剂用于将腔室附着到皮肤表面，如图20所示。图19说明了研究中涉及的表面区域的尺寸。将测试制剂施加于外部给药区域。中间和内部区域不接受测试制剂的局部施用。
利用正位移移液管，每天一次和/或每天两次将测试制剂施用于扩散池的供应腔室的表皮表面。
在首次施用后24小时，外部给药区域用70％乙醇溶液擦拭几次从皮肤表面除去所有残余的制剂。也擦拭中间和内部区域的表面区域。分析所有表面拭子的CPC含量。然后移除腔室，处理外部给药区域。简要地，通过刮擦技术在外部给药区域中从真皮上除去表皮，将表皮置于称皮重的小瓶中并称重。然后使用解剖刀从给药区域取下真皮，将真皮置于称皮重的玻璃小瓶中，并称重。中间和内部区域以相同的方式处理。外部、中间和内部区域的表皮和真皮组织用70％乙醇溶液提取，超声处理30分钟，通过25mm、0.45μm PTFE膜注射过滤器过滤，并分析。
结果和结论
NB-002的渗透研究的结果在图21至图25和表32和表33中示出。对于水性CPC溶液和NB-002制剂，不同区室(表皮、真皮和接受部)中发现的CPC的含量显著不同。在24小时持续时间之后使用了0.5％w/v水性CPC溶液的表皮和真皮中发现CPC含量比使用了0.25％和0.5％NB-002的表皮和真皮中的CPC含量更低。对于所有制剂，在24小时接受区室中发现的CPC的含量低于检测水平(5ng/ml)。与施用一次0.5％NB-002相比，在每天施用两次后(施用t＝0和8小时之后)在使用了0.25％NB-002制剂的表皮和真皮中发现更多的CPC。
Figure BPA00001278043200891
这些结果确认了纳米乳剂在角质层下方横向地扩散到远离施用位置1厘米的组织中。这表明，NB-002可以在人类指甲下方从邻近的皮肤位置扩散，杀死引起甲真菌病的真菌。
实施例14：人类尸体皮肤中特比萘芬的横向扩散
本实施例的目的是测定掺入纳米乳剂制剂中的活性剂(例如，盐酸特比萘芬(TBHC))是否可以横向地扩散到人类尸体皮肤中。
将1％TBHC掺入纳米乳剂制剂中。这项研究中使用的水包油纳米乳剂具有平均直径约200nm的液滴。CPC存在于油和水相之间的界面处。含有1％TBHC的Lamisil
Figure BPA00001278043200902
乳膏剂作为对照。
利用切下的人类尸体皮肤在改良的Franz扩散装置中进行体外研究。以100μl/cm2将1％TBHC/0.3％CPC NB-00Xb施用于两个同心玻璃圆筒包围的皮肤的5.27cm2同心的表面区域中。施用后24小时，通过擦拭给药区域除去残余的纳米乳剂。分离给药区域的表皮和真皮，称重并分析CPC和TBHC。内部非给药区域(内部区域)和中间非给药区域(中间区域)的8mm穿孔活检物以类似的方式处理。CPC和TBHC的定量通过使用独立的方法通过高效液相色谱法(HPLC)进行。可在中间和内部组织中检测CPC或TBHC的唯一方式是通过纳米乳剂渗透进入给药区域下方的皮肤，随后横向扩散到非给药区域。
14.1 实验
测试制剂
1％TBHC/0.3％NB-00Xb的制剂
本研究的纳米乳剂制剂包含：0.3％CPC(3％NB-001或3mg CPC/ml)和1％TBHC。通过首先将TBHC溶解在乙醇中然后与水混合，将TBHC掺入1％NB-00Xb(含有1％CPC)。将该溶液缓慢地加至1％纳米乳剂中并轻轻混合，获得包含0.3％纳米乳剂和1％TBHC的最终产品。最终制剂包含22％乙醇和57％的水。TBHC纳米乳剂的组成在表34中示出。
Figure BPA00001278043200911
Lamisil是商业上可获得的并且含有1％TBHC。利用正位移移液管，将测试制剂施加到扩散池的供应室的表皮表面。对于单次给药，施加527μL(例如，QD)。对于多次给药(例如，BID)，在初次给药之后8小时施加527μL。暴露的给药表皮表面积是5.27cm2。
人类尸体皮肤
获自Life Legacy组织库的75岁白种人雄性供体的人类尸体背腹部用于这项研究。将皮肤切成直径38mm的圆片，在组织提取之前记录每个池、每个给药区域和每个非给药区域的表皮和真皮的重量。将1％TBHC/0.3％NB-00Xb制剂和Lamisil
Figure BPA00001278043200913
在开始研究后0小时和8小时施加两次。
改良的扩散装置
这个实验设计类似于实施例13中所说明的。
扩散研究的参数在表35中列出。
Figure BPA00001278043200921
表皮和真皮的计算
TBHC和CPC渗透进入表皮、真皮和接受部区室(在首次剂量后24小时)的量通过HPLC测定。产生TBHC或CPC的标准浓度用于测定给药区域中TBHC或CPC的浓度。每个皮肤区域中CPC或TBHC的含量表示为：1)数量/湿组织重量(μg/克)±标准差；2)数量/表面积(μg/cm2)±标准差。
14.2.结果
表面施用后的TBHC含量
人类尸体皮肤表皮和人类尸体皮肤真皮的Lamisil和1％TBHC/0.3％NB-00Xb的渗透研究的结果分别在表36和表37中示出。在不同区室中(表皮和真皮)发现的1％TBHC/0.3％NB-00Xb递送的TBHC含量显著不同于Lamisil
Figure BPA00001278043200923
乳膏剂递送的TBHC含量。在24小时持续时间之后使用了Lamisil
Figure BPA00001278043200924
乳膏剂的表皮和真皮中发现的TBHC含量比使用了1％TBHC/0.3％NB-00Xb制剂的表皮和真皮中发现的TBHC含量低。
在由含有TBHC的NB-00Xb制剂处理的样品的外部、中间和内部表皮中发现的TBHC含量比由Lamisil
Figure BPA00001278043200931
乳膏剂处理的样品的同样区域(外部、中间、内部)中发现的TBHC含量分别高14、35和293倍(μg/g组织水平)。在1％TBHC/0.3％NB-00Xb制剂处理的样品的外部、中间和内部真皮中发现的TBHC含量比Lamisil乳膏剂处理的样品的相同区域(外部、中间、内部)的TBHC含量分别高27、28和115倍(μg/g组织水平)。并且，对于所有制剂，在24小时在中间和内部表面区域的表面拭子中发现的TBHC的量低于5μg/ml的检测水平，表明从给药区域到非给药区域没有测试物泄漏。
Figure BPA00001278043200934
  重复的次数   3   3   4   4
14.3.结论
含有盐酸特比萘芬的纳米乳剂的横向扩散数据表明，通过掺入纳米乳剂来递送TBHC导致第二活性剂横向扩散至远离给药区域11mm。因而，含其他活性剂的纳米乳剂组合物能够在人类指甲下方从邻近的皮肤位置扩散，该纳米乳剂组合物可被递送到邻近的位置(例如，指甲板的下方)并用于杀死引起甲真菌病的真菌。
对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的实质和范围的情况下，对本发明的方法和组合物作出各种改变和变化而是显而易见的。因而，本发明意在涵盖上述各种改变和变化，只要各种改变和变化落入附后的权利要求及其等同的范围之内。

Claims (29)

1.一种杀死有需要的人类受试者中的真菌、酵母菌或霉菌病原体或其组合的方法，所述方法包括将纳米乳剂局部或皮内施用于所述人类受试者，其中：
(a)所述纳米乳剂包含具有平均直径小于约1000nm的液滴；
(b)所述纳米乳剂液滴包含水相、至少一种油、至少一种表面活性剂和至少一种有机溶剂；和
(c)所述真菌、酵母菌或霉菌病原体选自：毛癣菌物种、表皮癣菌属物种、念珠菌属物种、小孢子菌属物种、曲霉属物种、拟青霉属物种、镰刀菌属物种、支顶孢属物种、毛壳菌属物种、茎点霉属物种、帚霉属物种、柱霉属物种、链格孢属物种、附球菌属物种、弯孢霉属物种或其任何组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中：
(a)所述毛癣菌属物种是红色毛癣菌、断发毛癣菌、须毛癣菌、苏丹奈斯毛癣菌、疣状毛癣菌、阿耶罗毛癣菌、同心性毛癣菌、马毛癣菌、意瑞奈斯毛癣菌、淡黄毛癣菌、光辉毛癣菌、趾间毛癣菌、麦格毛癣菌、豆形毛癣菌、许兰毛癣菌、猴毛癣菌、土毛癣菌、断发毛癣菌、范布鲁西米氏毛癣菌、紫色毛癣菌、杨德氏毛癣菌或其任何组合；
(b)所述表皮癣菌属物种是絮状表皮癣菌、斯托克表皮癣菌或其任何组合；
(c)所述念珠菌属物种是白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、乳酒念珠菌、高里念珠菌、杜氏念珠菌或其任何组合；
(d)所述小孢子菌属物种是犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、奥杜安小孢子菌、鸡禽小孢子菌、铁锈色小孢子菌、扭曲小孢子菌、矮小小孢子菌、库克小孢子菌、范布瑞西米小孢子菌或其任何组合；
(e)所述附球菌属物种是黑附球菌；
(f)所述曲霉属物种是聚多曲霉、土曲霉、黑曲霉、土曲霉、烟曲霉、黄曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉、花斑曲霉或其任何组合；
(g)所述拟青霉属物种是淡紫拟青霉、宛氏拟青霉或其任何组合；
(h)所述镰刀菌属物种是尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、半裸镰刀菌或其任何组合；
(i)所述毛壳菌属物种是C.atrobrunneum、粪生毛壳菌、球毛壳菌、C.strumarium、或其任何组合；
(j)所述帚霉属物种是短帚霉、S.candida、S.koningii、顶孢帚霉、黄帚霉、S.cinerea、S.trigonospora、布朗氏帚霉、S.chartarum、暗色帚霉、S.asperula或其任何组合；
(k)所述柱霉属物种是暗色柱霉、透明柱霉、S.infestans、日本柱霉、木生柱霉或其任何组合；
(l)所述链格孢属物种是交链格孢、A.chartarum、石竹链格孢、A.geophilia、感染链格孢、匍柄链格孢、极细链格孢或其任何组合；
(m)所述弯孢霉属物种是短孢弯孢霉、暗色弯孢霉、膝弯孢霉、新月弯孢霉、苍白弯孢霉、塞内加尔弯孢霉、疣状弯孢霉或其任何组合；或
(n)其任何组合。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中：
(a)所述真菌、酵母菌或霉菌感染选自：癣感染、皮肤癣菌病和皮肤癣菌瘤；
(b)所述真菌、酵母菌或霉菌感染选自：足癣、甲癣、圆癣、股癣、发癣、手癣、真菌角膜炎、面癣、花斑癣和须癣；或
(c)其任何组合。
4.如权利要求1到3任一项所述的方法，其中所述纳米乳剂液滴：
(a)具有的平均直径选自：小于约950nm、小于约900nm、小于约850nm、小于约800nm、小于约750nm、小于约700nm、小于约650nm、小于约600nm、小于约550nm、小于约500nm、小于约450nm、小于约400nm、小于约350nm、小于约300nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约100nm、大于约50nm、大于约70nm、大于约125nm和其任何组合；
(b)具有大于约125nm和小于约300nm的平均直径；
(c)经由滤泡途径利用毛孔和毛囊渗透进入表皮和真皮；
(d)扩散通过皮肤、毛孔、指甲、头皮、毛囊、损伤的皮肤、患病的皮肤、侧面或近端的皱褶、指甲、甲床或其任何组合；
(e)进入表皮、真皮或其组合；
(f)结合至真菌细胞表面，引起死亡、生长抑制、丧失致病性或其任何组合；
(g)杀死分生孢子、菌丝、单倍体酵母菌、二倍体酵母菌或其任何组合或抑制分生孢子、菌丝、单倍体酵母菌、二倍体酵母菌或其任何组合的生长；或
(h)其任何组合。
5.如权利要求1到4任一项所述的方法，其中，所述“局部”施用是施用于任何浅表皮肤结构、毛发、毛干、毛囊、眼睛或其任何组合。
6.如权利要求1到5任一项所述方法，其中，所述纳米乳剂包含：
(a)水相；
(b)约1％的油到约80％的油；
(c)约0.1％的有机溶剂到约50％的有机溶剂；
(d)以约0.001％表面活性剂到约10％表面活性剂的量存在的至少一种表面活性剂；
(e)约0.0005％到约1.0％的螯合剂；或
(f)其任何组合。
7.如权利要求1到6任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂包含：
(a)水相；
(b)约5％的油到约80％的油；
(c)约0.1％的有机溶剂到约10％的有机溶剂；
(d)以约0.1％到约10％的量存在的至少一种非离子表面活性剂；
(e)以约0.01％到约2％的量存在的至少一种阳离子试剂；
(f)约0.0005％到约1.0％的螯合剂；或
(g)其任何组合。
8.如权利要求1到7任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂：
(a)对真菌、酵母菌或霉菌病原体是抑真菌性的；
(b)对真菌、酵母菌或霉菌病原体是杀真菌性的；
(c)对真菌、酵母菌或霉菌病原体是治疗有效的；
(d)是杀真菌性的或抑真菌性的，并且对真菌分生孢子和菌丝或菌丝体或酵母菌单倍体或二倍细胞有效；
(e)向待治疗的病症提供真菌学的治愈；
(f)与常规的非纳米乳剂表面抗真菌治疗Penlac
Figure FPA00001278043100041
所提供真菌学治愈率相比，提供改善的真菌学治愈率；
(g)对所述人类受试者不是全身毒性的；或
(h)其任何组合。
9.如权利要求1到8任一项所述的方法，其中：
(a)所述纳米乳剂具有窄MIC(最小抑制浓度)值分布和窄MFC(最小杀真菌浓度)值分布；
(b)所述纳米乳剂的MIC和MFC相差小于或等于四倍，意味着所述纳米乳剂是杀真菌性的；
(c)所述纳米乳剂的MIC和MFC相差大于四倍，意味着所述纳米乳剂是抑真菌性的；或
(d)其任何组合。
10.如权利要求1到9任一项所述的方法，其中：
(a)所述生物体是毛癣菌属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(b)所述生物体是毛癣菌属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(c)所述生物体是表皮癣菌属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(d)所述生物体是表皮癣菌属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(e)所述生物体是犬小孢子菌，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至32μg阳离子试剂/ml；
(f)所述生物体是犬小孢子菌，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至128μg阳离子试剂/ml；
(g)所述生物体是念珠菌属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约32μg阳离子试剂/ml；
(h)所述生物体是念珠菌属物种，所述MFC为0.25μg阳离子试剂/ml至约128μg阳离子试剂/ml；
(i)所述生物体是曲霉属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(j)所述生物体是曲霉属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(k)所述生物体是拟青霉属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(l)所述生物体是拟青霉属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(m)所述生物体是支顶孢属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(n)所述生物体是支顶孢属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(o)所述生物体是毛壳菌属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(p)所述生物体是毛壳菌属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(q)所述生物体是茎点霉属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(r)所述生物体是茎点霉属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(s)所述生物体是帚霉属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(t)所述生物体是帚霉属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(u)所述生物体是镰刀菌属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(v)所述生物体是镰刀菌属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(w)所述生物体是柱霉属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(x)所述生物体是柱霉属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(y)所述生物体是链格孢属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml到约25μg阳离子试剂/ml；
(z)所述生物体是链格孢属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml到约100μg阳离子试剂/ml；
(aa)所述生物体是附球菌属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(bb)所述生物体是附球菌属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；
(cc)所述生物体是弯孢霉属物种，所述MIC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约25μg阳离子试剂/ml；
(dd)所述生物体是弯孢霉属物种，所述MFC为约0.25μg阳离子试剂/ml至约100μg阳离子试剂/ml；或
(ee)其任何组合。
11.如权利要求1到10任一项所述的方法，其中：
(a)所述纳米乳剂在约40℃和约75％相对湿度下稳定一段时间，所述一段时间选自：约1个月、约3个月、约6个月、约12个月、约18个月、约2年、约2.5年和约3年；
(b)所述纳米乳剂在约25℃和约60％相对湿度下稳定一段时间，所述一段时间选自：约1个月、约3个月、约6个月、约12个月、约18个月、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年和约5年；
(c)所述纳米乳剂在约4℃下稳定一段时间，所述一段时间选自：约1个月、约3个月、约6个月、约12个月、约18个月、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年、约5年、约5.5年、约6年、约6.5年和约7年；或
(d)其任何组合。
12.如权利要求1到11任一项所述的方法，其中，所述有机溶剂：
(a)选自：C1-C12醇类、二醇、三醇、二烷基磷酸酯、三烷基磷酸酯和其组合；
(b)选自：非极性溶剂、极性溶剂、质子溶剂、非质子溶剂、其半合成衍生物和其组合；
(c)是醇类，所述醇类选自：三-正丁基磷酸酯、乙醇、甲醇、异丙醇、甘油、中链甘油三酯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、乙酸、正丁醇、丁二醇、香料醇类、异丙醇、正丙醇、甲酸、丙二醇、甘油、山梨醇、工业用甲醇变性酒精、三乙酰甘油酯、己烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、1，4-二氧杂环、四氢呋喃、二氯甲烷、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酸、其半合成衍生物和其任何组合；和
(d)其任何组合。
13.如权利要求1到12任一项所述的方法，其中所述油是：
(a)任何化妆品或药学上可接受的油；
(b)非挥发性的；
(c)选自：动物油、植物油、天然油、合成油、烃类油、硅油和其半合成衍生物；
(d)选自：矿物油、角鲨烯油、香味油、硅油、精油、水不溶的维生素、异丙基硬脂酸酯、硬脂酸丁酯、辛基棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、十三烷酸山嵛酯、二异丙基己二酸酯、癸二酸二辛酯、薄荷基氨基苯甲酸酯、十六烷基辛酸酯、辛基水杨酸酯、十四烷酸异丙酯、新戊二醇二癸酸酯鲸蜡醇、Ceraphyls
Figure FPA00001278043100081
癸基油酸酯、二异丙基己二酸酯、C12-15烷基乳酸酯、十六烷基乳酸酯、月桂基乳酸酯、异硬脂醇新戊酸酯、十四烷基乳酸酯、异鲸蜡醇硬脂酰硬脂酸酯、辛基十二醇硬脂酰硬脂酸酯、烃类油、异链烷烃、流体石蜡、异十二烷、矿脂、摩洛哥坚果油、油菜油、辣椒油、椰子油、玉米油、棉花子油、亚麻籽油、葡萄籽油、芥子油、橄榄油、棕榈油、棕榈坚果油、花生油、松籽油、罂粟籽油、南瓜子油、米糠油、红花油、茶油、块菌油、植物油、杏(仁)油、希蒙德木油(加州希蒙得木种子油)、葡萄籽油、夏威夷果油、麦芽油、杏仁油、菜籽油、葫芦油、大豆油、芝麻油、榛子油、玉米油、向日葵油、大麻籽油、白檀香油、kuki坚果仁油、鳄梨油、核桃油、鱼油、刺柏子油、多香果油、桧油、籽油、杏仁籽油、茴香子油、芹菜子油、枯茗籽油、肉豆蔻籽油、叶油、罗勒叶油、月桂叶油、肉桂叶油、荔枝草叶油、桉树叶油、柠檬草叶油、白千层叶油、奥杜那干酪叶油、广藿香叶油、薄荷叶油、松叶油、迷迭香叶油、绿薄荷叶油、茶树叶油、百里香叶油、鹿蹄草叶油、花油、春黄菊油、鼠尾草油、丁香油、天竺葵花油、牛膝草花油、茉莉花油、熏衣草花油、松红梅花油、Marhoram花油、橙花油、玫瑰油、依兰树花油、栲皮油、肉桂皮油、桂皮油、黄樟树皮油、桐油、樟木油、柏木油、玫瑰木油、檀香油、地下茎(姜)桐油、松香油、兰丹油、没药油、果皮油、香柠檬果皮油、葡萄柚果皮油、柠檬皮油、石灰果皮油、橙皮油、柑桔皮油、根油、缬草油、油酸、亚油酸、油醇、异硬脂醇、其半合成衍生物和其任何组合；或
(d)其任何组合。
14.如权利要求1到13任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂包含挥发性油，其中：
(a)所述挥发性油是有机溶剂；
(b)除了有机溶剂之外还存在所述挥发性油；
(c)在硅氧烷成分中使用的所述挥发性油不同于油相中的油；或
(d)所述挥发性油是萜烯、单萜、倍半萜、排气剂、甘菊环烃、其半合成衍生物或其组合；
(e)所述挥发性油选自：萜烯、单萜、倍半萜、排气剂、甘菊环烃、薄荷醇、樟脑、侧柏酮、麝香草酚、橙花醇、芳樟醇、苎烯、香叶醇、紫苏子醇、橙花叔醇、法呢醇、依兰烯、没药醇、法呢烯、驱蛔萜、土荆芥油、香茅醛、柠檬醛、香茅醇、母菊奥、蓍草、愈创烯、甘菊、其半合成衍生物和其组合；或
(f)所述纳米乳剂包含硅氧烷成分，所述硅氧烷成分包含至少一种挥发性的硅氧烷油，其中所述挥发性的硅氧烷油可以是硅氧烷成分中的溶胶油，或所述挥发性的硅氧烷油可与其他硅氧烷和非硅氧烷油结合，其中所述其他油可以是挥发性的或非挥发性的；
(g)所述纳米乳剂包含硅氧烷成分，所述硅氧烷成分选自：甲基苯基聚硅氧烷、西甲硅氧烷、二甲基硅氧烷、苯基三甲基硅氧烷(或其有机改性的形式)、聚合硅氧烷的烷基衍生物、十六烷基二甲硅氧烷、月桂基三甲硅氧烷、聚硅氧烷的羟基化的衍生物，例如，二甲硅醇、挥发性硅氧烷油、环状和线性的硅氧烷、环甲硅氧烷、环甲硅氧烷的衍生物、六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、挥发性的线性二甲聚硅氧烷、异十六烷、异二十烷、异二十四烷、聚异丁烯、异辛烷、异十二烷、其半合成衍生物和其组合；或
(h)其任何组合。
15.如权利要求1到14任一项所述的方法，进一步包括：
(a)螯合剂；
(b)至少一种防腐剂；
(c)至少一种pH值调节剂；
(d)至少一种缓冲液；
(e)至少一种抗真菌剂；或
(f)其任何组合。
16.如权利要求15所示的方法，其中：
(a)所述螯合剂(i)以约0.0005％至约1.0％的量存在；(ii)选自：乙撑二胺、乙二胺四乙酸和二巯丙醇；(iii)是乙二胺四乙酸；(iv)或其任何组合；
(b)所述防腐剂选自：氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、苯甲醇、氯己定、咪唑基脲、苯酚、山梨酸钾、苯甲酸、溴硝丙二醇、氯甲酚、对羟苯甲酸酯、苯氧乙醇、山梨酸、α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟茴醚、丁基化羟基甲苯、抗坏血酸钠、二(p-氯苯基二胍)己烷、3-(-4-氯苯氧基)-丙烷-1，2-二醇、甲基和甲基氯异噻唑啉酮、焦亚硫酸钠、柠檬酸、依地酸，其半合成衍生物和其组合；氯苯甘醚(3-(-4-氯苯氧基)-丙烷-1，2-二醇)、Kathon CG(甲基和甲基氯异噻唑啉酮)、对羟基苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基对羟基苯甲酸酯)、苯氧乙醇(2-苯氧乙醇)、Phenonip(苯氧乙醇、甲基、乙基、丁基、丙基对羟基苯甲酸酯)、Phenoroc(0.73％苯氧乙醇，0.2％对羟基苯甲酸甲酯，0.07％对羟基苯甲酸丙酯)、Liquipar Oil(异丙基、异丁基、丁基对羟基苯甲酸酯)、Liquipar PE(70％苯氧乙醇，30％liquipar oil)、Nipaguard MPA(苯甲醇(70％)、甲基&丙基对羟基苯甲酸酯)、Nipaguard MPS(丙二醇、甲基&丙基对羟基苯甲酸酯)、Nipasept(甲基、乙基和丙基对羟苯甲酸酯)、Nipastat(甲基、丁基、乙基和丙基对羟基苯甲酸酯)、Elestab 388(丙二醇中的苯氧乙醇加氯苯甘醚和对羟基苯甲酸甲酯)和Killitol(7.5％氯苯甘醚和7.5％对羟基苯酸甲酯)；
(c)所述pH值调节剂选自：二乙醇胺、乳酸、单乙醇胺、三乙醇胺、氢氧化钠、磷酸钠，其半合成衍生物和其组合；
(d)所述缓冲液选自：2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、L-(+)-酒石酸、ACES、ADA、乙酸、乙酸铵溶液、碳酸氢铵、柠檬酸二铵、甲酸铵、草酸铵一水合物、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢钠铵四水合物、硫酸铵溶液、酒石酸二铵、BES缓冲盐水、BES、BICINE、BIS-TRIS、碳酸氢盐缓冲溶液、硼酸、CAPS、CHES、乙酸钙水合物、碳酸钙、柠檬酸三钙四水合物、柠檬酸盐浓缩溶液、含水的柠檬酸、二乙醇胺、EPPS、乙二胺四乙酸二钠盐二水合物、甲酸溶液、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly、甘氨酸、HEPES、咪唑、脂蛋白重折叠缓冲液、醋酸锂二水合物、柠檬酸三锂四水合物、MES水合物、MES一水合物、MES溶液、MOPS、乙酸镁溶液、乙酸镁四水合物、非水合柠檬酸三镁、甲酸镁溶液、磷酸氢二镁三水合物、草酸二水合物、PIPES、磷酸盐缓冲盐水、哌嗪、D-酒石酸氢钾、乙酸钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸二氢钾、柠檬酸三钾溶液、甲酸钾、草酸钾一水合物、磷酸氢二钾、用于分子生物学的无水的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾一水合物、邻苯二甲酸氢钾、酒石酸钠钾、酒石酸钠钾四水合物、四硼酸钾四水合物、四草酸钾二水合物、丙酸、STE缓冲液、STET缓冲液、5，5-二乙基巴比土酸钠、乙酸钠、乙酸钠三水合物、碳酸氢钠、酒石酸氢钠一水合物、碳酸钠十水合物、碳酸钠、柠檬酸二氢钠、柠檬酸三钠二水合物、甲酸钠溶液、草酸钠、磷酸氢二钠二水合物、磷酸氢二钠十水合物、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠二水合物、磷酸二氢钠一水合物、磷酸二氢钠溶液、焦磷酸二氢二钠、焦磷酸四钠十水合物、酒石酸二钠二水合物、酒石酸二钠溶液、四硼酸钠十水合物、TAPS、TES、TM缓冲溶液、TNT缓冲溶液、TRIS甘氨酸缓冲液、TRIS乙酸盐-EDTA缓冲溶液、TRIS缓冲盐水、TRIS甘氨酸SDS缓冲溶液、TRIS磷酸盐-EDTA缓冲溶液、Tricine、三乙醇胺、三乙胺、三乙基乙酸铵缓冲液、三乙基磷酸铵溶液、三甲基醋酸铵溶液、三甲基磷酸铵溶液、Tris-EDTA缓冲溶液、Trizma
Figure FPA00001278043100111
乙酸盐、Trizma
Figure FPA00001278043100112
碱、Trizma碳酸盐、Trizma
Figure FPA00001278043100114
盐酸盐、Trizma
Figure FPA00001278043100115
马来酸盐或其任何组合；
(e)除了所述纳米乳剂之外，所述抗真菌剂选自：(1)氮杂茂(咪唑)，(2)抗代谢物，(3)烯丙胺，(4)吗啉，(5)葡聚糖合成抑制物(化学物质家族：棘白菌素)，(6)聚烯，(7)benoxaaborale；(8)其他抗真菌/甲真菌病剂，和(9)新类型的抗真菌/甲真菌病剂；
(f)除了所述纳米乳剂之外，所述抗真菌剂选自：联苯苄唑、克霉唑、益康唑、咪康唑、噻康唑、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、普拉康唑、瑞扶康唑、泊沙康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶、特比萘芬、Naftidine、吗啉、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净、两性霉素B、制霉菌素、匹马菌素、灰黄霉素、环吡酮胺、AN2690、sodarin衍生物和尼柯霉素；或
(g)其任何组合。
17.如权利要求1到16任一项所述的方法，其中：
(a)所述表面活性剂选自：包含9到10个乙二醇单元的乙氧基化的壬基酚、包含8个乙二醇单元的乙氧基化的十一醇、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、乙氧基化的氢化蓖麻油、月桂基硫酸钠、环氧乙烷和环氧丙烷的二嵌段共聚物、环氧乙烷烯-环氧丙烷嵌段共聚物、基于环氧乙烷和环氧丙烷的四功能嵌段共聚物、甘油基单酯、甘油基癸酸酯、甘油基辛酸酯、甘油基椰油酸酯、甘油芥酸酯、甘油基羟基硬脂酸酯、甘油基异硬脂酸酯、甘油基羊毛脂酸酯、甘油基月桂酸酯、甘油基亚油酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基油酸酯、甘油基PABA、甘油基棕榈酸酯、甘油基蓖麻醇酸酯、甘油基硬脂酸酯、甘油基巯基乙酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二油酸脂、甘油基二肉豆蔻酸酯、甘油基二硬脂酸酯、甘油基倍半油酸酯、甘油基硬脂酸酯乳酸酯、聚氧乙烯十六烷基/硬脂酰基醚、聚氧乙烯胆固醇醚、聚氧乙烯月桂酸酯或二月桂酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或二硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯硬脂酰基醚、聚氧乙烯十四烷基醚、类固醇、胆固醇、β谷固醇、没药醇、醇的脂肪酸酯、十四烷酸异丙酯、脂肪-异丙基n-丁酸酯、异丙基n-己酸酯、异丙基n-癸酸酯、异丙基棕榈酸酯、辛基十二基肉豆蔻酸酯、烷氧基化的醇类、烷氧基化的酸、烷氧基化的酰胺、烷氧基化的糖类衍生物、天然油和蜡的烷氧基化的衍生物、聚氧乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物、壬苯醇醚-14、PEG-8月桂酸酯、PEG-6可可酰胺、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、PEG40羊毛脂、PEG-40蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪醚、甘油基二酯、聚氧乙烯硬脂酰基醚、聚氧乙烯十四烷基醚和聚氧乙烯月桂基醚、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、甘油基二硬脂酸酯、其半合成衍生物和其混合物；
(b)所述表面活性剂是非离子脂质，选自：甘油基月桂酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、其半合成衍生物和其混合物；
(c)所述表面活性剂是聚氧乙烯脂肪醚，所述聚氧乙烯脂肪醚具有约2个到约100个基团的聚氧乙烯头部基团；
(d)所述表面活性剂是具有如下式I所示的结构的烷氧基化的醇：
R5--(OCH2CH2)y--OH      式I
其中R5是具有约6到约22个碳原子的分支或不分支的烷基基团，y为约4至约100，优选地为约10至约100；
(e)所述表面活性剂是烷氧基化的醇，所述烷氧基化的醇是羊毛脂醇的乙氧基化的衍生物；
(f)所述表面活性剂是非离子型，并且选自：壬苯醇醚-9、乙氧基化的表面活性剂、乙氧基化的醇类、乙氧基化的烷基酚、乙氧基化的脂肪酸、乙氧基化的单烷醇酰胺、乙氧基山梨糖醇酐酯、乙氧基化脂肪氨基、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、二(聚乙二醇二[咪唑羰基])、Brij
Figure FPA00001278043100131
35、Brij56、Brij
Figure FPA00001278043100133
72、Brij76、Brij
Figure FPA00001278043100135
92V、Brij
Figure FPA00001278043100136
97、Brij
Figure FPA00001278043100137
58P、Cremophor
Figure FPA00001278043100138
EL、十乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、n-癸基α-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、n-十二烷酰-N-甲基葡糖酰胺、n-十二烷基α-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十四烷基醚、七乙二醇单十二烷基醚、正十六烷基β-D-麦芽糖苷、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油烯基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、来自皂树皮的皂角苷、Span
Figure FPA00001278043100139
20、Span
Figure FPA000012780431001310
40、Span60、Span
Figure FPA000012780431001312
65、Span
Figure FPA000012780431001313
80、Span85、Tergitol、Tergitol15-S-12型、Tergitol15-S-30型、Tergitol 15-S-5型、Tergitol 15-S-7型、Tergitol15-S-9型、Tergitol NP-10型、Tergitol NP-4型、Tergitol NP-40型、Tergitol NP-7型、Tergitol NP-9型、Tergitol TMN-10型、Tergitol TMN-6型、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、TritonX-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、Triton X-207、Triton X-114、Triton X-165、Triton X-305、Triton X-405、Triton X-45、Triton X-705-70、TWEEN
Figure FPA00001278043100141
20、TWEEN
Figure FPA00001278043100142
21、TWEEN
Figure FPA00001278043100143
40、TWEEN60、TWEEN
Figure FPA00001278043100145
61、TWEEN
Figure FPA00001278043100146
65、TWEEN
Figure FPA00001278043100147
80、TWEEN
Figure FPA00001278043100148
81、TWEEN
Figure FPA00001278043100149
85、泰洛沙泊、N-十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407、泊洛沙姆105苯甲酸盐、泊洛沙姆182、二苯甲酸酯、其半合成衍生物和其组合；
(g)所述表面活性剂是阳离子型，选自：季铵化合物、烷基三甲基氯化铵化合物、二烷基二甲基氯化铵化合物、苯扎氯铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、氯化十六烷基吡啶、二甲基二十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、Girard′s试剂T、十六烷基三甲基溴化铵、N，N′，N-聚氧乙烯(10)-N-牛羊脂-1，3-二氨基丙烷、溴苄嘧棕胺、三甲基(十四烷基)溴化铵、1，3，5-三嗪-1，3，5(2H，4H，6H)-三乙醇、1-癸基铵、N-癸基-N，N-二甲基-氯化物、二癸基二甲基氯化铵、2-(2-(p-(二异丁基)甲酚)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、2-(2-(p-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、烷基1或3苯甲基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉氯化物、烷基二(2-羟乙基)苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(100％C12)、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(50％C14、40％C12、10％C16)、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(55％C14，23％C12，20％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(41％C14，28％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(47％C12，18％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(55％C16，20％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(58％C14，28％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(60％C14，25％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61％C11，23％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61％C12、23％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(65％C12，25％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(67％C12，24％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(67％C12、25％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(90％C14、5％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(93％C14、4％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(95％C16、5％C18)、烷基二癸基二甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-18)、二烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵(90％C14、5％C16、5％C12)、烷基二甲基乙基溴化铵(混合的烷基和烯基基团，如在大豆油的脂肪酸中一样)、烷基二甲基乙基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基苄基氯化铵(60％C14)、烷基二甲基异丙基苄基氯化铵(50％C12、30％C14、17％C16、3％C18)、烷基三甲基氯化铵(58％C18、40％C16、1％C14、1％C12)、烷基三甲基氯化铵(90％C18、10％C16)、烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵(C12-18)、二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基甲基苯甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、二异癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基二(2-羟乙基)辛基氯化氢铵、十二烷基二甲基苯甲基氯化铵、十二烷基氨基甲酰基甲基二甲基苯甲基氯化铵、十七基羟基乙基咪唑啉氯化物、六氢-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三嗪、Myristalkonium氯化物(和)Quat RNIUM 14、N，N-二甲基-2-羟基丙基铵氯化物聚合物、n-十四烷基二甲基苯甲基氯化铵一水合物、辛基癸基二甲基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苯甲基氯化铵、氧基二乙烯基二(烷基二甲基氯化铵)、三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵、三甲氧基甲硅烷基季铵盐、三甲基十二烷基苄基氯化铵、其半合成衍生物和其组合；
(h)所述表面活性剂是阴离子型，选自：羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸钠盐、胆酸、牛或绵羊胆汁、去氢胆酸、去氧胆酸、去氧胆酸甲酯、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多库酯钠盐、甘氨鹅去氧胆酸钠盐、甘氨胆酸水合物，合成的甘氨胆酸钠盐水合物、合成的甘氨去氧胆酸一水合物、甘氨去氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸酸乙酯、N-十二烷基肌氨酸钠盐、N-十二烷基肌氨酸溶液、十二烷基硫酸锂、Lugol溶液、4型Niaproof 4、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二烷基磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、2-溴乙烷磺酸钠、胆酸钠水合物、络胆酸钠、去氧胆酸钠、去氧胆酸钠一水合物、十二烷基硫酸钠、无水己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、无水戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、牛磺去氧胆酸钠盐一水合物、牛磺猪去氧胆酸钠盐水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛磺熊去氧胆酸钠盐、Trizma十二烷基硫酸盐、熊去氧胆酸、其半合成衍生物和其组合；
(i)所述表面活性剂是两性离子型，选自：N-烷基甜菜碱、月桂基氨基丙基二甲基甜菜碱、烷基二甲基氨基乙酸、N-烷基氨基丙酸酯、CHAPS(最小值98％)、CHAPS(最小98％)、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基十八烷基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基辛基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基棕榈基铵)丙烷磺酸盐、其半合成衍生物和其组合；
(j)所述表面活性剂是聚合的，所述聚合表面活性剂选自：具有至少一个聚环氧乙烷(PEO)侧链的聚(甲基丙烯酸甲酯)主干的接枝共聚物、聚羟基硬脂酸、烷氧基化的烷基酚甲醛缩合物、具有脂肪酸疏水物的聚亚烷基二醇修饰的聚酯、聚酯、其半合成衍生物和其组合；或
(k)其任何组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中：
(a)所述烷氧基化的醇类是R5是月桂基基团、y平均值为23的物质；或
(b)羊毛脂醇的乙氧基化的衍生物是laneth-10，其是乙氧基化平均值为10的羊毛脂醇的聚乙二醇醚。
19.如权利要求1到18任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂：
(a)包含至少一种阳离子表面活性剂；
(b)包含氯化十六烷基吡啶阳离子表面活性剂；
(c)包含阳离子表面活性剂，其中所述阳离子表面活性剂的浓度小于约5.0％和大于约0.001％；
(d)包含阳离子表面活性剂，其中所述阳离子表面活性剂的浓度选自：小于约5％、小于约4.5％、小于约4.0％、小于约3.5％、小于约3.0％、小于约2.5％、小于约2.0％、小于约1.5％、小于约1.0％、小于约0.90％、小于约0.80％、小于约0.70％、小于约0.60％、小于约0.50％、小于约0.40％、小于约0.30％、小于约0.20％、小于约0.10％、大于约0.001％、大于约0.002％、大于约0.003％、大于约0.004％、大于约0.005％、大于约0.006％、大于约0.007％、大于约0.008％、大于约0.009％和大于约0.010％；或
(e)其任何组合。
20.如权利要求1到19任一项所述的方法，其中：
(a)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂；
(b)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中所述非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂；
(c)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中所述非阳离子表面活性剂是聚山梨酸酯非离子表面活性剂；
(d)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂是聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80；
(e)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中所述非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂的浓度为约0.05％到约10％、约0.05％到约7.0％、约0.1％到约7％或约0.5％到约4％；
(f)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，其中所述阳离子表面活性剂的浓度为约0.05％到约2％或约0.01％到约2％；或
(g)其任何组合。
21.如权利要求1到20任一项所述的方法，其中，所述水存在于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
22.如权利要求1到21任一项所述的方法，其中：
(a)将所述纳米乳剂在单次施用中局部或皮内施用；
(b)将所述纳米乳剂局部或皮内施用每周至少一次、每周至少两次、每天至少一次、每天至少两次、每天多次、每周多次、双周地、每月至少一次或其任何组合；
(c)将所述纳米乳剂局部或皮内施用一段时间，所述一段时间选自：约一周、约两周、约三周、约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月、约七个月、约八个月、约九个月、约十个月、约十一个月、约一年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年和约5年；
(d)将所述纳米乳剂局部施用，随后洗涤施用区域来除去任何残余的纳米乳剂；或
(e)其任何组合。
23.如权利要求1到22任一项所述的方法，其中所述纳米乳剂在人类受试者中不被全身吸收，或在人类受试者中非常少的所述纳米乳剂被全身吸收，其中，通过检测出所述受试者的血浆中所述纳米乳剂中存在的一种或一种以上表面活性剂小于10ng/mL，确定没有这样的吸收，或存在最小的吸收。
24.如权利要求23所述的方法，其中：
(a)检测出所述受试者的血浆中所述纳米乳剂中存在的一种或一种以上表面活性剂小于5ng/mL；
(b)检测出所述受试者的血浆中所述纳米乳剂中存在的一种或一种以上表面活性剂小于3ng/mL；
(c)检测出所述受试者的血浆中所述纳米乳剂中存在的一种或一种以上表面活性剂小于2ng/mL；
(d)所述受试者的血浆中所述纳米乳剂中存在的一种或一种以上表面活性剂的可测量量低于分析检测限。
25.如权利要求1到24任一项所述的方法，其中在治疗之后，
(a)获得阴性的真菌、酵母菌和/或霉菌培养物；
(b)获得阴性的氢氧化钾(KOH)测试；或
(c)其组合。
26.如权利要求1到25任一项所述的方法，其中：
(a)在所述纳米乳剂局部施用之后，所述纳米乳剂被封闭或半封闭；
(b)在所述纳米乳剂局部施用之后，所述纳米乳剂被封闭或半封闭，所述封闭或半封闭通过将绷带、聚烯烃薄膜、衣物、不可渗透隔挡层或半不可渗透隔挡层覆盖到局部制剂上进行；
(c)所述纳米乳剂以物体或载体的形式局部施用，所述物体或载体例如，绷带、插入物、注射器样敷涂器、阴道栓剂、粉剂、滑石粉或其他固体、溶液、液体、喷雾剂、气雾剂、软膏剂、泡沫、乳膏剂、凝胶、膏剂、洗液、微胶囊、生物粘附凝胶、香波、清洁剂(驻留和洗去产品)、喷雾器或其组合；
(d)所述纳米乳剂是控制释放剂型、持续释放剂型、立即释放剂型或其任何组合；或
(e)其任何组合。
27.如权利要求1到26任一项所述的方法，其中：
(a)所述感染是人类指甲、甲床、指甲基质、指甲板或其组合的感染；
(b)指甲周围的组织感染是甲沟炎；
(c)指甲周围的组织感染是慢性甲沟炎；或
(d)其任何组合。
28.如权利要求27所述的方法，其中在治疗之后，观察到部分或全部指甲感染被清除。
29.如权利要求28所述的方法，其中：
(a)在治疗六周之后，受试者显示了与基线相比未受影响的指甲线性生长增加；
(b)在治疗12周之后，受试者显示了与基线相比未受影响的指甲线性生长增加；
(c)在治疗18周之后，受试者显示了与基线相比未受影响的指甲线性生长增加；
(d)在治疗24周之后，受试者显示了与基线相比未受影响的指甲线性生长增加；
(e)在治疗六周之后，受试者显示了与基线相比受影响面积减小；
(f)在治疗12周之后，受试者显示了与基线相比受影响面积减小；
(g)在治疗18周之后，受试者显示了与基线相比受影响面积减小；
(h)在治疗24周之后，受试者显示了与基线相比受影响面积减小；或
(i)其任何组合。
CN2009801229072A 2008-04-25 2009-04-27 治疗真菌、酵母和霉菌感染的纳米乳剂 Pending CN102065851A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4807508P 2008-04-25 2008-04-25
US61/048,075 2008-04-25
US12996208P 2008-08-01 2008-08-01
US61/129,962 2008-08-01
US11587908P 2008-11-18 2008-11-18
US61/115,879 2008-11-18
PCT/US2009/041811 WO2009132342A1 (en) 2008-04-25 2009-04-27 Nanoemulsions for treating fungal, yeast and mold infections

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102065851A true CN102065851A (zh) 2011-05-18

Family

ID=41043966

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801229072A Pending CN102065851A (zh) 2008-04-25 2009-04-27 治疗真菌、酵母和霉菌感染的纳米乳剂

Country Status (7)

Country Link
US (2) US8226965B2 (zh)
EP (1) EP2293787A1 (zh)
JP (1) JP2011518844A (zh)
CN (1) CN102065851A (zh)
AU (1) AU2009240389A1 (zh)
CA (1) CA2722445A1 (zh)
WO (1) WO2009132342A1 (zh)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102397379A (zh) * 2011-11-19 2012-04-04 西北农林科技大学 一种复方水包油型黄柏油纳米乳组合物
CN102600178A (zh) * 2012-03-08 2012-07-25 西北农林科技大学 一种复方盐酸布替萘芬纳米乳及其制备方法
CN102716127A (zh) * 2012-07-05 2012-10-10 南京正宽医药科技有限公司 一种治疗真菌感染的外用药物制剂
CN103330933A (zh) * 2013-04-26 2013-10-02 江苏豪森药业股份有限公司 含有米卡芬净或其盐的药物组合物
CN103845725A (zh) * 2012-11-30 2014-06-11 上海医药工业研究院 一种更稳定的卡泊芬净组合物
CN103933545A (zh) * 2014-05-14 2014-07-23 深圳市红瑞生物科技有限公司 治疗真菌感染的药物及其制备方法
CN104013558A (zh) * 2014-06-25 2014-09-03 厦门金泰生物科技有限公司 一种湿巾杀菌防腐复配液、制备方法及其用途
CN104738032A (zh) * 2015-02-12 2015-07-01 河南科技学院 一种氯甲酚纳米乳消毒剂及其制备方法
CN107427465A (zh) * 2015-02-05 2017-12-01 马克·赛尔纳尔 离子型纳米囊泡悬浮液和从其制备的生物杀灭剂
CN107475123A (zh) * 2017-08-16 2017-12-15 中国人民解放军第二军医大学 金线莲内生真菌及其应用
CN107929438A (zh) * 2017-11-27 2018-04-20 内蒙古东达生物科技有限公司 一种治疗兔子真菌病的药物组合物、兔子饲料及制备方法
CN108524499A (zh) * 2018-07-13 2018-09-14 佛山市南海东方澳龙制药有限公司 百里香酚、非泼罗尼及盐酸特比萘芬的组合物的应用、动物皮肤病防治用药及其制备方法
CN109169653A (zh) * 2018-10-24 2019-01-11 湖北荷普药业股份有限公司 一种阳离子复合消毒液及其应用
CN110613684A (zh) * 2019-10-16 2019-12-27 李丽丽 一种泊沙康唑纳米乳及其制备方法
CN110753698A (zh) * 2017-01-31 2020-02-04 奇达拉治疗公司 用于治疗真菌感染的方法
CN110840865A (zh) * 2019-11-26 2020-02-28 青岛大学附属医院 橙花叔醇在制备用于治疗真菌性角膜炎的药物中的应用
CN111655237A (zh) * 2018-01-02 2020-09-11 西尼克斯公司 包覆于脂质体中的三萜类抗真菌剂的可注射组合物
CN112798729A (zh) * 2020-12-30 2021-05-14 海南海神同洲制药有限公司 一种硝酸舍他康唑的杂质检测方法
CN113633699A (zh) * 2021-09-10 2021-11-12 贵州省水产研究所 一种防治鱼类肤霉病的生化制剂配方及其制备方法

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9814422B2 (en) 2007-08-06 2017-11-14 The Regents Of The University Of California Compositions for solubilizing cells and/or tissue
CN102065851A (zh) * 2008-04-25 2011-05-18 纳米生物公司 治疗真菌、酵母和霉菌感染的纳米乳剂
WO2010036938A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Nanobio Corporation Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
US8101593B2 (en) 2009-03-03 2012-01-24 Kythera Biopharmaceuticals, Inc. Formulations of deoxycholic acid and salts thereof
US20110305646A1 (en) * 2009-03-20 2011-12-15 Jon Lenn Fatty acid monoglyceride compositions
US9023374B2 (en) * 2009-10-02 2015-05-05 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Sanitizing compositions
US20130052255A1 (en) * 2010-05-03 2013-02-28 Spenco Medical Corporation Nail discoloration and fungus treatment
US20130052256A1 (en) * 2010-05-03 2013-02-28 Spenco Medical Corporation Nail discoloration and fungus treatment
US20120019062A1 (en) * 2010-07-26 2012-01-26 Hui Wing-Kin Power head for above ground pools
JP6131194B2 (ja) * 2011-01-24 2017-05-17 アンテリオス， インコーポレイテッド 皮膚科学的症状を処置するためのエンプティナノ粒子組成物およびその使用
CA2827643C (en) 2011-02-18 2019-05-07 Kythera Biopharmaceuticals, Inc. Treatment of submental fat
MX344607B (es) 2011-03-02 2016-12-20 Pibed Ltd Composición química con peróxido de hidrógeno y una nanoemulsión de alcoholes de cadena larga.
MX2013015434A (es) * 2011-06-22 2014-10-14 Vyome Biosciences Pvt Ltd Profarmacos antifungicos y antibacterianos a base de conjugado.
US10307167B2 (en) 2012-12-14 2019-06-04 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10314594B2 (en) 2012-12-14 2019-06-11 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10813630B2 (en) 2011-08-09 2020-10-27 Corquest Medical, Inc. Closure system for atrial wall
EP2747779A4 (en) 2011-08-22 2015-04-08 Nanobio Corp VACCINE AGAINST HERPES SIMPLEX VIRUS IN THE FORM OF NANOEMULSION
WO2013032189A2 (ko) * 2011-08-26 2013-03-07 (주)다미화학 발효 식물성 오일 및 이를 포함하는 조성물
US9561271B2 (en) 2011-09-09 2017-02-07 Nanobio Corporation Nanoemulsion respiratory syncytial virus (RSV) subunit vaccine
US20130078705A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Hsuehkuan Lu Protease for treating nail abnormalities
CN102357121A (zh) * 2011-10-31 2012-02-22 姚尧 治疗灰指甲的外用药物
WO2013064360A2 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Unilever N.V. A personal cleaning composition
JP2015500819A (ja) * 2011-12-06 2015-01-08 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ 抗菌性組成物
WO2013172832A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 The Regents Of The University Of California Compositions for solubilizing cells and/or tissue
AU2013204604B2 (en) * 2012-05-30 2016-05-19 Biodiem Limited Method of treating Scedosporium spp. infection
CN102764276A (zh) * 2012-07-14 2012-11-07 徐生富 一种治疗花斑癣的糊状药物
WO2014059008A1 (en) 2012-10-09 2014-04-17 The Procter & Gamble Company Method of identifying or evaluating beneficial actives and compositions containing the same
EP2906197A1 (en) 2012-10-09 2015-08-19 The Procter & Gamble Company Method of identifying synergistic cosmetic combinations
US20140142689A1 (en) 2012-11-21 2014-05-22 Didier De Canniere Device and method of treating heart valve malfunction
CN103830726A (zh) * 2012-11-23 2014-06-04 魏维 抗微生物有机纳米组合物及其制备方法
DK3366677T3 (da) 2013-02-08 2020-09-28 Gen Mills Inc Fødevareprodukter med reduceret natriumindhold
SG11201507867RA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Purdue Research Foundation Antimicrobial compositions and methods of use
JP6589086B2 (ja) * 2013-04-12 2019-10-16 ビョーメ セラピューティクス リミテッド 抗菌薬の組成物および製剤、その製造法および微生物感染症の治療方法
GB2517778B (en) 2013-09-02 2015-08-05 Robert Anthony William Scoones Cleaning liquid
US9566443B2 (en) 2013-11-26 2017-02-14 Corquest Medical, Inc. System for treating heart valve malfunction including mitral regurgitation
RU2546001C1 (ru) * 2014-04-04 2015-04-10 Юлия Ивановна Коршикова Состав для ухода за кожей стоп, обладающий противогрибковыми свойствами
US10842626B2 (en) 2014-12-09 2020-11-24 Didier De Canniere Intracardiac device to correct mitral regurgitation
WO2016105289A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Duzgun Baris The anti cancerous, antiparasite (toxoplasma gondii (protozon) and antimicrobial effect and dosage of ginger (zingiber officinale) extract
CN104474550A (zh) * 2014-12-30 2015-04-01 广西医科大学 一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法
CA2973698A1 (en) * 2015-01-12 2016-07-21 Arno Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inhibiting fungal infections
US10406132B2 (en) 2015-03-09 2019-09-10 The Children's Mercy Hospital Dermatophytosis prophylaxis and treatment
ES2754586T3 (es) * 2015-03-19 2020-04-20 Valent Biosciences Llc Formulaciones en suspensión de natamicina concentradas
US11617724B2 (en) 2015-05-21 2023-04-04 Dermavant Sciences GmbH Topical pharmaceutical compositions
AU2016263161B2 (en) 2015-05-21 2019-02-28 Dermavant Sciences GmbH Topical pharmaceutical compositions
KR101760500B1 (ko) 2015-06-03 2017-07-31 강원대학교산학협력단 차나무 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 구강 캔디다증을 예방 또는 치료하기 위한 구강용 조성물
US11173197B2 (en) 2015-07-07 2021-11-16 Bluewillow Biologics, Inc. Methods and compositions for nanoemulsion vaccine formulations
KR101818811B1 (ko) 2015-08-20 2018-01-15 롯데케미칼 주식회사 신규한 캔디다 파라프실로시스 us01 미생물 및 이의 용도
WO2017047299A1 (ja) * 2015-09-15 2017-03-23 富士フイルム株式会社 注射用液剤組成物
AU2016377340B2 (en) * 2015-12-22 2019-10-31 3M Innovative Properties Company Methods for spore removal
JP6799373B2 (ja) * 2015-12-28 2020-12-16 学校法人帝京大学 洗口液
WO2017147145A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-31 The Regents Of The University Of California Macrocyclic polyphenols for universal coatings
US20180289421A1 (en) * 2017-04-05 2018-10-11 Terimber Corporation Systems and methods for treating nail fungus
CN107811969B (zh) * 2016-09-14 2021-09-03 阿赖耶识（上海）生物技术有限公司 一种高稳定性的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗真菌感染中的应用
CN111684066B (zh) * 2017-01-05 2024-03-08 国立大学法人东北大学 环状肽化合物合成相关基因、使用该基因的环状肽化合物制造方法以及具有该基因的转化体
BR112019013612B1 (pt) 2017-01-31 2022-08-09 Kimberly-Clark Worldwide, Inc Método para inibir o crescimento bacteriano em um produto, composição antibacteriana, e, lenço.
RU2638798C1 (ru) * 2017-03-06 2017-12-15 Александр Владимирович Локарев Гель противогрибкового действия (варианты)
US11318179B2 (en) * 2017-06-20 2022-05-03 Jessica Kado Topical formulation for binding to dermatological cannabinoid receptors
KR102658501B1 (ko) * 2017-09-26 2024-04-19 존슨 앤드 존슨 컨수머 인코포레이티드 박테리아 생물막과 관련된 아토피성 피부염 및 감염을 치료하고 예방하기 위한 국소 조성물 및 방법
US10959975B1 (en) 2017-11-02 2021-03-30 The Tetra Corporation Antifungal composition, method of making composition, and method of using composition
KR102267872B1 (ko) * 2017-11-30 2021-06-24 지오라 토파즈 파우더 코팅 (2007) 엘티디. 용액 내 실리콘 나노와이어 및 플레이트의 무전해 제조
CN110478504A (zh) * 2017-12-29 2019-11-22 堂美环境治理有限公司 用于净化基本封闭的空间的系统
US11369578B2 (en) 2018-11-15 2022-06-28 Bluewillow Biologics, Inc. Persistent topical antimicrobial compositions and methods of using the same
CA3119836A1 (en) * 2018-11-15 2020-05-22 Bluewillow Biologics, Inc. Nanoemulsion compositions having enhanced permeability
JP2021021028A (ja) * 2019-07-30 2021-02-18 株式会社カネカ ゴムグラフト共重合体の製造方法
WO2021022045A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Ecolab Usa Inc. Personal protective equipment free delimer compositions
GB201919234D0 (en) * 2019-12-23 2020-02-05 Jvs Products Ltd Compositions
WO2021155390A1 (en) * 2020-01-14 2021-08-05 Shaman Naturals, Llc. Antimicrobial compositions
WO2021188518A1 (en) * 2020-03-17 2021-09-23 Bluewillow Biologics, Inc. Persistant topical antimicrobial compositions and methods of using the same
WO2022035309A1 (en) * 2020-08-14 2022-02-17 Universiti Putra Malaysia Nano emulsion composition having antimicrobial properties

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003000243A1 (en) * 2001-06-25 2003-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
WO2005027872A2 (en) * 2003-06-04 2005-03-31 Nanobio Corporation Compositions for inactivating pathogenic microorganisms, methods of making the compositions, and methods of use thereof
US20070036831A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-15 Nanobio Corporation Nanoemulsion compositions having anti-inflammatory activity

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4895452A (en) * 1988-03-03 1990-01-23 Micro-Pak, Inc. Method and apparatus for producing lipid vesicles
US5103497A (en) * 1989-11-14 1992-04-07 Hicks John W Flying spot endoscope
US6015832A (en) * 1997-12-31 2000-01-18 The Regents Of The University Of Michigan Methods of inactivating bacteria including bacterial spores
WO2000050006A2 (en) 1999-02-26 2000-08-31 Chiron Corporation Microemulsions with adsorbed macromoelecules and microparticles
US6506803B1 (en) * 1999-04-28 2003-01-14 Regents Of The University Of Michigan Methods of preventing and treating microbial infections
US6559189B2 (en) * 1999-04-28 2003-05-06 Regents Of The University Of Michigan Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use
US7767216B2 (en) * 1999-04-28 2010-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial compositions and methods of use
US6616922B2 (en) * 2001-03-27 2003-09-09 The Dial Corporation Antibacterial compositions
US7314624B2 (en) * 2001-06-05 2008-01-01 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
US20050208083A1 (en) * 2003-06-04 2005-09-22 Nanobio Corporation Compositions for inactivating pathogenic microorganisms, methods of making the compositons, and methods of use thereof
WO2005030172A1 (en) 2003-09-24 2005-04-07 The Regents Of The University And Methods Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
CA2604392A1 (en) * 2005-04-11 2006-10-19 Nanobio Corporation Quaternary ammonium halides for treatment of infectious conditions
KR102110379B1 (ko) * 2005-12-01 2020-05-14 유니버시티 오브 메사츄세츠 로웰 보툴리눔 나노에멀젼
CN102065851A (zh) * 2008-04-25 2011-05-18 纳米生物公司 治疗真菌、酵母和霉菌感染的纳米乳剂

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003000243A1 (en) * 2001-06-25 2003-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
WO2005027872A2 (en) * 2003-06-04 2005-03-31 Nanobio Corporation Compositions for inactivating pathogenic microorganisms, methods of making the compositions, and methods of use thereof
US20070036831A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-15 Nanobio Corporation Nanoemulsion compositions having anti-inflammatory activity

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TERRY JONES, ET AL: "Safety, tolerance, and pharmacokinetics of topical nanoemulsion (NB-002) for the treatment of onychomycosis", 《JOURNAL OF THE AMERICAN ACADEMY OF DERMATOLOGY》 *

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102397379B (zh) * 2011-11-19 2014-07-09 西北农林科技大学 一种复方水包油型黄柏油纳米乳组合物
CN102397379A (zh) * 2011-11-19 2012-04-04 西北农林科技大学 一种复方水包油型黄柏油纳米乳组合物
CN102600178A (zh) * 2012-03-08 2012-07-25 西北农林科技大学 一种复方盐酸布替萘芬纳米乳及其制备方法
CN102716127A (zh) * 2012-07-05 2012-10-10 南京正宽医药科技有限公司 一种治疗真菌感染的外用药物制剂
CN103845725A (zh) * 2012-11-30 2014-06-11 上海医药工业研究院 一种更稳定的卡泊芬净组合物
CN103330933B (zh) * 2013-04-26 2015-08-05 江苏豪森药业股份有限公司 含有米卡芬净或其盐的药物组合物
CN103330933A (zh) * 2013-04-26 2013-10-02 江苏豪森药业股份有限公司 含有米卡芬净或其盐的药物组合物
CN103933545A (zh) * 2014-05-14 2014-07-23 深圳市红瑞生物科技有限公司 治疗真菌感染的药物及其制备方法
CN104013558A (zh) * 2014-06-25 2014-09-03 厦门金泰生物科技有限公司 一种湿巾杀菌防腐复配液、制备方法及其用途
CN107427465A (zh) * 2015-02-05 2017-12-01 马克·赛尔纳尔 离子型纳米囊泡悬浮液和从其制备的生物杀灭剂
CN104738032A (zh) * 2015-02-12 2015-07-01 河南科技学院 一种氯甲酚纳米乳消毒剂及其制备方法
CN110753698A (zh) * 2017-01-31 2020-02-04 奇达拉治疗公司 用于治疗真菌感染的方法
CN107475123A (zh) * 2017-08-16 2017-12-15 中国人民解放军第二军医大学 金线莲内生真菌及其应用
CN107475123B (zh) * 2017-08-16 2020-02-11 中国人民解放军第二军医大学 金线莲内生真菌及其应用
CN107929438A (zh) * 2017-11-27 2018-04-20 内蒙古东达生物科技有限公司 一种治疗兔子真菌病的药物组合物、兔子饲料及制备方法
CN111655237A (zh) * 2018-01-02 2020-09-11 西尼克斯公司 包覆于脂质体中的三萜类抗真菌剂的可注射组合物
CN111655237B (zh) * 2018-01-02 2023-02-03 西尼克斯公司 包覆于脂质体中的三萜类抗真菌剂的可注射组合物
CN115998684A (zh) * 2018-01-02 2023-04-25 西尼克斯公司 包覆于脂质体中的三萜类抗真菌剂的可注射组合物
CN108524499A (zh) * 2018-07-13 2018-09-14 佛山市南海东方澳龙制药有限公司 百里香酚、非泼罗尼及盐酸特比萘芬的组合物的应用、动物皮肤病防治用药及其制备方法
CN109169653A (zh) * 2018-10-24 2019-01-11 湖北荷普药业股份有限公司 一种阳离子复合消毒液及其应用
CN109169653B (zh) * 2018-10-24 2020-09-29 湖北荷普药业股份有限公司 一种阳离子复合消毒液及其应用
CN110613684A (zh) * 2019-10-16 2019-12-27 李丽丽 一种泊沙康唑纳米乳及其制备方法
CN110840865A (zh) * 2019-11-26 2020-02-28 青岛大学附属医院 橙花叔醇在制备用于治疗真菌性角膜炎的药物中的应用
CN112798729A (zh) * 2020-12-30 2021-05-14 海南海神同洲制药有限公司 一种硝酸舍他康唑的杂质检测方法
WO2022142151A1 (zh) * 2020-12-30 2022-07-07 海南海神同洲制药有限公司 一种硝酸舍他康唑的杂质检测方法
CN113633699A (zh) * 2021-09-10 2021-11-12 贵州省水产研究所 一种防治鱼类肤霉病的生化制剂配方及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2293787A1 (en) 2011-03-16
AU2009240389A1 (en) 2009-10-29
US20120276182A1 (en) 2012-11-01
AU2009240389A8 (en) 2011-05-26
US20090269380A1 (en) 2009-10-29
JP2011518844A (ja) 2011-06-30
WO2009132342A1 (en) 2009-10-29
CA2722445A1 (en) 2009-10-29
US8226965B2 (en) 2012-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102065851A (zh) 治疗真菌、酵母和霉菌感染的纳米乳剂
US20090269394A1 (en) Methods and compositions for treating onchomycosis
CN102083415A (zh) 用于治疗疱疹病毒感染的方法
CN109689034A (zh) 协同抗真菌组合物及其方法
Maheshwari et al. Ethosomes and ultradeformable liposomes for transdermal delivery of clotrimazole: a comparative assessment
CA3162675C (en) Topical roflumilast formulation having antifungal properties
US20120064136A1 (en) Anti-aging and wrinkle treatment methods using nanoemulsion compositions
JP2011518844A5 (zh)
US20100226983A1 (en) Compositions for treatment and prevention of acne, methods of making the compositions, and methods of use thereof
WO2017216722A2 (en) Synergistic antifungal compositions and methods thereof
CN102159202A (zh) 施用局部抗真菌制剂治疗真菌感染的方法
Wu et al. Progress of polymer-based strategies in fungal disease management: Designed for different roles
Shahid et al. Ketoconazole-loaded cationic nanoemulsion: in vitro–ex vivo–in vivo evaluations to control cutaneous fungal infections
US20190022040A1 (en) Valproate as a topical anti-fungal treatment
Patley et al. Development And Characterization Of Antifungal Potential Of Topical Emulgel Formulation Of Tolnaftate.
TW201127393A (en) Ophthalmic pharmaceutical composition in the dosage form of a low-irritating and translucent emulsion for the treatment of topical immunomodulator with anti-inflammatory effect of the eye or the surrounding or associated tissues thereof
Shilpa Shyam et al. A REVIEW OF FLUCONAZOLE LOADED TRANSETHOSOMAL GEL FOR CANDIDIASIS
Khan et al. A Review On Beyond Conventional: Itraconazole Niosomal Gel As A Novel Approach For Candida Albicans Management
Narain et al. Onychomycosis
Patil Formulation and evaluation of novel styling ketoconazole hair gel
CN107184551A (zh) 一种利拉萘酯双粒径分布乳剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110518