CN102061271A - 一种干酪乳杆菌细菌素及其在饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干酪乳杆菌细菌素及其在饲料中的应用。本发明所提供的干酪乳杆菌分离自青藏高原传统发酵酸牦牛乳中，其产生的细菌素经硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶过滤及RP-HPLC层析得到。该细菌素对热、酸稳定，可被蛋白酶降解，抑菌谱广。将细菌素添加到饲料中，可抑制细菌的生长，具有作为饲料添加剂应用的良好前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株干酪乳杆菌产的细菌素及其在饲料中的应用。
背景技术
乳酸菌细菌素(Bacteriocins of LAB)是指乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的一类具有抑菌活性的蛋白质、多肽或前体多肽(Klaenhammer，TR.Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria.FEMS.Microbiology Review[J].1993.12：39～85)，在抑制多种病原微生物和食物腐败菌等方面具有重要意义。
近十年来我国畜牧业持续稳定发展，已经成为国民经济的支柱产业。我国肉、蛋类居世界第一；奶类居世界第五。然而兽药及饲料添加剂在促进了养殖业生产发展的同时，带来的负面影响也是相当严重，如饲料添加剂在动物产品中的残留量过高而严重影响人类健康。近年来，国内大量发生的“β-兴奋剂”中毒、红心鸭蛋、多宝鱼和三聚氰胺等事件，无不表明保证食品饲料安全，绿色无公害的极端重要性，这不仅关系到养殖业的健康发展，而且直接关系着人类的身心健康、社会的稳定与发展的重大问题。
随着对天然微生物抗菌物的研究的逐步深入，国内外学者发现细菌素是一种良好的抗生素替代物。细菌素由于其具有对多种病原微生物具有很好的抑菌活性，又无抗原活性，无毒、无副作用、无残留、无抗药性、在动物体内不产生蓄积性的积累，因此国外在2000年以前就将细菌素广泛地应用于食品、化妆品、饲料等，取得了非常好的效果。
由于细菌素本身具有许多优良性质：具有较好的选择性杀菌效果，因而不仅适用于一般性饲料，也可适用于生物饲料等；易被人体消化道中的一些蛋白酶(如胰蛋白酶)所降解，不会在动物体内蓄积而引起不良反应，同时也不污染环境；具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏；对饲料的口感、味等无不良影响；同时它的使用可以降低饲料的杀菌温度，减少热处理时间，从而保持饲料原有的营养价值和风味。总之细菌素不仅具有与抗生素饲料添加剂相似的有益作用，而且无毒、无副作用、无残留、无抗药性并具有良好的扩散性，同时也不污染环境，所以细菌素必将逐步发展，并在饲料中得到广泛的应用。
细菌素作为抗生素替代物在饲料中的应用有着巨大的应用空间，但目前国内外的学者对细菌素的应用研究还处在起步阶段，商业化产品还很有限，因此亟待大规模的开发利用。在食品安全的今天，细菌素作为一种高效安全的饲料添加剂已经成为可能，随着研发的深入，细菌素最终将真正替代抗生素为人类生产绿色食品。
发明内容
本发明的目的是提供一株产细菌素的干酪乳杆菌。该干酪乳杆菌于2010年8月9日由位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC M 2010197，分类命名为：干酪乳杆菌lyT-7（Lactobacillus casei lyT-7）。
本发明所提供的干酪乳杆菌lyT-7是从青藏高原传统发酵的酸牦牛乳中分离得到。在MRS固体培养基上，菌落为圆形、乳白色的光滑菌落。菌体为短杆状，链状排列。根据如下生理生化特征：能利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、山梨醇和甘露醇，葡萄糖发酵产酸不产气，MR实验为阳性，H2S实验、吲哚实验、V-P试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、精氨酸产氨实验和硝酸盐还原实验均为阴性。经形态学生理生化特征及16S rDNA序列分析鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
本发明的第二个目的是提供一种细菌素。
本发明所提供的细菌素是发酵干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7得到的细菌素。
所述方法中用于培养干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7的培养基为改良MRS培养基，成分组成为：大豆蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5g、葡萄糖20.0g、K2HPO42.0g、柠檬酸二铵2.0g、乙酸钠5.0g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.4H2O 0.25g、吐温80 1ml、琼脂15.0g，pH自然，蒸馏水1000mL。(凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].中国轻工业出版社.1999)
所述方法中的培养条件为30℃，静止培养48h.
具体的，本发明的干酪乳杆菌细菌素可通过如下方法获得，但不限于此。
所述方法中得到的细菌素可以按以下方法进行分步纯化：
第一步，将按所述培养方法得到的发酵液离心，取上清液，向该上清液中加入硫酸铵至终饱和度50％，进行盐析；然后离心取沉淀，得到细菌素沉淀物；将细菌素沉淀物装入截流量为1000的透析袋中，在纯水中透析，用聚乙二醇浓缩，得到细菌素粗提物。
第二步，按上述方法得到的细菌素按照以下方法进行进一步纯化：将该细菌素粗提物进一步采用Sephadex G-100凝胶柱层析进行纯化，所述层析条件为：用0.01mol/L pH5.0的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为3min/mL，收集保留时间为180mim-460min的蛋白峰为细菌素活性峰；将收集到的细菌素样品进行RP-HPLC分离，制备条件为：以水(含0.1％三氟乙酸)∶乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，采用梯度洗脱的条件为：在0-35min乙腈的浓度由10％逐步增加到45％，收集保留时间为20min-25min的蛋白峰为细菌素活性峰。
本发明的干酪乳杆菌细菌素也可通过其他常规方法纯化，如吸附法(Yang，R.G.，Monty，C.， Johnson，E.Novel method extract amountsof bacteriocins from Lactic acid bacteria，Appl Environ.Microbiol[J].1992，58(10)：3353～3359)；有机溶剂法(Cheeseman，G.C.and Berridge，N.J.An improved meehod of preparingnisin，biochem J[J].1957 65：603～608)；柱层析法(Wilimowska-pelc，A.The use of Gel-filtratlon for the isolation of purc Nisin from commercial products，Microbiological Polonica[J].1976(1)：71～77)等。
按所述方法得到的细菌素粗提物，对热、酸稳定，在121℃条件下处理20min，仍能保持较好的抑菌活性；在pH2.0-11.0的范围内保持稳定；可被蛋白酶降解，经蛋白酶K及胰蛋白酶作用后，抑菌活性完全消失，被胃蛋白酶作用后，活性下降85％。该细菌素抑菌谱广，可抑制大肠杆菌(E.coli)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhim uriu)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，枯草芽孢杆菌(B.subtili)，蜡状芽孢杆菌(B.cereus)，保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)，嗜酸乳杆菌(L..acidoph ilus)，黄曲霉(A.flavus)。
本发明的第三个目的是将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)细菌素在饲料中应用。
将按所述方法的第一步得到的细菌素粗提物测定其抑菌效价为13095IU/mL，将其添加到饲料中，当每1000g饲料中加入有效抑菌物质的量在2.5mg-10.0mg的范围内，能明显抑制细菌的生长，且随着添加剂量的增大，抑菌效果增强。
附图说明
图1是饲料在常规储放条件下的抑菌效果
图2是饲料在强化储放条件下的抑菌效果
具体实施方式
实施例1 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7产细菌素的分离纯化
1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7的抑菌活性分析
抑菌活性分析方法：在600λ的入射光条件下，将指示菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)菌悬液的光密度值调为0.120，倾注于15mL LB固体培养基，用直径为7mm的打孔器在培养基上打孔，加入干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7的发酵上清液，在室温下扩散30min，在30℃条件下培养16-18小时，观察抑菌圈。
将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7接入改良MRS培养液中，其成分为：大豆蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5g、葡萄糖20.0g、K2HPO4 2.0g、柠檬酸二铵2.0g、乙酸钠5.0g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.4H2O 0.25g、吐温80 1ml、琼脂15.0g，pH自 然，蒸馏水1000mL。在30℃静止培养48h，8000rpm离心4min，得到发酵上清液。将发酵上清液进行以下实验：
(1)排除酸的影响：用1M/L的NaOH溶液将发酵上清液的pH调至5.0，做抑菌实验。
(2)排除过氧化氢的影响：将发酵上清液在80℃下水浴处理10min，做抑菌试验。
(3)蛋白酶敏感性实验：将排除酸及过氧化氢影响后的发酵上清液中加入蛋白酶k处理1h，做抑菌试验。
经过上述1-2步处理后，发酵上清液仍有活性；经过上述第3步处理后抑菌活性消失，初步判断干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7产生的抑菌物质属于细菌素。
2、细菌素的分离、纯化
其产生细菌素的最佳培养条件为30℃静止培养48h，将得到的发酵液经8000rpm离心4min，得到发酵上清液。向该上清液中加入硫酸铵至终饱和度50％，进行盐析；然后离心取沉淀，得到细菌素沉淀物；将细菌素沉淀物装入街流量为1000的透析袋中，在纯水中透析，用聚乙二醇浓缩，得到细菌素粗提物。将该细菌素粗提物进一步采用Sephadex G-100凝胶柱层析进行纯化，所述层析条件为：用0.01mol/L pH5.0的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为3min/mL，收集保留时间为180mim-460min的蛋白峰为细菌素活性峰；将收集到的细菌素样品进行RP-HPLC分离，制备条件为：以水(含0.1％三氟乙酸)∶乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度(Teixeira，M.L.，Cladera-Olivera，F.，Santos，J.，Brandelli，A.Purification and characterization of a peptide from Bacillus licheniformis showing dual antimicrobial and emulsifying activities.Food Research International[J]，2008，10：1064-1070)洗脱，采用梯度洗脱的条件为：在0-35min乙腈的浓度由10％逐步增加到45％，收集保留时间为20-25min的蛋白峰为细菌素活性峰。
3、细菌素的抑菌谱
测试菌株为大肠杆菌(E.coli)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhim uriu)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，枯草芽孢杆菌(B.subtill)，蜡状芽孢杆菌(B.cereus)，保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)，嗜酸乳杆菌(L.acidoph ilus)，黄曲霉(A.flavus)，产黄青霉(P.chrysogenum)，总状毛霉(M.racemosus)，白地霉(G.candidum)。
取发酵上清液采用步骤2抑菌活性分析方法，对11株指示菌进行了抑菌测试。实验结果如表1所示。
表1 干酪乳杆菌lyT-7发酵上清液的抑菌谱
4、细菌素抑菌特性研究
(1)热稳定性实验：将细菌素粗提物在60℃(水浴)，80℃(水浴)，100℃(水浴)，121℃(高压)条件下保持20min，测定抑菌活性。结果如表2所示，在不同的处理温度条件下，粗提物的抑菌活性几乎不发生变化，在121℃条件下处理20min后抑菌效果略有下降，但仍具有明显的抑菌活性。说明lyT-7产生的抑菌物质有良好的热稳定性。
表2 不同处理温度对粗提物抑菌活性的影响
孔的直径为7mm
(2)酸碱稳定性实验：用1mol/L NaOH和1mol/L HCl将样品的pH分别调至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，在室温条件下保持1h。再将pH值调回pH5.0后测定抑菌活性的变化，以pH6.0条件下处理1h后的抑菌效果为对照，测定抑菌活性，结果如表所示。结果如表3所示，粗提物在pH3.0至9.0之间处理1h后抑菌活性基本保持不变，在pH2.0和11.0的条件下处理1h后抑菌效果有所减退。
表3 不同处理pH对粗提物抑菌活性的影响
孔的直径为7mm
(3)酶敏感性实验：在样品中分别加入蛋白酶K(1.5mg/mL)，胰蛋白酶(1.5mg/mL)和胃蛋白酶(1.5mg/mL)，调节pH值至各蛋白酶的最适作用pH值(蛋白酶K pH值7.6，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶pH值7.0)，37℃下水浴1h，再将pH调到5.0，以在相同条件下处理的未加蛋白酶的样品为对照，测定抑菌活性的变化。结果显示粗提物经过蛋白酶K和胰蛋白酶消解后，抑菌活性完全丧失；经过胃蛋白酶消解后，抑菌率仅为发酵上清液的15％。
实施例2 细菌素粗提物在饲料中的应用
将粗提物进行平板抑菌实验，测定抑菌圈直径并根据抑菌圈标准曲线换算出粗提物中有效成分的效价为13095IU/mL。
猪饲料配方：粉末饲料配方：玉米粉58％，麦麸17％，豆饼20％，鱼粉4％，骨粉0.5％，食盐0.5％
按每1000g饲料中加入粗提物有效抑菌成分2.5mg(Tc1)，5mg(Tc2)，10mg(Tc3)。分别在在自然环境下(室温，湿度为85％)和恶化条件(高温、高湿37℃，湿度90％以上)储放，以未加任何抑菌物质的饲料做空白对照(CKc)，每隔7天对样品进行细菌计数。结果发现细菌素粗提物在所述条件下能有效抑制微生物的生长。
Claims (9)
1.一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，保藏名称为干酪乳杆菌lyT-7，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010197。其特征在于：在MRS固体培养基上菌落为圆形，乳白色的光滑菌落。
2.一种生产干酪乳杆菌细菌素的方法，是发酵干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7，得到细菌素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：用于培养干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)lyT-7的培养基有下属成分组成：大豆蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5g、葡萄糖20.0g、K2HPO4 2.0g、柠檬酸二铵2.0g、乙酸钠5.0g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.4H2O0.25g、吐温80 1ml、琼脂15.0g，pH自然，蒸馏水1000mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中的培养条件为30℃，静止培养48h.
5.根据权利要求2至5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中得到的细菌素按照以下方法进行初步纯化：将按所述培养方法得到的发酵液离心，取上清液，向该上清液中加入硫酸铵至终饱和度50％，进行盐析；然后离心取沉淀，得到细菌素沉淀物；将细菌素沉淀物装入街流量为1000的透析袋中，在纯水中透析，用聚乙二醇浓缩，得到细菌素粗提物。
6.根据权利要求2至6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中得到的细菌素按照以下方法进行进一步纯化：将该细菌素粗提物进一步采用Sephadex G-100凝胶柱层析进行纯化，所述层析条件为：用0.01mol/L pH5.0的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为3min/mL，收集保留时间为180mim-460min的蛋白峰为细菌素活性峰；将收集到的细菌素样品进行RP-HPLC分离，制备条件为：以水(含0.1％三氟乙酸)∶乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度[10]洗脱，采用梯度洗脱的条件[6、11、12]为：在0-35min乙腈的浓度由10％逐步增加到45％，在35-45min乙腈的浓度由45％回调为10％，收集保留时间为20min-25min的蛋白峰为细菌素活性峰。
7.由权利要求2至7中任一所述的方法及已知常规方法得到的该细菌素或含该细菌素的干酪乳杆菌发酵液。
8.权利要求2至5的方法及已知常规方法得到的细菌素或含该细菌素的干酪乳杆菌发酵液在饲料中的应用。
9.权利要求7所述的细菌素或含该细菌素的干酪乳杆菌发酵液在制备饲料添加剂中的应用。
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