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CN102061103A - 一类氟化硼络合二吡咯甲川染料、制备方法及其应用 - Google Patents

一类氟化硼络合二吡咯甲川染料、制备方法及其应用 Download PDF

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CN102061103A
CN102061103A CN2009102625656A CN200910262565A CN102061103A CN 102061103 A CN102061103 A CN 102061103A CN 2009102625656 A CN2009102625656 A CN 2009102625656A CN 200910262565 A CN200910262565 A CN 200910262565A CN 102061103 A CN102061103 A CN 102061103A
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CN
China
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pyrroles
dyestuff
methine
fluorescence
reaction
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CN2009102625656A
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Inventor
彭孝军
王东川
樊江莉
王丽
孙世国
张剑洲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian University of Technology
Zhuhai Ninestar Management Co Ltd
Original Assignee
Dalian University of Technology
Zhuhai Ninestar Management Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一类氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，该荧光染料具有通式I：
Figure 200910262565.6_AB_0
式中：R1、R2、R3、R5、R6、R7各自为H或C1-8烷基；R8为结构式X、Y、Z或P的基团；M为H、Na、K、N(R9R10R11R12)或N-琥珀酰亚胺基，其中R9、R10、R11、R12各自为H、C1-8烷基、或带有取代基-OH、醚键、或羧基的C1-8烷基。该染料由取代吡咯直接与酸酐反应而合成，具有良好的光物理特性、稳定性和细胞穿透能力和细胞内的溶解能力，尤其适用于生物荧光分析和生物标记。

Description

一类氟化硼络合二吡咯甲川染料、制备方法及其应用 
技术领域
本发明涉及可用于生物荧光分析领域的一类新型氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料、及其制备方法和应用。 
背景技术
荧光分析技术作为一种传统的分析方法，特别是近年来随着新型荧光分析技术的出现与应用而得到了长足的发展。这些新技术具有灵敏度高、选择性好、取样量少、方法快速简便等优点，已成为多种研究领域中进行痕量和超痕量甚至分子水平上分析的一种重要工具。荧光分析方法可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供研究对象的微观结构信息。 
众所周知，对蛋白质和DNA等生物大分子进行定性分析和定量测定是生物化学和生命科学中经常涉及的分析内容，建立高灵敏度、低检测限的荧光探针定量测定的方法仍具有重要意义；另外，在DNA测序、蛋白质标记、新药研发、细胞内组织成分测定、生物药代跟踪与分析及疾病发病机理研究等领域无不涉及到现代荧光分析检测技术。而荧光染料作为荧光分析技术中的前提条件，其性能的优劣将直接影响甚至决定整个荧光检测的灵敏度、可靠性和实用价值。因此，开发性能优异、适合生物荧光分析应用的荧光染料显得尤其重要。 
一般来讲，适合荧光分析应用的荧光染料通常要具备以下主要性质： 
一、染料的荧光量子产率较高，最好应该大于0.5。荧光量子产率高将有助于提高检测的灵敏度，使检测极限维持在较低浓度的水平。荧光量子产率的高低是衡量一个荧光染料优良与否的最重要因素之一。 
二、染料应该具有较长的最大吸收和发射波长，最好在可见光区。因为生物体内存在很多的有机共轭小分子，例如嘌呤、嘧啶、各种氨基酸，蛋白质分子等，他们在紫外区域都有吸收和发射光谱，如果荧光染料的吸收波长在紫外或者较短波长区域，将会降低荧光探针的灵敏度；并且某些干扰分子的自发荧光会掩盖探针的发射光谱，容易使检测的结果出现偏差；另外，紫外激发光照射在生物组织 内而造成的散射光也对荧光的检测灵敏度构成了很大障碍。 
三、荧光染料应该具有较高的稳定性。无论是在光照下、酸碱条件下，还是在较高温度下，染料的化学性质应该稳定：不会发生严重的光氧化现象，不会在酸碱条件有较小改变的状况下光谱发生较大的波动，当然也不应该在稍高的温度下就迅速地发生分解。 
四、染料分子应该具有较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能力。只有这样才能够设计出适合在细胞中应用的荧光探针。染料分子既要有一定的油溶性又要有一定的水溶性，油溶性是为了便于穿透细胞膜，水溶性是为了有助于在细胞内很好的分散。染料分子的这两种性质可以通过引入合适的亲水性或者亲油性基团来调节。 
五、染料基团对生物体应该没有或者仅有极小的毒害。这就要求荧光探针只对特定的靶标发生作用，而不应该由于自身结构的原因而对细胞内其它活性组织产生破坏作用，否则就失去了荧光探针的生物应用价值。而作为荧光探针重要组成部分的荧光团当然对细胞的毒害作用要小，尽量不要干扰细胞的活性。 
在常用的荧光染料中，芘类与香豆素类荧光染料吸收波长较短，在生物分析中不利于提高检测的灵敏度；菁染料虽然具有较长的发射波长，但其光稳定性较差，荧光量子产率也较低。因此，开发具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料，仍然是荧光分析技术发展的关键。 
氟化硼络合二吡咯甲川(简称BODIPY)类荧光染料是近二十几年才发展起来并受到广泛重视的一类新型荧光化合物。由于BODIPY类荧光染料具有：荧光量子产率高、摩尔消光系数大、光谱性质非常稳定(不易受到溶剂极性和pH值的影响)、染料的荧光光谱峰宽较窄及光稳定性较好等非常优异的理化性能，最近几年来在生物分子荧光标记、核酸检测、病理分析及细胞显像等诸多领域得到了大量应用。而合成具有特定活性基团，如氨基，羧基，羟基及特定识别基团等新的活性衍生物，是这类荧光染料在生物化学及生命科学等领域进一步应用的基础。 
对应用于生物分析领域的荧光染料，通常是在荧光染料的母体引入带羧基的活性官能团，并通过N-羟基丁二酰亚胺活化后，直接用于生物分子或生命有机体中进行分析检测。 
例如：有文献报道在BODIPY染料母体结构的侧面2号位置引入脂肪链羧 酸，合成路线达六步之多，产率只有12％，生产成本很高。[参见Ludmila A.Alexandrova和Marina K.Kukhanova等人发表于Bioconjugate Chem，2007；18：886-93.的文章“New Triphosphate Conjugates Bearing Reporter Groups：Labelingof DNA Fragments for Microarray Analysis”]。 
另外，Niko等人通过含有自由羧基的吡咯与另一分子的取代吡咯发生不对称缩合，最终生成带有活性羧基的BODIPY类荧光染料，但此方法原料很难合成，且整个反应进程也不易操作，收率也较低。参见Niko J.Meltola，Rina Wahlroos，和Aleksi E.Soini.发表于J.Fluorescence.Vol.14，No.5，635-647的文章。 
发明内容
综上所述，本行业内需求采用方便易行的新方法来合成新型的带有羧酸活性基团的BODIPY类荧光染料，促进该类染料更快更好的应用于生物荧光分析领域。 
本发明运用取代吡咯与不同的酸酐反应，简单可行地合成了一系列新型的带有羧酸活性基团的BODIPY类荧光染料。反应步骤简单，几步反应一锅完成，条件温和，产率较高。 
本发明方法不同于传统的利用醛类或酰氯类化合物与取代吡咯反应制备该系列染料的合成方法，而是采用酸酐直接与取代吡咯反应，并且对合成方法进行了改进和优化，从而使产率最高达到25％。 
合成的染料具有下面的通式I： 
Figure G2009102625656D00031
式中： 
R1-R3和R5-R7各自为H或C1-8的烷基； 
R8为结构式X、Y、Z或P的基团； 
M为H、Na、K、N(R9R10R11R12)或N-琥珀酰亚胺基 其中R9、R10、R11和R12各自为H、C1-8烷基、或带OH、醚键、羧基等取代基团的C1-8的烷基。 
本发明通式I染料的合成方法包括如下步骤： 
(1)取代吡咯与有机二元酸酐发生缩合，在缩合过程中，两分子的取代吡咯与一分子酸酐进行缩合，其中一分子的取代吡咯为具有取代基R1、R2和R3的吡咯，另一分子的取代吡咯为具有取代基R5、R6和R7的吡咯，所述有机二元酸酐选自：丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或邻苯二甲酸酐；吡咯与酸酐反应原料的投料摩尔比为0.5-10∶1，反应温度控制在15-120℃，反应得到产物二吡咯甲川结构化合物； 
(2)将得到的二吡咯甲川结构化合物再与三氟化硼化合物发生反应，并加入有机胺中和剂，脱掉氟化氢后形成通式I化合物，然后提纯；所述的三氟化硼化合物选自：气态三氟化硼、三氟化硼的乙醚络合物、或其他能够在常温溶液状态下释放出三氟化硼的化合物；反应温度为-10℃-100℃；三氟化硼化合物的摩尔加入量为二吡咯甲川结构化合物的摩尔量的0.1-10倍。 
其反应式如下所示： 
Figure G2009102625656D00042
本发明合成的含有羧酸或羧酸衍生物的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，具有良好的光物理特性，包括：较高的荧光量子产率及摩尔消光系数，窄的发射带宽，良好的光稳定性，对溶剂及环境影响较小等。荧光量子产率介于0.6-0.8，最大紫外吸引及荧光发射波长分别在495±10nm和510±10nm，斯托克斯位移在10-20nm之间。而且具有很好的稳定性和细胞穿透能力和细胞内的溶解能力，对生物体几乎没有毒害。非常适用于荧光分析，尤其生物荧光分析和生物标记。 
当荧光染料II、III或IV中的M为氢质子时，由于羧酸基的存在使得该类染料在低浓度(1×10-5M)时没有自聚现象的发生，溶液澄清且具有明亮的绿色荧光，染料完全分散于水介质中。这一现象大大拓展了该类染料的应用领域。 
当荧光染料II、III或IV中的R1＝R3＝R5＝R7＝H时，它们在水中具有极高的光稳定性。 
附图说明
图1为从不同角度观察到的实施例3的染料IVa的单晶衍射结构图(为清楚起见，省略氢原子标注及部分原子注示)。 
图2为含有羧酸的BODIPY染料在二氯甲烷中的最大紫外吸收光谱，显示了本发明实施例1的染料IIa、实施例2的染料IIIa、实施例3的染料IVa、实施例4的染料IIIb、和实施例5的染料IVb，在二氯甲烷中的最大吸收曲线。横坐标表示吸收波长，单位为纳米；纵坐标表示相对吸收强度(已做归一化处理)；染料摩尔浓度为1×10-5M，样品浓度为2×10-6M。为示区别，用不同的曲线来标明。 
图3为含有羧酸的BODIPY染料在二氯甲烷中的荧光发射光谱，显示了本发明实施例中的染料IIa、IIIa、IVa、IIIb和IVb在二氯甲烷中的荧光发射曲线。横坐标表示波长，单位为纳米；纵坐标表示相对荧光强度(已做归一化处理)；染料摩尔浓度为2×10-6M，样品浓度为1×10-5M。为示区别，用不同的曲线来标明。 
图4为例举出的含有羧酸的BODIPY染料在乙腈中的光稳定性测试对比，为本发明实施例中的染料IIa、IIIa、IVa、IIIb和IVb在乙腈介质中的光稳定性测试。染料摩尔浓度为1×10-5M，样品浓度为1×10-5M，横坐标表示光照时间，单位为小时；纵坐标表示剩余吸收百分比，以初始吸收强度为1进行计算；箭头表示染料随着光照时间的增加而吸收强度减弱的趋势。 
图5为例举出的含有羧酸的BODIPY染料在去离子水中(含0.1％的乙醇)的光稳定性测试对比，为本发明染料IIa、IIIa、IVa、IIIb和IVb在去离子水介质中(含有0.1％的乙醇)的光稳定性测试。染料摩尔浓度为1×10-5M，样品浓度为1×10-5M，横坐标表示光照时间，单位为小时；纵坐标表示剩余吸收百分比，以初始吸收强度为1进行计算；箭头表示染料随着光照时间的增加而吸收强度减弱的趋势。 
图6是本发明的染料分子IIIa经N-羟基丁二酰亚胺活化后，直接用于BSA标记的垂直板聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质电泳实验图。自左至右BSA与活化染料IIIa-NHS(1×10-4M)的摩尔浓度比依次为1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶100；电泳时间为1.5小时；缓冲体系为pH＝8.7的硼酸-硼砂的缓冲液(SDS 2.5％，蔗糖1％)；采用上海天能凝胶成像系统(Tanon GIS 2010)进行拍照。图中上面一条白色点为已标记上BSA的荧光染料电泳迁移带；最下面为未标记上BSA的活性染料 IIIa-NHS及失活变质的染料IIIa的电泳迁移带。 
图7表示在不同pH值下活化染料IIIa-NHS标记BSA的结果分析曲线图。图中横坐标表示不同的pH值；纵坐标表示蛋白标记结束后电泳带的相对荧光强度(Int)大小(由上海天能凝胶成像系统(Tanon GIS 1D)分析软件进行数据记录并计算得出)。 
图8表示活化染料IIIa-NHS标记BSA后相对荧光强度随pH值变化趋势图。图中横坐标表示不同的pH值；纵坐标表示蛋白标记结束后电泳带的相对荧光强度(Int)(由上海天能凝胶成像系统(Tanon GIS 1D)分析软件进行数据记录并计算得出)与面积(Pix)的乘积。 
图9表示染料IIIb活化后生成IIIb-NHS标记BSA时最佳反应摩尔比的实验结果图。此图为凝胶电泳分离标记后染料与BSA的效果图，图中白色荧光点是活化染料与BSA共价结合后的电泳带，每个电泳带代表不同的IIIb-NHS/BSA标记摩尔比，自左至右依次为：10∶1；15∶1；20∶1；25∶1；30∶1。 
图10是活化染料IVb活化后生成IVb-NHS标记BSA时对标记检测限的考察结果图。图中白色荧光点是活化染料与BSA共价结合后的电泳带，每个电泳带采用不同的BSA用量。其最优化的标记条件为：活化染料的摩尔浓度为0.8×10-9mol时，当硼酸-硼砂缓冲体系pH为9.0、标记反应温度40℃、反应时间40min时，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续(10％的浓缩胶与5％的分离胶)分离，当BSA的投入量自左至右分别为：10ng；30ng；50ng和0.2ug时，其荧光标记的检测限可达10-8g。 
图11染料IIIa的活化衍生物IIIa-NHS的单晶结构示意图(为方便观看，省略晶体结构中的氢原子的标注)。 
具体实施方式
在本发明的通式I染料中，R1-R3和R5-R7各自为H或C1-8的烷基，优选为H或C1-6的烷基，更优选为H或C1-4的烷基。再优选为H。 
R8为结构式X、Y、Z或P的基团，优选结构式X、Y或Z的基团。 
M为H、Na、K、N(R9R10R11R12)或N-琥珀酰亚胺基，优选H、Na、K、或N(R9R10R11R12)，更优选H、Na或K。 
R9、R10、R11、R12各自为H、C1-8烷基、或带OH、醚键、羧基等基团的C1-8的烷基。更优选各自为H或C1-6烷基，再优选各自为H或C1-4烷基。 
Figure G2009102625656D00071
在上述通式I的染料中，优选结构式II、III或者IV的染料： 
Figure G2009102625656D00072
在式II中：R1＝R3＝R5＝R7＝H；在式III和IV中：R1、R3、R5、R7各自为H或者CH3；其中M的含义与通式I中的相同。 
在合成通式I荧光染料的过程中，本发明采用酸酐直接与取代吡咯反应，通过酸酐的开环反应，酸酐自身即参与形成BODIPY类荧光染料的母体构成，也同时生成带有自由羧酸的活性基团，一举两得；生成8-位含有羧酸官能团的染料。 
生成的染料可直接用于荧光分析或生物分子标记。还可以经活化形成活化衍生物，例如NHS脂(如N-羟基丁二酰亚胺或者N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯活化衍生物)，再用于生化分析。 
含有羧酸基团的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的合成 
本发明的含有羧酸的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的合成方法是基于这样的机理进行的：酸酐在特定条件下易发生开环反应，而吡咯环上氮邻位氢原子活性较高而易发生缩合。 
合成8-位含有羧酸基团的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料及其活化衍生物的整个反应包括如下步骤： 
第一步：两分子吡咯(取代基R1-R3和R5-R7均为H)或取代吡咯(取代基R1-R3和R5-R7不为H)与一分子酸酐发生缩合，其中反应原料吡咯或取代吡咯与酸酐的投料的摩尔比可为0.1-1000∶1，优选为0.5-100∶1；更优选0.5-10∶1，再优选1-5∶1，最佳为2∶1。酸酐在反应后开环，提供自由羧基。 
反应可以在有机溶剂、绝对无水的有机溶剂中进行。优选为绝对无水的有机溶剂。吡咯原料在溶剂中的摩尔浓度为0.1-20％。有机溶剂包括但不局限于二氯甲烷、四氢呋喃或乙腈等。在反应过程中，生成的活性中间体原位脱掉一分子水形成碳碳双键-甲川键，得到二吡咯甲川结构。该结构仍为活性中间体，由于产物不稳定，可不经分离直接进行下一步反应，反应过程可通过薄层色谱(TLC)判断反应的终点，也就是当原料点消失，新的产物点生成后，即可进行下一步反应。 
由于吡咯分子本身遇酸极易聚合，因此反应时原料的摩尔浓度不能太大，应控制在0.1-20％，最好为1-15％，最佳为4-8％。 
表1以生成系列化合物IIa为例说明吡咯在反应时的摩尔浓度对产率的影响。化合物IIa的结构式参见实施例1。 
由于吡咯分子在高温时很容易发生自聚合，生成粘稠状褐色物质，从而影响主反应，大大降低收率。而当反应温度太低时，则需要很长的时间来使反应充分。表2列出了化合物IIa在不同温度下的反应情况，可以看出，反应温度应控制在15℃-120℃，优选为30℃-100℃，更优选30℃-80℃，最优选为40℃-60℃，且收率较高。 
表1合成IIa的基本条件和收率 
Figure G2009102625656D00081
表2化合物IIa在不同温度下的反应收率 
Figure G2009102625656D00091
第二步：二吡咯甲川结构的化合物再与三氟化硼化合物发生反应，加入有机胺如三乙胺中和，脱掉氟化氢后形成目标化合物。加入的三氟化硼化合物可为气态三氟化硼、三氧化硼的乙醚络合物、或其它三氟化硼化合物，其它三氟化硼化合物指：任何能够在常温的溶液下释放出三氟化硼的化合物。三氟化硼化合物加入量是二吡咯甲川结构化合物的摩尔数的0.1-10倍；优选为0.5-3倍。 
反应温度为-10℃-100℃，优选0-80℃，更优选5-60℃，更优选为10-40℃；加入三氟化硼化合物(例如气态三氟化硼或三氧化硼的络合物)时需要加入有机胺来促进反应的进行。有机胺优选三乙胺。 
该反应过程为染料最终生成的过程，通过365nm的紫外灯照射反应母液，可见到明显的绿光荧光，即可判断生成的新产物为荧光物质；三氟化硼化合物与第一步反应得到的中间体络合生成带有荧光的物质是此类染料的本质属性。且生成的染料带有羧基官能团，它在核磁氢谱中往往为较宽较矮的峰形，且出现在核磁谱图上化学位移较大的区域。另外，通过X-射线单晶衍射进行结构解析，可最直观地鉴定生成的荧光染料，附图1给出了染料IVa的单晶结构。 
本发明的含有羧酸及羧酸衍生物的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的提纯方法采用常规方法，没有特别限制。通常，把反应后母液经过萃取分液，干燥后，经硅胶柱层析分离及重结晶得到目标产物。 
本发明的上述荧光染料还可以进一步活化，形成活性很高的活化衍生物，直接用于生物分子的共价标记。其活化衍生物的制备过程举例如下。 
将本发明的荧光染料(取代基R2＝R6＝H)，在无水的有机介质中，与N-羟基琥珀酰亚胺(缩写为NHS)活化剂和碳化二酰亚胺类脱水活化剂(如N，N′-二环己基碳二亚胺，缩写为DCC)反应；或与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(缩写为DSC)活化剂，在有机胺如三乙胺(缩写为TEA)的作用下反应，原位形成含NHS酯的活化染料(如下图所示的DYE-NHS)。反应温度为0-80℃，优选 0-60℃，更优选10-50℃；含羧酸的染料与活化剂的摩尔比为1∶0.1-100，优选为0.5-10；染料与碳化二酰亚胺类脱水活化剂的摩尔比为1∶0.1-100，优选为0.5-10。原位反应得到的活性很高的染料活化衍生物，可不经分离，直接用于生物分子的共价标记。 
本发明的含有羧酸的BODIPY荧光染料，其活化所用的试剂为NHS或DSC；脱水剂可为DCC，有机胺如一乙胺(简写为MEA)、二乙胺(简写为DEA)、三乙胺(简写为TEA)等；可采用的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、DMF等。 
得到的活化衍生物用于标记的过程如下图所示： 
Figure G2009102625656D00101
上式中R2＝R6＝H，除R13外，其它取代基团的定义与结构通式I中一致。 
得到的活化衍生物产物可通过核磁进行定性判断，由于NHS酯基团的引入，染料结构上多出一个N-丁二酰亚胺结构，该结构上有两个亚甲基，它们在核磁上的氢谱化学位移一般在2.9ppm左右，从而可定性判断生成新的带有NHS酯的活化衍生物。 
本发明的制备方法不同于传统的利用醛类或酰氯类化合物与取代吡咯反应制备染料的合成方法，而是采用酸酐直接与取代吡咯反应，并且对合成方法进行了改进和优化，从而使产率最高达到25％。 
本发明的含有羧酸及其衍生物的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，其荧光染料的荧光量子产率介于0.6-0.8，最大紫外吸收及荧光发射波长分别在495±10nm和510±10nm，斯托克斯位移在10-20nm之间。 
本发明的含有羧酸及其衍生物的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，其荧光染料II、III或IV中的M为氢质子时，由于羧酸基的存在使得该类染料在低浓度(1×10-5M)时没有自聚现象的发生，溶液澄清且具有明亮的绿色荧光，染料完全分散于水介质中。这一现象大大拓展了该类染料的应用领域。 
本发明的含有羧酸及其衍生物的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，当荧光染料II、III或IV中的R1＝R2＝H时，它们在水中具有相当高的光稳定性。 
本发明的含有羧酸及其衍生物的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料由于其优良好的光物理特性：较高的荧光量子产率及摩尔消光系数，窄的发射带宽，良好的光稳定性，对溶剂及环境影响较小等，可以非常好地用于生物荧光分析领域。 
本发明的染料在不同极性的溶剂中的光谱变化较小，吸收和发射光谱的波动在15nm左右(如附图2和附图3所示)，尤其是对吸收光谱的影响更小一些。这五个染料斯托克斯位移(Stokes Shift)相对不大，不超过20nm。其荧光量子产率都较高，均大于0.6，带有甲基的BODIPY染料荧光量子产率达到0.8以上，其摩尔消光系数也在8万以上；而对于不含甲基的BODIPY染料，由于染料母体电子云密度小，其荧光量子产率与摩尔消光系数都较低。 
本发明给出的含羧基BODIPY染料的光稳定性良好。在乙腈介质中，含有脂肪羧基的BODIPY染料的光稳定性较好，而含有苯环的BODIPY染料的光稳定性较差，这主要是因为苯环受到BODIPY染料的母体的空间阻碍作用(如附图1所示)，导致染料在受激发时，通过分子内振动豫驰产生的内部转换的效率降低，因此荧光量子产率提高，因此也更易发生光致分解(如附图4所示)；而带有甲基的BODIPY染料，由于染料母体上电子密度增加，这一作用得到加强，因此染料相对也更易光氧化变质。需要说明的是，这一现象在去离子水中测试时更为明显，其原因很可能为水中含有更多的单线态氧，在受光激发过程中，染料更易发生光降解(如附图5所示)。 
本发明的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，还可以用于合成标记蛋白质或DNA的生物分子探针。标记后的生物分子可通过电泳分析、毛细管电泳分析、液相色谱分析、流式细胞术分析、荧光显微镜分析、荧光比色分析、荧光免疫分析等分析方法，在细胞尺度上探讨与研究生命体的生理现象及相互作用机理。 
本发明的含有羧酸的BODIPY荧光染料经活化后，直接用于蛋白质的标记，可应用于荧光免疫分析、蛋白质标记、DNA标记、多肽标记、抗原或抗体标记、 抗抗体标记等。蛋白质与染料的NHS酯的摩尔比为1∶0.1-100，最好1∶1-50；蛋白质与染料的NHS酯可在pH 4-11的环境中进行，最好为pH 7-10，可用pH缓冲溶液控制pH，反应温度在10-80℃，最好在25-60℃；反应的时间为1-100分钟，优选10-60分钟，最好为20-50分钟。 
标记后的蛋白质可用于电泳分析、毛细管电泳分析、液相色谱分析、流式细胞术分析、荧光显微镜分析、荧光比色分析、荧光免疫分析等荧光标记的应用分析领域。 
以标记蛋白质BSA为例，利用电泳检测活性染料DYE-NHS与BSA标记的最佳标记摩尔比的具体步骤如下： 
第一步：配制10％的聚丙烯酰胺分离胶和5％的浓缩胶，制好上样孔，凝固后，安置好待用。 
第二步：BSA变性实验。往5ug(1ul)BSA中加入2ul的pH＝8.7的硼酸-硼砂的缓冲液(SDS 2.5％，蔗糖1％)，1ul去离子水，煮沸5min。 
第三步：向变性后的BSA中加入1ul的DYE-NHS四氢呋喃溶液，分别配制BSA与染料的摩尔比为：BSA/DYE-NHS＝1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶100。30℃下避光反应30-40min。 
第四步：取反应后混合液依次上样，固定好电泳装置后，接通电源，100伏电压下，待活化染料移至凝胶底部1-1.5cm时，切断电源。 
第五步：卸下凝胶片，小心处理后进行拍照(如附图6所示)，并做数据记录与分析。 
通过上述实验，我们找出较优的蛋白质标记条件为：BSA与活化染料DYE-NHS的摩尔比为1∶20。 
在随后的正交实验中，当改变不同的缓冲液pH(8.0；8.4；8.7；9.0；9.3；9.6)时，最终实验结果表明当pH为9.0时，所得到的蛋白标记的电泳泳带强度最高(如附图7所示)，且所计算出的强度与面积的乘积值最大(如附图8所示)。 
通过实验证明，该发明的含有羧酸的BODIPY荧光染料经活化后，在生化分析和生命科学领域具有广阔的应用前景。例如在优化条件下：活化染料的摩尔浓度为4×10-9mol时，当硼酸-硼砂缓冲体系pH为9.0、标记反应温度27℃、反应时间40min时，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续(10％的浓缩胶与5％的分离胶)分离，当BSA的投入量分别为：5ng；10ng；30ng；50ng和0.1ug时， 其荧光标记的检测限可达10-8g。 
本发明的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的盐(金属离子盐及铵盐)是在合成出相应的羧酸染料之后，再与无机碱(如NaOH、KOH)或者有机胺反应所得到的盐。这种盐结构的性能稳定，可用于生化标记，或在加入活化试剂活化后，用于生化标记。 
实施例 
实施例1 
化合物IIa的合成： 
向干燥的250ml单口圆底烧瓶中，依次加入204mg(1.8mmol)戊二酸酐，201mg(3mmol)吡咯，然后在氮气保护下用注射器注入绝对无水的新蒸过的四氢呋喃75ml，控制反应温度为55℃，磁力快速搅拌过夜，反应液颜色浅褐色；冷却至常温并蒸掉一半的溶剂后，在冰浴下，缓慢加入1.2g(12mmol)无水三乙胺，强烈搅拌10分钟后，滴加1.28g(9mmol)三氟化硼乙醚溶液。保持快速搅拌，反应液恢复常温后，继续搅拌4-8小时。整个反应过程用TLC跟踪。反应完全后，将母液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷萃取，去离子水洗涤，反复三次后，合并有机相，无水硫酸镁干燥后，200目硅胶柱层析分离，洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯＝1∶1-1∶2(v/v)，蒸发掉溶剂后得到的红褐色固体用二氯甲烷与正己烷重结晶，得砖红色粉末96mg。 
收率：23％。Mp：136-137℃。HRMS(TOF MS EI+)计算值C13H13BF2N2O2：278.1038。实测值：278.1031。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：10.73(s，1H，-COOH)，7.88(s，2H，pyrrole-H)，7.63(d，2H，pyrrole-H，J＝3.6Hz)，6.61(d，2H，pyrrole-H，J＝4.0Hz)，3.16(t，2H，-CH2，J＝8.4Hz)，2.51(t，2H，-CH2，J＝7.6Hz)，2.08-2.00(m 2H，-CH2)。13C NMR(CDCl3，400MHz)：173.5，151.2，143.8，135.4，128.8，118.3，32.8，29.8，29.1。 
将所得IIa染料(10mg)溶解于甲醇(20ml)中，用10％三乙胺的甲醇溶液NH(C2H5)3)；同理，加入等当量的三乙醇胺，可得IIa的三乙胺盐(M＝NH(C2H4OH)3)；加入等当量的1％NaOH甲醇溶液中和，可得IIa的钠盐(M＝Na)；加入等当量的1％KOH甲醇溶液中和，可得IIa的钾盐(M＝K)等。 
生成的化合物IIa可直接用于生化标记与分析，其活化衍生物IIa-NHS的合成见实施例6。活化衍生物IIa-NHS用于考察BSA标记最佳摩尔比的应用效果见实施例10。 
实施例2 
化合物IIIa的合成： 
Figure G2009102625656D00141
250mL单口圆底烧瓶中，依次加入160mg(1.6mmol)丁二酸酐，201mg(3mmol)1-氢吡咯，然后在氮气保护下分别用注射器注入10mL干燥的乙腈和50mL的DCM，磁力快速搅拌使固体溶解(也可利用超声波或加热促进溶解)，然后搭上冷凝装置并在抽真空下用氮气置换反应体系3-5次，油浴加热并回流反应过夜；TLC跟踪检测无原料剩余后，待反应母液冷却到室温，将其置于冰水浴中，缓慢滴加2.4g(24mmol)无水三乙胺，强烈搅拌10分钟后，接着滴加2.56g(18mmol)三氟化硼乙醚溶液。保持快速搅拌，反应液恢复常温后，缓慢加热到50℃，继续搅拌直至无更多的荧光物质生成为止。整个反应过程用TLC跟踪。反应完成后，将母液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷萃取(3×50mL)，2N的稀盐酸及饱和食盐水洗涤分液，最终合并有机相，并用无水硫酸镁干燥，蒸发掉溶剂后，用少量硅胶拌样，硅胶柱层析分离，洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯＝1∶1-2∶1(v/v)，蒸发掉溶剂后得到的产品用二氯甲烷与正己烷混合溶剂冷法重结晶，得深红色粉末91mg，收率：23％。产品结构鉴定： 
Mp：142-144℃.HRMS(TOF MS EI+)计算值C12H11BF2N2O2：264.0882；实测值：264.0871.1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝7.88(s，2H，pyrrole-H)，7.32(d，2H，pyrrole-H，J＝3.6Hz)，6.57(d，2H，pyrrole-H，J＝3.2Hz)，3.28(t，2H，-CH2，J＝8.0 Hz)，2.85(t，2H，-CH2，J＝8.0Hz).13C NMR(CDCl3，100.518MHz)：δ＝177.0，147.4，144.5，135.0，128.2，118.7，36.7，25.7。 
将所得IIIa染料(10mg)溶解于甲醇(20ml)中，用10％三乙胺的甲醇溶液NH(C2H5)3)；同理，加入等当量的三乙醇胺，可得IIIa的三乙胺盐(M＝NH(C2H4OH)3)；加入等当量的1％NaOH甲醇溶液中和，可得IIIa的钠盐(M＝Na)；加入等当量的1％KOH甲醇溶液中和，可得IIIa的钾盐(M＝K)等。可直接用于生化标记与分析的化合物IIIa-NHS酯的合成见实施例7，活化衍生物IIIa-NHS用于考察BSA标记最佳摩尔比的应用效果见实施例11。 
实施例3 
化合物IVa的合成： 
Figure G2009102625656D00151
往干燥的100mL单口圆底烧瓶中，依次加入237mg(1.6mmol)邻苯二甲酸酐，201mg(3mmol)吡咯，然后在氮气保护下用注射器注入50mL干燥的乙腈，磁力快速搅拌，65℃反应过夜，TLC检测无吡咯剩余后，将母液冷却至常温，缓慢加入1.5g(15mmol)无水三乙胺，强烈搅拌；15分钟后，滴加2.19g(16mmol)三氟化硼乙醚溶液。保持快速搅拌，直至无更多的荧光物质生成为止。整个反应过程用TLC跟踪。反应完成后，将母液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷萃取，2N的稀盐酸及饱和食盐水洗涤分液，反复萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥；然后柱层析分离，洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯＝2∶1-1∶1(v/v)，蒸发掉溶剂后得到的粗产品用二氯甲烷/正己烷(5/95，v/v)重结晶，得到具有金属光泽的砖红色粉末121mg，产率26％。产品结构鉴定： 
Mp：170-172℃.HRMS(TOF MS EI+)计算值C16H11BF2N2O2：312.0882；实测值：312.0886.1H NMR(CD3COCD3，400MHz)：δ＝11.48(s，1H，-COOH)，8.19(d，1H，Ar-H，J＝7.6Hz)，7.99(s，2H，pyrrole-H)，7.80(t，1H，Ar-H，J＝6.4Hz)，7.78(t，1H，Ar-H，J＝6.8Hz)，7.62(dd，1H，Ar-H，J＝7.6Hz)，6.79(d，2H，pyrrole-H，J＝4.0Hz)，6.59(d，2H，pyrrole-H，J＝4.0Hz).13C NMR(CD3COCD3，100.518MHz)：δ＝ 167.1，149.0，144.8，136.4，134.9，132.9，132.6，132.0，131.5，131.0，130.9，119.3。 
将所得IVa染料(10mg)溶解于甲醇(20ml)中，用10％三乙胺的甲醇溶液NH(C2H5)3)；同理，加入等当量的三乙醇胺，可得IVa的三乙胺盐(M＝NH(C2H4OH)3)；加入等当量的1％NaOH甲醇溶液中和，可得IVa的钠盐(M＝Na)；加入等当量的1％KOH甲醇溶液中和，可得IVa的钾盐(M＝K)等。 
荧光染料IVa经衍生化后(衍生活化过程、方式和条件与实施例1相似)，用于生化分析。在优化后的标记条件下：活化染料的摩尔浓度为1.8×10-9mol时，当硼酸-硼砂缓冲体系pH为9.0、标记反应温度40℃、反应时间40min时，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续(10％的浓缩胶与5％的分离胶)分离，当BSA的投入量分别为：10ng；30ng；50ng，200g和0.5ug时，其荧光标记的检测限可达3×10-8g。 
实施例4 
化合物IIIb的合成： 
Figure G2009102625656D00161
向干燥的250ml单口圆底烧瓶中，依次加入180mg(1.8mmol)丁二酸酐，285mg(3mmol)2，4-二甲基吡咯，然后在氮气保护下分别用注射器注入7.5ml干燥的乙腈和67.5ml的二氯甲烷，磁力快速搅拌，回流反应过夜，TLC检测无2，4-二甲基吡咯后，将母液冷却至常温并蒸掉40ml的溶剂后，在冰浴下，缓慢加入1.2g(12mmol)无水三乙胺，强烈搅拌10分钟后，滴加1.28g(9mmol)三氟化硼乙醚溶液。保持快速搅拌，反应液恢复常温后，40℃下继续搅拌直至无更多的荧光物质生成为止。整个反应过程用TLC跟踪。反应完成后，将母液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷萃取，去离子水洗涤，反复萃取三次后，合并有机相，无水硫酸镁干燥后，200目硅胶柱层析分离，洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯＝1∶1-1∶2(v/v)，蒸发掉溶剂后得到的红褐色固体用二氯甲烷与正己烷重结晶，得黄红色粉末101mg。 
收率：21％。Mp：173-174℃。HRMS(TOF MS EI-)计算值C16H19BF2N2O2： 319.1429。实测：319.1435，(TOF MS EI+Na)：343.0405。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：6.08(s，2H，pyrrole-H)，3.34(t，2H，-CH2，J＝8.8Hz)，2.67(t，2H，-CH2，J＝8.8Hz)，2.53(s，6H，-CH3)2.85(s，6H，-CH3)。13C NMR(CDCl3，400MHz)：176.4，155.5，142.8，140.7，131.4，122.2，35.1，23.5，16.6，14.7。 
将所得IIIb染料(10mg)溶解于甲醇(20ml)中，用10％三乙胺的甲醇溶液中和，可得IIIb的三乙胺盐(M＝NH(C2H5)3)；同理，加入等当量的三乙醇胺，可得IIIb的三乙胺盐(M＝NH(C2H4OH)3)；加入等当量的1％NaOH甲醇溶液中和，可得IIIb的钠盐(M＝Na)；加入等当量的1％KOH甲醇溶液中和，可得IIIb的钾盐(M＝K)等。 
此染料在衍生活化后(衍生活化过程、方式和条件与实施例1相似)，用于标记蛋白质BSA的正交实验中，在最优化条件下：活化染料的摩尔浓度为1×10-9mol时，当硼酸-硼砂缓冲体系pH为8.8、标记反应温度30℃、反应时间40min时，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续(10％的浓缩胶与5％的分离胶)分离，当BSA与染料的用量摩尔比为1∶25时，其荧光标记的灵敏度最好(见附图9)。 
实施例5 
化合物IVb的合成： 
向干燥的250ml单口圆底烧瓶中，依次加入267mg(1.8mmol)邻苯二甲酸酐，285mg(3mmol)2，4-二甲基吡咯，然后在氮气保护下用注射器注入75ml干燥的乙腈，磁力快速搅拌，60℃反应过夜，TLC检测无2，4-二甲基吡咯后，将母液冷却至常温并蒸掉30ml的溶剂后，在冰浴下，缓慢加入1.2g(12mmol)无水三乙胺，强烈搅拌10分钟后，滴加1.28g(9mmol)三氟化硼乙醚溶液。保持快速搅拌，待反应液恢复常温后，继续搅拌直至无更多的荧光物质生成为止。整个反应过程用TLC跟踪。反应完成后，将母液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷萃取，去离子水洗涤，反复萃取三次后，合并有机相，无水硫酸镁干燥；然后用200目硅胶柱层析分离，洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯＝2∶1-1∶1(v/v)，蒸发掉溶 剂后得到的红褐色固体，粗产品用二氯甲烷与正己烷重结晶，得到具有金属光泽的砖红色粉末138mg。 
收率：25％。Mp：235-237℃。HRMS(TOF MS EI+)计算值C20H19BF2O2N2：368.1508。实测：368.1504。1H NMR(CD3COCD3，400MHz)δ：11.47(s，1H，COOH)，8.14(dd，J＝8.0Hz，1H)，7.79(dd，3J＝7.6Hz，4J＝1.2Hz，1H)，7.69(dd， 3J＝7.6Hz，4J＝1.2Hz，1H)，7.42(dd，J＝7.6Hz，1H)，6.03(s，2H)，2.45(s，6H，CH3)，1.33(s，6H，CH3)。13C NMR(CD3COCD3，400MHz)：166.4，154.6，142.9，142.2，136.0，133.4，131.4，131.2，131.0，129.9，129.8，121.0，13.9，13.5。 
将所得IVb染料(10mg)溶解于甲醇(20ml)中，用10％三乙胺的甲醇溶液中和，可得IVb的三乙胺盐(M＝NH(C2H5)3)；同理，加入等当量的三乙醇胺，可得IVb的三乙胺盐(M＝NH(C2H4OH)3)；加入等当量的1％NaOH甲醇溶液中和，可得IVb的钠盐(M＝Na)；加入等当量的1％KOH甲醇溶液中和，可得IVb的钾盐(M＝K)等。 
荧光染料IVb经衍生化后(衍生活化过程、方式和条件与实施例1相似)，用于生化分析。在优化后的标记条件下：活化染料的摩尔浓度为0.8×10-9mol时，当硼酸-硼砂缓冲体系pH为9.0、标记反应温度40℃、反应时间40min时，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续(10％的浓缩胶与5％的分离胶)分离，当BSA的投入量分别为：10ng；30ng；50ng和0.2ug时，其荧光标记的检测限可达5×10-8g(见附图10)。 
实施例6 
可直接用于生化标记与分析的化合物IIa-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺酯)的合成： 
25ml单口圆底烧瓶中，先后加入55.6mg(0.2mmol)的IIa，77mg(0.3mmol)N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，然后用微量进样器注入200ul(1.5mmol)的三乙醇胺，加入5ml无水DMF，在氮气保护下，常温避光搅拌24小时。可用TLC检测反应进程。待染料完全活化后，蒸掉溶剂，将剩余的蛋黄色固体用二氯甲烷溶解，水洗分液两次。有机层干燥浓缩后，快速硅胶柱层析两次，洗脱液为：二氯甲烷/乙酸乙酯＝20∶1-10∶1(v/v)，蒸发掉洗脱液后得到暗红色固体，粗产品用二氯甲烷与正己烷重结晶，得到67mg深红色粉末状活化的IIa-NHS。该方法简便易操作，活化后的产物需要进行硅胶柱快速分离，最终可直接用于蛋白质标记， 且由于此染料与IIIa-NHS(实施例7)结构上只多一个亚甲基，理化性能相近，因此我们认为在标记应用上效果基本一致。 
收率：90％。HRMS(TOF MS EI+Na)计算值C17H16BF2N3O4：398.1097。实测：398.1100。1H NMR(CDCl3，400MHz)：7.87(s，2H，pyrrole-H)，7.365(d，2H，pyrrole-H，J＝4.4Hz)，6.552(d，2H，pyrrole-H，J＝3.2Hz)，3.075(t，2H，-CH2，J＝8.0Hz)，2.887(d，2H，-CH2，J＝2.8Hz)，2.783(d，2H，-CH2，J＝6.4Hz)，2.258-2.185(m，2H，-CH2)。13C NMR(CDCl3，400MHz)：169.2，168.1，148.6，144.2，135.3，128.3，118.6，30.8，29.7，28.3，25.6。 
化合物IIa-NHS直接用于BSA标记时的最佳标记摩尔比的应用考察见实施例10。 
实施例7 
可直接用于生化标记与分析的化合物IIIa-NHS酯的合成： 
Figure G2009102625656D00192
25ml单口圆底烧瓶中，先后加入80mg(0.3mmol)的IIIa，42mg(0.36mmol)的N-羟基丁二酰亚胺，155mg(0.75mmol)的环己基碳二亚胺。氮气下，注入8ml无水乙腈，常温下遮光搅拌36小时。TLC检测无IIIa剩余后，蒸掉溶剂，将剩余的蛋黄色固体用二氯甲烷溶解，水洗分液两次。有机层干燥浓缩后， 快速硅胶柱层析两次，洗脱液为：二氯甲烷/乙酸乙酯＝20∶1-10∶1(v/v)，蒸发掉洗脱液后得到暗红色固体，粗产品用二氯甲烷与正己烷重结晶，得到100mg桔红色粉末状IIIa-NHS。该方法简便易操作，活化后的产物需要进行硅胶柱快速分离，最终可直接用于蛋白质标记，其应用及其效果参见实施例11。 
收率：92％。HRMS(TOF MS EI+)计算值C16H14BF2N3O4：361.1045。实测：361.1013。1H NMR(CDCl3，400MHz)：7.893(s，2H，pyrrole-H)，7.327(d，2H，pyrrole-H，J＝4.0Hz)，6.583(d，2H，pyrrole-H，J＝3.6Hz)，3.345(t，2H，-CH2，J＝8.0Hz)，3.069(t，2H，-CH2，J＝8.0Hz)，2.875(s，2H，-CH2)。13C NMR(CDCl3，400MHz)：168.94，167.06，145.93，144.91，134.94，128.20，118.97，33.74，25.79，25.55。 
该活化衍生物结构已通过X-射线单晶衍射得以证实，见附图11。 
实施例8 
为进一步验证带有羧酸官能团的染料的良好的应用前景，在本实施例中，所取把它们溶解不同溶剂中(表3)，溶液的摩尔浓度为1×10-5mol/L，并通过紫外-可见分光光度仪及荧光光度仪来测量染料的吸收及发射光谱，进行光谱性能测试。 
通过测定所选的带有羧基的染料在DCM下的紫外吸收(附图2)与荧光发射(附图3)光谱，我们可以清楚地看出：它们的最大紫外吸收及荧光发射波长分别在495±10nm和510±10nm，斯托克斯位移在10-20nm之间。该类荧光染料在可见光范围内激发与发射，且较窄的发射带宽，使得其能有效地避免生物背景荧光的干扰，提高检测的灵敏度，是一类性能优异的生物分析用荧光染料。而且染料的荧光量子产率较高，有的甚至达到0.83，这一性质有利于提高应用时的检测灵敏度。 
将所选带有羧基的染料溶于各类不同溶剂：己烷(Hexane)、二氯甲烷(DCM)、乙醇(Ethanol)和水(H2O)中，测得的最大吸收波长λmax(abs)、最大发射波长λmax(em)、Stokes位移(Δλ)、摩尔消光系数(E)、荧光素(Φf＝0.85in 0.1N NaOH)为参比所测得的荧光量子产率(Φf)等列于表3。表3中除上述实例中所列举的部分染料(IIa：R1＝R2＝M＝H；IIIb：R1＝R2＝CH3，M＝H；IVb：R1＝R2＝CH3，M＝H)外，其它染料的结构为IIIa：R1＝R2＝M＝H；IVa：R1＝R2＝M＝H。 
表3不同溶剂中选定的含羧基BODIPY染料的光物理性质 
Figure G2009102625656D00211
实施例9 
带有羧基的染料的光稳定性测试： 
染料在乙腈介质中的光稳定性测试：样品浓度为1×10-5M，在不同光照时间后分析染料溶液密度，计算出剩余吸收百分比，以初始吸收强度为1进行计算；结果见附图4。通过染料在乙腈中的光稳定性比较，我们发现：母体结构上不带甲基且含有脂肪羧酸的染料其光稳定性优良，这主要是由于染料核心结构上的电子云密度较小所造成的。因此染料IIIa与IIa具有更好的实际应用价值。 
染料在去离子水介质中的光稳定性测试：样品浓度为1×10-5M，在不同光照时间后分析染料溶液密度，计算出剩余吸收百分比，以初始吸收强度为1进行计算。结果见附图5。通过染料在乙腈中的光稳定性比较，我们进一步发现：不带甲基的染料在水中的光稳定性优良，即染料IIIa与IIa的稳定性非常好，完全可 满足生物分析应用研究。 
实施例10 
以标记蛋白质BSA为例，利用电泳检测活性染料IIa-NHS与BSA的最佳标记摩尔比的具体步骤如下： 
第一步：配制10％的聚丙烯酰胺分离胶和5％的浓缩胶，制好上样孔，凝固后，安置好待用。 
第二步：蛋白质变性实验。往5ug(1ul)BSA中加入2ul的pH＝8.7的硼酸-硼砂的缓冲液(SDS 2.5％，蔗糖1％)，1ul去离子水，煮沸5min。 
第三步：向变性后的BSA中加入1ul的IIa-NHS四氢呋喃溶液，分别配制BSA与染料的摩尔比为：BSA/IIa-NHS＝1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶100。30℃下避光反应30-40min。 
第四步：取反应后混合液依次上样，固定好电泳装置后，接通电源，100伏电压下，待活化染料移至凝胶底部1-1.5cm时，切断电源。 
第五步：卸下凝胶片，小心处理后进行拍照(如附图6所示)，并做数据记录与分析。 
通过上述实验，我们找出较优的蛋白质标记条件为：BSA与活化染料IIa-NHS的摩尔比为1∶20。 
实施例11 
活化染料IIIa-NHS标记BSA及其凝胶电泳实验： 
以标记蛋白质BSA为例，利用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺)凝胶电泳检测不同pH下活化染料标记效果的具体步骤如下： 
第一步：配制10％的聚丙烯酰胺分离胶和5％的浓缩胶，制好上样孔，凝固后，安置好待用。 
第二步：蛋白质变性实验。往5ug(1ul)BSA中加入2ul的pH＝8.7的硼酸-硼砂的缓冲液(SDS 2.5％，蔗糖1％)，1ul去离子水，煮沸5min。 
第三步：向变性后的BSA中加入1ul的IIIa-NHS四氢呋喃溶液，配制BSA与染料的摩尔比：BSA/IIIa-NHS＝1∶20；尝试不同的缓冲液pH值(8.0；8.4；8.7；9.0；9.3；9.6)进行标记对照实验，标记体系在30℃下避光反应30-40min。 
第四步：取反应后混合液依次上样，固定好电泳装置后，接通电源，100伏电压下，待活化染料移至凝胶底部1-1.5cm时，切断电源。 
第五步：卸下凝胶片，妥当处理后进行拍照，并做数据记录与分析。 
实验结果表明：当标记反应缓冲液pH为9.0时，所得到的蛋白标记的电泳泳带强度最高(如附图7所示)，且所计算出的强度与面积的乘积值也最大(如附图8所示)。 
通过实验证明，该发明的含有羧酸的BODIPY荧光染料经活化后，在生化分析和生命科学领域具有广阔的应用前景。例如在优化条件下：活化染料的用量为3.6×10-9mol(1ug溶解于1ul的四氢呋喃中)，当硼酸-硼砂缓冲体系pH为9.0、标记反应温度30℃、反应时间40min时，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续(10％的浓缩胶与5％的分离胶)分离，当BSA的投入量分别为：2ng；5ng；10ng；30ng；50ng和0.2ug时，其荧光标记的检测限可达2ng，且通过凝胶成像系统在302nm的紫外灯下用肉眼就可看到明显的BSA标记带。 
实施例12 
在实施例1中得到的IIa的盐式结构，在实施例2中得到的IIIa的盐式结构，及在实施例3中得到的IVa的盐式结构，它们在用于标记蛋白实验时的效果，与实施例11所述基本相同。在实施例4中得到的IIIb的盐式结构，在用于标记蛋白实验时与化合物IIIb-NHS具有相同的效果；在实施例5中得到的IVb的盐式结构，在用于标记蛋白实验时与化合物IVb-NHS具有相同的效果。 
具体方法是：称取一定质量的染料盐，，加入10倍当量的N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，过量的三乙醇胺，在pH 7.5-8.5的缓冲体系下及30度水浴下边活化边标记，标记时间为12小时，然后按照实施例8的步骤，通过SDS-PAGE进行分离检测，具有相同的标记效果。 
本发明的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的盐(金属离子盐及铵盐)，用于生化标记时的效果与相应的DYE-NHS相似，本实施例不再单独说明。 

Claims (9)

1.一类氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，其特征在于该荧光染料具有如下结构通式I：
式中：
R1、R2、R3、R5、R6、R7各自为H或C1-8烷基；
R8为结构式X、Y、Z或P的基团；
M为H、Na、K、N(R9R10R11R12)或N-琥珀酰亚胺基
Figure F2009102625656C00012
其中R9、R10、R11、R12各自为H、C1-8烷基、或带取代基的C1-8烷基，所述的取代基选自OH、醚键、或羧基。
2.如权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，其中所述的R1、R2、R3、R5、R6、R7各自为H或C1-4的烷基。
3.如权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，其中所述的R9、R10、R11、R12各自为H或C1-4烷基。
4.如权利要求1-3中任一项所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，其特征在于该染料具有如下结构式II、III、或IV：
Figure F2009102625656C00021
在上述结构式II中，R1＝R3＝R5＝R7＝H；在上述结构式III和IV中：R1、R3、R5、R7各自为H或者CH3。
5.一种制备如权利要求1所述荧光染料的方法，包括：
(1)被取代的吡咯与有机二元酸酐，在有机溶剂或绝对无水的有机溶剂中发生缩合，在缩合过程中，两分子的取代吡咯与一分子酸酐进行缩合，其中一分子的取代吡咯为具有取代基R1、R2和R3的吡咯，另一分子的取代吡咯为具有取代基R5、R6和R7的吡咯，有机二元酸酐选自：丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或邻苯二甲酸酐；有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃或乙腈，所述取代吡咯在所述有机溶剂中的摩尔浓度为0.1-20％，而且取代吡咯与酸酐的原料投料摩尔比为0.5-10∶1，反应温度控制在15-120℃，反应得到产物二吡咯甲川结构化合物；
(2)将得到的二吡咯甲川结构化合物再与三氟化硼化合物发生反应，并加入有机胺中和剂，脱掉氟化氢后形成通式I化合物，然后提纯；所述三氟化硼化合物选自：气态三氟化硼、三氟化硼的乙醚络合物、或其他能够在常温溶液状态下释放出三氟化硼的化合物；反应温度为-10℃-100℃；三氟化硼化合物的加入量是：使二吡咯甲川结构化合物与三氟化硼化合物的摩尔比为1∶0.1-10。
6.一种权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料的用途，它用于合成标记蛋白质或DNA的生物分子探针。
7.一种权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料的用途，它用于生物荧光分析或生物分子标记。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述的生物分子标记是：蛋白质标记、DNA标记、多肽标记、抗原或抗体标记、或抗抗体标记。
9.如权利要求7所述的用途，其中所述的荧光分析是荧光免疫分析、荧光显微镜分析、或荧光比色分析。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102520153A (zh) * 2011-12-15 2012-06-27 安徽师范大学 一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法
WO2012083509A1 (zh) * 2010-12-20 2012-06-28 大连理工大学 一类氟化硼络合二吡咯甲川染料、制备方法及其应用
CN102564987A (zh) * 2012-01-12 2012-07-11 浙江大学 一种基于吡咯甲川衍生物的pH比色检测分析方法
CN102702768A (zh) * 2012-06-04 2012-10-03 天津理工大学 一种新型红光bodipy荧光染料及其制备方法和应用
CN102993763A (zh) * 2012-12-09 2013-03-27 大连理工大学 一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料及其应用
WO2015081803A1 (zh) * 2013-12-02 2015-06-11 大连理工大学 一类氟化硼络合二吡咯甲川荧光探针，其制备方法及应用
CN105102464A (zh) * 2012-12-26 2015-11-25 新加坡国立大学 梅咖斯托克斯氨基-三唑基-bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物位点探测的应用
CN105237570A (zh) * 2014-05-28 2016-01-13 中国科学院化学研究所 一类用于dna原位杂交荧光检测（fish）技术的生物试剂及其制备和应用
CN105884806A (zh) * 2016-06-21 2016-08-24 福州大学 荧光探针的制备方法及基于荧光探针的土霉素检测方法
CN106928261A (zh) * 2017-02-09 2017-07-07 南京航空航天大学 一种含n‑羟基琥珀酰亚胺基酯的三枝氟硼二吡咯荧光化合物、制备方法及其胺基偶联产物
CN111100153A (zh) * 2019-12-31 2020-05-05 华侨大学 一种氟硼二吡咯甲川衍生物染料配体及其制备方法
CN112574239A (zh) * 2019-09-27 2021-03-30 中国科学院上海药物研究所 3-噻唑烯基氟化硼络合二吡咯甲川类化合物及其制备方法和用途
CN113321671A (zh) * 2021-01-29 2021-08-31 南京工业大学 一种氟硼二吡咯类固态发光材料及其制备方法和应用、一种蓝光驱动的led

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944540A (zh) * 2006-09-15 2007-04-11 大连理工大学 生物分析用近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料
CN101550156A (zh) * 2009-05-14 2009-10-07 浙江大学 一种荧光探针及其合成方法和用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944540A (zh) * 2006-09-15 2007-04-11 大连理工大学 生物分析用近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料
CN101550156A (zh) * 2009-05-14 2009-10-07 浙江大学 一种荧光探针及其合成方法和用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGCHUAN WANG ET AL.: "Carboxyl BODIPY Dyes from Bicarboxylic Anhydrides: One-Pot Preparation, Spectral Properties, Photostability, and Biolabeling", 《J. ORG. CHEM.》 *
YANG LIU ET AL.: "TEMPO-based Redox-sensitive Fluorescent Probes and Their Applications to Evaluating Intracellular Redox Status in Living Cells", 《CHEMISTRY LETTERS》 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012083509A1 (zh) * 2010-12-20 2012-06-28 大连理工大学 一类氟化硼络合二吡咯甲川染料、制备方法及其应用
CN102520153A (zh) * 2011-12-15 2012-06-27 安徽师范大学 一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法
CN102564987A (zh) * 2012-01-12 2012-07-11 浙江大学 一种基于吡咯甲川衍生物的pH比色检测分析方法
CN102702768A (zh) * 2012-06-04 2012-10-03 天津理工大学 一种新型红光bodipy荧光染料及其制备方法和应用
CN102702768B (zh) * 2012-06-04 2013-12-04 天津理工大学 一种新型红光bodipy荧光染料及其制备方法和应用
CN102993763A (zh) * 2012-12-09 2013-03-27 大连理工大学 一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料及其应用
CN102993763B (zh) * 2012-12-09 2014-08-27 大连理工大学 一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料及其应用
CN105102464A (zh) * 2012-12-26 2015-11-25 新加坡国立大学 梅咖斯托克斯氨基-三唑基-bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物位点探测的应用
CN105102464B (zh) * 2012-12-26 2017-03-29 新加坡国立大学 梅咖斯托克斯氨基‑三唑基‑bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物位点探测的应用
WO2015081803A1 (zh) * 2013-12-02 2015-06-11 大连理工大学 一类氟化硼络合二吡咯甲川荧光探针，其制备方法及应用
US9862731B2 (en) 2013-12-02 2018-01-09 Dalian University Of Technology Difluoroboron dipyrromethene fluorescent probe, production method and application thereof
CN105237570A (zh) * 2014-05-28 2016-01-13 中国科学院化学研究所 一类用于dna原位杂交荧光检测（fish）技术的生物试剂及其制备和应用
CN105884806A (zh) * 2016-06-21 2016-08-24 福州大学 荧光探针的制备方法及基于荧光探针的土霉素检测方法
CN106928261A (zh) * 2017-02-09 2017-07-07 南京航空航天大学 一种含n‑羟基琥珀酰亚胺基酯的三枝氟硼二吡咯荧光化合物、制备方法及其胺基偶联产物
CN112574239A (zh) * 2019-09-27 2021-03-30 中国科学院上海药物研究所 3-噻唑烯基氟化硼络合二吡咯甲川类化合物及其制备方法和用途
CN112574239B (zh) * 2019-09-27 2022-03-25 中国科学院上海药物研究所 3-噻唑烯基氟化硼络合二吡咯甲川类化合物及其制备方法和用途
CN111100153A (zh) * 2019-12-31 2020-05-05 华侨大学 一种氟硼二吡咯甲川衍生物染料配体及其制备方法
CN113321671A (zh) * 2021-01-29 2021-08-31 南京工业大学 一种氟硼二吡咯类固态发光材料及其制备方法和应用、一种蓝光驱动的led

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