CN102046203A - 含有与聚阴离子偶联的、衍生自cd4受体的肽的用于治疗艾滋病的共轭分子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有通过接头与有机分子偶联的、衍生自CD4受体的肽的共轭分子，以及制备共轭分子的方法。该共轭分子可以用于抗病毒治疗，也就是用于艾滋病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及含有衍生自CD4受体的肽和有机分子，例如聚阴离子性多糖的共轭分子。该共轭分子可以用于抗病毒治疗，也就是用于艾滋病(AIDS)的治疗。本发明进一步涉及制备所述共轭分子的方法。
背景技术
在大量血清反应阳性的HIV患者中，结合核苷(NRTI)、非-核苷(NNRTI)和/或蛋白酶抑制剂(PI)的三联疗法导致病毒电荷降低至检测水平以下。这种功效已经导致由HIV感染导致的死亡数目的大量减少。但不幸地，已经在80％的患者中发现了抗病毒耐药的基因型，更忧虑地，45.5％的病毒患者对NRTI/PI联合治疗耐受，而26％的病毒患者对三种抗-HIV类的联合治疗耐受(Tamalet等人，AIDS.2003Nov7；17(16)：2383-8)。由于在70％接受治疗的患者中发现的长期三联疗法治疗的不良反应(脂肪萎缩、脂肪代谢障碍、高三酸甘油酯血症、高胆固醇血症、神经病等)导致差的依从性和通常导致耐受的治疗的“突然”停止，这种观察特别令人不安。因此，开发具有较少不良反应和不具有交叉抗药性的治疗的较少的严重形式是优先考虑的，尽管市场上目前可以得到大量的药物。有鉴于此，不同于逆转录和蛋白质水解，有必要以HIV复制步骤为靶向。
在病毒性感染循环中，病毒进入细胞是重要步骤。该步骤被分成两个阶段，第一阶段是病毒与细胞表面在特定宿主受体水平相互作用，接着病毒遗传物质渗透入靶细胞。关于HIV，在粘附和进入机理中涉及的分子伴侣已很好地确定。从病毒角度考虑，gp120包膜糖蛋白是本质上决定病毒/细胞相互的复合物。该蛋白质最初与宿主细胞的跨膜糖蛋白(CD4)结合。这种相互作用导致gp120中构象的改变，gp120暴露出特定的表位，称为CD4-诱导(CD4i)，因此建立趋化因子受体(基本上为CCR5和CXCR4)的结合位点。因此，CCR5和CXCR4在细胞表面充当gp120共受体。第二种相互作用导致gp120/gp41蛋白质复合体的重组和细胞/病毒膜融合的开始。
通过使用的共受体的类型定义HIV病毒的细胞趋向性。更具体地说，所谓的X4或“T-嗜性(T-tropic)”病毒倾向于感染在它们的表面表达CXCR4的细胞株，例如T淋巴细胞。所谓的R5或“M-嗜性(M-tropic)”病毒使用共受体CCR5且主要感染巨噬细胞和单核细胞。R5或X4型病毒的存在通常与完全不同的艾滋病发展阶段相关(对R5无症状阶段，X4病毒的出现通常与不利的疾病发展结果相联系，提示共受体CXCR4的使用是艾滋病发病机理的重要因素)。由于gp120带有对CCR5和CXCR4识别的结构决定因素，所以R5和X4病毒代表两种分开的靶标。
除了上述的受体，HIV能够与其它在细胞表面发现的分子，特别是硫酸乙酰肝素(HSs)结合。HSs是属于糖胺聚糖家族(GAGs)的多糖。它们大量存在于细胞表面和间质基质(interstitial matrices)中，固定于特定糖蛋白的细胞外区域。在化学上与肝素(因其抗凝性质使用的另一种GAG)相关，凭借它们结构和功能的多样性，HSs不同于其它生物大分子。由于它们与多种不同蛋白质结合的能力，它们的结构、稳定性和/或反应性通过相互作用被修饰，所以它们与大量现象相关。尤其是，它们识别大量的病原体，其中之一是HIV，因此充当结合受体。在HIV中，仍然是gp120带有HS识别位点。
发明人以前的工作发现HIV与肝素(或HS)结合的能力特定于X4模式株，由于R5型病毒仅非常轻微地与多糖相互作用(Moulard等人，J.Virol.74，1948-1960，2000)。这些结果提示HS可能涉及到某些与细胞趋向性有关的特定性质，例如靶细胞的性质，X4菌株的更大的致病性和在感染的无症状阶段，潜在X4病毒的贮液囊的建立。
如发明人所见，HIV-HS的相互作用发生在gp120水平，病毒粘附和进入的所有原始阶段均涉及gp120。相互作用的位点位于gp120的区域，称为可变环3(V3)。X4菌株(isolates)的V3环与R5菌株的V3环相比富含碱性氨基酸，导致与肝素样低聚糖更好的相互作用。
在此所述的本发明是基于在CD4存在下gp120-肝素相互作用非常具有潜力的观察。然而，该作用依赖于使用的病毒株，且基本上发生在gp120仅单独地与HSs微弱地相互作用的浓度。
发明人以前的工作已显示CD4诱导的位点构成补充的与肝素或HSs相互作用的位点(Vivès等人J.Biol.Chem.279，54327-54333，2005)。因此，抑制剂(mCD4-HS)，下面将描述其生物作用，包含在CD4识别位点与gp120连接的肽(mCD4)。它能触发gp120中构象的改变，导致CD4i表位的暴露。然后，根据图1，共价结合低聚糖(HS)能识别CD4i位点。
人们很多年前就知道某些聚阴离子例如肝素(HP)和硫酸葡聚糖(DS)，但不是硫酸软骨素(CS)，能抑制HIV引起的细胞感染(EstéJA等人，Mol Pharmacol.1997Jul；52(1)：98-104)。尽管如此，但是特别由于它们的抗凝作用，它们不在临床上使用(Flexner C等人，Antimicrob Agents Chemother.1991Dec；35(12)：2544-50)。近来研究显示该抑制作用的分子机理与聚阴离子和V3环的相互作用相关(Moulard M等人，J Virol.2000Feb；74(4)：1948-60)。
此外，各种研究已经探寻使用可溶的CD4抑制病毒与在HIV靶细胞表面表达的CD4的相互作用。已发现该溶液是无效的，由于通过与病毒的结合，溶液CD4暴露表位CD4i，因此促进病毒与CCR5或CXCR4共受体的相互作用，这在某些情况下增加感染(Schenten D.等人，1999.J Virol.73：5373-80)。
从国际专利WO 03/089000可知衍生自CD4受体的肽，当与聚阴离子联系时，具有抗-HIV活性。尤其是，推荐根据NajjamS.等人的文章给出的说明可以制备肽和聚阴离子结合的化合物(Cytokine 1997，9(12)：1013-1022)(参见实施例部分I.1节)。
发明内容
在本发明中，发明人已经获得衍生自CD4受体的活化肽，其可能直接地和共价地连接至有机分子，例如聚阴离子性多糖。该活化作用要求将特定氨基酸残基插入至天然肽(native peptide)。特别地，发明人已经发现在衍生自CD4受体的肽的序列中的一个和唯一的氨基酸赖氨酸残基的存在对获得本发明的活化肽极其重要。此外，该唯一的氨基酸赖氨酸残基必须在衍生自CD4受体的肽序列中的定义明确的位置。设计在确定的位置含有单一氨基酸赖氨酸残基的miniCD4肽允许在miniCD4上选择性和直接地引入所需的功能。
为了简化以mCD4为基础的轭合物的合成，发展了设计带有单一衍生/偶联位点的miniCD4的想法。我们的策略允许在miniCD4正确合成、折叠、纯化和表征之后，经大型板的接头(linker)和化学过程偶联大量有机化合物。该策略让我们能够完美地制备定义轭合物。
本领域技术人员可能争辩存在用于在肽的序列内选择的氨基酸的特定标记和衍生的方法。然而，在miniCD4序列内的多个半胱氨酸残基的存在限制了某些经典方法的使用，这些经典方法通常在固相肽合成中使用，用于选择性的修饰/衍生所选的氨基酸(见图10)。
就此而言，在选择的赖氨酸侧链上引入马来酰亚胺基是不可能的。
的确，在最终TFA裂解中硫醇化清除剂的应用和正确合成和折叠miniCD4肽所需的基于谷胱甘肽化(gluthation)的条件，排除当肽依然连接于载体上时在选择的赖氨酸上引入马来酰亚胺功能(fonction)(或其它硫醇化敏感性衍生分子)的机会。事实上，其排除例如，在mCD4-聚阴离子共轭步骤应用强马来酰亚胺/SH的策略。
此外，我们的前-mCD4(post-mCD4)合成衍生物策略能够快速筛选不同的接头，无需进行mCD4肽的多重肽树脂(multiple on-peptide resin)衍生化、分裂和折叠。
更重要地，miniCD4序列内衍生位点(赖氨酸)的正确位置(例如，位置5)提供聚阴离子化合物的最佳方位，该聚阴离子化合物靶向CD4i的HSBS和共受体结合位点(见图11)。
因此，本发明提供能生成大量潜在抗病毒衍生物的活化肽。这些衍生物由含有CD4肽的共轭分子组成，CD4肽特别地通过接头偶联至有机分子，例如聚阴离子性多糖。
该方法在治疗上有利地抑制病毒粘附于细胞，由于它直接靶向病毒，而非细胞本身。因此，初看之下缺乏观察到的与连接至共受体的药物的细胞作用。另外，考虑到涉及各种病毒趋向性的位点的保留，本发明的化合物应当与不同病毒株的gp120相互作用。而且，尽管可能误导认为耐受没有发生，该新型化合物不应导致耐受的容易出现。的确，gp120的CD4位点必须保持完整以便继续结合至CD4，就像结合至聚阴离子性多糖涉及的碱性残基用于与共受体相互作用。这两个位点中的一个突变将导致病毒减弱感染性。最后，在本发明的框架内，可以开发化合物完整合成的版本，因此保证大量可用的制剂，其是均匀的和完美定义的。偶联方法是简单、快速和定量的。
因此，根据第一方面，本发明涵盖含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通过接头偶联至有机分子，其中：
■所述衍生自CD4受体的肽含有下列通用序列(I)：
Xaaf-P1-Lys-Cys-P2-Cys-P3-Cys-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Cys-Xaak-Cys-Xaal-Xaam，(I)
其中：
-P1代表3至6个氨基酸残基，
-P2代表2至4个氨基酸残基，
-P3代表6至10个氨基酸残基，
-Xaaf代表N-乙酰半胱氨酸(Ac-Cys)或3-巯基丙酸(TPA)，
-Xaag代表Ala(丙氨酸)或Gln(谷氨酰胺)，
-Xaah代表Gly(甘氨酸)或(D)Asp(天冬氨酸)或Ser(丝氨酸)，
-Xaai代表Ser或His(组氨酸)或Asn(天冬酰胺)，
-Xaaj代表联苯丙氨酸(Bip)、苯基丙酸或β-萘基丙氨酸，
-Xaak代表Thr(苏氨酸)或Ala，
-Xaal代表Gly、Val(缬氨酸)或Leu(亮氨酸)，且
-Xaam代表-NH2或-OH，
所述在P1、P2和P3中的氨基酸残基是天然或非天然的，相同或不同的，所述P1、P2和P3的残基都与Lys残基不同，且P1、P2和P3具有共同或非共同的序列，且
■所述有机分子具有下列通用结构(II)：
其中：
-n代表0至10之间的整数，特别地，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，有利地，n是0、1、2、3、4或5，
-X代表无机反离子(couterion)，例如Na+、K+、Li+或Mg2+，或有机反离子，例如R3NH+、R4N+，其中R彼此独立地代表烷基，有利地为Na+，
-m代表所述分子的负电荷的数目，
-R1是相同或不同的基团且代表氢原子或O-保护基GP，
-R2代表氢原子或O-保护基GP′，其中GP和GP′相同或不同，
-R3是相同或不同的基团且代表氢原子、硫酸盐、磷酸根或任何阴离子，
-R4是相同或不同的基团且代表氢原子、硫酸盐、烷基或酰基，
-R5是相同或不同的基团且代表氢原子、烷基或酰基，
-A 代表选自下列通式的基团：-(CH2)p-NH-CO-(CH2)q-、-(CH2-CH2)-(O-CH2-CH2)p-NH-CO-(CH2)q-、-(CH2)p-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-或-(CH2-CH2)-(O-CH2-CH2)p-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-，其中p代表1至10之间的整数且q代表1至10之间的整数，有利地，A代表通式-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-的基团，且
-Z代表卤原子，巯基或马来酰亚胺基，
所述接头的一个末端共价结合至存在于衍生自CD4受体的肽的通用序列(I)中的氨基酸残基Lys的游离氨基(-NH2)，且所述接头的另一个末端共价结合至有机分子的Z基团。
优选地，P3含有至少一种碱性氨基酸，所述碱性氨基酸甚至更优选为精氨酸。在CD4受体片段该位置上的碱性残基的存在有助于其结合至gp120蛋白质。因此，发明人更喜欢将至少一种碱性氨基酸引入至P3，优选精氨酸。因此这样保持碱性部分，该碱性部分在pH 7-8不发生衍生化，但是已发现其有助于将miniCD4肽结合至gp120蛋白质。
在本申请中，术语“miniCD4肽”、“CD4肽”和“miniCD4”可交换地用于指定含有上面定义的通用序列(I)或由上面定义的通用序列(I)组成的衍生自CD4受体的肽。
本发明需要衍生自CD4受体的肽在它的通用序列(I)中包括在通用序列(I)定义的位置中的一个和唯一的氨基酸赖氨酸(Lys)残基。
通用序列(I)中的Cys残基允许用于折叠回miniCD4的三个二硫桥键的形成。
当3-巯基丙酸(TPA)在通用序列(I)的肽的N-末端位置时，使其可能减少N-末端障碍并克服胺基的存在。
因此，根据一个优选的具体实施方案，Xaaf代表在通用序列(I)中的TPA。
在通用序列(I)中，Xaaj代表Bip、Phe或β-萘基丙氨酸。联苯丙氨酸增加与糖蛋白gp120在腔内的接触，CD4受体的Phe 43位于腔内。然而，当分析miniCD4/gp120复合物的结构时，具有Phe的本发明的miniCD4肽可以更好的模拟CD4(Huang CC等人，Structure.2005May；13(5)：755-68)。
因此，根据另一个优选的具体实施方案，Xaaj代表Phe。
衍生自CD4受体的通用序列(I)的肽具有α螺旋结构，接着是β-折叠(betasheet)。氨基酸Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Cys-Xaak-Cys-Xaal以主要途径参与和gp120的结合。这些肽拥有与sCD4(可溶性CD4)相似的IC50(对gp120的亲和力)。
衍生自CD4受体的通用序列(I)的肽可以通过常规的固相化学合成技术制备，例如根据Fmoc固相肽合成方法制备(“Fmoc solid phase peptide synthesis，a practicalapproach”，W.C.Chan和P.D.White编辑，Oxford University Press，2000)和/或通过基因重组制备。
优选，衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽的序列选自序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2，有利地为SEQ ID No.1。
在本发明中，术语“接头”是指通过如下所定义的双官能团化合物与衍生自CD4受体的肽和有机分子偶联获得的接头。
因此，接头的长度随使用的双官能团化合物而变化。
特别地，接头将有利地选自：
当Z代表巯基，且选自：
当Z代表马来酰亚胺基团或卤素原子。
在一个优选的具体实施方案中，接头将选自：
因此，这些接头对应于应用琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺丙酰胺基]己酸酯(SMPH)，NHS-PEOn-马来酰亚胺，其中n代表2至24之间的整数，有利地为2、4、8或12，SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯)和SATP(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯)，作为双官能团化合物。
在另一个优选的具体实施方案中，所述接头是
通式(II)的有机分子代表肝素的特定形式，其具有低度的聚合作用，为了在分子上引入官能团Z被修饰。
本发明中所用的术语“O-保护基”是指保护羟基避免在合成过程中发生不良反应的基团，例如Greene中公开的那些O-保护基“Protective Groups In Organicsynthesis”，(John Wiley&Sons，New York(1981))。O-保护基包括取代或非取代的甲基或烷基醚，例如甲氧基甲基(MOM)、苄氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-(三甲基硅烷基)乙氧基甲基、叔丁基、苄基和三苯基甲基，取代或非取代的苄基醚，例如对甲氧基苄基，四氢吡喃基醚，取代乙基醚，例如2，2，2-三氯乙基，硅醚，例如三甲基硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基硅烷基(TBS)和叔丁基二苯基硅烷基；和通过羟基和羧酸反应制备的酯，例如乙酸酯、丙酸酯、苯甲酸酯等等。尤其是，烯丙基或乙酰基是本发明的“O-保护基”。
有利地、它是甲基、苄基或对甲氧苄基。
本发明中所用的术语“烷基”是指含有1-6个碳原子的直链或支链、取代或未取代烷基，包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等等。
本发明中所用的术语“酰基”是指烷基-CO基团，其中烷基如上所定义。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
在一个优选的具体实施方案中，Z代表巯基。
在一个特定具体实施方案中，基团R1都相同。
在另一个特定具体实施方案中，基团R1选自氢原子、甲基或苄基。
有利地，R2为氢原子、甲基或对甲氧苄基(pMBn)。
有利地，R3为硫酸或磷酸根(phosphate moiety)。
更有利地，R3都相同，特别为磷酸根。
有利地，R4都相同，特别为硫酸根。
有利地，R5都相同，特别为氢原子。
在一个优选的具体实施方案中，所述有机分子将选自：
有利地，A代表通式-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-的基团。
有利地Z代表巯基。
在一个优选的具体实施方案中，所述有机分子选自：
(化合物20)，
(化合物21)，或
(化合物22)。
尤其是，本发明的共轭分子可以是下列分子之一：
而且，根据本发明的第二方面，本发明涵盖含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通过接头偶联至有机分子，其中：
■所述衍生自CD4受体的肽含有如上所定义的通用序列(I)，且
■所述有机分子代表选自肝素或硫酸乙酰肝素的聚阴离子，其中糖醛酸部分可以是葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸，聚合度dp为2-24，其中基本上聚阴离子的所有游离羟基被O-保护基GP″取代，这些GP″相同或不同，且其中所述聚阴离子被修改以便于其带有选自卤原子、巯基或马来酰亚胺基的官能团，
所述接头的一个末端共价结合至存在于衍生自CD4受体的肽的通用序列(I)中的氨基酸残基Lys的游离氨基(-NH2)，且所述接头的另一个末端共价结合至有机分子的官能团。
本发明中的术语“基本上”是指所有或几乎所有聚阴离子的游离羟基被O-保护基取代，优选70％，更优选80％，甚至更优选90％的游离羟基被取代。
衍生自CD4受体的肽的特性与上面所定义的相同。
尤其是，P3优选含有至少一个碱性氨基酸，所述碱性氨基酸甚至更优选为精氨酸。
根据一个优选的具体实施方案，Xaaf代表在通用序列(I)中的TPA。
根据另一个优选的具体实施方案，Xaaj代表Phe。
优选，衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽的序列选自序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2，有利地为SEQ ID No.1。
所述接头如上所定义，有利地选自：
在一个优选的具体实施方案中，接头将选自：
其中K代表2至24之间的整数，有利地为2、4、8或12，或当官能团代表巯基，且选自：
在另一个优选的具体实施方案中，所述接头为
术语“O-保护基”具有如上所定义的相同含义。有利地为甲基、苄基或对甲氧苄基。
优选地，所述聚阴离子不太长，在糖醛部分不具有3-O-硫酸根基团，由于它将具有抗凝活性，该活性在本发明中是不受欢迎的，且聚阴离子将与各种蛋白质，也就是凝血酶和抗凝血酶III形成非特异性的键。聚阴离子优选具有聚合度dp为2-24，有利地4-18，优选4-14。聚阴离子优选具有至少两个阴离子基团/二糖。
肝素十二糖(HP12)和肝素四糖(HP4)可以作为实例被引用，尤其是HP12。
有利地，所述官能团是巯基。
在一个特定具体实施方案中，GP″基团是相同的。
有利地，这些GP″基团是甲基或苄基。
在一个优选的具体实施方案中，带有官能团的聚阴离子选自：
其中
■A 代表选自下列通式：-(CH2)p-NH-CO-(CH2)q-、-(CH2-CH2)-(O-CH2-CH2)p-NH-CO-(CH2)q-、-(CH2)p-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-或-(CH2-CH2)-(O-CH2-CH2)p-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-的基团，其中p代表1至10之间的整数，且q代表1至10之间的整数，且
■Z代表卤素原子、巯基或马来酰亚胺基。
有利地，A代表通式-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-的基团。
有利地，Z代表巯基。
在一个优选的具体实施方案中，所述有机分子选自：
(化合物20)，或
(化合物21)。
在另一个特定具体实施方案中，本发明的共轭分子选自下列分子：
根据第三方面，本发明涵盖如上所定义的共轭分子，其作为药物的应用，尤其是用于艾滋病的治疗。
如上所定义的共轭分子在用于抗病毒治疗，尤其是艾滋病治疗的药物的生产中的应用也是本发明的目标。
本发明也涉及抗病毒治疗的方法，优选抗艾滋病治疗的方法，包括向需要治疗的患者施用本发明的共轭分子。
根据第四方面，本发明涵盖含有如上所定义的共轭分子和药学上可接受载体的药物组合物。
在用于口服、鼻内、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、局部或直肠给药的本发明药物组合物中，可以将活性成分以给药的单位形式，与常规药物载体混合，施用给动物或人类。给药的合适的单位形式包括用于口服给药的形式，例如片剂、明胶胶囊、粉末、颗粒和口服溶液或悬浮液，用于舌下和口腔给药的形式，用于皮下、肌肉内、静脉内、鼻内或眼内给药的形式和用于直肠给药的形式。
根据第五方面，本发明涵盖制备如上所定义的共轭分子的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：
a.将如上所定义的衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽与带有两个活性基团的双官能团的化合物接触，以便于两个活性基团中的一个与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH2)形成共价键，从而获得带有双官能团中第二活性基团的活化肽，且
b.将步骤(a)中获得的活化肽与带有如上所定义的官能团的有机分子，或与相当于如上所定义的带有巯基的有机分子的有机分子接触，其中所述巯基(SH)已被巯基保护基保护，以便于所述活化肽的活性基团与有机分子的受保护或不受保护的官能团形成共价键，从而获得所述共轭分子。
因此，官能团是指卤素原子、马来酰亚胺基、巯基或巯基保护基。
步骤(a)获得的化合物在本发明中将一般被称为“活化肽”、“活化miniCD4”、“活化CD4肽”或“活化miniCD4肽”。
本发明中所用的术语“巯基保护基”是指被S-保护基取代的硫原子，从而保护巯基避免在合成过程中发生不良反应。常规使用的S-保护基公开于Greene中，“Protective Groups In Organic Synthesis”(John Wiley&Sons，New York(1981))。S-保护基包括取代或未取代的苄基醚，例如对甲氧苄基或对硝基苄基，三苯甲基醚，硫醚，硫代乙酸酯或硫缩醛。
有利地，受保护的巯基为硫代乙酰基。
当有机分子带有巯基保护基时，所述保护基将在步骤(b)前或步骤(b)期间脱保护，从而恢复游离巯基且允许该巯基与活化肽的活性基团偶联。
衍生自CD4受体的肽的特性与上面所定义的相同。
尤其是，P3优选含有至少一个碱性氨基酸，所述碱性氨基酸甚至更优选为精氨酸。
根据一个优选的具体实施方案，Xaaf代表在通用序列(I)中的TPA。
根据另一个优选的具体实施方案，Xaaj代表Phe。
优选，衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽的序列选自序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2，有利地为SEQ ID No.1。
在本申请中的术语“双官能团化合物”是指并入两个活性基团的任何化合物其中两个活性基团的一个能与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH2)形成共价键，且另一个活性基团能与有机分子形成共价键。
本领域技术人员非常清楚能用于本发明框架内的双官能团化合物。也就是，本发明的双官能团化合物可以选自下列非限制性的名单：NHS-PEOn-马来酰亚胺其中n是2至24之间的整数，有利地n＝2、4、8或12，硫代-KMUS(N-[k-马来酰亚胺基十一烷酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯)，LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯])，KMUA(N-k-马来酰亚胺基十一烷酸)，SMPB(琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯)，硫代-SMPB(硫代琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯)，硫代-SIAB(N-硫代琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯)，SLAB(N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸)，硫代-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯)，EMCA(N-e-马来酰亚胺基己酸)，EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酰氧基]琥珀酰亚胺酯)，SMCC(琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)，硫代-SMCC(硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)，MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，硫代-MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯)，GMBS(N-[g-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯)，硫代-GMBS(N-[g-马来酰亚胺基丁酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯)，SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯)，SBAP(琥珀酰亚胺基3-[溴乙酰氨基]丙酸酯)，BMPS(N-[β-马来酰亚胺基丙酰氧基]琥珀酰亚胺酯)，BMPA(N-β-马来酰亚胺基丙酸)，AMAS N-(a-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯)，SIA(N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯)，SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β马来酰亚胺基丙酰氨基]己酸酯)，SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯)或SATP(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯)。
根据本发明，NHS-PEOn-马来酰亚胺其中n＝2也被称为琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰氨基)-二甘醇]酯，
NHS-PEOn-马来酰亚胺其中n＝4也被称为琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰氨基)-四甘醇]酯，
NHS-PEOn-马来酰亚胺其中n＝8也被称为琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰氨基)-八甘醇]酯，
NHS-PEOn-马来酰亚胺其中n＝12也被称为琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰氨基)-十二甘醇]酯。
能与存在于通用序列(I)中的氨基酸残基Lys的游离氨基(-NH2)形成共价键的活性基团可以是任何活性酯基团。
优先地，能与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH2)形成共价键的活性基团是活性基团N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)或N-羟基-4-硫代-琥珀酰亚胺酯，有利地为NHS活性基团。
甚至更优选，双官能团化合物的两个活性基团是不同的(杂双官能团)，且两个基团中的一个为NHS活性基团或N-羟基-4-硫代-琥珀酰亚胺酯，有利地为NHS活性基团。
有利地，当有机分子的官能团为巯基或巯基保护基时，能与有机分子的官能团形成共价基团的双官能团化合物的活性基团为卤素原子或马来酰亚胺基，当有机分子的官能团为卤素原子或马来酰亚胺基时，所述双官能团化合物的活性基团为如上所定义的巯基或巯基保护基。
根据一个优选的具体实施方案，当有机分子的官能团为巯基或巯基保护基时，双官能团化合物选自琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺丙酰胺基]己酸酯(SMPH)或NHS-PEOn-马来酰亚胺，n为2至24之间的整数，有利地为2、4、8或12。
根据一个特别优选的具体实施方案，双官能团化合物为SMPH。
SMPH的分子结构如下：
根据另一个特别优选的具体实施方案，所述双官能团化合物为琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰氨基)-二甘醇]酯，也称为NHS-PEO2-马来酰亚胺，琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰氨基)-四甘醇]酯，也称为NHS-PEO4-马来酰亚胺，琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰氨基)-八甘醇]酯，也称为NHS-PEO8-马来酰亚胺，琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰氨基)-十二甘醇]酯，也称为NHS-PEO12-马来酰亚胺，更优选所述双官能团化合物为NHS-PEO2-马来酰亚胺。
NHS-PEO2-马来酰亚胺的分子结构如下：
根据另一个特别优选的具体实施方案，当有机分子的官能团为卤素原子或马来酰亚胺基时，所述双官能团化合物选自N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)或N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)。
SATA的分子结构如下：
SATP的分子结构如下：
所述双官能团化合物可以从PIERCE(Rockford，IL)获得。
再次优选，当Xaaf代表TPA时，本发明的方法包括用于制备衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽的初步步骤，其中当Xaaf代表衍生自CD4受体的肽的序列(I)中的TPA时，所述方法包括用于制备所述肽的初步步骤，所述初步步骤包括用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)接触衍生自CD4受体的具有下列通用序列(III)的肽：
P1-Lys-Cys-P2-Cys-P3-Cys-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Cys-Xaak-Cys-Xaal-Xaam，(III)
其中P1至P3和Xaag至Xaam如通用序列(I)中所定义，
从而在衍生自CD4受体的具有通用序列(III)的所述肽的N-末端引入TPA。
SPDP的分子结构如下：
此外，作为能通过共价键偶联至有机分子的活性基团的实例，可以引用下列基团：马来酰亚胺或溴乙酰基，S-S-吡啶或硫代乙酰基。
当miniCD4被受保护的巯基(例如，硫代乙酰基)活化，其有可能进行偶联至带有例如马来酰亚胺基的有机分子。这有可能当聚阴离子性多糖被巯基或受保护的巯基，例如硫代乙酰基官能化时造成问题。那么，这称为“逆偶联”。
优选地，所述活性基团为马来酰亚胺基。
当SMPH为使用的双官能团化合物时，本发明的活化肽(其活性基团为马来酰亚胺)的分子结构如下：
在本申请中，术语“SMPH活化的miniCD4肽”是指本发明的活化肽，其氨基酸Lys残基经衍生自SMPH的接头共价结合，有利地通过胺键，结合至马来酰亚胺活性基团。
根据另一个有利的具体实施方案，当NHS-PEO2-马来酰亚胺为使用的双官能团化合物时，本发明的活化肽(其活性基团为马来酰亚胺基)的分子结构如下：
在本申请中，术语“经PEO2接头的马来酰亚胺活化的miniCD4肽”是指本发明的活化肽，其氨基酸Lys残基经PEO2接头共价结合，有利地通过胺键，结合至马来酰亚胺活性基团。
根据另一个优选，所述活性基团为硫代乙酰基。
例如，当SATA为使用的双官能团化合物，本发明的活化肽(其活性基团为硫代乙酰基)的分子结构如下：
相似地，当SATP为使用的双官能团化合物，本发明的活化肽(其活性基团为硫代乙酰基)的分子结构如下：
硫代乙酰基为巯基的受保护形式。为了巯基的脱保护，我们使用例如羟胺。该步骤与偶联至有机分子中的马来酰亚胺基同时进行。
在本申请中，术语“SATA活化的miniCD4肽”和“SATP活化的miniCD4肽”是指本发明的活化肽，其氨基酸Lys残基经衍生自SATA或SATP的接头共价结合，有利地通过胺键，结合至受保护的巯基(例如，硫代乙酰基)。
因此，根据一个特定的具体实施方案，活化肽的活性基团为马来酰亚胺基，且有机分子带有巯基或硫代乙酰基。
当SMPH作为双官能团化合物用于偶联时，含有衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽，所述肽偶联至带有巯基或受保护的巯基，例如硫代乙酰基的被修饰的聚阴离子的本发明共轭分子的分子结构如下：
当NHS-PEO2-马来酰亚胺作为使用的双官能团化合物时，其也可以是下列共轭分子：
根据另一个具体实施方案，本发明的共轭分子含有衍生自CD4受体的肽和带有马来酰亚胺或卤素的有机分子，所述肽含有通用序列(I)或由通用序列(I)组成，优选序列SEQ ID No.1。
根据另一个特定具体实施方案，活化肽的活性基团为硫代乙酰基，且有机分子带有马来酰亚胺或卤素。
例如，当SATA用于偶联时，含有衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽，所述肽偶联至带有马来酰亚胺基的有机分子的共轭分子的分子结构如下：
有机分子的马来酰亚胺基
根据本发明，所述聚阴离子性多糖(本发明的有机分子)可以通过肝素(HP)或硫酸乙酰肝素的部分解聚使用酶方法，例如通过肝素酶的方式，或化学方法，例如亚硝酸的方式进行制备。当以化学方法获得时，乙酰肝素可以通过N-硫酸化或N-乙酰化的葡萄糖胺或未取代的葡萄糖胺(在N位置与具有不同比例硫酸化的糖醛酸(葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸)结合)的存在而定义。这些低聚糖的结构类似物可以通过化学合成而获得。
相比于重组化合物或天然来源的化合物的共轭，这样的合成方法具有很多优点。在治疗用途的框架内，除了完全确定的结构，合成的化合物常常是优选的，因为可以避免由病原体引起的污染，特别是对HP片段而言朊病毒蛋白引起的污染。此外，合成的HP片段相比于它们的天然同等物具有更好的均匀性。例如，合成的HP12完全没有3-O-硫酸根，其对肝素的抗凝活性负责。
尤其是，通式(II)的有机分子可以通过类似Lubineau等人(Chem.Eur.J.2004，10，4265-4282)和Noti等人(Chem.Eur.J.2006，12，8664-8686)所述的方法制备。
本发明制备活化肽和共轭分子的方法的操作条件为本领域技术人员熟知，如果需要可以采用这些条件。
下面的实施例和附图阐明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1：阐明本发明共轭分子的生物作用的图表。
图2：miniCD4和gp120的相互作用。
通过Biacore评价合成的miniCD4对gp120的亲和力。结果证实发明人“指定”具有单一赖氨酸的miniCD4，是CD4蛋白质的功能类似物。
上面的图：结合至mCD4表面的gp120；为了芯片制备，将生物素连接至mCD4的Lys侧链。
中间的图：结合至sCD4表面的gp120被nM浓度的mCD4抑制。
下面的图：mCD4不存在时，gp120不与mAb 17b结合(mAb与CD4i表位相互作用，且mAb被用作共受体替代物)。由于mCD4与gp120复合促进gp120结合至mAb 17b表面，所以该实验显示mCD4诱导CD4i表位的暴露。
图3：经PEO2接头合成马来酰亚胺活化的miniCD4肽的图表。
图4：图表代表gp120(YU2或MN)和CD4的结合。经单独的CD4表面(细线)或结合至mCD4的CD4表面(粗线，上面的图)或共价连接至mCD4-HS12Lb(25)的CD4表面(粗线，下面的图)注射gp120。
图5：图表代表gp120(MN)和HS的结合。经单独的HS表面(细线)或结合至mCD4的HS表面(粗线，左上图)，结合至HS12Lb(19)的HS表面(粗线，右上图)，mCD4和HS12Lb非共价连接的HS表面(粗线，左下图)或共价连接mCD4-HS12Lb(25)的HS表面(粗线，右下图)注射gp120。
图6：图表代表gp120(YU2或MN)和mAb 17b的结合。经单独的mAb 17b表面(细线)或结合至mCD4的mAb 17b表面(粗线，上面的图)或共价连接mCD4-HS12Lb(25)的mAb 17b表面(粗线，下面的图)注射gp120。
图7：图表代表gp120MN(上面的图)或YU2(下面的图)和mAb 17b的结合。经具有增加浓度的非共价结合mCD4和HS12Lb(19)(黑)或共价连接mCD4-HS12Lb(25)(白)的mAb 17b表面注射gp120。
图8：图表代表gp120和mAb 17b的结合。在具有mCD4(T)或mCD4和GPR1，HS4Bz(17)，HS12Lb(19)，HS12Bz(18)非共价连接(黑)或共价连接(白)的mAb 17b表面上注射gp120。
图9：mCD4-HS12(3)结合至gp120揭露并阻碍gp120共受体的结合位点。传感图的覆盖图显示，在(从高到低)76、51、37、22、15和10nM，mCD4-HS12(25)与固定的YU2(a)或MN(b)gp120的结合。在200nM，经YU2(c，e)或MN(d，f)活化的传感芯片(sensorchip)上注射mCD4(黑)或mCD4-HS12(25)(粗线)持续5分钟(100-400秒)，之后注射mAb 17b(c，d)或mAb E51(e，f)，再持续5分钟(400-700秒)。根据时间(以秒计)记录结合响应(以RU计)。
图10：对于含有多个Lys序列内的被选择的赖氨酸(下面的图)和在含有单个Lys序列内的被选择的赖氨酸(上面的图)，用于马来酰亚胺标记赖氨酸的现有技术的策略。
图11：与mCD4(深灰色)复合的YU2GP120(淡灰色)的结构，显示Lys5位置接近于由R419、K421和K432构成的HS结合位点，因此代表相比于Lys11，用于生产HS衍生的低聚糖的更合适的连接位点。
具体实施方式
实施例：
实施例I合成的示意图
I.1miniCD4肽和申请WO 03/08900中提及的聚阴离子之间的偶联方法的合成图表(Najjam S.等人，Cytokine 1997，9(12)：1013-1022)。
胺基偶联至糖的还原末端
I.2本发明偶联方法的合成示意图(用SMPH作为双官能团基团的实例)
经引入马来酰亚胺基的miniCD4活化方法允许具有游离巯基(SH)或受保护的巯基(例如硫代乙酰基)的任何化合物的偶联。因此在肝素(或任何其它多糖)将预先被巯基衍生化的情况下，该活化的miniCD4允许获得miniCD4-肝素共价偶联分子。
实施例II 活化miniCD4与SMPH或SATP的化学合成
II.1miniCD4的合成
依照Fmoc固相肽合成(“Fmoc solid phase peptide synthesis，a practical approach”，W.C.Chan和P.D.White编辑，Oxford University Press，2000)的方法学使用AppliedBiosystems 433肽合成器合成小肽CD4(mini-peptide CD4)。用0.1mmole的酰胺-Fmoc树脂开始，通过偶联被Fmoc保护的10氨基酸当量进行肽链阶段的延长，通过HATU/DIEA混合物活化。通过在肽-树脂上的SPDP偶联(在DMF中1.6当量)引入N-末端硫代丙酰基。
在通过TFA/H2O/EDT/TIS(94/2.5/2.5/1)裂解后，通过在冷乙醚中沉淀回收肽。冷冻干燥后，在DTT的20％乙酸溶液中还原粗肽(156mg)过夜，并通过反相MPLC经NucleoprepC18柱，20μm，
(26x313mm)纯化，采用线性梯度30-90％从B至A，经过60分钟，流速20ml/分钟(B＝80％CH3CN/20％水溶液含0.08％TFA；A＝100％水溶液含0.08％TFA)。收集纯化部分并冷冻干燥。然后使用过夜GSH/GSSG处理折叠肽。通过MPLC纯化折叠的肽，采用20-80％梯度，经过60分钟，得到8.7mg的mini-CD4。通过分析型的反相HPLC，经Nucleosil柱C18，5μm，
(4.6x150mm)证实纯度(93.5％)，采用线性梯度25-35％CH3CN水溶液含0.08％TFA，经过20分钟，流速1ml/分钟(保留时间＝15.44分钟)。
ES+MS：2896.32±0.23；理论值：2896.49；产率：5.5％
II.2用SMPH活化Mini-CD4
通过与4当量SMPH在磷酸盐缓冲液pH＝8中反应将马来酰亚胺基引入到mini-CD4的侧面Lys链。通过HPLC控制反应。15分钟后达到100％偶联。经反相HPLC的半制备型Nucleosil C18柱，5μm，
(10x250mm)纯化，采用线性梯度25-45％CH3CN水溶液含0.08％TFA，经过20分钟，流速6ml/分钟，通过分析型RP-HPLC控制用SMPH活化的mini-CD4的最终纯度(97.7％)，采用线性梯度25-45％(保留时间＝13.21分钟)。
ES+MS：3160.83±0.29；理论值：3160.78；产率：1.9mg(67％)。
SMPH活化的miniCD4肽的最终HPLC Elugram
大约2mg/ml
注射5μl ds 25-45
样品名称：FBX13082-190
表面百分比：
分类：信号
倍增器：1.0000
稀释：1.0000
使用倍增器和具有内标的稀释因子
信号1：DADI A，Sig＝230.4Ref＝关闭
表1
采用改良的积分器得到的结果。
SMPH活化的miniCD4肽的质谱
用于+Q1MCA(10扫描)的超质量(hypermass)计算的拷贝：来自FBX13082-190/InfMSpo/c/03/08/05
用于超质量计算的标准
介质(Agent)：，质谱：1.0079，电荷：1，得到的介质
电荷估测的公差(Tolerance for charge estimation)：0.1000
质量估测间的公差(Tolerance between mass estimations)：20.000
表2
| 峰 | 强度 | 电荷 | 计算的电荷 | 超质量估测 |
| 791.29 | 322500.00 | 4 | 4.00218 | 3161.12 |
| 1054.52 | 41316500.00 | 3 | 3.00218 | 3160.54 |
| 1581.43 | 7411500.00 | 2 | 1.99944 | 3160.84 |
估计的最终质量：3160.83
标准偏差：0.29
II.3用SATP活化的Mini-CD4
通过与1当量SATP在磷酸盐缓冲液pH＝8中反应将硫代乙酰基引入到mini-CD4的侧面Lys链。通过HPLC控制反应。3分钟后达到46％偶联。经半制备型反相HPLC的Nucleosil C18柱，5μm，
(10x250mm)分离被SATP活化的mini-CD4，采用线性梯度20-40％CH3CN水溶液含0.08％TFA，经过20分钟，流速6ml/分钟。通过分析型RP-HPLC控制用SATP活化的mini-CD4的最终纯度(100％)，采用线性梯度25-45％(保留时间＝13.88分钟)。
ES+MS：3027.31±0.41；理论值：3027.66。该偶联反应进行一次，且能通过直接加入2当量的SATP使其最佳化。
SATP活化的miniCD4肽的最终HPLC Elugram
25-45在20分钟内
样品名称：FBX13082-168-2
表面百分比：
分类：信号
倍增器：1.0000
稀释：1.0000
使用倍增器和具有内标的稀释因子
信号1：DADI A，Sig＝230.4Ref＝关闭
表3
采用改良的积分器得到的结果。
SATP活化的miniCD4肽的质谱
用于+Q1MCA(10扫描)的超质量计算的拷贝：来自FBX13082-186-2/Infpo/c/29/07/05
用于超质量计算的标准
介质：，质谱：1.0079，电荷：1，得到的介质
电荷估测的公差：0.1000
质量估测间的公差：20.000
表4
| 峰 | 强度 | 电荷 | 计算的电荷 | 超质量估测 |
| 757.72 | 125000.00 | 4 | 3.99687 | 3026.85 |
| 1010.22 | 45016000.00 | 3 | 2.99687 | 3027.64 |
| 1514.73 | 23987000.00 | 2 | 2.00039 | 3027.45 |
估计的最终质量：3027.31
标准偏差：0.41
实施例III在确定的位置含有一个和唯一的赖氨酸残基的通用序列(I)的选择关联性
通过使用EZ-Link-NHS-(PEO)4-生物素PIERCE试剂(Rockford，IL)经(PEO)4-生物素在Lys上衍生的miniCD4肽的合成来验证在确定的位置含有一个和唯一的赖氨酸残基的通用序列(I)的选择关联性。
在通用序列(I)的确定位置的生物素衍生物的引入并没有改变gp120和miniCD4的结合(见图2的Biacore测定)。
各种合成方法不是最优化的，应该能获得更好的产率。
实施例IV 经PEO2接头的马来酰亚胺活化的mini-CD4(miniCD4-PEO2-mal)的化学合成(见图3)
mCD4-PEO2-马来酰亚胺在接头类型上不同于化合物mCD4-SMPH。因为溶解度，亲水性更好的氧化聚乙烯(PEO2)接头被引入到miniCD4和马来酰亚胺基之间。
合成：将10mg的mCD4(MW：2897；3.4mmoles)的1ml的H2O溶液稀释在1ml的磷酸盐缓冲液0.1M pH 8中。搅拌下将4.5mg的NHS-PEO2-马来酰亚胺(MW：325；13.8mmoles；4当量)加入至20μl的DMSO的混浊溶液中。10分钟后，85％(HPLC)的原料转化成马来酰亚胺衍生物。由于马来酰亚胺基在pH 8的低的稳定性，将偶联反应直接置于10％CH3CN水溶液含0.08％TFA平衡的SepaK C18柱上。用50％CH3CN洗脱马来酰亚胺衍生物。冷冻干燥后，用半制备型柱纯化该化合物。产率：5.2mg(48％)，最终纯度：77％。
ES+：3205.3938(理论上单一同位素的M：3205.4211)，QTOF Micro WatersMaxEnt1。
HPLC条件：
分析型：Nucleosil 5C18
(4.6x 150mm)；线性梯度25-45％CH3CN水溶液含0.08％TFA，经过20分钟，流速1ml/分钟。检测：230nm。mCD4Rt＝10.7分钟；mCD4-PEO2-Mal Rt＝12.8分钟。
半制备型：Nucleosil 5C18
(10x 250mm)；线性梯度25-45％CH3CN水溶液含0.08％TFA，经过20分钟，流速6ml/分钟。
检测：230nm。mCD4-PEO2-Mal Rt＝11.4。
实施例V本发明共轭分子的化学合成
V.1.合成示意图
方案1：在二糖结构单元(building block)1上引入受保护的氨基接头(m＝5)。
a)TMSOTf，
CH2Cl2，-40至-10℃，79％(α/β：2/8)。b)TFA，CH2Cl2，RT，93％。
方案2：受保护的低聚糖5，8和10的合成。
a)TMSOTf，
CH2Cl2，-40至-10℃，80％。b)TFA，CH2Cl2，RT，93％6，91％9。c)7(1.3eq.)，TBDMSOTf，
CH2Cl2，-40至-10℃，78％8以及10％未反应的6，85％10以及6％未反应的9。
方案3：硫酸化低聚糖15，18和19的制备。
a)K2CO3，MeOH/CH2Cl2(10/4)，0℃，71％11a以及13％11b，80％12a以及17％12b。b)1，3-丙二硫醇，NEt3，MeOH，75％(12)，86％(13)。c)吡啶·SO3，吡啶，16h RT，20h 55℃，51％(15)，52％(16)。d)LiOH，H2O2，24h RT，50％(17)；KOH，H2O2，48h 37℃，51％(18)。e)Pd(OH)2，磷酸盐缓冲水溶液0，1M pH7.0/tBuOH(6/2)，定量的(19)。
V.2.有机分子(多糖)的化学合成
根据Lubineau等人(Chem.Eur.J.2004，10，4265-4282)和WO 2004/000887合成化合物1、2和7。
化合物3：5-(乙酰氨基-N-苄氧基羰基)戊基(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-4-O-(4-甲氧基苄基)-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯(idopyranosyluronate))-(1-＞4)-O-6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷。
将受体2(50mg，0.18mmol，2eq)和亚胺酸酯(imidate)1(83mg，0.09mmol)用甲苯共沸干燥并溶解于干燥CH2Cl2(400μL)中。加入粉末状分子筛(300mg)并在氩气下室温搅拌混合物30分钟。将溶液冷却至-40℃并加入TMSOTf(0.2M在CH2Cl2中，90μL，0.018mmol，0.2eq)。在此温度下搅拌反应液15分钟，然后经过30分钟升温至-10℃。然后用NEt3溶液(0.2M在CH2Cl2中，180μL，0.036mmol，0.4eq)淬灭反应。过滤溶液，然后将溶液用硅胶快速层析法纯化(甲苯/AcOEt6∶1至1∶1)，得到分离的双糖3的α和β端基异构体(76mg，79％)，比例为α/β≈2/8。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.43-7.23(m，15H，Ph)，7.13(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-OMe)，6.83(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-OMe)，5.25(d，J1，2＝4.5Hz，1H，H-1B)，5.23(s，2H，CH 2 Ph(Cbz))，4.87(t，J1，2＝J2，3＝4.5Hz，1H，H-2B)，4.82(d，J＝11.0Hz，1H，CH 2 Ph)，4.73(d，J5，4＝4.0Hz，1H，H-5B)，4.71(d，J＝11.0Hz，1H，CH 2 Ph)，4.70(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.64(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.46(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.42(dd，J6a，6b＝11.5Hz，J6a，5＝2.0Hz，1.5H，H-6a A)，4.40(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.21(d，J1，2＝7.5Hz，1H，H-1A)，4.18(dd，J6a，6b＝11.5Hz，J6b，5＝4.0Hz，1H，H-6bA)，3.93(t，J4，5＝J4，3＝9.5Hz，1H，H-4A)，3.85(dt，Ja，a’＝9.5Hz，Ja，b＝6.5Hz，1H，H-a)，3.81(t，J3，4＝J4，5＝4.0Hz，1H，H-4B)，3.80(s，1H，PhOMe)，3.76(dd，J2， 3＝4.5Hz，J3，4＝4.0Hz，1H，H-3B)，3.80-3.74(m，2H，H-e)，3.55(s，3H，COOMe)，3.52-3.38(m，2H，H-a’和H-5A)，3.35(dd，J2，3＝10.0Hz，J2，1＝7.5Hz，1H，H-2A)，3.31(t，J3，2＝J3，4＝9.5Hz，1H，H-3A)，2.50(s，3H，CH 3 NAc)，2.06(s，3H，CH 3 OAc)，2.03(s，3H，CH 3 OAc)，1.68-1.48(m，4H，H-b和H-d)，1.43-1.28(m，2H，H-c)；
13C NMR(100.6MHz，CDCl3)δ＝172.8，170.7，170.0，169.8(C＝O)，159.4(C-OMe，pMBn)，138.1，137.9，135.1，135.0(C季原子)，129.6，129.4，129.0，128.9，128.7，128.6，128.4，128.3，128.2，128.1，127.9，127.8，127.4(C原子)，113.7(CmpMBn)，102.1(C-1A)，97.9(C-1B)，80.9(C-3A)，75.3(C-4A)，74.9(CH2Ph)，74.8(C-4B)，74.4(C-3B)，73.1(C-5A)，73.0(CH2Ph)，72.4(CH2Ph)，70.5(C-5B)，70.1(C-2B)，70.0(CH2-a)，68.4(CH2Ph Cbz)，66.2(C-2A)，62.2(C-6A)，55.2(CH3，COOMe)，51.8(CH3，COOMe)，44.0(CH2-e)，29.0(CH2-b)，28.2(CH2-d)，26.8(CH3，NAc)，23.1(CH2-c)，20.9，20.8(CH3，OAc)；
ESI HR-MSm/z C54H64N4O17Na[M+Na]+的计算值：1063.4159，实测值：1063.4171。
化合物4：5-(乙酰氨基-N-苄氧基羰基)戊基(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷。
将TFA(160μL，2.16mmol，18eq)缓慢加入至双糖3(125mg，0.12mmol)的干燥CH2Cl2(1.6mL)溶液中，在氩气下搅拌所得的紫色溶液1小时。然后加入NEt3(350μL)并浓缩所得的溶液。快速层析残余物(硅胶，石油醚/AcOEt 85∶15至35∶65)得到所需的双糖4(103mg，93％)。
1H NMR(360MHz，CDCl3)δ＝7.45-7.22(m，15H，Ph)，5.20(s，2H，CH 2 Ph(Cbz))，5.03(br.s，1H，H-1B)，4.92(d，J5，4＝1.5Hz，1H，H-5B)，4.88(br.s，1H，H-2B)，4.72(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.71(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.66(d，J＝11.5Hz，l H，CH 2 Ph)，4.60(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.42(d，J6a，6b＝12.0Hz，J6a， 5＝2.0Hz，1H，H-6a A)，4.20(d，J1，2＝8.0Hz，1H，H-1A)，4.15(d，J6a，6b＝12.0Hz，J6b， 5＝4.0Hz，1H，H-6b A)，3.95(b r.d，J4，OH＝10.5Hz，1 H，H-4B)，3.90-3.84(m，1H，H-a)，3.82(t，J4，5＝J4，3＝10.0Hz，1H，H-4A)，3.74-3.66(m，3H，H-3B和H-e)，3.49-3.32(m，5H，在δ＝3.47含有单峰，PhOMe，H-a’和H-5A)，3.36(dd，J2，3＝10.0Hz，J2，1＝8.0Hz，1H，H-2A)，3.23(t，J3，2＝J3，4＝10.0Hz，1H，H-3A)，2.59(d，JOH，4＝10.5Hz，1H，OH)，2.46(s，3H，CH 3 NAc)，2.05(s，3H，CH 3 OAc)，2.04(s，3H，CH 3 OAc)，1.65-1.53(m，2H，H-b)，1.51(q，Jc，d＝Jc，d＝Je，d＝7.5Hz，2H，H-d)，1.41-1.30(m，2H，H-c)；
13C NMR(100.6MHz，CDCl3)δ＝172.8，170.5，169.4，169.1(C＝O)，137.9，137.2，135.1(C季原子)，128.6，128.4，128.2，128.1，127.9，127.4(C原子)，102.2(C-1A)，98.0(C-1B)，81.0(C-3A)，74.8(C-4A)，74.6(CH2Ph)，74.4(C-3B)，73.1(C-5A)，72.3(CH2Ph)，69.9(CH2-a)，68.5(C-5B)，68.4(CH2Ph Cbz)，67.7(C-4B)，67.2(C-2B)，66.4(C-2A)，62.2(C-6A)，52.0(CH3，COOMe)，43.9(CH2-e)，29.0(CH2-b)，28.2(CH2-d)，26.8(CH3，NAc)，23.1(CH2-c)，20.9，20.8(CH3，OAc)；
ESI HR-MS m/z C46H56N4O16Na[M+Na]+的计算值：943.35890，实测值：943.36018。
化合物5：5-(乙酰氨基-N-苄氧基羰基)戊基[(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-4-O-(4-甲氧基苄基)-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)]-(1-＞4)-O-6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷。
将受体4(80mg，0.087mmol)和亚胺酸酯1(107mg，0.12mmol，1.3eq)用甲苯共沸干燥并溶解于干燥CH2Cl2(360μL)中。加入粉末状的
分子筛(280mg)并在氩气下室温搅拌混合物30分钟。将溶液冷却至-40℃并加入TMSOTf(0.2M在CH2Cl2中，89μL，0.017mmol，0.2eq)。在此温度下搅拌反应液15分钟，然后经过30分钟升温至-10℃。然后用NEt3溶液(0.2M在CH2Cl2中，180μL，0.035mmol，0.4eq)淬灭反应。过滤溶液并将溶液置于Sephadex LH-20层析的顶部(CH2Cl2/MeOH，1∶1)。合并含有四糖5的部分，浓缩并用硅胶快速层析法纯化(甲苯/AcOEt 85∶15至35∶65)，得到四糖5(116mg，80％)。
1H NMR(360MHz，CDCl3)δ＝7.37-7.14(m，25H，Ph)，7.06(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-OMe)，6.76(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-OMe)，5.20(d，J1，2＝5.5Hz，1H，H-1B)，5.16(s，2H，CH 2 Ph(Cbz))，5.14(d，J1，2＝3.5Hz，1H，H-1D)，4.83(d，J＝10.0Hz，1H，CH 2 Ph)，4.86-4.79(m，2H，H-2D和H-1C)，4.79(t，J2，3＝J2，1＝5.5Hz，1H，H-2B)，4.69(d，J＝10.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.71-4.62(m，4H，H-5D，2CH 2 Ph)，4.59(s，2H，CH 2 Ph)，4.55(d，J＝10.5Hz，1H，CH 2 Ph)，4.52(d，J5，4＝5.0Hz，1H，H-5B)，4.39(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 PhOMe)，4.38-4.34(m，1H，H-6a A)，4.35(d，J＝11.5Hz，1H，CH 2 PhOMe)，4.28(d，J6a，6b＝12.0Hz，1H，H-6a C)，4.14(d，J1，2＝7.5Hz，1H，H-1A)，4.14-4.10(m，1H，H-6b A)，4.08(dd，J6b，6a＝12.0，J6b，5＝2.5Hz，1H，H-6b C)，3.92(t，J4，3＝J4，5＝4.0Hz，1H，H-4D)，3.88(t，J4，5＝J4，3＝9.0Hz，1H，H-4C)，3.83(t，J3，4＝J3，2＝4.0Hz，1H，H-3D)，3.78(t，J4，5＝J4，3＝10.0Hz，1H，H-4A)，3.81-3.62(m，9H，在δ＝3.73含有单峰，H-a，H-5C，H-4B，PhOMe，H-3B和H-e)，3.58(dd，J3，2＝10.0，J3，4＝9.0Hz，1H，H-3C)，3.49(s，3H，COOMe)，3.42(s，3H，COOMe)，3.42-3.31(m，2H，H-5A和H-a’)，3.29(dd，J2，3＝9.5，J2，1＝7.5Hz，1H，H-2A)，3.22(dd，J2，3＝10.0，J2，1＝3.5Hz，1H，H-2C)，3.21(dd，J3，4＝10.0，J3，2＝9.5Hz，1H，H-3A)，2.42(s，3H，CH 3 NAc)，2.03(s，3H，CH 3 OAc)，1.98(s，3H，CH 3 OAc)，1.96(s，3H，CH 3 OAc)，1.95(s，3H，CH 3 OAc)，1.61-1.48(m，2H，H-b)，1.47(q，Jc，d＝Jc，d＝Je，d＝7.5Hz，2H，H-d)，1.28(m，2H，H-c).
13C NMR(100.6MHz，CDCl3)δ＝159.5(C-OMe，pMBn)，138.0，137.8，137.2(C季原子)，129.6，128.7，128.6，128.5，128.4，128.3，128.2，128.0，127.9，127.8，127.5(C原子)，113.8(CmpMBn)，102.2(C-1A)，98.0(C-1D)，97.9(C-1B)，97.4(C-1C)，81.0(C-3A)，77.9(C-3C)，75.6(C-4C)，75.5(C-3B)，75.3(C-4B和C-4A)，75.0(CH2Ph)，74.8(CH2Ph)，73.7(C-3D)，73.5(CH2Ph)，73.3(CH2Ph)，73.1(C-5A)，72.9(C-4D)，72.6(CH2pMBn)，71.2(C-5B)，71.0(C-2B)，70.0(CH2-a)，69.7(C-5C)，69.3(C-5D)，68.8(C-2D)，68.4(CH2Ph Cbz)，66.2(C-2A)，62.8(C-2C)，62.2(C-6A)，61.7(C-6C)，55.3(CH3，OMepMBn)，52.0(CH3，COOMe)，51.7(CH3，COOMe)，44.1(CH2-e)，29.1(CH2-b)，28.3(CH2-d)，26.8(CH3，NAc)，23.1(CH2-c)，20.9，20.7(CH3，OAc)；
IR(薄膜)：v＝3021(vC-H原子)，2948，2933，2833(vC-H脂肪族)，2110(vN3)，1741(vC＝O)，1618，1550，1509，1452，1369，1227；
[α]D 28＝-8.0833(c＝1.2，在CH2Cl2中)；
ESI HR-MSm/zC85H99N7O29Na[M+Na]+的计算值：1704.63849，实测值：1704.63252。
化合物8：5-(乙酰氨基-N-苄氧基羰基)戊基[(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-4-O-(4-甲氧基苄基)-α-L-吡喃艾杜糖醛酯)-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L--吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)]-(1-＞4)-O-6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷。
用CH2Cl2(850μL)中的TFA(87μL，1.18mmol)处理四糖5(110mg，0.065mmol)，如二糖3中所述，得到95mg四糖6(93％)。将受体6(95mg，0.061mmol)和亚胺酸酯7(123.5mg，0.079mmol，1.3eq)用甲苯共沸干燥并溶解于干燥CH2Cl2(900μL)中。加入粉末状的
分子筛(325mg)并在氩气下室温搅拌混合物30分钟。将溶液冷却至-40℃并加入TBDMSOTf(0.2M在CH2Cl2中，60μL，0.012mmol，0.2eq)。在此温度下搅拌反应液15分钟，然后经过30分钟升温至-10℃。然后用NEt3溶液(0.2M在CH2Cl2中，120μL，0.024mmol，0.4eq)淬灭反应并在此温度下搅拌15分钟。然后将溶液直接置于Sephadex LH-20层析的顶部(CH2Cl2/MeOH，1∶1)并用硅胶快速层析法纯化(甲苯/AcOEt 85∶15至35∶65)，得到八糖8(141mg，78％)以及10mg未反应的受体6(10％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.45-7.10(m，47H，Ph)，6.75(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-OMe)，5.22(d，J1，2＝5.5Hz，1H，H-1B)，5.21(d，J1，2＝5.5Hz，2H，H-1D和H-1F)，5.14(s，2H，CH 2 Ph(Cbz))，5.13(d，J1，2＝3.5Hz，1H，H-1H)，4.89(d，J1，2＝3.0Hz，2H，H-1C或H-1E或H-1G和H-1E或H-1G或H-1C)，4.86-4.77(m，6H，H-1G或H-1C或H-1E，H-2B，H-2D，H-2F，H-2H和CH 2 Ph)，4.78(d，J＝11.0Hz，2H，CH 2 Ph)，4.72-4.53(m，14H，在δ＝4.79含有H-5H，13xCH 2 Ph)，4.50(d，J＝5.0Hz，2H，H-5D和H-5F)，4.48(d，J＝5.0Hz，1H，H-5B)，4.38(d，J＝11.0Hz，1H，CH 2 PhOMe)，4.35(d，J＝11.0Hz，1H，CH 2 PhOMe)，4.39-4.26(m，3H，H-6a A，H-6a C和H-6a E)，4.26(d，J6a，6b＝11.0Hz，1H，H-6a G)，4.13(d，J1，2＝8.0Hz，1H，H-1A)，4.15-4.03(m，4H，H-6b A，H-6b C，H-6b E和H-6b G)，3.96-3.88(m，3H，H-4H，H-4F和H-4D)，3.90-3.68(m，16H，在δ＝3.71含有单峰，H-4G，H-3D，H-3F，H-3H，H-4E，H-4C，H-4A，H-a，H-5G，H-5C，H-5E，H-4B，PhOMe和H-3B)，3.65(br t，Jd，e＝7.5Hz，2H，H-e)，3.61-3.50(m，3H，H-3G，H-3E和H-3C)，3.50(s，3H，COOMe)，3.47(s，3H，COOMe)，3.45(s，3H，COOMe)，3.41(s，3H，COOMe)，3.41-3.31(m，2H，H-a’和H-5A)，3.28(dd，J2，3＝9.5，J2，1＝8.0Hz，1H，H-2A)，3.24-3.15(m，4H，在δ＝3.20含有三重峰H-3A，H-2C，H-2E和H-2G)，2.40(s，3H，CH 3 NAc)，2.01(s，6H，CH 3 OAc)，2.00(s，3H，CH 3 OAc)，1.96(s，3H，CH 3 OAc)，1.94(2s，6H，CH 3 OAc)，1.93(s，6H，CH 3 OAc)，1.57-1.46(m，2H，H-b)，1.46(q，Jc，d＝Je，d＝7.5Hz，2H，H-d)，1.33-1.22(m，2H，H-c)；
13C NMR(100.6MHz，CDCl3)δ＝170.7，170.6，169.9，169.7，169.5，169.3(C＝O)，159.5(C-OMe，pMBn)，137.9，137.8，137.7，137.6，137.4，137.3(C季原子)，129.6，129.3，128.6，128.5，128.4，128.2，127.8，127.6(C原子)，113.8(CmpMBn)，102.1(C-1A)，98.0(C-1H)，97.9(C-1B，C-1D和C-1F)，97.7(C-1C或E或G和C-1E或G或C)，97.1(C-1G或C或E)，80.9(C-3A)，77.9，77.8，77.7(C-3C，C-3E和C-3G)，75.7(C-3B和C-4G)，75.6(C-4A和C-4B)，75.5(C-4C或E)，75.4(C-3D或F和C-4C或E)，75.2(C-3D或F)，75.0(2xCH2Ph)，74.8(4xCH2Ph)，74.1(CH2Ph)，74.0(CH2Ph)，73.6(C-3H和CH2Ph)，73.5，73.4(C-4D和C-4F)，73.2(CH2Ph)，73.1(C-5A)，72.6(CH2pMBn和C-4H)，71.3(C-5D或C-5F)，71.2(C-2D或C-2F)，70.6(C-5B)，70.4(C-2B或C-5F)，70.3(C-5D或C-2B)，70.1(C-2F或C-2D)，70.0(CH2-a)，69.7-60.6(C-5C，C-5E和C-5G)，69.1(C-5H)，68.7(C-2H)，68.4(CH2Ph Cbz)，66.2(C-2A)，63.0(C-2C或E)，62.8(C-2C或E和C-2G)，62.2(C-6A)，61.6(C-6C，C-6E和C-6G)，55.2(CH3，OMe pMBn)，52.0(3x CH3，COOMe)，51.7(CH3，COOMe)，44.0(CH2-e)，29.0(CH2-b)，28.3(CH2-d)，26.8(CH3，NAc)，23.1(CH2-c)，20.8，20.7(CH3，OAc)；
ESI HR-MS m/z C147H169N13O53Na[M+Na]+的计算值：2987.0821，实测值：2987.0845。
化合物10：5-(乙酰氨基-N-苄氧基羰基)戊基[(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-4-O-(4-甲氧基苄基)-α-L-吡喃艾杜糖醛酯0-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)]-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(甲基2-O-乙酰基-3-O-苄基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)]-(1-＞4)-O-6-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷。
用干燥CH2Cl2(1.2mL)中的TFA(61μL，0.825mmol)处理八糖8(136mg，0.046mmol)，如3中所述，得到119mg化合物9(91％。MALDI-TOF HR-MS m/zC139H161N13O52Na[M+Na]+的计算值：2867.0246，实测值：2867.0226)。将受体9(95mg，0.034mmol)和亚胺酸酯7(65mg，0.042mmol，1.3eq)用甲苯共沸干燥并溶解于干燥CH2Cl2(500μL)。加入粉末状的
分子筛(180mg)并在氩气下室温搅拌混合物30分钟。将溶液冷却至-40℃并加入TBDMSOTf(0.2M在CH2Cl2中，33μL，0.0067mmol，0.2eq)。在此温度搅拌反应液15分钟，然后经过30分钟升温至-10℃。然后用NEt3溶液(0.2M在CH2Cl2中，66μL，0.013mmol，0.4eq)淬灭反应。过滤溶液，然后将溶液直接置于Sephadex LH-20层析的顶部(CH2Cl2/MeOH，1∶1)。合并含有十二糖的部分，浓缩并用硅胶快速层析法纯化(甲苯/AcOEt 80∶20至50∶50)，得到十二糖10(120mg，85％)以及6mg未反应的受体9(6％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.36-7.03(m，67H，Ph)，6.76(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-OMe)，5.28-5.18(m，5H，H-1B，H-1D，H-1F，H-1H和H-1J)，5.16(s，2H，CH 2 Ph(Cbz))，5.14(d，J1，2＝3.5Hz，1H，H-1L)，4.95-4.89(m，4H，4来自H-1C，H-1E，H-1G，H-1I，H-1K)，4.88-4.75(m，10H；1来自H-1C，H-1E，H-1G，H-1I，H-1K和H-2B，H-2D，H-2F，H-2H，H-2J，H-2L和4x CH 2 Ph)，4.71(d，J＝11.0Hz，2H，CH 2 Ph)，4.71(br.s，1H，H-5L)，4.71-4.58(m，19H，19x CH 2Ph)，4.55-4.43(m，5H，H-5B，H-5D，H-5F，H-5H和H-5J)，4.41(d，J＝11.0Hz，1H，CH 2 PhOMe)，4.37(d，J＝11.0Hz，2H，CH 2 PhOMe和H-6a A)，4.35-4.24(m，5H，H-6a C，H-6a E，H-6a G，H-6a I，H-6a K)，4.14(d，J1，2＝8.0Hz，1H，H-1A)，4.17-4.15(m，6H，H-6b A，H-6b C，H-6b E，H-6b G，H-6b I和H-6b K)，3.95-3.72(m，25H，在δ＝3.73含有单峰，H-4A，H-4F，H-4H，H-4J，H-4L，H-4K，H-4D，H-3D，H-3F，H-3H，H-3J，H-3L，H-4C，H-4E，H-4G，H-4I，H-a，H-5C，H-5E，H-5G，H-5I，H-5K和PhOMe)，3.72(br.s，2H，H-3B和H-4B)，3.66(br t，Jd，e＝7.5Hz，2H，H-e)，3.63-3.52(m，5H，H-3C，H-3E，H-3G，H-3I和H-3K)，3.51(s，3H，COOMe)，3.47(s，9H，3x COOMe)，3.46(s，3H，COOMe)，3.41(s，3H，COOMe)，3.43-3.32(m，2H，H-a’和H-5A)，3.30(dd，J2，3＝9.5，J2，1＝8.0Hz，1H，H-2A)，3.26-3.17(m，6H，H-3A，H-2C，H-2E，H-2G，H-2I和H-2K)，2.42(s，3H，CH 3 NAc)，2.03(s，6H，CH 3 OAc)，2.03(s，9H，CH 3 OAc)，1.98(s，3H，CH 3 OAc)，1.96(s，6H，CH 3 OAc)，1.95(s，12H，CH 3 OAc)，1.59-1.48(m，2H，H-b)，1.47(q，Jc，d＝Jc，d＝Je，d＝7.5Hz，2H，H-d)，1.34-1.22(m，2H，H-c)。
13C NMR(100.6MHz，CDCl3)δ＝170.6，170.0，169.7，169.5(C＝O)，137.9，137.8，137.6，137.5，137.4，137.3(C季原子)，129.6，129.0，128.7，128.6，128.5，128.4，128.3，128.2，128.1，128.0，127.8，127.6(C原子)，113.4(CmpMBn)，102.1(C-1A)，98.0(C-1L)，97.8(C-1B，C-1D，C-1F，C-1H，C-1J和C-1C或E或G或I或K，C-1E或G或I或K或C，C-1G或I或K或C 或E和C-1I或K或C或E或G)，97.1(C-1K或C或E或G或I)，80.9(C-3A)，77.9，77.8(C-3C，C-3E，C-3G，C-3I和C-3K)，75.7，75.6，75.5，75.3，75.2(C-3B，C-4B，C-4A，C-4C，C-4E，C-4G，C-4I，C-3D，C-3F，C-3H，C-3J和C-4K)，74.9，74.8(6x CH2Ph)，74.1(3x CH2Ph)，74.0(CH2Ph)，73.7(CH2Ph)，73.4(C-3L)，73.1(C-4D，C-4F，C-4H，C-4J和C-5A)，72.7(C-4L)，72.6(CH2pMBn)，71.3(C-5J)，71.2(C-2B)，70.6，70.5，70.4，70.3，70.1(C-5B，C-5D，C-5F，C-5H，C-2D，C-2F，C-2H和C-2J)，70.0(CH2-a)，69.7(C-5C，C-5E，C-5G，C-5I和C-5K)，69.1(C-5L)，68.7(C-2L)，68.4(CH2Ph Cbz)，66.2(C-2A)，62.9，62.8，62.7(C-2C，C-2E，C-2G，C-2I和C-2K)，62.2(C-6A)，61.6(C-6C，C-6E，C-6G，C-6I和C-6K)，55.3(CH3，OMepMBn)，52.0(4xCH3，COOMe)，51.8(2xCH3，COOMe)，44.0(CH2-e)，29.0(CH2-b)，28.3(CH2-d)，26.9(CH3，NAc)，23.1(CH2-c)，20.9，20.8，20.7(12xCH3，OAc)；
ESI HR-MSm/zC209H239N19O77Na[M+Na]+的计算值：4269.5262，实测值：4269.5280。
化合物17：5-氨基戊基[(3-O-苄基-4-O-(4-甲氧基苄基)-2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(3-O-苄基-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(3-O-苄基-2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)]-(1-＞4)-O-3-O-苄基-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷七钠盐(heptasodium salt)。(HS4Bz)
0℃，在MeOH/CH2Cl2(1mL/0.4mL)混合物中与K2CO3(1.5mg，0.011mmol，0.625eq)搅拌四糖5(29mg，0.017mmol)2小时，然后升至室温。用BioRad AG50W-X8200(H+)树脂中和混合物，过滤并浓缩。硅胶快速层析法(甲苯/AcOEt70∶30至20∶80)得到去乙酰基化合物11a(18mg，71％)以及3mg化合物11b(13％，ESI HR-MSm/zC75H89N7O24Na[M+Na]+计算值：1494.58567，实测值：1494.58474)。
然后将化合物11a(18mg，0.012mmol)溶解于MeOH(324μL)中并与1，3-二巯基丙烷(24μL，0.24mmol，20eq)和三乙胺(33μL，0.24mmol，20eq)搅拌15小时。用Sephadex LH-20层析法纯化所得混合物两次(CH2Cl2/MeOH，1∶1具有0.1％NEt3)，得到13mg 13(75％，ESI HR-MSm/zC75H93N3O24Na[M+Na]+计算值：1442.60467，实测值：1442.60248)。
将三氧化硫吡啶复合物(74mg，0.46mmol，60eq)加至13(11mg，7.75μmol)的吡啶(320μL)溶液。将混合物室温避光搅拌24小时，然后在55℃加热20小时。然后加入甲醇(140μL，0.124mmol)和NEt3(63μL，0.014mmol)淬灭反应。将得到的混合物室温搅拌1小时，并用Sephadex LH-20层析法和RP-18半制备型HPLC(AcOHNEt3100mM，pH 7.0/CH3CN 70/30至58/42)成功地纯化，接着在用冷冻干燥法(2x1mL H2O)去除AcOHNEt3盐后，在BioRad AG50W-X8200(Na+，1mL)上进行离子交换。因此获得作为六钠盐的化合物15(8mg，51％，ESI MSC75H87N3O42S6Na6：m/z(％)654.1(100)[M-3Na]3-/3，992.8(50)[M-2Na]2-/2)。
将四糖15(6mg，2.9μmol)溶解于LiOH(7mg，0.29mmol，52eq)，水(40μL)和H2O2(35％在水中，43μL，0.49mmol)的混合物中。24小时后在37℃，加入AcOH(6M，36μL，0.22mmol)并用RP-18半制备型HPLC(AcOHNEt3100mM，pH7.0/CH3CN 75/25至60/40)纯化混合物，接着在用冷冻干燥法(2x1mL H2O)去除AcOHNEt3盐后，在BioRad AG50W-X8200(Na+，1mL)上进行离子交换。因此获得作为八钠盐的化合物17(3mg，50％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ＝7.60-7.24(m，22H，Ph)，6.93(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-OMe)，5.37(br.s，1H，H-1B)，5.29(br.s，1H，H-1D)，5.20(d，J1，2＝3.0Hz，1H，H-1C)，4.77(d，J＝12.0Hz，2H，CH 2 Ph)，4.75(d，J1，2＝6.5Hz，1H，H-1A)，4.68(br.s，1H，H-5D)，4.64(d，J＝12.0Hz，2H，CH 2 Ph)，4.63(d，J4，5＝2.0Hz，1H，H-5B)，4.61(d，J＝12.0Hz，2H，CH 2 Ph)，4.49(d，J＝12.0Hz，2H，CH 2 Ph)，4.44(d，J＝11.0Hz，1H，CH 2 PhOMe)，4.43(br.s，1H，H-2D)，4.41(br.s，1H H-2B)，4.40(d，J＝11.0Hz，1H，CH 2 PhOMe)，4.36-4.24(m，4H，H-6a A，H-6b A，H-6a C和H-6b C)，4.19(br.s，1H，H-3B)，4.26(br.s，1H，H-4B)，4.22-4.13(m，1H，H-5C)，4.05(t，J4，5＝J4，3＝6.5Hz，1H，H-4A)，4.00(m，1H，H-5A)，3.97-3.75(m，9H，在δ＝3.82含有单峰，H-3D，H-a，H-4C，H-4D，H-3A，PhOMe和H-3C)，3.79(t，J3，2＝J3，4＝9.0Hz，1H，H-3C)，3.64(m，1H，H-a’)，3.41(dd，J2，3＝10.0，J2，1＝3.0Hz，1H，H-2C)，3.34(t，J2，1＝J2，3＝6.5Hz，1H，H-2A)，2.95(br.t，Jd，e＝7.0Hz，2H，H-e)，1.67(q，Ja，b＝Jb，c＝7.0Hz，2H，H-b)，1.65(q，Jc，d＝Je，d＝7.0Hz，2H，H-d)，1.47(m，2H，H-c)；
来自1H-13C HSQC(100.6MHz，D2O)的13C NMRδ＝101.7(C-1A)，98.5(C-1C)，97.8(C-1B)，97.6(C-1D)，79.4(C-3A)，77.5(C-3C)，75.5(C-3B)，75.2(C-4B)，74.2(C-5A)，73.9(C-4C)，73.7(C-4D)，73.6(C-2B)，73.5(2×CH2Ph)，73.0(C-4A)，72.4(C-2D)，72.1(CH2pMBn，2×CH2Ph)，71.4(C-3D)，70.2(CH2-a)，69.8(C-5C)，69.2(C-5B)，69.1(C-5D)，68.5(C-6A)，67.3(C-6C)，58.8(C-2C)，58.6(C-2A)，55.9(CH3，OMepMBn)，40.2(CH2-e)，28.9(CH2-b)，27.2(CH2-d)，23.1(CH2-c)，
C65H75N3O40S6Na8(1913，1432)的LC-ESI-TOF-MS：m/z(％)1837.41(100)[M-8Na+7H+NEt3]-，1736.29(91)[M-8Na+7H]-，1656.33(86)[M-8Na+7H-SO3]2-，1576.36(49)[M-8Na+7H-2SO3]3-。
化合物18：5-氨基戊基[(3-O-苄基-4-O-(4-甲氧基苄基)-2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(3-O-苄基-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(3-O-苄基-2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(3-O-苄基-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷-(1-＞4)-O-(3-O-苄基-2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(3-O-苄基-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷-(1-＞4)O-(3-O-苄基-2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(3-O-苄基-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(3-O-苄基-2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(3-O-苄基-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(3-O-苄基-2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)]-(1-＞4)-O-3-O-苄基-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷二十四钠盐。(HS12Bz)
0℃在MeOH/CH2Cl2(6mL/3mL)混合物中与K2CO3(4.6mg，0.033mmol)搅拌十二糖11(90mg，21mol)2小时，然后升至室温。用BioRad AG 50W-X8200(H+)树脂中和混合物，过滤并浓缩。硅胶快速层析法(甲苯/AcOEt 70∶30至20∶80)得到去乙酰基化合物12a(63mg，80％)以及13mg化合物12b(17％)。
然后用甲醇(860μL)中的1，3-二巯基丙烷(210μL，2.1mmol，123eq)和三乙胺(290μL，2.1mmol，123eq)处理十二糖12a(63mg，17μmol)。在室温搅拌该混合物42小时，然后用Sephadex LH-20层析法(CH2Cl2/MeOH 0.1％NEt350∶50)纯化，得到还原的十二糖14(52mg，86％)。
将三氧化硫吡啶复合物(208mg，1.31mmol，89eq)加入至14(52mg，14μmol)的吡啶(1.8mL)溶液。将混合物室温避光搅拌16小时，然后在55℃搅拌20小时。然后加入MeOH(800μL，20mmol)和NEt3(360μL，2.6mmol)淬灭反应。室温搅拌所得混合物1小时，接着用Sephadex LH-20层析法(CH2Cl2/MeOH，1∶1)纯化混合物。合并含有十二糖的部分，浓缩。HPLC分析显示已经形成小部分的去-N-硫酸化合物，在2ml水中以三氧化硫吡啶复合物(23mg，0.1mmol)和K2CO3(41mg，0.3mmol)作为碱进行重-N-硫酸化(re-N-sulfatation)。然后将混合物直接用RP-18快速层析法(AcOHNEt3100mM，pH 7.0/CH3CN 100∶0至60∶40)和RP-C 18半制备型HPLC(AcOHNEt3100mM，pH 7.0/CH3CN)纯化，接着在用冷冻干燥法(3x2mL H2O)去除AcOHNEt3盐后，在BioRad AG50W-X8200(Na+，3mL)上进行离子交换。因此得到作为十八钠盐的化合物16(41mg，52％，LC-ESI-TOF-MSC183H207N7O118S18Na18(精确质量＝5379,3543)：m/z(％)：1830.09(13)[M-18Na+15H+5NEt3]3-/3，1768.73(40)[M-18Na+15H+4NEt3-SO3]3-/3，1708.37(73)[M-18Na+15H+3NEt3-2SO3]3-/3，1681.71(93)[M-18Na+15H+3NEt3-3SO3]3-/3，1621.35(100)[M-18Na+15H+2NEt3-4SO3]3-/3)。
将十二糖16(24mg，4.4μmol)在含水KOH(6M，480μL，3mmol)，水(192μL)和H2O2(35％在水中，768μL，9mmol)中37℃搅拌24小时。在此之后，观察到甲酯的完全皂化，但Cbz基团仅部分水解。因此加入含水KOH(6M，480μL，3mmol)和H2O2(35％在水中，768μL，9mmol)并将反应在37℃另外搅拌24小时，这之后Cbz基团全部水解。加入含水AcOH(6M，720μL，4mmol)并用RP-C18半制备型HPLC(AcOHNEt3100mM，pH 7.0/CH3CN)纯化混合物，接着在用冷冻干燥法(3x2mL H2O)去除AcOHNEt3盐后，在BioRad AG50W-X8200(Na+，1mL)上进行离子交换。因此得到作为二十四钠盐的化合物18(12mg，51％)。
1H NMR(400MHz，D2O，50℃，ref CH3CN)仅部分信号被归属δ＝7.55-7.25(m，62H，Ph)，7.93(d，J＝8.0Hz，2H，Ph-OMe)，6.94(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-OMe)，5.60-5.32(br.S形成的m，6H，H-1B，H-1D，H-1F，H-1H，H-1J和H-1L)，5.32-5.18(br.s形成的m，5H，H-1C，H-1E，H-1G，H-1I和H-1K)，4.90-4.81(m，CH 2 Ph)，4.81-4.71(m，在δ＝4.77含有d (J＝6.0Hz，H-1A)CH 2 Ph和H-5B或D或F或H或J或L)，4.71-4.65(m，CH 2 Ph和5xH-5B或D或F或H或J或L)，4.46-4.36(m，6H，H-2B，H-2D，H-2F，H-2H，H-2J和H-2L)，4.35-4.27(m，6H，6x H-6)，4.27-4.16(m，12H，H-3B，H-3D，H-3F，H-3H，H-3J，H-3L，H-4B，H-4D，H-4F，H-4H，H-4J和H-4L)，3.87(dt，J偕＝10.0Hz，J＝6.0Hz，Ha)，3.82(s，3H，PhOMe)，3.61(dt，J偕＝10.0Hz，J＝6.0Hz，Ha’)，3.48-3.33(m，6H，H-2A，H-2C，H-2E，H-2G，H-2I，H-2K)，3.94(t，J＝7.5Hz，2H，H-e)，1.73-1.57(m，4H，H-d和H-b)，1.46(q，J＝7.5Hz，2H，H-c)。
来自1H-13C HSQC(100.6MHz，D2O，50℃，参考CH3CN)的13C NMRδ＝114.8(CmpMBn)，101.6(C-1A)，99.2-98.1(C-1B，C-1C，C-1D，C-1E，C-1F，C-1G，C-1H，C-1I，C-1J，C-1K，C-1L)，73.9(C-2艾杜糖醛基部分(Idurony moieties))，69.9(C-a)，68.7(C-6)，58.7(C-2C，C-2E，C-2G，C-2I，C-2K)，55.2(CH3OMepMBn)，40.2(C-e)，28.5(C-b)，26.9(C-d)，23.0(C-c)。
C169H183N7O116S18Na24(精确质量＝5293，1153)的ESI MS：m/z(％)1756.03(14)[M-24Na+21H+5NEt3]3-/3，1722.32(33)[M-24Na+21H+4NEt3]3-/3，1695.67(51)[M-24Na+21H+3NEt3-SO3]3-/3，1635.3(100)[M-24Na+21H+3NEt3-2SO3]3-/3。
化合物19：5-氨基戊基[(2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(1-＞4)-O-(2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)-(2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷)-(1-＞4)-O-(2-O-磺酸根合-α-L-吡喃艾杜糖醛酸酯)]-(1-＞4)-O-2-去氧-2-磺酸氨基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡萄糖苷二十四钠盐。(HS12Lb)
将Pd(OH)2(20％在活性炭上，30mg)加入至十二糖18(5.5mg，9.4mol)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.0，400μL)和叔丁醇(200μL)溶液。将混合物脱气并在二氢(1个大气压)下搅拌24小时。在室温24小时后加入另外部分Pd(OH)2(20％在活性炭上，20mg)，将混合物脱气并在氢气(1个大气压)下搅拌另外24小时。用ultrafree-MC过滤器(Amicon)过滤混悬液并用磷酸盐缓冲液(33mM，pH 7.0)/叔丁醇(3/1，400μL)冲洗催化剂两次，然后CH3CN/H2O(1/1，400μL)冲洗两次，从而从活性炭上解吸化合物19。冷冻干燥后，将所得溶液在PD-10柱(Pharmacia)上脱盐并冷冻干燥得到4mg 19(98％)。
1H NMR(400MHz，D2O，50℃refCH3CN)δ＝5.37(br.s，5H，H-1C，H-1E，H-1G，H-1I，H-1K)，5.20(br.s，5H，H-1B，H-1D，H-1F，H-1H，H-1J)，5.17(b r.s，1H，H-1L)，4.80，4.78和4.72(3x b r.s，H-5艾杜糖醛基部分(Iduronylmoieties))，4.55(d，J1，2＝8.0Hz，H-1A)，4.34-4.30(m，H-2艾杜糖醛基部分)，4.30-4.28(m，H-2艾杜糖醛基部分)，4.28-4.22(m)，4.22-4.14(m，H-6b)，4.14-3.94(m，11H，H-4艾杜糖醛基部分，H-5氨基葡萄糖基部分(Glucosaminyl moieties)，H-6b)，3.90-3.82(m，1H，H-a)，3.80-3.59(m，13H，H-4氨基葡萄糖基部分，H-3氨基葡萄糖基部分，H-a’)，3.27(dd，J2，3＝10.0Hz，J2，1＝3.0Hz，5H，H-1C，H-1E，H-1G，H-1I，H-1K)，3.05(t，J2，1＝J2，3＝8.0Hz，H-2A)，3.05(t，J＝7.5Hz，H-e)，1.76-1.56(m，4H，H-d和H-b)，1.53-1.43(m，2H，H-c).
来自1H-13C HSQC(100.6MHz，D2O，50℃，参考CH3CN)的13C NMRδ＝114.8(CmpMBn)，101.7(C-1A)，100.3-98.0(C-1B，C-1D，C-1F，C-1H，C-1J，C-1L)，98.0-95.5(C-1C，C-1E，C-1G，C-1I，C-1K)，77.5-75.4(C-4氨基葡萄糖基部分)，77.5-75.0(C-3艾杜糖 醛基部分和C-4艾杜糖醛基部分)，73.0(C-3A)，70.9-68.5(C-2艾杜糖醛基部分，C-5艾杜糖醛基部分，C-5氨基葡萄糖基部 分，C-3氨基葡萄糖基部分)，69.9(C-a)，67.8-65.3(C-6氨基葡萄糖基部分)，60.2(C-2A)，58.1(C-2C，C-2E，C-2G，C-2I，C-2K)，39.7(C-e)，28.1(C-b)，26.2(C-d).
计算[M-H]-的C77H127N7O115S18的ESI MS：3563.9204，实测值：3563.7568；3483.9287(-1SO3)；3403.9897(-2SO3)；3324.0291(-3SO3)。
V.3.本发明共轭分子的化学合成
HPLC和LCMS的条件：
偶联反应的监视和纯度测定在装有Waters Symmetry3.5μmC18
(2.1x100mm)柱的Agilent1100HPLC上进行，使用CH3CN在10mM乙酸铵缓冲水溶液的线性梯度，经过20分钟，流速1ml/分钟。检测：215/230nm。
在连接Alliance HPLC的Waters Q-TOFmicro质谱仪上进行LCMS分析，使用相同的柱和溶剂。为了避免磷酸离子注入，在纯化步骤后LCMS装置仅用于评价产品的鉴定。使用负离子模式(ES-)获得数据。将锥电压设置成低值(10-20V)从而使硫酸盐损失最小化(SO3，80质量单位)。低聚糖相比于它们的mCD4轭合物更容易MS硫酸盐损失。
化合物定量
通过在HitachiL8800上的氨基酸分析(AAA)量化起始低聚糖和最终mCD4轭合物的量。对于低聚糖，使用16h，95℃，HCl 6N，2％苯酚水解，而不是用于肽/蛋白质水解的标准的20h，110℃，HCl 6N，2％苯酚条件。经水解，Phe之后洗脱生成葡萄糖胺。
经SATP在低聚糖上引入巯基
苄基-四糖-SATP 20
将4x 6μl SATP/DMSO溶液(40mg/ml；MW：245；4x 0.5μmole)经过15分钟加入至0.5mg苄基-四糖17(MW：1914，8Na+；0.25μmole)的660μl 50mM磷酸钠缓冲液pH8中。20分钟后，在HPLC追踪上观察到定量的偶联。苄基-四糖17Rt＝6.6分钟；S-乙酰硫代丙酸酯苄基-四糖20Rt＝8.8(12-32％梯度)。将混合物置于C18Sepak滤芯(cartridge)上并用6ml 20％CH3CN/H2O洗脱S-乙酰硫代丙酸酯苄基-四糖20。冷冻干燥后，用LCMS分析控制产品。
计算的单一同位素质量C70H89N3O42S7[M-H]-：1866.2892；实测值：1866.4692；1786.5131(-1SO3)；1706.5300(-2SO3)。
苄基-十二糖-SATP 21
将4x 6μl SATP/DMSO溶液经过15分钟加入至1.5mg苄基-十二糖18(MW：5293，24Na+；0.29μmole)的530μl 50mM磷酸钠缓冲液pH8中。20分钟后在HPLC追踪上观察到定量的偶联。苄基-十二糖18Rt＝10.7分钟；S-乙酰硫代丙酸酯苄基-十二糖21Rt＝12.5(5-25％梯度)。在PD10硅胶过滤柱上纯化产品，用水洗脱。合并含有S-乙酰硫代丙酸酯苄基-十二糖21(通过MS注入检测)第一次洗脱部分并冷冻干燥。用LCMS分析控制产品。计算的单一同位素质量C174H213N7O118S19[M-H]-：4894.5501；实测值：4894.6836；4815.6084(-1SO3)；4734.5625(-2SO3)；4654.6660(-3SO3)；4575.6226(-4SO3)。
十二糖-SATP 22
将4x 6μl SATP/DMSO溶液经过15分钟加入至0.5mg十二糖19(MW：4092，24Na+；0.12μmole)的600μl 15mM磷酸钠缓冲液pH8中，。由于非常低的215/230UV-吸收并且19在C18柱上没有保留，没有通过HPLC监测偶联反应。20分钟后，将混合物直接置于PD10柱上。进行如上相同的纯化方法。用LCMS分析控制产品。没有检测到完全的硫酸化(C82H133N7O117S19)。仅检测到-1SO3、-2SO3、-3SO3和-4SO3和-5SO3形式。计算的单一同位素质量C82H133N7O114S18[M-H-1SO3]-：3613.9724。实测值：3613.9536；3533.9170(-2SO3)；3454.0190(-3SO3)；3374.0474(-4SO3)；3294.1528(-5SO3)。
偶联至mCD4-PEO2-马来酰亚胺
mCD4-PEO2-苄基-四糖23(或mCD4-HS4Bz)
为了追踪用羟胺对四糖-SATP 20的巯基脱保护并偶联至mCD4-PEO2-马来酰亚胺，使用12-22％(10分钟)-82％(10分钟)线性梯度的在10mM乙酸铵中的CH3CN。
将在100mM磷酸钠缓冲液中的100μl 0.5MNH2OH，HCl(用4NNaOH调节pH至7.2)加入至苄基-四糖SATP20的500μl 50mM磷酸钠缓冲液pH7.2中。用HPLC监视巯基的脱保护。10分钟后，仅保留11％的苄基-四糖SATP 20(Rt＝8.7分钟)，而对应于SH四糖的新峰出现在7.4分钟。
10分钟后，加入在50μl H2O中的mCD4-PEO2-Mal(MW：3207；0，1μmole)，5分钟后第二次加入相同物质。20分钟后，游离的巯基四糖全部消失。新化合物出现在16分钟，对应于mCD4-PEO2-苄基-四糖23。在半制备型RP-HPLC柱(Macherey Nagel 5μmC18300A，10x 250mm)上纯化轭合物，使用相同的梯度，但是流速为6ml/分钟。用LCMS分析控制纯化的产品。计算的平均质量C204H299N43O79S13：5034.7185。实测值：5034.7002。
在Symmetry柱上评价mCD4-PEO2-苄基-四糖23的最终纯度(87％)，使用20-50线性梯度(Rt＝11.06分钟)。
产率：276μg通过AAA定量(24％来自17)。
mCD4-PEO2-苄基-十二糖24(或mCD4-HS 12Bz)
将100μl相同的羟胺溶液加入至苄基-十二糖-SATP 21的500μl 50mM磷酸钠缓冲液pH7.2中。使用5-25％(20分钟)-85％(10分钟)梯度追踪脱保护和偶联反应。20分钟后，苄基-十二糖-SATP 21(Rt＝12.7分钟)消失，生成游离巯基苄基-十二糖(Rt＝11.9)。为了定量地得到mCD4-PEO2-苄基-十二糖24轭合物(Rt＝24.8)，三次连续加入mCD4-PEO-Mal溶液(3X 0.1mm)是必需的。用半制备型RP-HPLC纯化轭合物，使用5-25％(10分钟)-85％(20分钟)梯度。
用LCMS分析控制纯化的产品。计算的平均质量C308H423N47O155S25：8065.6204。实际值；8065.1006；7985.6000(-1SO3)；7905.2002(-2SO3)。
在Symmetry柱上评价mCD4-PEO2-苄基-十二糖24轭合物的最终纯度(63％)，使用20-50线性梯度(Rt＝9.37分钟)。
产率：643μg通过AAA定量(28％来自18)。
mCD4-PEO2-十二糖25(或mCD4-HS12Lb或mCD4-HS12)
由于十二糖-SATP 22非常低的UV吸收并且在C18柱上没有保留，不能通过HPLC追踪脱保护步骤。将150μl相同的羟胺溶液加入至十二糖-SATP 22的500μl50mM磷酸钠缓冲液pH7.2中。20分钟后，在反应混合物上进行的阳性Ellmann试验显示巯基脱保护。加入mCD4-PEO2-Mal溶液(3x 0.1μmole)。偶联反应液的等份注入(10分钟)显示(Rt＝8.4)与某些剩余的mCD4-PEO2-Mal(Rt＝11.8)在20-50％梯度中结合的新产物。
用半制备型RP-HPLC纯化轭合物，使用如用于mCD4-PEO2-苄基-十二糖24轭合物的条件。
用LCMS分析控制纯化的产物。计算的平均质量C216H343N47O154S25：6863.9738。实测值：6863.1001；6763.2000(-1SO3)；6703.5005(-2SO3)。
在Symmerty柱上评价mCD4-PEO2-十二糖25轭合物的最终纯度(100％)，使用20-50线性梯度(Rt＝8.37分钟)。
产率：321μg通过AAA定量(28％来自19)。
实施例VI：生物活性
在这部分，mCD4是指miniCD4。
VI.1.方法
使用两种不同的gp120，源自X4型菌株(gp120MN)和R5型菌株(gp120YU2)。通过表面等离子共振(Biacore)测定不同分子抑制gp120与各种受体或共受体相互作用的能力。为此，将三种化合物根据所述的方法(Vivès等人J.Biol.Chem.279，54327-54333，2005)固定在生物传感器(biosenser)(Sensorchip CM 4 Biacore)的表面。这些化合物为CD4、HS(或肝素)和单克隆抗体(mAb 17b)。该抗体识别由CD4诱导的表位并模拟共受体CCR5或CXCR4。这三种表面代表在细胞表面由gp120识别的三种主要分子(CD4、共受体和HS)。
在下面描述的一套实验中，在这些表面上注射单独的gp120(图4-6中的细线)或与要测试的化合物预培养的gp120(图4-6中的粗线)，根据时间测定相互作用信号持续五分钟。细线和粗线的不同显示出，相对于gp120和固定在生物传感器上的分子之间的相互作用的，要测试化合物的抑制能力。
VI.2.结果
○mCD4、HS12Lb(分子19)和mCD4-HS12Lb(分子25)分子的分析。
-在CD4表面(gp120和抑制剂，100nM)：
单独的化合物HS12Lb对gp120/CD4的相互作用没有影响，结果并没有显示在这里。
应当注意化合物mCD4-HS12Lb抑制gp120/CD4相互作用更强于mCD4，这点对gp120X4和R5一样(见图4)。
-在HS表面(gp120和抑制剂，40nM)
gp120YU2仅非常微弱的与HS结合(由于是对于R5型gp120组)。因此在该表面得到的结果没有显示。
mCD4对gp120/HS的相互作用没有影响。化合物HS12Lb根据使用的浓度条件部分抑制相互作用。没有相互连接的mCD4和HL12Lb的化合物(mCD4+HS12Lb)具有相同的活性。另一方面，mCD4-HS12Lb轭合物完全地抑制相互作用，证明与共轭结合向联系的强大的协同作用。(见图5)。
-在mAb 17b表面(gp120和抑制剂，40nM)：
mCD4不存在时gp120仅轻微地(YU2)或根本不(MN)与抗体17b连接(图6中的细线)。mCD4的存在大大提高了该反应(图6中上面的图的粗线)。另一方面，mCD4-HS12Lb化合物完全地抑制相互作用(图6中下面的图的粗线)，验证图1中描述的机理(通过mCD4的CD4i表位的暴露和通过HS12Lb分子的CD4i表位的阻断)。
为了证明mCD4和HS12Lb之间共价结合的潜在作用进行了下面的实验：
将40nM gp120(MN或YU2)与增加浓度的(0至80nM)共价连接的mCD4-HS12Lb(图7中白色部分)或不连接的mCD4+HS12Lb(图7黑色部分)共培养，然后将其注射在17b表面。注射结束后测定结合至抗体的gp120的数量。应当牢记只有当CD4i暴露时，即在mCD4或sCD4存在下gp120才与17b结合。
已发现共价分子(mCD4-HS12Lb)强烈抑制gp120-17b的相互作用，然而两分子的混合物(mCD4+HS121B)具有相反的作用：mCD4的作用是主要的(CD4i位点的暴露，因此gp120与17b结合)，对于MN型gp120被HS12Lb的抑制仅在高浓度处开始出现。对于YU2型gp120，HS12Lb不是抑制剂，与如下观察一致：单独的YU2根本不结合或仅非常轻微地结合至HS(见图7)。
○混合mCD4的肽GPR1、HS4Bz(17)、HS12Bz(18)、HS12Lb(19)对比mCD4-GPR1、mCD4-HS4Bz(23)、mCD4-HS 12Bz(24)和mCD4-HS 12Lb(25)轭合物的分析
如上所述，对于除HS12Lb以外的分子进行了与mCD4连接或不与mCD4连接的分子的抑制能力的比较。对如下分子进行比较：
1.肽GPR1，(SEQ ID N°4)
2.低聚糖HS4Bz(17)，
3.低聚糖HS12Lb(18)，
4.低聚糖HS12Bz(19)，
这些分子与mCD4混合，或：
A.mCD4-GPR1，
B.mCD4-HS4Bz(23)，
C.mCD4-HS12Bz(24)，
D.mCD4-HS12Lb(25)，
轭合物。
肽GPR1为合成肽，其衍生自偶联至蛋白质G、GPR1的受体的细胞外N-末端区域(Jinno-Oue等人，J Biol chem.2005 Sep2；280(35)：30924-34.Epub 2005年5月26日)。它作为有机分子使用，与本发明的聚阴离子性多糖相比较。所述的肽GPR1可以具有序列SEQ IDN°3或SEQ IDN°4。
在下面的实验中，将40nM gp120与80nM mCD4和80nM上述的各种分子，或80nM相应的共价轭合物共培养。测定与17b的相互作用。T代表gp120与mCD4单独结合的测定。
应该注意测试的分子，当不与mCD4结合时，具有不同程度的抑制能力(图8中黑色部分)，然而当它们共价结合至mCD4时(图8中白色部分)，所有这些分子非常强烈地抑制相互作用。
VI.3.结论
上述的工作证明由mCD4(或任何其它结合至gp120并能暴露共受体识别位点的分子)组成的杂交分子的抑制活性，所述mCD4共价结合至能识别共受体识别位点的分子。
该杂交分子的作用是与gp120结合和暴露CD4i位点(经mCD4)和阻断与共受体的相互作用位点(经共轭)。
特别重要的点为：
●在nM浓度范围，同时抑制gp120与CD4，共受体和HS的相互作用，
●由两分子的共轭诱导的非常高的协同作用，和
●对X4和R5菌株的抑制活性。
实施例VII.生物活性-补充实验
VII.1.亲和力
本研究中使用了下面的文章中描述的方法：
Vivès R.R.等人Journal of Biological Chemistry 2005，280，21353-21357(见Materials and methods-Surface Plasmon resonance-based binding assays(材料和方法-基于表面等离子共振的结合试验))，和
Crublet E.等人Journal of Biological Chemistry 2008，283，15193-15200(见Materials and methods-Surface Plasmon resonance-based binding assays部分)。
表5、mCD4-HS12对MN和YU2gp120的结合和解离速率常数
*对于1∶1朗缪尔结合模型无效。
通过使用Biaeval 3.1软件拟合图9a、b的原始数据，测定mCD4-HS12(25)对MN和YU2gp120的结合(kon)和解离(koff)速率常数(两种独立分析的平均值)。使用简单“1∶1朗缪尔”结合模型的传感图的评价分别回归对MN和YU2gp120的3.7和2.7nM的亲和力值(Kd＝koff/kon)。然而，当通过χ2参数(其描述拟合的紧密度)测定时，观察到某些来自该模型的数据偏差。与mCD4-HS12的二价性质一致，使用“二价结合(bivalent binding)”模型(χ2参数现在为0.8和0.4，而非对于先前模型的2.7和1.6)改善了拟合。根据该模型，最初的结合步骤因此特征在于指示的结合(kon1)和分解(koff1)速率常数，其产生对MNgp120的10nM解离平衡常数和对YU2gp120的7.2nM解离平衡常数。通过第二结合步骤应该能进一步增加这些亲和力。然而，在这里这种亲和力不能被定量，因为对于二价结合模型，第二结合位点的结合速率常数是以RU-1s-1计(该反应涉及结合至配体(也以RU计)的复合物(以RU计))，而不是以M-1s-1计。虽然如此，这些数据显示mCD4-HS12以低nM范围的亲和力连接至X4和R5gp120并且提出了二价结合机理(见图9c-d)。
VII.2.抗病毒活性
VII.2.1.用HIV-1-LAI和BaL菌株感染周边血液单核细胞核和抑制试验。
在体外活性实验中，在植物血细胞凝集素-P(PHA-P)-活化的周边血液单核细胞(PBMC)上放大和滴定X4-嗜性HIV-1-LAI(Barre-Sinoussi，Science 220，868-71，1983)或R5-嗜性HIV-1/Ba-L(Gartner等人，Science 233，215-9，1986)菌株。使用公式计算组织培养感染剂量(
Arch.Exp.Path.Pharmak.162，480-483，1931)。对于抗病毒试验，使用每种药物的六个浓度(1∶5稀释1μM至320pM之间)预处理PHA-P-活化的PBMC 30分钟，并用X4-嗜性LAI或R5-嗜性Ba-L菌株的一百50％组织培养感染剂量(TCID50)感染PHA-P-活化的PBMC。在培养阶段维持用药，在感染后第7天收集细胞上清液并在-20℃贮存。叠氮胸苷(AZT)作为内部对照在这些实验中使用。通过使用RetroSys HIV RT试剂盒(Innovagen)在细胞培养上清液中定量逆转录酶(RT)的活性测定病毒的复制。
平行的，通过甲基四唑盐(MTT)试验在第7天在未感染PHA-P-活化的PBMC中评价样品的细胞毒性。实验一式三份的进行，使用SoftMaxPro软件计算50、70和90％有效剂量和细胞毒剂量。
表6、mCD4、HS12和mCD4-HS12的抗病毒活性
用每种调查研究中的药物(1∶5稀释1μM至320pM之间)处理PHA-P-活化的PBMC，并用100TCID50的HIV-1-LAI(X4嗜性)或/Ba-L(R5嗜性)菌株感染PHA-P-活化的PBMC。在培养过程维持分子和病毒，在感染后第7天收集细胞上清液用于逆转录酶活性的定量。实验一式三份的进行，使用SoftMaxPro软件计算50、70和90％有效剂量(ED)，以nM计(±S.D.)。
这些分子中没有一个显示出高达1μM的细胞毒性。
表7、mCD4-GPR1、mCD4-HS4Bzl、mCD4-HS12Bzl的抗病毒活性
VII.2.2.用HIV假型报告病毒VSV-感染周边血液单核细胞的阴性对照
通过在HEK293T细胞中的单感染循环产生VSV-G假型病毒微粒，并用质粒pNL4-3env-Luc和允许表达源自水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)的包膜G蛋白(VSV-G)的质粒共转染该病毒微粒。所述pNL4-3env-Luc质粒衍生自感染性的前病毒克隆HIV-1NL4-3且带有env基因中的移码，这赋予其非感染性。萤火虫萤光素酶(Luc)报告基因代替NL4-3nef基因。通过用Luc基因代替相应的HIV nef产生感染性的HIV-1前病毒克隆pNL4-3Luc(来自D r.J.Alcami的赠予，MadridSpain)。通过在HEK293T细胞中转染结构产生感染性的病毒制剂。从健康血液捐献者中分离PBMC，并用植物血细胞凝集素和IL-2破坏PBMC 48小时。在HeLaCD4+CXCR4+CCR5+细胞中滴定病毒制剂，在细胞溶解产物中测定的Luc酶活性用于正常化PBMC感染的病毒的量。感染2小时后(mCD4-HS12存在或不存在下)，细胞被彻底洗涤并接种于微孔板(2x105细胞/孔)持续另一个48小时，其后使用LB 940Berthold Mithras光度计装置(Berthold Technologies，Germany)在PBMC溶解产物中测定Luc酶的活性。
表8、mCD4-HS12针对NL4-3HIV-1和Δenv+VSVg-HIV-1的抗病毒活性
在用106RLU的NL4-3海肾或Δenv+VSVg-luc病毒感染PBMC后第2天测定萤光素酶活性(RLU x 10-5)，用指示浓度的mCD4-HS12处理。
VII.3.结论
因此，我们的研究显示相对小的合成分子，含有连接至小肝素片段或更通用的聚阴离子化合物的3kDa CD4模拟物，能有效模拟数个大的gp120配体，包含CD4和共受体结合位点识别mAbs。基于CD4模拟物能够赋予共受体结合位点容易接近HS-介导的阻塞的能力，这些分子同时靶向gp120上两个决定性的和非常保守的结构，因此显示强的抗病毒活性。显著地，本发明所述的轭合物中和R5-和X4-嗜性的HIV-1，是一个重大的优点，因为CCR5-特异性拮抗剂的功效能被利用CXCR4的病毒株的出现危害，对于该病毒株还没有有效的抑制剂。
带有明智地位于miniCD4序列内的单一衍生位点的miniCD4的设计对基于mCD4的轭合物的合成和生物活性带来重大的改进。
缩写词：
Fmoc：9-芴甲氧羰基
DMF：二甲基甲酰胺
HATU：六氟磷酸化N[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三氮唑并[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲胺的N-氧化物
DIEA：二异丙基乙基胺
SPDP：N-琥珀酰亚胺基-3(2-吡啶二硫代)丙酸酯
TFA：三氟乙酸
EDT：乙二硫醇
TIS：三异丙基硅烷
DTT：1，4-二硫苏糖醇
MPLC：中压液相色谱
ES+MS：电喷雾质谱，正模式
GSH：还原型谷胱甘肽
GSSG：氧化型谷胱甘肽
HPLC：高效液相色谱
RP-HPLC：反相高效液相色谱
SMPH：琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰氨基]己酸酯
SATP：N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯
RT：室温
Rt：保留时间
TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅酯
TBDMSOTf：三氟甲磺酸叔丁基-二甲基-硅酯
Cbz：苄氧基羰基
pMBn：对甲氧苄基
Bn：苄基
Ac：乙酰基
Me：甲基
Et：乙基
eq：当量
NMR：核磁共振
IR：红外
HSQC：异核单量子相干谱
HRMS：高分辨质谱
ESI：电喷雾电离
MALDI-TOF：基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱
LC-ESI-TOF-MS：液相色谱/电喷雾电离飞行时间质谱
LCMS：液相色谱/质谱
DMSO：二甲基亚砜
Claims (20)
1.含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通过接头偶联至有机分子，其中：
■所述衍生自CD4受体的肽含有下列通用序列(I)：
Xaaf-P1-Lys-Cys-P2-Cys-P3-Cys-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Cys-Xaak-Cys-Xaal-Xaam，(I)
其中：
-P1代表3至6个氨基酸残基，
-P2代表2至4个氨基酸残基，
-P3代表6至10个氨基酸残基，
-Xaaf代表N-乙酰半胱氨酸(Ac-Cys)或3-巯基丙酸(TPA)，
-Xaag代表Ala或Gln，
-Xaah代表Gly或(D)Asp或Ser，
-Xaai代表Ser或His或Asn，
-Xaaj代表联苯丙氨酸(Bip)、苯基丙酸或β-萘基丙氨酸，
-Xaak代表Thr或Ala，
-Xaal代表Gly、Val或Leu，且
-Xaam代表-NH2或-OH，
所述在P1、P2和P3的氨基酸残基是天然或非天然的，相同或不同的，所述P1、P2和P3的残基都与Lys残基不同，且P1、P2和P3具有共同或非共同的序列，且
■所述有机分子具有下列通用结构(II)：
其中：
-n代表0至10之间的整数，特别地，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，有利地，n是0、1、2、3、4或5，
-X代表无机反离子，例如Na+、K+、Li+或Mg2+，或有机反离子，例如R3NH+、R4N+，其中R彼此独立地代表烷基，
-m代表所述分子的负电荷的数目，
-R1是相同或不同的基团且代表氢原子或O-保护基GP，
-R2代表氢原子或O-保护基GP′，其中GP和GP′相同或不同，
-R3是相同或不同的基团且代表氢原子、硫酸根、磷酸根或任何阴离子，
-R4是相同或不同的基团且代表氢原子、硫酸根、烷基或酰基，
-R5是相同或不同的基团且代表氢原子、烷基或酰基，
-A 代表选自下列通式的基团：-(CH2)p-NH-CO-(CH2)q-、-(CH2-CH2)-(O-CH2-CH2)p-NH-CO-(CH2)q-、-(CH2)p-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-或-(CH2-CH2)-(O-CH2-CH2)p-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-，其中p代表1至10之间的整数且q代表1至10之间的整数，有利地，A代表通式-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-的基团，且
-Z代表卤素原子、巯基或马来酰亚胺基，
所述接头的一个末端共价结合至存在于衍生自CD4受体的肽的通用序列(I)中的氨基酸残基Lys的游离氨基(-NH2)，且所述接头的另一个末端共价结合至有机分子的Z基团。
2.根据权利要求1所述的共轭分子，其中所述衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽的序列选自序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。
3.根据权利要求1或2所述的共轭分子，其中所述接头选自：
当Z代表巯基时，且选自：
当Z代表马来酰亚胺基团或卤素原子。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的共轭分子，其中基团R1都相同。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的共轭分子，其中基团R1选自氢原子、甲基或苄基。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的共轭分子，其中基团R2选自氢原子或对甲氧苄基。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的共轭分子，其中所述共轭分子选自下列分子：
8.含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通过接头偶联至有机分子，其中：
■所述衍生自CD4受体的肽含有如权利要求1所定义的通用序列(I)，且
■所述有机分子代表选自肝素或硫酸乙酰肝素的聚阴离子，其中糖醛酸部分可以是葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸，聚合度dp为2-24，其中基本上所有聚阴离子的游离羟基被O-保护基GP″取代，这些GP″基团相同或不同，且其中所述聚阴离子被修改从而其带有选自卤原子、巯基或马来酰亚胺基的官能团，
所述接头的一个末端共价结合至存在于衍生自CD4受体的肽的通用序列(I)中的氨基酸残基Lys的游离氨基(-NH2)，且所述接头的另一个末端共价结合至有机分子的官能团。
9.根据权利要求8所述的共轭分子，其中所述衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽的序列选自序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。
10.根据权利要求8或9所述的共轭分子，其中所述接头选自：
当Z代表巯基时，且选自：
当Z代表马来酰亚胺基团或卤素原子。
11.根据权利要求8-10任意一项所述的共轭分子，其中GP″基团相同。
12.根据权利要求11所述的共轭分子，其中GP″基团为甲基或苄基。
13.根据权利要求1-12任意一项所述的共轭分子，其作为药物使用。
14.根据权利要求13所述的共轭分子，其用于艾滋病的治疗。
15.药物组合物，其含有根据权利要求1-12任意一项所述的共轭分子和药学上可接受的载体。
16.制备根据权利要求1-13任意一项所述的共轭分子的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：
a.用带有两个活性基团的双官能团的化合物接触如权利要求1所定义的衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的肽，从而两个活性基团中的一个与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH2)形成共价键，以获得带有双官能团的第二活性基团的活化肽，且
b.用带有如权利要求1或8所定义的官能团的有机分子，或用相当于带有如权利要求1或8所定义的巯基的有机分子的有机分子，其中所述巯基(SH)已被巯基保护基保护，接触步骤(a)中获得的活化肽，从而所述活化肽的活性基团与有机分子的受保护或不受保护的官能团形成共价键，以获得所述共轭分子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述双官能团化合物的活性基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-羟基-4-硫代-琥珀酰亚胺酯，所述双官能团化合物的活性基团在步骤(a)与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH2)形成共价键。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述双官能团化合物的两个活性基团是不同的，且两个基团中的一个为N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-羟基-4-硫代-琥珀酰亚胺酯。
19.根据权利要求16-18任意一项所述的方法，其中所述的双官能团化合物选自琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺丙酰胺基]己酸酯(SMPH)或NHS-PEOn-马来酰亚胺，n为2至24之间的整数。
20.根据权利要求16-19任意一项所述的方法，其中当Xaaf代表衍生自CD4受体的肽的序列(I)中的TPA时，所述方法包括初步步骤，所述初步步骤包括用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)接触衍生自CD4受体的具有下列通用序列(III)的肽：
P1-Lys-Cys-P2-Cys-P3-Cys-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Cys-Xaak-Cys-Xaal-Xaam，(III)
其中P1至P3和Xaag至Xaam如通用序列(I)中所定义，
从而在所述衍生自CD4受体的具有通用序列(III)的肽的N-末端引入TPA。
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