CN102041298B - 凝结芽孢杆菌的pcr快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测凝结芽孢杆菌的PCR方法。首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用；再利用凝结芽孢杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物；然后使用该引物对待测样品增菌液的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。其加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括待测样品增菌液的基因组DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP0.1mmol/L；权利要求1中的特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃40s，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。具有检测速度快、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种凝结芽孢杆菌的PCR快速检测方法。
背景技术
引起罐头食品酸败变质而又不胖听(即产酸不产气)的微生物在罐头工业上称为平酸菌。它是需氧芽孢杆菌科中的一群高温型，具有嗜热、耐热的特点，其适宜生长温度为45℃～60℃。凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)是造成罐头食品平盖酸败的一种重要微生物。凝结芽孢杆菌同时也是益生素，是近年来国内外迅速崛起的一类微生态制剂，它广泛地应用于医疗、保健、食品、畜牧和水产等行业。因其具有调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体健康水平、能够避免服用抗生素带来的耐药性和二重感染等问题的优点，一直受世人瞩目。凝结芽孢杆菌除了具有上述优点外，同时还具有抗逆性强、耐高温高压、易贮存等独特的生物特性，成为当今研究和应用的热点，也是我国农业部2004年被批准使用的微生物级饲料添加剂品种之一。当前，凝结芽孢杆菌的检测方法主要是传统的增菌培养——纯分离培养——生化鉴定，该方法的缺点是操作繁琐、检测时间长，而且生化鉴定的项目较多。随着人们生活水平的提高，对食品安全的需求越来越高，同时，凝结芽孢杆菌微生态制剂的研制，生产规模的扩大，传统检测方法的低效率已经不能满足当前批量化的检测任务。因而，研究的凝结芽孢杆菌快速检测方法很有必要。PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点，是当前细菌鉴定中一种快速有效的方法。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的不足，提供一种检测速度快、成本低的快速检测凝结芽孢杆菌的PCR方法。
本发明的技术解决方案是：一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于有如下步骤：
首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用。
然后进行PCR反应，每个PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP 0.1mmol/L；凝结芽孢杆菌特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：95℃变性5min；95℃30sec，56℃30s，72℃40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。其中凝结芽孢杆菌特异性引物为：
B.coag-F：5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA3’；
B.coag-R：5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’
最后进行电泳检测，PCR产物与10×PCR上样缓冲液混合，在加Gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记对照进行检测，如果在紫外灯下存在555bp的核酸片段，则说明有凝结芽孢杆菌。
本发明提供了一对扩增凝结芽孢杆菌的特异引物B.coag-F、B.coag-R，从而提供一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法，同现有技术相比具有如下优点：
1.检测速度快，直接利用增菌液的基因组DNA进行检测，省去了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，而分离纯化和生化鉴定一般需要48～72h。
2.成本低，由于省略了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，节省了革兰氏染色、分离纯化培养基和生化试剂的费用，降低了检测成本。
具体实施方式
首先无菌操作取1g待测样品，加入盛有9ml酸性肉汤(酸性罐头食品)或溴甲酚紫葡萄糖肉汤(低酸性罐头食品及其它待测样品)的灭菌容器内，55℃±1℃，需氧条件下培养48h。取培养的菌液加入离心管中，以12000rpm离心1min，弃上清液，利用菌体沉淀提取基因组DNA并稀释备用。
然后进行PCR反应，每个PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP 0.1mmol/L；凝结芽孢杆菌特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：95℃变性5min；95℃30sec，56℃30s，72℃40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。其中凝结芽孢杆菌特异性引物为：
B.coag-F：5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA3’；
B.coag-R：5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’
最后进行电泳检测，取9μl PCR产物与10×PCR上样缓冲液混合，在加入万分之一的Gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记(DL2000)对照进行检测，如果在紫外灯下存在555bp的核酸片段，则说明有凝结芽孢杆菌。
凝结芽孢杆菌PCR引物序列表
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CGACATGATTTGGTTTTCCA 20
Claims (2)
1.一种快速检测凝结芽孢杆菌的PCR方法，其特征在于首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用；再利用凝结芽孢杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物；然后使用该引物对待测样品增菌液的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其中所述的凝结芽孢杆菌特异性引物为：
B.coag-F：5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA-3’；
B.coag-R：5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’；用该引物时的退火温度为56℃。
2.根据权利要求1所述的快速检测凝结芽孢杆菌的PCR方法，其加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括待测样品增菌液的基因组DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+ 1.5mmol/L；Taq酶1u；dNTP0.1mmol/L；权利要求1中的特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：95℃变性5min；95℃ 30sec，56℃ 30s，72℃ 40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
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