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CN102037357A - 双靶生物传感器细胞试验 - Google Patents

双靶生物传感器细胞试验 Download PDF

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CN102037357A
CN102037357A CN2009801155740A CN200980115574A CN102037357A CN 102037357 A CN102037357 A CN 102037357A CN 2009801155740 A CN2009801155740 A CN 2009801155740A CN 200980115574 A CN200980115574 A CN 200980115574A CN 102037357 A CN102037357 A CN 102037357A
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receptor
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T·A·邦奇
方晔
E·特兰
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Corning Inc
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Abstract

本发明公开了一种不用标记的多重筛选方法，涉及含有表面固定了活细胞的生物传感器，所述活细胞至少有两种靶标，或涉及表面共同固定了含两种类型细胞的混合细胞群的生物传感器，或涉及表面共同固定了混合细胞群的生物传感器，所述混合细胞群包含表达第一种靶标的第一类细胞和表达第二种靶标的第二类细胞，这两类细胞共同固定在所述生物传感器的表面上。所述靶标可以是Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道、钠-质子交换蛋白、整联蛋白受体或转运蛋白。不同类别的GPCR大多能独立地介导信号转导，强烈提示信号转导级联反应的空间时间腔室化是GPCR信号转导的关键。受体信号转导下游发生的大多数细胞反应是“开通”或“传送”。

Description

双靶生物传感器细胞试验
要求在先提交的美国专利申请的权益
本申请要求2008年3月5日提交的美国临时申请序列号61/068,266的权益。该文件的内容和本文述及的出版物、专利及专利文件的全部内容通过引用纳入本文。
背景
本发明涉及，例如用于化合物筛选和化合物模式分析的细胞试验所用的生物传感器，例如共振波导光栅(RWG)生物传感器和电阻抗生物传感器。
概述
本发明提供用于化合物筛选和化合物模式分析，例如针对一种细胞类型中的两种不同细胞靶标，或针对不同细胞类型的两种不同细胞靶标的细胞试验所用的方法和装置。
附图简述
图1A-1B显示在本发明的各实施方式中，分别采用RWG生物传感器和电子生物传感器进行双重或双靶标特异性筛选的生物传感器细胞试验各方面的内容。
图2A-2D显示在本发明的各实施方式中，针对两类G蛋白偶联受体(GPCR)的示范性RWG生物传感器细胞试验。
图3A-3C显示在本发明的各实施方式中，针对两类G蛋白偶联受体的另一示范性RWG生物传感器细胞试验。
图4显示在本发明的各实施方式中，采用RWG生物传感器的示范性双重和靶标特异性筛选。
图5A-5C显示在本发明的各实施方式中，检测A431细胞中的两种内源性受体-β2-肾上腺素能受体和组胺H1受体的示范性光学生物反应器细胞试验。
图6A-6D显示在本发明的各实施方式中，采用RWG生物传感器的示范性双重和靶标特异性筛选。
图7A-7F显示在本发明的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化合物文库中的激动剂结果。
图8显示在本发明的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化合物文库中的激动剂结果。
图9显示在本发明的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化合物文库中的拮抗剂结果。
详述
参考附图(如果有的话)详述本发明的各种实施方式。参考各种实施方式不是限制本发明的范围，该范围只由随附的权利要求书限制。此外，本说明书中的实施例不是限制性的，仅是列出本发明许多可能的各实施方式中的一些。
定义
“试验”、“测定”等术语指分析以测定，例如用外源性刺激，例如用候选配体化合物刺激后，细胞是否存在光学或生物阻抗反应、其量度、程度、动力学(kinetics)、或动态学(dynamics)类型。
“结合”、“连接”、“粘附”、“附着”、“粘附的”、“固定的”等术语通常指通过，例如物理吸附、化学键合等过程或它们的组合，而将(例如)本发明的表面修饰物质、增容剂、细胞、候选配体化合物等实体固定于表面。“细胞连接”、“细胞粘附”等术语，具体指通过(例如培养)使细胞与表面相互作用或结合，或使细胞与表面，例如生物传感器表面相互作用。这种生物传感器表面可以是未经修饰或经过修饰的，例如具有表面涂层、锚定材料、增容剂(例如，纤连蛋白、胶原、核纤层蛋白、明胶、聚赖氨酸等)等修饰，以促进细胞粘附和细胞生长。对于悬浮细胞，可以(例如)通过培育期间细胞的物理沉降或通过表面与细胞的相互作用，使细胞与生物传感器检测区接触。可通过以下几种方式实现这种表面-细胞相互作用，例如共价偶联反应活性表面与基底细胞膜蛋白或分子、电荷为基础的电子相互作用、传感器表面-呈递分子(例如，抗体、配体)与基底细胞表面分子结合等方法。
“粘附细胞”指维持与基材外表面结合、固定于其上或相接触的细胞或细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。此类细胞在培育后能经受洗涤和培养液更换过程而存活，而这些过程是许多细胞试验的先决条件。“弱粘附细胞”指在细胞培养期间与基材表面相互作用或结合或接触弱的细胞或细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。然而，物理干扰方法，例如洗涤或培养液更换易使这些类型的细胞，例如人胚胎肾(HEK)细胞从基材表面脱离下来。“悬浮细胞”指优选在培养液中培养时不附着或粘附于基材表面的细胞或细胞系。“细胞培养”指原核或真核细胞在受控制条件下的生长过程。“细胞培养”不仅指培养多细胞真核生物的细胞，特别是动物细胞，而且指培养复杂的组织、器官等系统。
“细胞”等术语指通过半透膜与外部分界的小(通常微观)原生质团，任选包含能单独执行或与其它类似物质相互作用而执行生命功能的一个或多个核和各种其它细胞器，形成能独立执行功能的活物质的最小结构单元，包括合成的细胞构造、细胞模型系统和类似的人造细胞系统。
“细胞系统”等术语指细胞的集合，可包括一种以上类型的细胞(或一类细胞的分化形式)，它们通过彼此相互作用执行生物学或生理学或病理生理学功能。此类细胞系统可包括，例如器官、组织、干细胞、分化的干细胞和类似的细胞系统。
“靶标”等术语指细胞蛋白质或生物分子，其活化可介导细胞信号转导或调节细胞功能。靶标可以是，例如受体、磷酸酶、激酶、酶、DNA、RNA和类似实体。受体可以是，例如G蛋白-偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTK)、转运蛋白、离子通道、整联蛋白受体、钠/质子交换剂和类似实体。激酶可以是，例如蛋白激酶A、蛋白激酶C、有丝分裂原激活的蛋白(MAP)激酶、胞外信号-调节的激酶、Src、Rho激酶、灶性黏着激酶和类似实体。酶可以是，例如膜-结合的腺苷酸环化酶、可溶性腺苷酸环化酶、蛋白酶和类似实体。
“双-”、“双重”、“双重的-”等术语指检测由两种不同的靶标，例如Gq-偶联受体和Gs-偶联受体，两种不同的Gq-偶联受体，GPCR和受体酪氨酸激酶，GPCR和酶，GPCR和激酶及类似组合介导的细胞反应或活性的试验。
“多重”、“多重的”等术语指检测由两种以上各个靶标介导的细胞反应或活性的试验。所述靶标可属于(例如)同一类别的靶标，如GPCR，或不同类别的靶标，如两种GPCR和一种受体酪氨酸激酶。
“筛选”等术语指，对(例如)一种或多种化合物或候选药物或生物物质(例如，RNAi、抗体)的系统性研究，检测它们作用于特定靶标、细胞类型或细胞系统的药理学活性。药理学或生物学活性表现为药物对生命物质的有益或有害作用。
“模式”、“模式分析”等术语指外推的信息，是关于候选药物、化合物通过一种或多种细胞靶标，通过特定靶标介导的已知的或预定的信号输出，例如细胞的光学或生物阻抗反应的幅度，对活细胞或细胞系统的生物学作用的信息。
“标记”等术语指，例如能调节至少一种细胞靶标(例如，Gq-偶联受体、Gs-偶联受体、Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、离子通道、受体酪氨酸激酶、转运蛋白、钠-质子交换蛋白、核受体、细胞激酶、细胞蛋白等)的活性，产生可用生物传感器检测的可靠的可检测生物传感输出信号的分子、生物分子或生物物质。根据所需细胞靶标的类别及其随后的细胞反应，所述标记可以是活化剂，例如激动剂、部分激动剂、反激动剂，例如GPCR或受体酪氨酸激酶或离子通道或核受体或细胞腺苷酸环化酶。所述标记也可以是某些类别细胞靶标的抑制剂，例如肌动蛋白丝或微管的抑制剂；或是激酶，例如Rho激酶的抑制剂，或是细胞表面分子的抗体，或类似实体，例如抗-表皮生长因子受体抗体。
“检测”等术语指本发明装置和方法能同时发现或感知至少两种配体诱导的细胞反应并区分缺乏配体化合物时的感知反应。
“鉴定”等术语指本发明装置和方法不仅能识别配体化合物对至少两种靶标的影响，而且能辨别配体化合物特性对至少两种靶标的影响或相互作用的类型。
“刺激物”、“治疗性候选化合物”、“治疗性候选药物”、“预防性候选药物”、“预防剂”、“候选配体”等术语指，能与固定或连接于生物传感器的细胞靶标相互作用的感兴趣的天然或合成的分子或材料。治疗性或预防性候选药物可包括，例如能特异性结合两种或多种靶标，例如蛋白质、DNA、RNA、离子、脂质等活细胞结构或组分的至少一种，或与之相互作用的化学化合物、生物学分子、肽、蛋白质或生物学样品、候选小分子药物、候选药物生物学分子、候选小分子药物-生物学物质偶联物和类似的材料或分子实体，或它们的组合。
“生物传感器”等术语指与合适设备联用可检测所需分析物的制品。生物传感器可联合生物学组件与理化检测器组件。生物传感器通常由三部分构成：生物学组件或元件(例如，组织、微生物、病原体、细胞、细胞组分或它们的组合)、检测器元件(以理化方式，例如光学、压电、电化学、热量、磁力等方式工作)和与这两种组件结合的转换器。在各实施方式中，光学生物传感器可将活细胞中的分子识别或分子刺激反应转换成可定量信号。
可采用本领域普通技术人员熟知的缩写，例如″h″或“hr”为小时，″g″或″gm″为克，″mL″为毫升，″rt″为室温，“nm”为纳米和类似的缩写。
“包括”等术语表示包括但不限于。
修饰用于描述本发明各实施方式中的，例如组合物中成分的含量、浓度、体积、加工温度、加工时间、产率、流速、压力等类似数值，以及它们范围的“大约”指，例如对制备化合物、组合物、浓缩物或所用制剂的常规检测和处理过程可允许的数值差异；这些工艺中偶发的误差；制备过程的差异；实施所述方法的起始材料或成分的来源或纯度的差异；和类似考虑。术语“大约”还包括，例如由于含有特定起始浓度或配料的组合物、制剂或细胞培养的老化导致的而含量差异，和因含有特定起始浓度或配料的组合物或制剂的混合或加工导致的含量差异。无论有无术语“大约”的修饰，随附的权利要求包括这些数量的等价含量。
在各实施方式中，“基本上由...构成”指，例如本发明的组合物、在生物传感器表面制备或利用组合物、制剂的方法，和制品、装置、或设备，可包括权利要求所列的组分或步骤，加上不会实质性影响本发明组合物、制品、设备和制备使用方法的基本特性和新颖特性的其它组分或步骤，例如选择的具体反应物、具体添加剂或成分、具体试剂、具体细胞或细胞系、具体表面修饰剂或条件、具体候选配体，或类似的结构、材料或所选的不同方法。
可实质性影响本发明组分或步骤基本特征或可能对本发明特征造成不良影响的项目包括，例如细胞对生物传感器表面的亲和力降低、候选配体对细胞的亲和力降低、病原体对细胞的亲和力降低、对候选配体或类似刺激反应的异常或相反细胞活性，和类似特征。在一些例子中，上面举例的不良特征在本发明的筛选或模式分析应用中，例如发现能降低候选配体对细胞的亲和力，或降低病原体对细胞的亲和力的条件或配体，可能是极其需要而有益的。
除非另有说明，本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“该”表示至少一个或一个或多个。
组分、成分、添加剂、细胞类型、病原体和类似方面及其范围所公开的具体值和优选值，只是说明；它们不排除所限定范围内的其它限定值或其它值。本发明的组合物、装置和方法包括具有本文所述任何值或所述值的任何组合、比值、更多比值和优选值。
本发明提供的方法和装置可用于化合物筛选和化合物模式分析试验，例如分析一种细胞类型的两种不同细胞靶标的试验。
在各实施方式中，本发明提供采用不用标记的生物传感器的多重靶标特异性筛选方法，分析化合物的模式、进行筛选或二者。
在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如：
提供生物传感器；
将表达至少两种不同靶标(例如，第一靶标和第二靶标)的细胞系样品固定在生物传感器表面上；
使接触生物传感器的细胞系样品与候选配体接触，例如温育一段时间；
使经过候选配体处理的细胞系与包含至少两种标记的混合物接触，例如温育，各标记能选择性调节所述不同靶标中至少一种活性；
监测温育期间生物传感器的输出；和
测定候选配体对所述混合物诱导生物传感器输出的作用。
在各实施方式中，所述靶标可以是，例如受体、细胞蛋白的至少一种，或它们的组合。所述细胞蛋白可以是，例如细胞酶、细胞激酶、细胞结构蛋白质的至少一种或它们的组合。所述受体可以是，例如Gq-偶联受体、Gs-偶联受体、Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道、钠-质子交换蛋白、整联蛋白受体和转运蛋白的至少一种或它们的组合。在各实施方式中，所述标记可以是，例如激动剂、部分激动剂或反激动剂的至少一种。在各实施方式中，所述激动剂可以，例如能活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。在各实施方式中，所述标记可以是抑制剂或抗体的至少一种，所述标记可活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。在各实施方式中，所述标记各自可特异性调节不同靶标的活性。在各实施方式中，所述靶标可以是，例如以下至少一种：一对Gq-偶联受体、一对Gq-偶联受体和Gs-偶联受体、一对Gi-偶联受体和Gs-偶联受体、一对G蛋白-偶联受体和受体-酪氨酸激酶，或一对受体和细胞蛋白。在各实施方式中，候选配体对生物传感器输出的影响可以是，例如调节所述标记诱导的信号反应。在各实施方式中，所述调节可以是，例如信号幅度、动力学变化或它们的组合。
在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如：
提供生物传感器；
将表达至少两种不同靶标(例如，第一靶标和第二靶标)的细胞系样品固定在生物传感器表面上；
将细胞系样品与含有至少一种阻断剂的混合液一起温育，所述阻断剂抑制细胞蛋白的活性，而所述细胞蛋白并非靶标但能干扰靶标的活性；
将接触生物传感器的细胞系样品与候选配体一起温育合适的时间；
将经候选配体处理的细胞系与包含至少两种活化剂的混合物一起温育，各活化剂能选择性活化所述不同靶标中的一种；
监测温育期间生物传感器的输出；和
测定候选配体对所述混合物诱导的生物传感器输出的作用。
在各实施方式中，可分别或一起加入所述阻断剂和候选配体。如果分别加入，优选先加入阻断剂再加入候选配体。所述阻断剂可以是，例如细胞蛋白的拮抗剂、细胞蛋白的抑制剂、细胞蛋白的干扰性RNA(RNAi)、细胞蛋白的反义核酸或类似实体。在各实施方式中，所述阻断剂，例如溶液可以在候选配体之前加入。在各实施方式中，所述阻断剂，例如溶液可以与候选配体一起加入。
在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如：
提供生物传感器；
将含有表达第一靶标的第一细胞系和表达第二靶标的第二细胞系的混合细胞群固定在生物传感器表面上；
使生物传感器上固定的混合细胞群与候选配体接触合适或足够时间；
将经候选配体处理的细胞系与包含两种活化剂的混合物一起温育，一种活化剂选择性活化所述第一靶标而另一种活化所述第二靶标；
监测温育期间生物传感器的输出；和
测定候选配体对所述混合物诱导的生物传感器输出的作用。
在各实施方式中，所述两种细胞系彼此相关，例如亲代细胞系和用该亲代细胞系工程改造的细胞系。或者，两种细胞的来源可以不同。
在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如：
提供生物传感器；
将含有表达靶标的第一细胞系和不表达靶标的第二细胞系的混合细胞群固定在生物传感器表面上；
将接触生物传感器的细胞系与候选配体温育合适或足够时间；
将经候选配体处理的细胞系与，例如包含能选择性活化所述靶标的活化剂溶液一起温育；
监测温育期间生物传感器的输出；和
测定候选配体对所述活化剂诱导的生物传感器输出的作用。
在各实施方式中，所述两种细胞系优选彼此相关，例如表达GPCR的工程改造细胞和不表达GPCR的亲代细胞。可预定两种细胞系的接种数量从而在培养后，这两类细胞之间的理想比例可以是，例如约1∶1。当采用靶标活化剂刺激得到的混合细胞群时，获得的平均反应将是与只采用表达该靶标的细胞的大约50％。当候选配体也是靶标的特异性活化剂时，可提供与活化剂相当的反应。当候选配体是靶标的非特异性活化剂时，可提供不同的反应。
在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如：
提供生物传感器；
将含有表达第一靶标的第一细胞系和表达第二靶标的第二细胞系样品的混合细胞群固定在生物传感器表面上；
将细胞系样品与含有至少一种阻断剂的混合溶液一起温育，所述阻断剂能抑制细胞蛋白的活性，而所述细胞蛋白并非靶标但能干扰至少一种靶标的活性；
将接触生物传感器的细胞系样品与候选配体一起温育合适或足够时间，例如以检测或测量任何配体与细胞，或更具体地说，与细胞靶标或受体的相互作用；
将经候选配体处理的细胞系与包含至少两种活化剂的混合物一起温育，各活化剂能选择性活化不同靶标之一种；监测培育期间生物传感器的输出；和
测定候选配体对所述混合物诱导的生物传感器输出的作用。
在各实施方式中，所述生物传感器可以是，例如光学生物传感器，特别是共振波导光栅生物传感器，或者是例如电阻抗生物传感器，特别是生物阻抗生物传感器。所述细胞可以是表达两种不同受体，例如受体A和受体B(图1，165、170)的一种细胞类型。或者，所述细胞可以是各自表达一种受体的两种不同类型细胞，其中可先将两类细胞混合在一起再置于传感器表面上。两种受体可属于同一类受体(例如，Gq-偶联受体)、不同类型的受体，例如一对Gq和Gs-偶联受体、一对GPCR和受体酪氨酸激酶，或类似的受体组合。当两种受体导致相似的信号传导途径时，它们相应活化剂的浓度优选约为它们的EC50值(即，活化剂结合而活化受体，产生50％最大反应的浓度)。当两种受体导致不同的信号传导途径时，它们相应活化剂的浓度范围可以较宽，例如约EC10至约10xEC100，或更高。
在各实施方式中，本发明提供利用各自可激活不同靶标的两种不同激动剂或活化剂的组合进行化合物筛选和模式分析的方法。该方法可用于靶特异性筛选和模式分析，特别适合于双重或多重受体或靶标筛选。
在各实施方式中，本发明提供利用不用标记的生物传感器，例如RWG生物传感器或电阻抗生物传感器，在活细胞环境中进行多重靶特异性化合物筛选和模式分析。本发明无需工程改造细胞等操作，对于相同类别的靶标，例如Ca2+动员，它们的细胞信号传导途径不需要相似或相同。然而，可工程改造细胞或对细胞进行操作。
在各实施方式中，所述靶标可属于同一家族(例如，Gq-偶联受体)或不同家族(例如，一个是Gq-偶联受体，另一个是Gs-偶联受体；或者一个是Gs-偶联受体，另一个是Gi-偶联受体；一对G蛋白-偶联受体和受体酪氨酸激酶；一对受体和胞内激酶(例如蛋白激酶C)；或一对胞内激酶和酶，例如一对蛋白激酶C和腺苷酸环化酶)。
在各实施方式中，所述活化剂或标记可以是受体的激动剂，或激酶或酶的活化剂。对于给定的细胞或细胞系统，可预定并选择各自能导致可靠和可检测的生物传感器信号的一组活化剂。例如，当在人表皮样癌A431细胞中利用光学生物传感器，例如RWG生物传感器时，可选择以下活化剂：
内源性GPCR的激动剂或部分激动剂，例如缓激肽B2受体的缓激肽、β2肾上腺素能受体的肾上腺素、腺苷A2B受体的腺苷、蛋白酶活化受体亚型1的凝血酶或SFLLR-酰胺、蛋白酶活化受体亚型2的胰蛋白酶或SLIGKV-酰胺、组胺H1受体的组胺、P2Y受体的三磷酸腺苷(ATP)、LPA受体的溶血磷脂酸(LPA)，参见，例如Fang，Y.等.，J.Pharmacol.Tox.Methods，2007，55，314-322。
内源性受体酪氨酸激酶的激动剂可以是，例如EGFR的表皮生长因子(EGF)，参见，例如Fang，Y等.，Anal.Chem.，2005，77，5720-5725。
内源性离子通道的离子通道打开剂(ion channel opener)可以是，例如ATP-敏感性钾离子通道的吡那地尔(pinacidil)。
细胞酶的活化剂可以是，例如腺苷酸环化酶的福斯高林(forskolin)。
细胞激酶的活化剂可以是，例如蛋白激酶C的12-脱氧佛波醇13-乙酸酯和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；或蛋白激酶A的8-溴-cAMP和Sp-cAMPS及二丁基-cAMP。
破坏剂可以是，例如肌动蛋白丝的细胞松弛素D或微管的噻氨酯哒唑(nocodozale)。
整联蛋白受体的活化剂可以是，例如可溶性纤连蛋白或其片段。
细胞膜破坏剂可以是，例如导致细胞膜渗漏的皂苷，参见，例如Fang，Y等.，FEBS Lett.，2005，579，4175-4180。
凋亡诱导剂可以是，例如，可触发Ca2+依赖性细胞凋亡的Ca2+离子载体A23187。
激酶抑制剂可以是，例如Rho激酶的Y-27632。
由于用各标记刺激所检测的细胞可导致特定细胞反应、信号传导途径或信号传导网络相互作用，并且各信号传导途径可能涉及不同组别细胞靶标，选择的一组标记应覆盖给定细胞系统中的许多(如果不是全部的话)细胞信号传导途径。
在各实施方式中，本发明提供采用生物传感器对化合物进行靶特异性多重筛选和模式分析的方法。所述方法的明显属性包括，例如：
应用于光学生物传感器或电阻抗生物传感器的细胞试验；
提高该试验的通量至少二倍；
可在一次试验中同时测定不同类别的靶标因而具有广泛适用性；和
该方法适合于检测受体-受体相互作用。
可发生不同水平的受体-受体相互作用，例如两种受体二聚化，受体的寡聚化，通过受体下游信号传导级联反应的串话(cross-talk)或类似相互作用，和它们的组合。常规细胞试验依赖于通过靶受体，例如G蛋白-偶联受体检测特定细胞反应。由于这种维度以及知道给定细胞类型中不同类别的靶受体可导致不同的细胞信号传导，因此对多种靶受体的筛选有很大困难。
虽然采用标准筛选方法(通常包括一次测定一个靶标)已成功鉴定了强效候选药物，但关于化合物选择性的信息非常少。目前进行选择性的研究集中于药物开发过程的下游。然而，这种后期研究需要弃去有害结合的化合物因而使得药物发现过程更昂贵费时。能同时检测化合物对多种靶标的活性的多靶筛选方法，极其有利于在药物发现过程的早期有效寻找化合物的选择性。
常规多重筛选方法通常依据于微阵列技术，该技术已成为在一次实验中同时分析许多基因和蛋白质的通用方法。蛋白质微阵列的应用已从蛋白质丰度模式分析扩展到测定，例如蛋白质的位置、蛋白质的修饰以及蛋白质与其它化学和生物学分子的相互作用。这些进步对药物发现和开发工艺提供了新的范例。用于化合物模式分析和筛选的微阵列的例子包括，例如空气稳定的GPCR微阵列，参见，例如Fang，Y等.，“Membrane protein microarrays(膜蛋白微阵列)”，Journal of the American Chemical Society，2002，124，2394-2395；Fang，Y等.，“Air-stable G protein-coupled receptor microarrays and ligand bindingcharacteristics(空气稳定的G蛋白-偶联受体微阵列和配体结合特征)”，Analytical Chemistry，2006，78，149-155，采用条码CellCard载体(bar-codedCellCard carrier)培养的细胞的细胞阵列，参见，例如Beske，O等.，“A novelencoded particle technology that enables simultaneous interrogation of multiplecell types(能同时查询多种细胞类型的新型编码的颗粒技术)”，Journal ofBiomolecular Screening，2004，9，173-185，或采用固态转染的转染细胞集群阵列，参见，例如Mishina，Y.M等.，“Multiplex GPCR assay in reversetransfection cell microarrays(反转染细胞微阵列的多重GPCR试验)”，Journalof Biomolecular Screening，2004，9，196-207。这些技术通常要求工程改造或操作细胞，例如用于GPCR微阵列的含过表达靶受体的裂解细胞的纯化细胞膜片段，或用于转染细胞集群阵列的，或用于CellCard技术的不同类型细胞或一种类型细胞的工程改造变体。
也开发了依据Ca2+流量进行检测的双功能试验，例如通过混合合适比例的两种稳定转染的细胞群，其中各群细胞表达一种靶标。如果存在能活化一种受体的“选中物”，可用，例如FLIPR(荧光计成像平板读数计)系统检测其导致的50％荧光信号。此外，如果另一选中物具有交叉活性而能活化两种受体，则此“选中物”能导致100％的信号。此类筛选采用单靶标筛选可使产生的潜在选中物翻倍。然而，需要采用单靶标筛选进行额外筛选而去卷积选中物。此类双重试验仅限于两种Gq-偶联受体，二者均通过Gq和随后的Ca2+动员介导信号传导。
在各实施方式中，本发明提供不用标记的筛选方法，包括：
提供具有混合细胞群的生物传感器，所述细胞群含有共同固定在生物传感器表面上的两类细胞；
使固定的细胞与候选配体接触；和
测定候选配体诱导的生物传感器输出。
这两类细胞可以是，例如亲代细胞和其表达一种靶标的工程改造细胞；各自表达一种靶标的两种工程改造细胞；或两种天然细胞。
在各实施方式中，本发明提供不用标记的筛选方法，包括：
提供具有混合细胞群的生物传感器，所述细胞群含有表达第一靶标的第一类细胞和表达第二靶标的第二类细胞，这两种细胞类型共同固定在生物传感器的表面上；
使固定的细胞与候选配体接触；
使经候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触，每种标记能特异性调节一种靶标的活性；和
测定所述候选配体对标记混合物-诱导的生物传感器输出的作用。
1.不用标记的生物传感器细胞试验
不用标记的细胞试验通常采用生物传感器来监测活细胞中配体诱导的反应。生物传感器通常利用转换器，例如光学、电子、量热、声学、磁力等转换器将与生物传感器接触的细胞中分子识别或配体诱导的变化转换成可定量的信号。这些不用标记的生物传感器可用于分子相互作用的分析，包括表征分子复合物如何随时间形成和解离，或分析细胞反应，包括表征分子如何对刺激起反应。图1突出显示了目前用作不用标记的细胞试验基础的两类生物传感器：共振波导光栅(RWG)生物传感器和电子生物传感器，以及如何利用依据生物传感器的细胞试验进行化合物的双靶标筛选和模式分析。
RWG生物传感器和系统-RWG生物传感器可包含，例如基板(如，玻璃)、具有嵌入光栅结构和细胞层的波导薄膜(图1a)。RWG生物传感器采用借助衍射光栅将光共振耦合入波导管，导致溶液-表面界面完全的内部反射(totalinternal reflection)，进而在该界面产生电磁场。该电磁场的性质为逐渐消散接近于零，意味其从传感器表面开始呈指数衰减；将其衰减到初始值的1/e处的距离称为穿透深度，此深度与特定RWG生物传感器的设计呈函数关系，但数量级通常约为200nm。此类生物传感器利用此类消散波可特征分析配体诱导的传感器表面或附近细胞层的变化。
可依据角度漂移(angle-shift)或波长漂移(wavelength-shift)的测量，将RWG仪器再分成多个系统。在波长漂移检测中，利用角度恒定覆盖入射波长范围的偏振光照亮波导管；特定波长的光耦合入波导管并沿波导管传播。或者，在角度-漂移仪器中，用单色光照亮传感器并检测光的共振耦合角度。与生物传感器表面直接接触的细胞层(例如，汇合和粘附状态细胞)能影响共振状态。当配体或分析物与活细胞中的细胞靶标(例如，GPCR、激酶)相互作用时，可检测细胞层内局部折射率的任何变化表示为共振角度(或波长)的变化。
Figure BPA00001251710300141
系统采用RWG生物传感器进行不用标记的生物化学或细胞试验(纽约州康宁市康宁公司(Corning Inc.，Corning，NY))。
Figure BPA00001251710300142
系统由RWG平板读数计和SBS(生物化学筛选协会(Society for BiomolecularScreening))标准微量滴定板构成。平板读数计中的检测器系统利用集成光纤可检测细胞中配体诱导变化所致的入射光波长漂移。以线性方式安排一系列照明检测头，从而能同时收集384-孔微量板中一列孔内各孔的反射光谱。扫描整块板，多次寻址各传感器并顺序寻址各列孔。收集入射光的波长用于分析。该仪器中可包括温度控制单元，以最大程度减小温度波动导致的入射波长伪漂移。
电子生物传感器和系统-电子生物传感器由基板(例如，塑料)、电极和细胞层构成(图1b)。在该电子检测方法中，将细胞培养在基板上排列的小金电极上，监测该系统随时间而变的电阻抗。阻抗是对细胞层电导率变化的衡量。通常将频率固定的或变化的小恒定电压施加于电极或电极阵列，随时间监测通过回路的电流。配体诱导的电流变化是对细胞反应的衡量。1984年首次实现了全细胞传感(whole cell sensing)的阻抗测量。自此后，阻抗检测已应用于研究各种细胞反应，包括细胞粘附和传播、细胞微动(cellmicromotion)、细胞形态的变化和细胞死亡。阻抗系统的典型问题是由于采用小检测电极和大参比电极导致试验的差异高。为克服这种差异，最新一代的系统，例如加利福尼亚州南旧金山MDSS公司的细胞匙系统(CellKeysystem，MDS Sciex，South San Francisco，CA)和加利福尼亚州圣迭戈ACEA生物科学公司(ACEA Biosciences Inc.，San Diego，CA)的RT-CES采用了含微电极阵列的集成电路。
该细胞匙系统由环境控制的阻抗检测系统、96-孔电极-嵌入微量滴定板、负载96-孔板射流器(onboard 96-well fiuidics)及客户获取和分析软件构成。将细胞接种在培养孔中；各孔含有集成的电极阵列。该系统利用24种频率(1KHz-10MHz)的小幅交流电压进行操作。以2秒的适时修正率(update rate)检测所产生的电流。量热调节该系统后，可在例如28℃-37℃进行实验。用96-孔头液体递送装置(96-well head fluid delivery device)处理液体的加入并交换(板孔)负载。
RT-CES系统可包括四种获取数据和展示的主要组件：电子微量滴定板(E-PlateTM)、E-平板站、电子分析仪和监测系统。电子分析仪发送和接收电子信号。E-平板站置于组织培养孵育箱内。E-平板站以三种通量方式工作：一次运行6块16-孔E-平板的16x站、一个96-孔E-平板站和一次可容纳最多6块96-孔E-平板的多重-E-平板TM站。可将细胞接种入与微电子传感器集成阵列的E-平板中。该系统以多种频率的低电压(低于20mV)AC信号操作。
GPCR活化的光学信号与RWG生物传感器细胞是具有较大尺寸，例如数十微米的动态研究对象。RWG生物传感器通过检测消散波的穿透深度而能测定细胞底部配体诱导的变化。此外，通过入射光源的斑点大小(约100微米)测定光学生物传感器的空间分辨率。因此，通常采用高度汇合的细胞层以获得最佳试验结果；可将该传感器构造视作三层波导复合构造，包括，例如基板、波导薄膜和细胞层。按照3-层波导生物传感器理论和细胞生物物理学，我们发现对于全细胞传感，配体-诱导的有效折射率变化(检测到的信号ΔN)受以下方程(1)的控制：
ΔN = S ( N ) Δ n C
= S ( N ) αd Σ i Δ C i [ e - z i Δ Z C - e - z i + 1 Δ Z C ] - - - ( 1 )
其中S(C)是该系统对细胞层的灵敏度，Δnc是生物传感器检测到的配体诱导的细胞层局部折射率变化。ΔZc是透入细胞层的穿透深度，α是比折射率增量(specific refractive index increment)(蛋白质约为0.18/mL/g)，zi是质量重分布(mass redistribution)发生的距离，d是细胞层内薄片的假想厚度(imaginary thickness)。此处为将细胞层在垂直方向分成相等间隔的薄片。我们设想检测到的信号与细胞层底部折射率变化Δnc直接成一级比例。鉴于细胞内给定体积的折射率在很大程度上取决于生物分子，主要是蛋白质的浓度，Δnc进而与传感体积(sensing volume)中的细胞靶标或分子集合的局部浓度变化直接成比例。考虑到消散波呈指数衰减的性质，对于发生的蛋白质局部浓度变化考虑了加权因素exp(-zi/ΔZc)。因此，检测到的信号是发生在距离传感器表面不同处的质量重分布之和，各自不相等地影响到总体反应。方程(1)提示RWG生物传感器检测的信号主要对蛋白质局部浓度变化所致的垂直质量重分布敏感。常将检测到的信号称为动态质量重分布(DMR)信号。
GPCR活化导致一系列空间和时间变化，包括，例如配体结合、受体活化、蛋白质募集、受体内化和再循环、第二信使变化、细胞骨架重塑、基因表达和细胞粘附变化。关于动力学、持续时间、幅度和大量移动(mass movement)的变化，各种细胞具有其自身特征。因此，可以合理假设这些细胞变化依据它们发生的地点不同程度地影响着总体DMR信号。利用靶向各种GPCR的一组激动剂，我们在人表皮样癌A431细胞中鉴定到三类DMR信号，反映了它们所介导的信号传导途径状态。由于各信号与一类GPCR的活化相关(取决于该受体耦合的G蛋白)，将获得的DMR信号分别命名为Gq-、Gs-和Gi-DMR信号。各类DMR信号表现出不同的动态学和动力学性质，反映为通过不同GPCR类别介导的独特信号传导的整合。可利用DMR信号的这种独特性质来鉴定孤儿GPCR的G-蛋白偶联机制。
GPCR活化的生物阻抗信号-在典型的阻抗细胞试验中，使细胞与排列在培养孔底部的金电极接触。该传感器系统的总阻抗主要由围绕生物传感器的离子环境决定。施加电场时，离子在电场中定向移动发生浓度梯度驱动的扩散。对于全细胞传感，总电阻抗具有4部分：电解质溶液的电阻；细胞的阻抗；电极/溶液界面的阻抗；和电极/细胞界面的阻抗。此外，细胞的阻抗包括两部分：电阻和电抗(reactance)。细胞离子强度的导电特征产生电阻部分，而起着不完美电容器作用的细胞膜可影响频率依赖性电抗部分。因此，总阻抗与许多因素呈函数关系，包括，例如细胞活力、细胞汇合、细胞数量、细胞形态、细胞粘附程度、离子环境、细胞内的水含量、检测频率和类似考虑。
在RT-CES系统中，施加的一定百分比的这种低电压与细胞内部耦合。据信，施加于细胞的此类信号远小于哺乳动物细胞的典型静息膜电位，因此极小或不破坏细胞功能。RT-CES系统可检测阻抗的这些变化，显示的参数称为细胞指数。按照方程(2)计算这种细胞指数：
CI = max i = 1 , . . . , N ( R cell ( f i ) R 0 ( f i ) - 1 ) - - - ( 2 )
其中N是检测阻抗的频率点数(例如，10kHz、25kHz和50kHz的N＝3)，R0(f)和R细胞(f)分别是孔中不存在或存在细胞时的电极电阻频率。
在细胞匙系统中，传感器系统的阻抗变化归因于对受体刺激反应时细胞层复合阻抗的变化(ΔZ或dZ)。频率较低时，施加的低电压诱导了流过层中各细胞周围的胞外电流(iec)。然而，检测频率低时，通过细胞膜离子通道的传导电流也可能至关重要。频率高时，它们诱导的跨细胞电流(itc)穿透细胞膜(图1b)。按欧姆定律所述，施加于各孔的电压与测得电流之比即为其阻抗(Z)。
当细胞接触刺激物，例如受体的配体时，活化信号转导导致复杂的细胞变化，例如调节肌动蛋白细胞骨架，导致细胞的粘附、形状和体积变化以及细胞-细胞相互作用。这些细胞变化各自或整体影响胞外电流和跨细胞电流的流动，因而影响到所检测阻抗的量级和特征。例如，利用细胞匙系统鉴定通过不同类别GPCR活化介导的细胞阻抗反应时，结果显示根据受体偶联的G蛋白，有三类阻抗信号是通过三类GPCR的活化所介导。采用RT-CES系统也记录到相似的模式。虽然不想受理论的束缚，但据信这些阻抗信号是在对不同类别GPCR活化的反应中，对肌动蛋白细胞骨架的不同效应所致，这些效应影响通过阻抗检测的细胞参数。现已证明Gq和Gi GPCR的活化可导致肌动蛋白聚合增加，而Gs GPCR刺激可导致肌动蛋白解聚。
光学和电子生物传感器均适用于许多不同类别的靶标，包括GPCR、受体酪氨酸激酶、激酶、酶或其它细胞靶标。
2.采用生物传感器细胞试验进行双靶标-特异性筛选
生物传感器细胞试验能多重检测。给定细胞系中同一类靶标(例如，Gq-偶联受体)的活化可导致几乎相同的光学标签(optical signature)，提示可同时检验同一家族内的多个靶标。例如，A431细胞可内源性表达缓激肽B2受体、P2Y受体和蛋白酶活化受体(PAR)。用缓激肽、ATP或凝血酶刺激后，静息A431细胞反应的光学标签与Gq-型相似。采用无血清培养液连续培养约20小时获得静息状态。氟-3试验显示所有三种受体的活化均介导了Gq-信号传导。这些观察提示生物传感器试验可用于筛选化合物或选中能活化同一细胞中表达的同一类别受体的那些化合物。
G蛋白-偶联的受体(GPCR)是人基因组药物靶标最丰富的类别，也是医药工业的常用靶标。约30种已知的GPCR是占目前投入市场的所有药物中约40％的靶标，许多功能未经表征的其它GPCR是可能的药物靶标，代表了药物开发的未使用资源。将新的GPCR药物投入市场的努力促进了对试验方法，特别是功能性细胞试验的革新。然而，目前的试验大多有途径偏向性(pathway-biased)，只能检测GPCR信号传导级联反应中的“接触点”。鉴于近年认识到GPCR信号传导和配体导向功能的选择性很复杂，这种途径偏向性试验易产生假阴性。此外，许多常规试验因其多重检测能力有限以及途径偏向性质，通常一次只能检测一种靶标。能同时检测化合物对多种靶标活性的多重靶标筛选方法在逻辑上适合于寻址化合物的选择性。
包括表面等离振子共振(SPR)、共振波导光栅(RWG)和等离子-波导共振(PWR)在内的不用标记的光学生物传感器常规用于生物分子相互作用的分析。近年，不用标记的光学生物传感器已应用于全细胞传感，这些生物传感器能监测内源性受体的活化，导致高-信息和生理相关地检测受体-配体对(参见Fang，Y.等.“Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing(活细胞传感的共振波导光栅生物传感器”，Biophys.J.，2006，91，1925-1940)。这些试验无需预先了解细胞信号传导并且是途径非偏向性的(参见Fang，Y.等，“Non-invasive optical biosensor for assaying endogenous G protein-coupledreceptors in adherent cells(检验粘附细胞中内源性G蛋白-偶联受体的非侵入性光学生物传感器)”，J.Pharmacol.Toxicol.Methods，2007，55，314-322)。记录的光学反应是途径敏感性的，反映了受体信号传导的复杂性(参见Fang，Y等.，“Optical biosensor provides insights for bradykinin B2receptor signalingin A431 cells(利用光学生物传感器了解A431细胞中的缓激肽B2受体信号传导)”，FEBS Lett.，2005，579，6365-6374)。
参见附图，图1显示生物传感器细胞试验和双靶标-特异性筛选的原理。图1a显示监测活细胞中配体-诱导的动态质量重分布(DMR)的RWG生物传感器(100)。可在生物传感器表面上直接培养细胞，或者使细胞与传感器表面接触。在各实施方式中，生物传感器可包括，例如玻璃基板(105)、其中嵌入光栅结构的波导(110)薄膜、光源(112)及检测和加工所产生的折射光的器件(113)。只直接检测检测区(115)和细胞底部分(120)的质量重分布。图1b是监测生物传感器和细胞周围离子环境的电子生物传感器(150)。可在生物传感器表面培养细胞，所述生物传感器，例如在基板(160)上具有排列的金微电极(155)。对细胞施加可变频率的低AC电压(例如，电脉冲(180))的同时检测胞外(161)和胞内(162)电流。在图1a和1b中，方块(■)代表受体A(165)的配体(163)，圆圈(○)代表受体B(170)的配体(168)。受体A和B二者在同一细胞中表达。
实验过程
材料
LOPAC购自密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)。S(-)肾上腺素、多巴胺、去甲肾上腺素和组胺购自密苏里州圣路易斯的托克里斯公司(Tocris，St.Louis，MO)。(±)-马来酸溴苯那敏、(±)马来酸氯苯那敏、盐酸克立咪唑、延胡索酸克立马丁、盐酸苯海拉明、或盐酸曲普利啶、SKF91488马来酸氢盐、盐酸雷尼替丁、儿茶酚和马来酸噻普酰胺购自密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma.，St.Louis，MO)。SFFLR-酰胺购自宾夕法尼亚州金戈夫普鲁西亚的巴卡姆公司(Bachem，King of Prussia，PA)。细胞培养相容的
Figure BPA00001251710300191
384-孔RWG(共振波导光栅)生物传感器购自纽约州康宁市康宁公司。
细胞培养
用补加了10％胎牛血清(FBS)、4.5克/升葡萄糖、2mM谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco改进的Eagle培养液(DMEM)培养人表皮样癌A431细胞(美国典型培养物保藏所)。将悬浮于含10％FBS的50μL培养液中约1.8x104个3-15代细胞置于384-孔微量滴定板的各孔中，37℃，在空气/5％CO2下培养约1天，然后通过在无血清DMEM中连续培养禁食约20小时。
光学生物传感器系统和细胞试验
采用波长询问系统。该系统由温度-控制单元、光学检测单元和机器人操作的液体单元平板构成。检测单元位于集成光纤的中央，能动态检测细胞反应，时间间隔约7秒或约15秒。
RWG生物传感器利用其在溶液-表面界面处通过光全反射产生的消散波，检测细胞中配体诱导的动态质量重分布(DMR)信号。消散波延伸入细胞，随距离增加呈指数衰减，从而产生约150nm体积的特征性传感，暗示通过受体活化介导的任何光学反应仅代表产生消散波的细胞样品部分的平均值。用生物传感器作此类取样足以区分活细胞中的不同类别GPCR信号传导，并简化表述的GPCR信号传导。
类似于SPR，RWG生物传感器对折射率(生物分子的固有特性)敏感。由于细胞内给定体积的折射率在很大程度上取决于生物分子，主要是蛋白质的浓度，我们发现根据三层波导光栅理论，配体诱导的光学反应与动态质量重分布极其相关。细胞靶标向传感器表面的再定位(例如，胞内靶标向基底膜表面的活化受体的再定位)对DMR有正面影响(P-DMR)；相反，细胞靶标远离传感器表面的移动(例如，受体内化)对DMR有负面影响(N-DMR)。这些情况的归并决定了配体诱导DMR的动力学和幅度。然而，利用PWR技术和固定在传感器表面的体外重建GPCR的近年研究，显示受体-脂膜系统的配体诱导光学反应由两部分组成-质量密度变化和结构变化。由于本文所用的RWG生物传感器不能区分这些部分的影响，配体诱导的活细胞生物分子组成的变化也可能影响所检测到的总体反应。
对于生物传感器细胞试验，首先建立2分钟基线。然后将化合物溶液转移至含有汉克平衡盐溶液(20mM Hepes，pH 7.1)维持的细胞的传感器平板中，继续记录细胞反应1小时。然后，建立第二基线(约2分钟)，将含2nM肾上腺素和500nM组胺的混合液引入各孔。再持续监测该共同刺激反应1小时。除非另有述及，在控制温度(28℃)下进行所有研究，每次检测一式三份。发现该试验的变异系数＜10％。用微软Excel或图垫公司(Graph Pad)的Prism软件进行所有数据分析。
实施例
以下实施例用于更完全地描述本发明的使用方式以及进一步说明和证明考虑用于实施本发明各方面的最佳方式的具体实施例。提供这些实施例不是限制本发明的范围，而是为了说明。
实施例1
用SFFLR-酰胺和肾上腺素，或缓激肽和肾上腺素共同刺激后静息A431细胞的光学反应随着高分辨单个细胞成像系统与荧光探针的出现，产生了其中第二信使水平在时间和空间上独特变化的腔室化观念。广泛认为除了产生和调节第二信使，例如Ca2+和cAMP外，GPCR信号的传导过程还通过一系列受到高度调节的空间和时间活动。然而，以前未曾证明或确立通过受体的一系列信号传导的这种“开通(tunneling)”或“传送(channeling)”。不用标记的光学生物传感器能检测该生物传感器检测区中与细胞中的配体诱导动态质量重分布有关的整合细胞反应，从而提供受体生物学和配体药理学的新型读出值。这里采用生物传感器细胞试验研究了静息A431细胞对SFLLR-酰胺和肾上腺素共同刺激反应时的光学反应。SFFLR-酰胺介导的信号传导是通过内源性Gq-偶联蛋白酶活化的受体(参见Fang，Y.和Ferrie，A.M.“Optical biosensordifferentiates signaling of endogenous PAR1 and PAR2 in A431 cells(光学生物传感器可区分A431细胞中内源性PAR1和PAR2的信号传导)”，BMC CellBiol.，2007，8，24)，而肾上腺素介导的信号传导是通过内源性Gs-偶联的β2-肾上腺素能受体(β2AR)(参见Fang，Y.等.，“Non-invasive optical biosensorfor assaying endogenous G protein-coupled receptors in adherent cells(检验粘附细胞内源性G蛋白偶联受体的非侵入性光学生物传感器)”，Journal ofPharmacological&Toxicological Methods，2007，55，314-322)。
图2提供针对两类G蛋白-偶联受体的RWG生物传感器细胞试验。图2a显示A431细胞中的Gq-偶联受体(蛋白酶活化的受体亚型1，PAR1)(210)和Gs-偶联受体(β2肾上腺素能受体，β2AR)(220)。A431细胞可内源性表达PAR1和β2AR。SFLLR-酰胺(215)是PAR1-的特异性激动剂，而肾上腺素(225)是β2AR-的特异性激动剂。图2b显示，用例如1微摩尔SFLLR-酰胺刺激A431细胞可导致Gq-型DMR信号。图2c显示，用例如2纳摩尔肾上腺素刺激A431细胞可导致Gs-型DMR信号。这分别与通过各受体介导的已知信号传导途径相一致，即，PAR1活化导致Gq途径，而β2AR活化导致Gs途径。图2d显示用SFLLR-酰胺(1微摩尔)和肾上腺素(2纳摩尔)共同刺激A431细胞导致的光学标签看来是SFLLR-酰胺和肾上腺素分别诱导的光学标签之和。在图2b、2c和2d中，还包括各时间点的误差棒。一种可能的解释是，不同类别的GPCR可能通过不同途径(例如，“传送”或“开通”)介导信号传导，细胞对靶向不同受体的两种激动剂共同刺激的反应可以是协同反应。
用缓激肽和肾上腺素共同刺激A431细胞也观察到类似结果。图3提供了针对A431细胞中以下两类G蛋白-偶联受体：Gq-偶联受体(缓激肽B2受体)和Gs-偶联受体(β2肾上腺素能受体，β2AR)的RWG生物传感器细胞试验的一个例子。A431细胞可内源性表达B2受体和β2AR。缓激肽是B2-的特异性激动剂，而肾上腺素是β2AR-的特异性激动剂。图3a显示用16纳摩尔缓激肽刺激A431细胞导致Gq-型DMR信号。图3b显示用2纳摩尔肾上腺素刺激A431细胞导致Gs-型DMR信号。这与通过各受体介导的已知信号传导途径相一致，即，B2活化主要导致Gq途径，而β2AR活化导致Gs途径。图3c显示用缓激肽(2纳摩尔)和肾上腺素(2纳摩尔)共同刺激A431细胞导致的光学标签与缓激肽和肾上腺素分别诱导的光学标签之和十分类似。在图3a、3b和3c中，还包括各时间点的误差棒，显示这种动力学反应是高度可重现的。
实施例2
用肾上腺素和组胺共同刺激后静息A431细胞的光学反应A431可内源性表达大量β2AR，但不表达β1或β3-AR。肾上腺素能介导静息A431细胞的双相Gs-型DMR反应(410)(图4)。DMR信号包含持续时间短的小减弱信号(即，N-DMR)，然后是增强信号(即，P-DMR)至升高水平。肾上腺素反应是剂量依赖性和可饱和反应(520)，导致产生0.08±0.03nM的表观EC50和0.95的希尔斜率(Hill slope)(n＝10)(图5a和图5c)。在图5a中，用不同剂量(501：0.01纳摩尔(nM)；502：0.02nM；503：0.04nM；504：0.08nM；505：0.16nM；506：0.64nM；507：2.56nM；508：10.25nM)的肾上腺素刺激细胞，记录它们的实时动力学反应。β-阻断剂普萘洛尔能剂量依赖性减弱肾上腺素反应(数据未显示)，提示肾上腺素反应是β2AR-特异性的。
A431也可内源性表达组胺受体亚型1(H1R)。用组胺刺激静息A431细胞导致剂量依赖性可饱和的Gq-型光学信号，包含初始P-DMR和后续N-DMR(420)(图4)。组胺反应也是可饱和反应(图5b)。在图5b中，用不同剂量的组胺：511：2.7nM；512：43.5nM；513：174nM；514：696nM；515：2,784nM；516：11,138nM；517：445,506nM刺激细胞。绘制成P-DMR幅度与组胺浓度为函数的饱和曲线(530)看来与可变斜率的S形非线性回归拟合良好，产生的表观EC50(n＝6)为687±34nM，希尔系数斜率为1.87(图5c)。观察到活化曲线非常陡峭提示有通过未知机制的受体协同正面效应。用各为1μM的H1特异性拮抗剂(±)-溴苯那敏、(±)氯苯那敏、克立咪唑、克立马丁、苯海拉明或曲普利啶预处理A431细胞完全抑制了1μM组胺诱导的DMR信号。相反，1μM的H2拮抗剂SKF91488和雷尼替丁不明显影响组胺反应，H3-特异性拮抗剂噻普酰胺也不。这些结果提示组胺反应在很大程度上是H1R-特异性反应。
现已确定了其中第二信使水平在时间和空间上发生的独特变化为腔室化信号传导，并且已知它对GPCR信号传导至关重要。至少就生物传感器的传感体积内的质量重分布而言，由于DMR信号是对受体信号传导的整体检测，共同活化与不同类型G蛋白偶联的两种受体产生的DMR信号，很大程度上是通过活化各受体介导的两种DMR信号之和。为检验该假设，用肾上腺素和组胺分别或一起刺激静息A431细胞。结果显示用1μM组胺和2nM肾上腺素的确激活了静息A431细胞，导致产生的的独特DMR信号(430)极其类似于分别活化两种DMR信号之和(440)(图4)。由于这种简单的叠加性质，将早期P-DMR称为组胺反应(450)，延迟的P-DMR称为肾上腺素反应(460)。这些结果连同以上所示实施例，提供了不同类别GPCR大多能独立介导信号传导的第一手证据，强烈提示信号传导级联反应空间和时间的腔室化对于GPCR信号传导至关重要。受体信号传导下游发生的大多数细胞反应为“开通”或“传送”。
令人感兴趣的是，共同-刺激P-DMR信号不是两种个别DMR信号的简单叠加，其初始P-DMR在很大程度上与计算的信号相同，而与该计算信号相比，其第次二衰减相表现出更快的动力学和更大的幅度。虽然不想受理论的束缚，但这可能是由于组胺介导信号传导与肾上腺素介导信号传导的串话(crosstalk)所致。已知活化Gq-偶联受体可导致调节cAMP微域中的腺苷酸环化酶。为检验这种可能性，采用了脱敏试验。此时先用不同剂量的肾上腺素或组胺预处理A431细胞，然后用含2nM肾上腺素和1μM组胺的混合液共同刺激。结果显示肾上腺素剂量依赖性地减弱了组胺反应和肾上腺素反应(图6a)，IC50几乎相同(分别是0.66±0.20nM和0.38±0.09nM(n＝4))(图6b)。在图6a中，用不同剂量(601：0.01nM；602：0.03nM；603：0.13nM；604：0.50nM；605：2nM；606：8nM；607：32nM；608：256nM)的肾上腺素预处理细胞，然后用1,000nM组胺和2nM肾上腺素共同刺激。仅记录共同刺激诱导的实时DMR信号，见图6a。在图6b中，将肾上腺素反应(630)和组胺反应(620)绘制成细胞预处理所用肾上腺素浓度的函数关系图。高剂量肾上腺素完全抑制了随后的肾上腺素反应，但仅部分减弱早期组胺反应。相反，用组胺预处理细胞完全抑制了组胺反应，其表观IC50为1.6±0.4μM，希尔斜率为1.4(n＝4)，但略微减弱肾上腺素反应(图6c和图6d)。在图6c中，用不同剂量：611：2.7nM；612：10.9nM；613：43.5nM；614：174nM；615：696nM；616：2,784nM；617：11，138nM；618：44,550nM的组胺预处理细胞，然后用1,000nM组胺和2nM肾上腺素共同刺激。仅记录共同刺激诱导的实时DMR信号，见图6c。在图6d中，将肾上腺素反应(650)和组胺反应(640)绘制成细胞预处理所用肾上腺素浓度的函数关系图。这些结果提示Gq-偶联受体H1R的确可能通过cAMP-PKA途径与Gs-偶联受体β2AR发生串话。而且，这些结果证明双受体特异性筛选方法可采用不用标记的生物传感器细胞试验。
实施例3
采用作用于A431细胞的LOPAC文库筛选激动剂的光学生物传感器细胞试验-选择包括针对所有主要靶标类别(包括几种GPCR)的1,280种生物活性有机小分子的化合物Sigma-Aldrich LOPAC 1280TM文库，以验证采用生物传感器细胞试验的筛选。由于配体-诱导的DMR信号是整合反应并且常常显示许多配体与细胞中一种以上受体有交叉反活性，用含有0.1％DMSO的1xHBSS稀释该文库成员获得1微摩尔终浓度进行筛选以尽可能降低靶外效应(off-target effect)。此外，配体诱导的DMR是实时动力学反应，包括用于分析配体药理学的许多有用参数(例如，相、幅度和动力学)。采用实时动力学检测，利用LOPAC文库筛选A431细胞内源性受体的激动剂。图7总结了用该方法与该文库获得的DMR信号的一些代表性类别。组胺导致双相Gq-型DMR信号(图7a)。β2AR完全激动剂(±)异丙肾上腺素和R(-)异丙肾上腺素导致典型的Gs-型DMR信号(分别见图7b和图7d)。两种β2AR部分激动剂(±)CGP12177和S(-)吲哚洛尔导致Gs-样DMR，但只包括延长的P-DMR而没有初始N-DMR(图7c和图7e)。钌红(Ruthernium red)(线粒体Ca2+单向转运体和VR1香草素受体偶联离子通道的抑制剂)也导致Gs-样DMR信号，但幅度大得多(图7f)。与文库中的许多化合物相似，强效H1拮抗剂曲普利啶不导致任何显著的DMR信号(称为净零-DMR)(数据未显示)。
根据肾上腺素反应和组胺反应的动力学模式，选择四类终点检测来测定文库中化合物的反应。首先，依据波长漂移计算刺激前与刺激后2分钟之间的反应。结果显示采用该终点检测，从文库中鉴定到的唯一选中物为组胺(数据未显示)。由于肾上腺素(反应)的初始N-DMR较小，此类终点检测看来不能足够可靠地鉴定Gs-偶联受体的激动剂。相反，由于组胺反应的初始P-DMR相当大，此类终点检测极适合鉴定Gq-偶联受体的激动剂。
第二，依据波长漂移计算刺激前与刺激后50分钟之间的反应。结果显示此类终点检测极适合鉴定Gs-偶联受体的激动剂(数据未显示)。然而，不能鉴定Gq-偶联受体的激动剂，因为Gq-型DMR包括初始的快速P-DMR和几乎衰减成初始基线的后续缓慢N-DMR(图4和图5b)。
第三，依据波长漂移计算刺激后2分钟与50分钟之间的反应。将两个时间点之间共振波长的差异绘制成化合物的函数关系图(图8)。结果显示此类两时间点检测足够可靠地鉴定到文库中的Gp-偶联受体和Gs-偶联受体的激动剂。采用三点检测(即，刺激前2分钟和刺激后50分钟)选出了类似的选中物(数据未显示)。因此，可利用从刺激后2分钟到50分钟的波长漂移检测反应来选择H1R和β2AR二者的选中物。H1R的激动剂会导致大的负反应，而β2AR激动剂会导致正反应。
如图8所示，Gq-偶联的H1R只有一个选中物。组胺导致大的负反应。在LOPAC中，组胺是唯一的广谱组胺受体激动剂，但有两种H3R特异性激动剂R(-)-α-甲基-组胺和伊美特(imetit)。1μM的这两种H3R激动剂不导致任何明显的DMR信号。除组胺受体激动剂外，文库中1μM的P2Y激动剂也不导致任何明显或特异性DMR信号，虽然A431可内源性表达Gq-偶联的P2Y受体。虽然不想受理论的束缚，但这可能是因为这些激动剂活化P2Y受体的能力低所致。
相反，有很多选中物可导致幅度不同的正反应。依据导致225±18pm反应的肾上腺素正对照(n＝64)，认为可导致170-280pm反应的选中物是完全的激动剂或强的部分激动剂。结果显示有63个选中物为完全的激动剂或强的部分激动剂-其中12个腺苷受体激动剂，27个肾上腺素受体激动剂和7个多巴胺受体激动剂。此外，认为可导致40-170反应的选中物是部分激动剂或弱的部分激动剂。结果显示有51个选中物属于该类别，包括6个腺苷激动剂、6个肾上腺素受体激动剂和5个多巴胺激动剂。这种高阳性选中率反映了A431也可内源性表达腺苷受体，其活化也导致肾上腺素样DMR反应。此外，已知许多多巴胺激动剂能活化β2AR。除了两种低能β-肾上腺素受体激动剂(±)-麻黄碱和胺碘酮外，正确鉴定了文库中所有其它β-肾上腺素受体激动剂。这种低假阴性率部分证明用所述生物传感器细胞试验方法筛选内源性GPCR的配体具有可行性。
实施例4
用生物传感器细胞试验筛选双受体-特异性拮抗剂-由于用组胺和肾上腺素共同刺激A431细胞产生了同时含有组胺和肾上腺素介导信号传导特征的DMR信号，检验了用生物传感器细胞试验进行双受体-特异性筛选的可能性。该试验采用生物传感器进行初步激动剂筛选1小时，然后用组胺和肾上腺素共同刺激。依据文库中化合物相应的DMR幅度，检验它们对组胺反应和肾上腺素(反应)的影响(图9)。对于肾上腺素反应，有77个导致完全抑制的选中物(20±30pm)、57个部分抑制剂(90±40pm)和1,146个非抑制剂(190±60pm)。对于组胺反应，有51个导致完全抑制的选中物(15±50pm)、79个部分抑制剂(165±100pm)和1,160个非抑制剂(370±110pm)。
初步激动剂筛选与后续激动剂筛选之间的相关性分析进一步澄清了阳性选中物作用于H1R或β2AR。组胺导致Gq-样DMR信号，还导致细胞对组胺(而非肾上腺素)完全脱敏。文库中所有已知的H1R拮抗剂不导致产生任何DMR信号。这些配体包括(±)-溴苯那敏、(±)-氯苯那敏、(+)-溴苯那敏、(+)-氯苯那敏、克立咪唑、克立马丁、苯海拉明、非索非那定、多西拉敏、美沙吡林、异丙嗪、美吡拉敏、特非那定、酮替芬、氯雷他定、非尼拉敏、和曲普利啶。除酮替芬外，1微摩尔的氯雷他定和非尼拉敏仅导致部分抑制组胺反应，所有其它H1R-特异性拮抗剂完全或几乎完全减弱了组胺反应。相反，文库中的H2R-或H3R-特异性拮抗剂均不导致对组胺反应的任何显著抑制，提示组胺反应在很大程度上是H1R特异性反应。令人感兴趣的是，两种H2R拮抗剂-法莫替丁和SKF95282导致类似于吲哚洛尔的DMR，还导致细胞对肾上腺素(而不是组胺)的部分脱敏，提示这两种配体与A431细胞的内源性Gs-偶联受体有串话。此外，几种肾上腺素受体摄取/再摄取抑制剂几乎完全抑制了组胺反应，但对肾上腺素反应无甚影响。它们是普罗替林、酚苄明、阿莫沙平、马普替林、地昔帕明、去甲替林、阿米替林和多塞平。
能导致显著DMR信号的肾上腺素能受体的配体也能导致对肾上腺素反应的细胞脱敏；这种脱敏在很大程度上与配体诱导P-DMR的幅度相关。然而，这些配体减弱组胺反应的能力有很大的不同。相反，对于不产生任何明显DMR信号的肾上腺素能受体配体，这些拮抗剂中只有10种抑制了或部分减弱了肾上腺素反应。这些拮抗剂是阿普洛尔、倍他洛尔、S(-)-噻吗洛尔、(S)-(-)-普罗帕酮、(S)-普萘洛尔、(±)-美托洛尔、SR 59230A、(±)-普萘洛尔、ICI 118，551和(±)-索他洛尔。这10种β阻断剂对组胺反应无甚影响。
近年累积的证据提示受体及其下游信号传导途径单独不起作用。在信号传导网络中它们通过多次交叠相互作用(fold interaction)(串话)连接并结合。不同受体可在多种水平发生串话。发生这种串话是通过胞内信号转导途径的相互作用、激酶使受体和调节蛋白磷酸化或影响胞内钙释放而致。这种串话可确保各信号传导途径之间的信息交换并为它们的协作提供分子基础。因此，刺激特定受体导致信号传导途径活化，随后与被其它受体活化的那些途径分子相互作用。现已逐渐认识和接受，细胞表面受体之间的物理相互作用可为实现受体串话研究提供有用的方法。受体串话代表精细调控细胞功能的方法，它与了解疾病和对与细胞表面受体相互作用的治疗剂的反应相关。不同G蛋白-偶联受体(GPCR)之间的串话是熟知的，大多导致协同效应和放大细胞反应。采用本发明的生物传感器细胞试验，我们发现组胺略微减弱肾上腺素反应，而肾上腺素部分减弱组胺反应，二者均是剂量依赖性方式。已知cAMP-PKA途径在通过不同类别GPCR介导的信号传导整合中起着关键作用；普遍存在的第二信使Ca2+能调节许多腺苷酸环化酶，这种调节为整合这两种主要信号传导系统的活性提供了支配性机制(overarching mechanism)。此外，共同刺激产生的DMR信号较大，但不是两种DMR信号各自功能的简单叠加，而且表明通过这两种受体介导的信号传导之间可能有串话。另外，文库中有许多腺苷受体激动剂也能完全减弱肾上腺素反应。这与众所周知的异源脱敏相一致，在异源脱敏中不同Gs-偶联受体能通过cAMP-PKA途径导致交叉脱敏(cross-desensitization)。
本文的生物传感器细胞试验可用于几个方面的多重筛选。首先，生物传感器细胞试验性质上是筛选激动剂的多重试验。生物传感器能监测内源性受体的活化，产生高-信息和受体-配体对的生理相关检测。这些试验无需预先了解细胞的信号传导且无途径偏向性。然而，记录的光学反应是途径敏感性的，确实反映了受体信号传导的复杂性。A431细胞可内源性表达腺苷受体和β2AR及组胺受体，它们的配体也存在于LOPAC文库中。在该激动剂筛选中，用1μM的配体刺激细胞。结果显示能导致显著DMR信号的配体主要来自三个化合物家族：肾上腺素能受体；腺苷受体；和组胺受体的配体。已知能活化β2AR的一些多巴胺受体的配体也能导致肾上腺素样反应，将它们鉴定为β2AR的选中物。然而，文库中P2Y激动剂中的四种不导致任何显著的DMR信号(数据未显示)，可能是因为它们的能力低。由于A431细胞表达的其它受体(例如，蛋白酶活化受体、缓激肽B2受体和表皮生长因子受体)，可用生物传感器细胞试验检测它们的活化，如果文库中存在这些受体的配体，也可将其鉴定为选中物。
本文的生物传感器细胞试验方法也可以是筛选拮抗剂的多重试验。除了用靶向同一受体的激动剂反复刺激导致脱敏外，在许多情况中，通过异源脱敏，细胞倾向丧失它们的反应性。因此，另一受体(例如，腺苷受体)的激动剂可用作靶受体(例如，β2AR)的拮抗剂。此外，由于生物传感器细胞试验可检测整合的DMR反应，某受体(例如，β2AR)的激动剂可能部分减弱甚至能通过不同途径介导信号传导的(例如，Gq-偶联的H1R)靶受体的反应。此外，途径调节剂也可起作着靶受体的拮抗剂作用。
采用不用标记的光学生物传感器检测的配体诱导的DMR信号，可以是整合反应，受体活化的许多下游细胞反应，特别是导致生物传感器的传感体积内显著的质量重分布的那些反应对其有影响。受体介导对这些反应的影响使得生物传感器细胞试验具有价值，然而也使获得的光学信号与常规细胞试验相比“无特异性”。在一种细胞类型或细胞系统中许多配体常常显示与一种以上的受体有交叉活性。此外，许多GPCR配体常可诱导操作性偏向(operative bias)于通过受体活化细胞信号传导的特定部分，因此表现出配体导向的功能选择性。因此，采用生物传感器细胞试验分析GPCR配体药理学特性和筛选靶受体的配体时应小心。可采用几种方法进行靶标特异性筛选。对于给定的细胞或细胞系统，应进行受体淘选以确定采用生物传感器细胞试验能检测多少受体。然后，应研究受体生物学和配体药理学特性以测定某受体干扰靶受体的可能性，并系统评价该靶受体的信号传导潜能。如果有一种或多种内源性受体干扰靶受体，可用含有阻断这些受体活性的拮抗剂混合液最大程度降低靶受体(导致)的假阳性。或者，还可采用细胞工程改造方法加强靶-特异性DMR信号，或抑制除靶标外的受体介导的信号。可在亲代细胞系与其含有或不含有靶受体的工程改造细胞系之间进行计数筛选(counter screen)以测定靶受体的阳性选中物。
现已参考各种具体的实施方式和技术描述了本发明。然而，应该知道可以有许多变化和改进而仍属于本发明的构思和范围内。
参考文献
1.Fang，Y等.，J.Biophys.J.91，1925-1940(2006).
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5.Fang，Y.，Assays and Drug development Technologies(试验和药物开发技术)，4，583-595(2006)。

Claims (22)

1.一种不用标记的的筛选方法，包括：
提供生物传感器，在该生物传感器的表面上固定有活细胞，所述活细胞含有至少两种不同靶标；
使固定的细胞与候选配体接触；
使经过候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触；和
测定候选配体对标记混合物诱导的生物传感器输出的作用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两种不同靶标包括用生物传感器彼此区分的第一靶标和第二靶标。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各标记可选择性调节不同靶标之一的活性。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选配体包括化学化合物、生物学分子、肽、蛋白质、生物学样品、候选小分子药物、候选生物学分子药物或候选小分子药物-生物学偶联物中的至少一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标包括受体或细胞蛋白质中的至少一种。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述受体包括Gq-偶联受体、Gs-偶联受体、Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道、钠-质子交换蛋白、整联蛋白受体、转运蛋白中的至少一种。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞蛋白质包括细胞酶、细胞激酶或细胞结构蛋白中的至少一种。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记包括激动剂、部分激动剂或反激动剂中的至少一种，所述激动剂活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记包括抑制剂或抗体中的至少一种，所述标记活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各标记特异性调节不同靶标的活性。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述靶标包括以下至少一种：一对Gq-偶联受体、一对Gq-偶联受体和Gs-偶联受体、一对Gi-偶联受体和Gs-偶联受体、一对G蛋白-偶联受体和受体-酪氨酸激酶，或一对受体和细胞蛋白质。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选配体对生物传感器输出的作用包括调节所述标记诱导的信号反应。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述调节包括改变信号幅度、动力学、动态学或它们的组合。
14.一种不用标记的筛选方法，包括：
提供生物传感器，在该生物传感器的表面上固定有活细胞，所述活细胞含有至少两种不同靶标；
使固定的细胞与两种标记的混合物接触；
使经过标记混合物处理的固定的细胞与候选配体接触一段时间；和
测定所述标记对候选配体诱导的生物传感器输出的作用。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述至少两种不同靶标包括用生物传感器彼此区分的第一靶标和第二靶标。
16.一种不用标记的筛选方法，包括：
提供生物传感器，在该生物传感器的表面上固定有活细胞，所述活细胞含有至少两种不同靶标；
使固定的细胞与含至少一种阻断剂的溶液接触；
使固定的细胞与候选配体接触；
使经过候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触；和
测定候选配体对所述标记混合物诱导的生物传感器输出的作用。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述阻断剂包括细胞蛋白质的拮抗剂、抑制剂、干扰性RNA、反义核酸或抑制性抗体中的至少一种，所述细胞蛋白质不是所述标记的靶标，但其活化干扰生物传感器对靶标的反应。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，加入所述阻断剂后再加入候选配体。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述阻断剂与候选配体一起加入。
20.一种不用标记的筛选方法，包括：
提供生物传感器，在该生物传感器的表面上共同固定含有两类细胞的混合细胞群；
使固定的细胞与候选配体接触；和
测定该选配体诱导的生物传感器输出。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述两类细胞包括：亲代细胞系和其表达靶标的工程改造细胞；各自表达靶标的两种工程改造细胞；或两种天然细胞。
22.一种不用标记的筛选方法，包括：
提供含有表达第一靶标的第一类细胞和表达第二靶标的第二类细胞的混合细胞群的生物传感器，两类细胞共同固定在该生物传感器的表面上；
使固定的细胞与候选配体接触；
使经过候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触，各标记特异性调节靶标的活性；和
测定候选配体对标记混合物诱导的生物传感器输出的作用。
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