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CN102030792A - 3＇-ｏ-荧光修饰的核苷酸及其用途 - Google Patents

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CN102030792A CN2009102059988A CN200910205998A CN102030792A CN 102030792 A CN102030792 A CN 102030792A CN 2009102059988 A CN2009102059988 A CN 2009102059988A CN 200910205998 A CN200910205998 A CN 200910205998A CN 102030792 A CN102030792 A CN 102030792A
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Abstract

本发明涉及一种使用在其3′-OH端带有荧光阻断基团的三磷酸核苷作为可逆终止子进行DNA测序的方法。进一步地讲，本发明涉及使用单修饰的可逆终止子(MRT)进行边合成边测序的方法，这种新的核苷酸单体在其3′-OH端具有可用化学方法或酶方法除去的可逆的荧光阻断基团。本发明的测序方法通过用该核苷酸单体终止核苷酸链的延伸，然后测定由3′-OH端所发出的荧光信号从而促进了所插入碱基的测序。此时，在对荧光信号进行分析后，连接到3′-OH端的阻断基团被可有效地除去，这表明可以成功复原游离的3′-OH官能团，以使随后的单体插入成为可能，从而可以进行连续的测序。

Description

3′-O-荧光修饰的核苷酸及其用途
技术领域
本发明涉及具有可用化学方法除去的荧光3′-O-阻断基团的三磷酸核苷(3′-O-FL-dNTP)以及使用该物质进行的DNA测序方法(边合成边测序(sequencing-by-synthesis))。
背景技术
根据最近完成的人类基因组工程(HGP)的成功结果，可获得人类基因组的信息。虽然该信息包含人类基因组的共同序列，但其并未在该基因组中呈现出个体差异。为了获得完整的个体基因组信息，必须对个人基因组进行分析。由于单倍体人类基因组占有大约30亿个DNA碱基对，如果将迄今已被广泛用于DNA测序的、基于毛细管电泳的Sanger方法用于个人基因组的测序，那么为了获得个体基因组的信息将会需要与完成HGP类似的成本和时间(G.M Church等人，Nature Reviews，2004，5，335-344)。自2004年以来，美国国家人类基因组研究中心(NationalHuman Genome Research Institute，NHGRI，USA)支持了能够使每一个体的全基因组测序成本显著降低的技术的发展，特别是短期成本达到100,000美元以及长期成本达到1,000美元的技术。于是，能够以大约50,000美元的成本进行个体全基因组测序的测序平台目前已经商品化。这类设备基于两个主要的技术：焦磷酸测序以及边合成边测序(SBS)。由454 Life Sciences，Roche公司提供的GS TLX钛系列设备是以焦磷酸测序技术为基础。其可在10小时内分析4-6亿个碱基并可立即对长链(大约200个核苷酸)进行比较分析。而由Solexa公司提供的基因组分析器则是以SBS技术为基础。
本发明所直接涉及到的边合成边测序(SBS)使用的是荧光标记的核苷酸。特别是根据所述的技术，用聚合酶将每个核苷酸引入到DNA引物中，然后测定来自核苷酸的荧光信号以鉴别该核苷酸的碱基并可同时分析其互补碱基(参见图2)。
用于SBS的三磷酸核苷(dNTP)基本上为双修饰的可逆终止子(DRT)，这些双修饰的可逆终止子是在三磷酸核苷的3′-OH部分具有可逆的阻断基团(3′-O-阻断基团)以及在碱基上具有荧光团(FL)的修饰的三磷酸核苷(参见图1左图)。此时，4种碱基(A、T、G和C)使用发出不同波长的光的不同荧光团进行标记。将目标DNA作为用于利用此类修饰的三磷酸核苷进行聚合反应的模板。然后，一旦用DNA聚合酶将核苷酸引入到引物链当中，由于所引入核苷酸的3′-O-阻断基团的作用，其他三磷酸核苷就不能引入到这个链当中。然后，对连接到所引入核苷酸碱基上的荧光团的荧光进行测定，来鉴别所引入核苷酸的碱基，从而实现对该模板链的互补核苷酸序列的分析。当除去所述的荧光团和3′-O-阻断基团时，则重新获得了游离的3′-OH官能团，从而使随后的核苷酸可以引入。所引入核苷酸的碱基可以用如上所述的相同方法进行鉴别，从而实现对模板链的测序。这一逐步测序的过程被称作“边合成边测序(SBS)”。
用于商品SBS的双修饰的可逆终止子(DRT)具有通过炔键连接到碱基上的荧光基团。在这种情况下，即使将3′-O-阻断基团和荧光基团在DRT插入和测序后除去，将荧光基团连接到碱基上的连接键部分仍然残留在上面。该残留部分被称作分子疤(molecular scar)。随着测序的进行，新聚合的链包含有更多分子疤。由于此类分子疤的累积降低了随后聚合酶的活性和保真度，导致所测序的碱基的数目受到限制。由于该问题的存在，相比于基于焦磷酸测序的方法，SBS已知具有相对较短的读取长度，大约25-35个碱基。因此，当对打断成为若干用于SBS的短片段的长链多聚核苷酸进行分析时，这一限制会增加分析多核苷酸片段的错误机率。
要成功地进行SBS有两个重要因素。首先，需要能够以几乎完全的效率引入DRT的聚合酶。其次，3′-O-阻断基团和连接到碱基上的荧光团必须在水溶液中以几乎完全的效率除去而不破坏DNA。天然的DNA聚合酶已经进化了很长时间，因而选择性地接受具有游离3′-OH的三磷酸核苷。因此，它们不接受在3′-OH上具有阻断基团的底物。在早期的研究中，Sarfati等人在1994年报道了用多种聚合酶(AMV逆转录酶、TaqDNA聚合酶和DNA聚合酶I的Klenow片段)将具有3′-O-邻氨基苯甲酸酯(ester anthranylic)阻断基团的三磷酸核苷引入到DNA链中，然后通过利用酯酶切断酯键来继续聚合反应，从而重新获得游离的3′-OH官能团(Sarfati等人，Gene，1994，148：1-6)。同年，M.L.Metzker等人报道了他们可以观察到在聚合酶(AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、DNA聚合酶I的Klenow片段、测序酶、Bst DNA聚合酶、AmpliTaq DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶以及Pfu(exo-)DNA聚合酶)的作用下，包含连接有不同阻断基团的3′-OH基团的三磷酸核苷的插入，因此，可通过某些聚合酶插入具有3′-O-甲基和3′-O-(2-硝基苄基)的三磷酸核苷，从而暂时终止聚合反应(M.L.Metzker等人，Nucleic Acids Research，1994，22：4259-4267)。然而，就进行连续聚合的效率和保真度而言，上述现有技术并不适用于SBS。
聚合酶不能接受具有大体积的3′-O-阻断基团的三磷酸核苷作为反应底物的原因可通过在天然聚合酶的活性部位中仅为3′-OH基团提供狭窄的空间进行解释(Burgess等人，A Chemistry European Journal，1999，5：951-960)。为了用具有3′-O-阻断基团的三磷酸核苷广泛地进行SBS，需要适当修饰的聚合酶，该聚合酶在其活性部位中在3′-OH基团周围具有较大的空间。最近，哥伦比亚大学Ju教授的小组用3′-O-烯丙基化的三磷酸核苷和3′-O-叠氮甲基化的三磷酸核苷进行了SBS(Seo等人，PNAS，2005，102：5926-5931；Guo等人，PNAS，2008，105：9145-9150)。为了插入此类具有3′-O-阻断基团的核苷酸，上述小组使用了收集自东太平洋火山口的菌株中获得的修饰DNA聚合酶(Southworth等人，PNAS，1996，93：5281-5285)。该修饰的DNA聚合酶目前在市面上有售，其商标名称为“Therminator II”，由New England Biolabs Inc.提供。HelicosBiosciences Corp.的Kwiatkowski等人设计了3′-O-烃基二硫甲基三磷酸核苷用于SBS(Kwiatkowski等人，2007，US20077279563)，而Caliper LifeSciences，Inc.的Parce等人使用了包含磷酸酯基团或氨基甲酸酯基团的阻断基团(Parce等人，2006，US20067105300)。
如果SBS能够不用双修饰的可逆终止子而是利用单修饰的可逆终止子(MRT)，其中在3′-OH基团上的该可逆阻断基团起到双重作用，既作为荧光信号的报道子又作为可逆终止子，那么将不再需要核苷碱基(nucleobase)上的荧光标记。在从3′-OH部分除去荧光阻断基团后，MRT能够随即转变回自然状态而没有残留的分子疤(参见图1右图)。然而，这一使用MRT和常规的聚合酶进行测序的原理尚未实现。
本发明的发明者证实能够按如下过程成功地进行SBS，从而完成了本发明：(1)设计具有既起到阻断基团作用又能够发出荧光信号的化学结构的MRT，该化学结构位于其3′-OH基团而非碱基，以及(2)用常规的聚合酶插入所述的MRT→通过识别3′-O-荧光阻断基团的荧光信号进行测序→除去所述的荧光阻断基团→再次插入所述的MRT(参见图2)。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种单修饰的可逆终止子(MRT)以及使用该物质进行测序的方法(边合成边测序)，所述的可逆终止子为在其3′-OH基团处具有可用化学方法除去的、能够发出荧光信号的可逆阻断基团的三磷酸核苷。
为了实现上述目的，本发明提供了一种修饰的三磷酸核苷(dNTP)，所述的三磷酸核苷在该修饰的三磷酸核苷的3′-OH基团处具有可通过物理作用或化学反应除去的可逆荧光基团，所述的三磷酸核苷具有核糖或脱氧核糖作为糖的骨架结构。
本发明还提供了一种使用所述的核苷酸单体或其多聚体进行测序的方法。
此外，本发明提供了一种用于边合成边测序(SBS)的测序试剂盒，该试剂盒包含所述的核苷酸单体或其多聚体。
附图说明
参考附图可以更好地理解对本发明的优选实施方式的应用，其中：
图1为一组图，示意了双修饰的可逆终止子(DRT)，该可逆终止子是用于常规的边合成边测序(SBS)技术的三磷酸核苷，在该三磷酸核苷的3′-OH基团上带有可逆阻断基团、且在核苷碱基上带有荧光基团(荧光团)；图1还示意了单修饰的可逆终止子(MRT)，该可逆终止子是用于本发明所述的SBS的三磷酸核苷，在该三磷酸核苷的3′-OH基团上带有同时起到荧光信号报道子和可逆终止子双重作用的可逆阻断基团。
图2为显示边合成边测序(SBS)的过程的图，包括下列步骤：用聚合酶将单修饰的可逆终止子(MRT)插入；通过测定来自荧光3′-O-阻断基团的荧光信号进行测序；以及插入第二个MRT。
图3为一组图：(a)为引物在与聚合酶和MRT反应以前的MALDI-TOF质谱；(b)为通过聚合酶使MRT延伸的引物的MALDI-TOF质谱；(c)为含有延伸的MRT的引物在从3′端除去荧光阻断基团后的MALDI-TOF质谱；以及(d)为含有再次延伸的MRT的引物的MALDI-TOF质谱，所述的再次延伸是在除去荧光阻断基团后通过聚合酶进行的(蓝色圆圈：3′端的荧光阻断基团)。
图4为显示通过聚合酶在引物中进行MRT延伸之前(实线)以及之后(虚线)的荧光强度测量结果的曲线图。
具体实施方式
以下将对本发明进行具体的描述。
本发明提供了一种新的化合物或其盐，其具有下列式1的结构：
[式1]
Figure G2009102059988D00051
式1中，
R1为H、保护基团、单磷酸酯基团、二磷酸酯基团、三磷酸酯基团或核酸；
R2为核苷碱基，该碱基为嘌呤、嘧啶或脱氮嘌呤；
R3为吸电子官能团或给电子官能团，选自于由O、N、S和Si所组成的组；
R4为发出300-1500nm的荧光或燐光的荧光团，例如香豆素、AlexaFluor、Bodipy、荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3、得克萨斯红(Texas Red)或其衍生物；
R5为吸电子宫能团或给电子官能团，选自于由O、N、S和Si所组成的组；以及
连接子为包含C、O、N、S、P或Si的化学基团，其包括烯丙基、叠氮甲基、2-硝基苄基、醚、酰胺、酯、磷酸二酯、羟胺、氨基甲酸肟酯(oxime carbamate)、硫醚、亚砜、亚胺、胺、亚甲基、二硫基、脲或硫脲基团。
本发明不仅包括由式1表示的新的化合物，还包括其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物以及由该化合物制备的前体药物。
本发明中的化合物优选在三磷酸核苷的3′-OH部分含有可通过物理作用或化学反应除去的可逆荧光基团的核苷酸单体，所述三磷酸核苷具有核糖或脱氧核糖作为糖的骨架结构，但不总限于此。
所述的核苷酸单体优选具有下列式2的结构，但不总限于此：
[式2]
式2中，
R1为三磷酸酯基团，
R2为核苷碱基，
R3为荧光团，以及
R4为H(氢原子)或OH(羟基)。
所述的荧光团优选由荧光团(FL)本身组成或由荧光团和将其连接到3′-OH基团上的连接子组成。此时，所述的连接子优选能够通过一种或多种方法进行切断以复原游离3′-OH基团的连接子，但不总限于此，所述的方法选自于由下列方法所组成的组：物理方法、化学方法、生化方法、加热方法和照射方法。
连接到所述的3′-OH基团上的荧光基团优选起到可逆终止子的作用，所述的可逆终止子仅允许插入一个核苷酸随后抑制聚合反应，并能够进一步将其除去以继续聚合反应，与此同时，该荧光基团还起到用于进行测序的荧光信号报道子的作用，但不总限于此。
所述的荧光团优选选自于由下列物质所组成的组：香豆素、AlexaFluor、Bodipy、荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3、得克萨斯红及其衍生物，但不总限于此。
本文中所述的连接子优选选自于由下列物质所组成的组：烷基、烯丙基、叠氮甲基、二硫基、2-硝基苄基或4-硝基苄基及其混合物，但不总限于此。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的核苷酸单体优选3′-O-(7-羟基香豆素)-脱氧胸苷三磷酸，但不总限于此。
在本发明中，所述的化合物能够通过下列反应方程式1进行制备，但不总限于此：
[反应式1]
Figure G2009102059988D00081
本发明还提供了使用核苷酸单体或其多聚体进行DNA测序(边合成边测序)的方法，所述的核苷酸单体或其多聚体具有可用物理方法或化学方法除去的可逆荧光基团，所述的可逆荧光基团连接于具有核糖或脱氧核糖作为糖骨架结构的三磷酸核苷的3′-OH部分。
该测序方法如下所述：将荧光团标记于具有核糖或脱氧核糖作为糖骨架结构的三磷酸核苷的3′-OH部分而非其碱基上，从而在用聚合酶进行核苷酸合成期间，对所插入的连接到3′-OH基团的荧光团的荧光信号进行测定，从而实现测序。
特别地，所述的测序方法包括下列步骤，但不总限于此：
(1)合成单修饰的可逆终止子(MRT)，所述的MRT在具有核糖或脱氧核糖作为糖骨架结构的三磷酸核苷的3′-OH部分具有可用物理方法或化学方法除去的可逆的荧光阻断基团；
(2)以目标核苷酸链作为模板，使用步骤(1)所述的MRT以及DNA聚合酶或RNA聚合酶将引物延伸一个核苷酸；
(3)通过测定荧光信号，对延伸后的核苷酸链中的碱基进行鉴别，所述的荧光信号来自于可逆的荧光阻断基团，所述的荧光阻断基团连接到由步骤(2)的聚合反应产生的延伸后的核苷酸链的3′-OH基团上；
(4)除去来自于步骤(3)中延伸后的核苷酸链的可逆的荧光阻断基团，然后复原为游离的3′-OH基团，从而继续进行聚合反应；以及
(5)重复步骤(2)至步骤(4)，从而测定出目标模板链的碱基序列。
在上述方法中，步骤(1)中的可逆的荧光阻断基团优选由荧光团(FL)以及将其连接到所述的3′-OH基团上的连接子组成，但不总限于此。本文中所述的连接子例如烷基、烯丙基、叠氮甲基、二硫基、2-硝基苄基或4-硝基苄基及其混合物。所述的荧光团例如香豆素、AlexaFluor、Bodipy、荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3、得克萨斯红以及这些物质的衍生物。为了合成具有荧光3′-O-阻断基团的dNTP，使用了用于其他3′-O-阻断基团的常规的合成方法但对其进行了修饰，确切地说是用可逆的荧光阻断基团代替了其他阻断基团。
在上述方法中，步骤(2)中的目标核苷酸链优选能够作为测序目标的DNA。此时，所述的DNA优选基因组DNA、质粒或寡聚核苷酸，但不总限于此。所述的DNA聚合酶包括任何能够接受步骤(1)中的MRT作为底物的聚合酶，所述的聚合酶选自嗜热聚合酶(thermophilicpolymerase)、嗜温聚合酶(mesophilic polymerase)或它们的突变体，但不总限于此。
可将为聚合反应制备的模板以及由所述的引物和模板所形成的双链DNA负载在固相上。用所述的聚合酶将MRT插入到引物的3′端，随后所述的聚合反应在MRT的可逆荧光3′-O-阻断基团的作用下终止。然后，洗去未参加聚合反应的过量的MRT以及其他副产物。
在上述方法中，对步骤(3)中碱基的鉴别可通过测定荧光来进行，所述的荧光从插入到步骤(2)中引物3′-端的MRT的可逆荧光3′-O-阻断基团发出。对荧光的检测通过在荧光显微镜下观察负载有所述模板和双链DNA的固相来进行。或者包含此类双链DNA溶液的荧光可以通过荧光检测器进行测量，但不总限于此。
在上述方法中，步骤(4)中的除去过程优选包括通过化学方法或酶方法除去包含被测定的荧光团的可逆的荧光阻断基团，但不总限于此。如果所述可逆的荧光阻断基团的连接子为烯丙基，则可将Pd催化剂用于除去所述可逆的荧光阻断基团的化学反应。如果所述的连接子为叠氮甲基，则可将三烷基膦、三芳基膦或它们的衍生物用以除去所述的可逆的荧光阻断基团。在所述的连接子为二硫基的情况下，可将β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)用以除去所述的荧光阻断基团。如果所述的连接子为硝基苄基，则可用紫外线(300-400nm)进行照射以除去所述的可逆的荧光阻断基团。
一旦通过上述的方法之一除去所述可逆的荧光阻断基团，则所述的3′-OH基团将被复原，从而使互补MRT能够插入到模板的下一个碱基中。因此，可重复步骤(1)至步骤(4)的过程。也就是说，随着聚合反应的进行，可对模板的每个碱基逐一进行分析，从而实现边合成边测序(SBS)。
本发明中的将MRT用于SBS的测序方法具有两个重要的、优于使用DRT的常规SBS的效果。首先，根据本发明的测序方法，碱基未被荧光所标记，从而在完成荧光分析并除去荧光阻断基团之后不会残留有分子疤，可以为连续聚合带来更高的效率。其次，根据本发明的测序方法，所述的荧光阻断基团连接于3′-OH基团。也就是说，所述的MRT应当只除去一个标记物。因此，相比于碱基上的荧光标记以及3′-O-阻断基团全部都应除去的常规方法，本发明中的方法得到了明显更高的产率。
因此，使用了本发明中的MRT的SBS可促进长链的高效测序，因为相比于常规方法其效率更高，从而在每个反应循环可得到更高的产率。
在本发明的优选实施方式中，为了研究是否能够通过使用MRT使所述的引物得到延伸，将3′-O-(7-羟基香豆素)-dTTP(MRT，化合物13)和用生物素标记的引物进行聚合。然后通过使用MALDI-TOF质谱法对分子量进行分析。结果证实了所述的引物通过3′-O-(7-羟基香豆素)-dTTP得到了延伸(参见图3)。
在本发明的另一个优选实施方式中，研究了通过聚合酶插入到引物中的碱基是否能用荧光标记的MRT进行分析。通过用与上述方法相同方法进行聚合反应，所得到的固定于磁珠上的DNA用生物素溶液进行洗脱。然后，用荧光分光光度计测量该DNA的荧光强度。结果证实，相比于来自延伸前的引物的荧光信号，延伸后的引物的荧光信号得到了增强(参见图4)。
在本发明的另一个优选实施方式中，研究了所述的MRT的荧光标记是否能在引物延伸后成功除去。通过用与上述方法相同方法进行聚合反应，随后从固定于磁珠上的DNA得到了延伸的具有游离3′-OH的引物。用MALDI-TOF质谱法进行质量分析。结果证明，MRT的荧光标记在引物延伸后能够成功地除去(参见图3)。
在本发明的另一个优选实施方式中，研究了在除去所述的荧光标记后，下一个引物链是否能够用另一个MRT进行延伸。通过与上述方法相同方法将所述的3′端的荧光基团除去，然后将所得到的DNA用反相高效液相色谱进行纯化。将所得到的DNA作为引物用MRT进行第二次延伸，然后用MALDI-TOF质谱法进行质量分析。结果证实，所述的引物能够用具有3′-O-荧光标记的MRT进行延伸，并且在对该荧光标记进行分析和除去后，所述的引物还能够用另一个MRT进行延伸(参见图3)。
因此证实，使用本发明中的MRT，通过分析每步延伸的荧光信号，能够成功地进行边合成边测序。
本发明还提供了用于边合成边测序(SBS)的测序试剂盒，所述的测序试剂盒包含核苷酸单体或其多聚体，所述的核苷酸单体或其多聚体在具有核糖或脱氧核糖作为糖骨架结构的三磷酸核苷的3′-OH部分具有可用物理方法或化学方法除去的可逆荧光基团。
此外，本发明提供了所述的用于边合成边测序(SBS)的测序试剂盒的用途，所述的测序试剂盒包含核苷酸单体或其多聚体，所述的核苷酸单体或其多聚体在具有核糖或脱氧核糖作为糖骨架结构的三磷酸核苷的3′-OH部分具有可用物理方法或化学方法除去的可逆荧光基团。
本发明中的核苷酸单体不仅能终止核苷酸链的延伸，还能测定来自其3′-OH的荧光信号以鉴别所插入的碱基。同时，在完成荧光信号的分析后，能够将连接于3′-OH基团上的阻断基团有效地除去，从而可以复原游离的3′-OH官能团，这使得下一个单体可以插入，表明可能进行连续测序。因此，其能够有效地用作所述的测序试剂盒的组成部分。
本发明中的使用单修饰的可逆终止子(MRT)的测序方法(边合成边测序)具有如下有益效果：首先，根据本发明的方法，碱基未被荧光所标记，从而在完成荧光分析并除去荧光阻断基团之后不会残留有分子疤，可以为连续聚合带来更高的效率；其次，根据本发明的方法，所述的荧光阻断基团可逆连接于3′-OH基团。因此，相比于碱基上的荧光标记和3′-O-阻断基团全部都应除去的常规方法，本发明所述的方法得到了明显更高的产率。
本发明中实用且目前优选的实施方式通过如下的实施例、实验例和制备例进行说明。
然而，可以理解的是，本领域技术人员在对本文所公开的内容进行思考后，可能会进行属于本发明范围内且与其精神相符的变化与改进。
实施例1：单修饰的可逆终止子(MRT)3′-O-(7-羟基香豆素)-dTTP的合 成
<1-1>化合物2的合成
向1，5-戊二醇(66.9mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl，66.9mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入三乙胺(100.4mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌5min。然后将该反应混合物用二氯甲烷稀释，再用水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝10∶1)进行纯化，得到无色油状目标化合物(产率95％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)d 3.63-3.58(m，4H)，1.59-1.49(m，4H)，1.41-1.35(m，2H)，0.87(s，9H)，0.03(s，6H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ63.4，62.7，32.7，32.6，26.2，22.2，18.6，-5.1ppm；IR(KBr)3348，2932，2859，1472，1389，1362，1255，1102，1006，939，836，775cm-1；高分辨质谱(实时直接分析)(HRMS(DART))计算值[C11H27O2Si]+：219.1775，实验值：219.1771。
<1-2>化合物3的合成
向草酰氯(1.5mmol)的二氯甲烷(70mL)溶液中加入二甲亚砜(65.5mmol)。将该反应混合物在-78℃下搅拌15min。向上述反应混合物中加入溶解于二氯甲烷(50mL)的化合物2。然后将该反应混合物再搅拌15min。最后，向这反应混合物中加入三乙胺(297.8mmol)，并将其温度在搅拌下在30min内缓慢升至室温。将该反应混合物用二氯甲烷稀释，再用水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝30∶1)进行纯化，得到浅黄色油状目标化合物(产率96％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.76(s，1H)，3.62-3.58(t，J＝6.3Hz，2H)，2.46-2.41(t，J＝7.2Hz，2H)，1.73-1.48(m，4H)，0.87(s，9H)，0.03(s，6H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ62.7，43.8，32.3，26.1，18.8，18.5，-5.2ppm；IR(KBr)3398，2922，2852，1736，1650，1466，1260，1026，802cm-1；HRMS(DART)计算值[C11H25O2Si]+：217.1618，实验值：217.1619。
<1-3>化合物4的合成
在0℃下，向NaH(60％的矿物油分散体，22.3mmol)的THF(30mL)悬浮液中滴入膦酰乙酸二乙酯(22.3mmol)。向该反应混合物中加入溶解于THF(30mL)的化合物3。将该反应混合物在室温下搅拌2h。然后用饱和NH4Cl溶液将反应猝灭。蒸发除去溶剂，然后将剩余物用乙酸乙酯稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝30∶1)进行纯化，得到无色油状目标化合物(产率78％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.00-6.90(m，1H)，5.84-5.77(m，1H)，3.70(s，3H)，3.61-3.57(t，J＝6.3Hz，2H)，2.21-2.19(m，2H)，1.53-1.49(m，4H)，0.87(s，9H)，0.03(s，6H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ167.1，149.5，121.2，62.8，51.4，32.4，32.1，26.1，24.6，18.5，-5.2ppm；IR(KBr)2932，2858，1729，1658，1471，1437，1257，1101，1039，837，776cm-1；HRMS(DART)计算值[C14H29O3Si]+：273.1880，实验值：273.1875。
<1-4>化合物5的合成
在-78℃下，向溶解于二氯甲烷(50mL)所形成的化合物4(10.7mmol)的溶液中滴入DIBAL-H(1.0M的甲苯溶液，12.8mmol)，然后将该混合物在-78℃下搅拌2h。再将该反应混合物缓慢升温至0℃。用饱和NH4Cl溶液将反应猝灭，然后通过硅藻土(Celite)进行过滤。将该滤液用二氯甲烷稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝10∶1)进行纯化，得到无色油状目标化合物(产率77％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.71-5.57(m，2H)，4.07-4.06(d，J＝5.1Hz，2H)，3.61-3.56(t，J＝6.3Hz，2H)，2.08-2.01(m，2H)，1.53-1.37(m，4H)，0.87(s，9H)，0.03(s，6H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ133.0，129.5，63.6，63.3，32.5，32.2，26.2，25.6，18.6，-5.1ppm；IR(KBr)3364，2930，2858，1470，1254，1101，1006，836，775cm-1；HRMS(DART)计算值[C13H29O2Si]+：245.1931，实验值：245.1932。
<1-5>化合物6的合成
在0℃下，向溶解于二氯甲烷(50mL)所形成的化合物5(7.55mmol)的溶液中加入对甲苯磺酸吡啶鎓盐(0.76mmol)和乙基乙烯基醚(37.76mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌19h。在溶剂蒸发后，将剩余物用二氯甲烷稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝30∶1)进行纯化，得到无色油状目标化合物(产率86％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.73-5.49(m，2H)，4.73-4.68(q，J＝10.5Hz，1H)，4.06-3.88(m，2H)，3.67-3.56(m，3H)，3.52-3.41(m，1H)，2.07-2.00(q，J＝14.1Hz，2H)，1.55-1.35(m，4H)，1.30-1.29(d，J＝5.4Hz，3H)，1.21-1.16(t，J＝7.2Hz，3H)，0.87(s，9H)，0.02(s，6H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ134.2，126.7，99.0，66.1，63.1，60.5，32.5，32.2，26.1，25.5，20.1，18.5，15.5，-5.1ppm；IR(KBr)2932，2859，1471，1387，1339，1254，1060，1032，971，837，776cm-1。
<1-6>化合物7的合成
在室温下，向溶解于THF(50mL)所形成的化合物6(6.28mmol)的溶液中，加入四丁基氟化铵(1.0M的THF溶液，9.42mL，9.42mmol)，然后将该混合物搅拌15h。在溶剂蒸发后，将剩余物用二氯甲烷稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝2∶1)进行纯化，得到无色油状目标化合物(产率90％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.73-5.50(m，2H)，4.73-4.68(q，J＝10.5Hz，1H)，4.06-3.88(m，2H)，3.66-3.56(m，3H)，3.52-3.41(m，1H)，2.10，2.03(q，J＝14.4Hz，2H)，1.59-1.41(m，4H)，1.31-1.28(d，J＝5.1Hz，3H)，1.21-1.16(t，J＝7.5Hz，3H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ134.2，133.2，126.9，99.2，66.2，62.9，60.7，32.5，32.2，25.4，20.1，15.6ppm；IR(KBr)9419，2979，2933，2887，1670，1445，1381，1340，1131，1090，1058，1031，972，870cm-1；HRMS(DART)计算值[C11H23O3]+：203.1642，实验值：203.1639。
<1-7>化合物8的合成
在0℃下，向处于THF(5mL)中的化合物7(2.21mmol)、三苯基膦(5.21mmol)和7-羟基香豆素(2.23mmol)的溶液中加入偶氮二羧酸二乙酯(2.2M的甲苯溶液，2.9mL，6.37mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌12h。在蒸发除去溶剂后，将剩余物用二氯甲烷稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝10∶1)进行纯化，得到无色油状目标化合物(产率77％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.62-7.59(d，J＝9.3Hz，1H)，7.35-7.32(d，8.4Hz，1H)，6.82-6.77(m，2H)，6.24-6.20(d，J＝10.5Hz，1H)，5.75-5.53(m，2H)，4.73-4.65(m，1H)，4.07-3.89(m，4H)，3.66-3.42(m，2H)，2.15-2.08(q，J＝14.1Hz，2H)，1.85-1.76(m，2H)，1.61-1.51(m，2H)，1.31-1.29(d，J＝5.1Hz，3H)，1.21-1.16(t，J＝7.5Hz，3H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ162.5，161.2，156.0，143.7，133.5，129.0，127.2，113.0(x 2)，112.6，101.4，99.1，68.5，66.1，60.7，32.1，28.6，25.6，20.1，15.5ppm。
<1-8>化合物9的合成
在0℃下，向溶解于甲醇(30mL)所形成的化合物8(3.14mmol)的溶液中加入对甲苯磺酸吡啶鎓盐(1.57mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌3h。在溶剂蒸发后，将剩余物用二氯甲烷稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝2∶1)进行纯化，得到无色固体目标化合物(产率95％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.62-7.59(d，J＝9.6Hz，1H)，7.35-7.32(d，J＝8.7Hz，1H)，6.82-6.77(m，2H)，6.24-6.20(dd，J＝9.0Hz，2.1Hz，1H)，5.69-5.65(m，2H)，4.09(s，2H)，4.02-3.97(m，2H)，2.15-2.09(q，J＝12.6Hz，2H)，1.86-1.76(m，2H)，1.61-1.51(m，2H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ162.5，161.7，156.0，144.0，132.0，130.0，129.1，113.1，112.9，112.6，101.4，68.6，63.5，32.0，28.6，25.6ppm；IR(KBr)3435，2953，1731，1614，1555，1508，1402，1351，1282，1232，1201，1232，1201，1127，997，836cm-1；m.p＝70℃；HRMS(DART)计算值[C16H19O4]+：275.1278，实验值：275.1277。
<1-9>化合物10的合成
在0℃下，向处于二氯甲烷(15mL)中的化合物9(2.80mmol)和三苯基膦(5.60mmol)的溶液中加入四溴化碳(5.89mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌1h。然后用饱和NaHCO3溶液将反应猝灭。将该混合物用二氯甲烷稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝30∶1)进行纯化，得到黄色油状目标化合物(产率63％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.63-7.60(d，J＝9.6Hz，1H)，7.36-7.33(d，J＝8.7Hz，1H)，6.83-6.77(m，2H)，6.25-6.21(d，J＝9.9Hz，1H)，5.82-5.66(m，2H)，4.02-3.93(m，4H)，2.18-2.11(q，J＝13.5Hz，2H)，1.86-1.76(m，2H)，1.62-1.54(m，2H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ162.5，161.4，156.1，143.8，136.0，129.1，127.2，113.1(x 2)，112.7，101.5，68.5，33.7，31.9，28.6，25.4ppm；IR(KBr)2938，1733，1614，1555，1508，1401，1350，1281，1231，1201，1123，969，892，835cm-1；m.p＝88-90C；HRMS(DART)计算值[C16H18BrO3]+：337.0434，实验值：337.0432。
<1-10>化合物11的合成
在0℃下，向NaH(60％的矿物油分散体，4.93mmol)的THF(10mL)悬浮液中滴入5′-O-叔丁基二甲基硅烷基胸苷(2.46mmol)。向该混合物中加入化合物10，然后将该反应混合物在室温下搅拌48h。在0℃下用饱和NH4Cl溶液将反应猝灭。在溶剂蒸发后，将剩余物用二氯甲烷稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。将该剩余物通过柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50∶1)进行纯化，得到白色泡沫状的目标化合物(产率62％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.36(s，1H)，7.63-7.60(d，J＝9.3Hz，1H)，7.48(s，1H)，7.36-7.33(d，J＝8.7Hz，1H)，6.82-6.74(m，2H)，6.30-6.25(m，1H)，6.24-6.21(d，J＝9.6Hz，1H)，5.76-5.51(m，2H)，4.09-3.73(m，8H)，2.43-2.37(m，1H)，2.16-2.09(q，J＝14.1Hz，2H)，1.97-1.77(m，3H)，1.89(s，3H)，1.62-1.52(m，2H)ppm；13CNMR(75MHz，CDCl3)δ164.5，162.5，161.5，156.1，150.8，143.8，135.7，134.5，129.1，126.6，113.1，112.6，111.0，101.5，85.4，85.3，78.9，70.1，68.6，63.9，38.2，32.1，31.2，28.7，36.1，25.6，18.6，12.8，-5.1ppm；IR(KBr)2924，2854，1732，1614，1464，1378，1279，1126，837cm-1；HRMS(DART)计算值[C32H45N2O8Si]+：613.2940，实验值：613.2948。
<1-11>化合物12的合成
在室温下，向溶解于THF(10mL)所形成的化合物11(0.90mmol)的溶液中加入四丁基氟化铵(1.0M的THF溶液，2.64mL，2.64mmol)。然后将该反应混合物在室温下搅拌15h。在溶剂蒸发后，将剩余物用二氯甲烷稀释，再用盐水洗涤，然后通过无水MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪进行浓缩。然后将该剩余物通过柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝40∶1)进行纯化，得到白色固体目标化合物(产率87％)。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.63-7.60(d，J＝9.6Hz，1H)，7.37(s，1H)，7.36-7.33(d，J＝8.7Hz，1H)，6.82-6.76(m，2H)，6.24-6.20(d，J＝9.6Hz，1H)，6.11-6.07(t，J＝7.5Hz，1H)，5.76-5.51(m，2H)，4.22-4.20(m，1H)，4.08-3.89(m，6H)，3.79-3.72(m，1H)，2.34-2.29(m，2H)，2.16-2.12(m，2H)，1.88(s，3H)，1.83-1.76(m，2H)，1.62-1.57(m，2H)ppm；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ164.6，162.6，161.8，156.0，150.9，144.1，137.3，134.5，129.2，126.6，113.3，112.7，111.1，101.6，86.7，85.5，78.7，70.4，68.6，62.8，37.7，32.1，28.7，25.5，20.4，12.8ppm；IR(KBr)2930，1705，1613，1556，1508，1470，1404，1352，1280，1232，1200，1130，1060，837，756cm-1；HRMS(DART)计算值[C26H31N2O8]+：499.2075，实验值：499.2086。
<1-12>化合物13的合成
将化合物12(0.28mmol)溶解于无水吡啶并真空浓缩。在氩气下用无水吡啶(0.28mL)和无水1，4-二氧六环(0.84mL)将其稀释。向该溶液中加入2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(2-chloro-4H-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one)(0.45mmol)的无水1，4-二氧六环(0.3mL)溶液，并在室温下搅拌10min。向该反应混合物中加入处于无水DMF(0.80mL)中的双(三丁基铵)焦磷酸盐(0.33mmol)和三丁基胺(1.10mmol)的溶液，再将该反应混合物在室温下搅拌10min。向该反应混合物中加入1％碘溶液(吡啶/水＝98/2，v/v，5.6mL)，并在室温下搅拌15min。用5％的Na2SO3水溶液将反应猝灭，然后加入1M三乙基铵重碳酸盐(TEAB)缓冲溶液(3mL)。将该溶液进行真空浓缩，然后重新溶解于水中(2mL)，并用HPLC进行纯化。
将所得到的化合物用NMR进行分析，结果如下：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.88-7.85(d，J＝9.3Hz，1H)，7.54(s，1H)，7.49-7.46(d，J＝7.8Hz，1H)，6.23-6.20(d，J＝9.6Hz，1H)，6.11-6.06(m，1H)，5.82-5.74(m，1H)，5.66-5.55(m，1H)，4.32(s，1H)，4.14-3.92(m，7H)，2.33-2.28(m，1H)，2.23-2.05(m，3H)，1.81-1.71(m，2H)，1.76(s，3H)，1.54-1.49(m，2H)ppm；31PNMR(121.4MHz，D2O)δ-11.55(s，1P)，-14.00(d，J＝20.8Hz，1P)，-25.39(s，1P)ppm；MALDI-TOF MS[M-H]-：737.4711。
实施例2：用MRT延伸DNA引物
使用聚合酶的延伸反应在20mL反应混合物中进行，该反应混合物包含5mM生物素化的引物(5′-生物素-GCTACGACTCACTATGGACG-3′，SEQ.ID.NO：1)、5mM模板(5′-AAAAAAAAAACGTCCATAGTGAGTCGTAGC-3′，SEQ.ID.NO：2，与所插入碱基互补的碱基用下划线标出并加粗)、200mM的3′-O-(7-羟基香豆素)-dTTP(MRT，化合物13)、1X ThermoPol II反应缓冲溶液(20mMTris-HCl/10mM(NH4)2SO4/10mM KCl/2mM MnCl2/0.1％TritonX-100，pH 8.8，New England Biolabs，Inc.)以及4单位的Therminator IIDNA聚合酶。该反应由20个循环组成，每个循环为：在94℃下进行20秒，在46℃下进行40秒，以及在60℃下进行90秒。反应后，将该混合物用链霉亲和素包被的磁珠(100mg，Dynabead MyOneTM，Invitrogen)在室温下于PBS缓冲溶液(200mL)中培养30min。然后将固定于珠上的DNA用200mL去离子水洗涤两次，再用40mL生物素溶液(处于去离子水/二甲亚砜＝98/2中的1mM溶液)进行洗脱。将洗脱后的DNA用ZipTip c18脱盐，并通过MALDI-TOF MS进行分析。
结果，如图3b所示，该引物已经在聚合酶的作用下消失，并证实了通过该引物与一分子3′-O-(7-羟基香豆素)-dTTP的反应所新产生的分子量7079的峰。该峰证明了增加后的分子量(与图3a所证实的引物相比增加了563)，该分子量与用化合物13(MRT)所延伸的引物链的分子量相等，这表明所述的引物确实通过MRT进行了延伸(图3)。
实施例3：用3′端荧光标记对插入碱基的序列进行测序
将实施例2中得到的固定于磁珠上的DNA用40mL生物素溶液(处于去离子水/二甲亚砜＝98/2中的1mM溶液)进行洗脱，再用360mLTris-HCl缓冲溶液(50mM，pH＝8.0)进行稀释。用LB50B发光光度计(Perkin-Elmer，Waltham，USA)(激发波长316nm)测定所述溶液的荧光强度。对于对照组，使用与实施例2所描述的相同方法测定未加入Therminator II DNA聚合酶的反应混合物的荧光强度。
结果，如图4所示，与反应前引物的荧光信号相比，用MRT聚合后，由连接于MRT上的荧光基团发出的延伸后引物的荧光信号(虚线)增强了(图4)。上述结果表明，连接有MRT的荧光标记可被用于对通过聚合酶插入引物的碱基进行测序。
实施例4：除去连接于延伸后的引物上的荧光标记(所述的延伸后的引物 在3′端具有MRT)以及由此实现的3′-OH的复原
在70℃下，将采用与实施例2所描述的相同方法得到的固定于磁珠上的DNA使用事先用脱气后的H2O(20mL)制备的切割溶液(1mM生物素，1.2mM Na2PdCl4，TPPTS 9.8mM)培养20min，得到具有游离3′-OH的单核苷酸延伸产物。将含有DNA的上清液用ZipTip c18脱盐，并通过MALDI-TOF MS进行分析。
结果如图3c所示，从由3′-O-(7-羟基香豆素)-dTTP生成的反应产物中除去MRT，证实了延伸后引物的分子量6818的峰，该延伸后的引物具有游离的、复原后的3′-OH。该分子量与通过从实施例2的延伸后引物的末端除去荧光标记的延伸链的分子量相等，表明MRT的荧光标记在引物延伸后被成功地除去。
实施例5：以DNA作为引物，通过与MRT聚合再次进行MRT延伸
在用与实施例4所描述的相同方法从3′端除去荧光基团后，将所得到的DNA通过反相高效液相色谱进行纯化。以纯化后的DNA作为使用MRT进行再次延伸的引物。采用与实施例2所描述的相同方法进行所述延伸。最终产品使用MALDI-TOF质谱法进行表征(图3d)。
结果如图3d所示，在实施例4中通过聚合酶制备的延伸后的引物已经消失，而证实了通过该引物与一分子3′-O-(7-羟基香豆素)-dTTP的反应所新产生的分子量7382的峰(图3)。该分子量和通过使用聚合酶用化合物13将实施例4中的引物进行延伸所制得的延伸链的分子量相等，表明在对所述的荧光标记进行分析并除去后，该引物链能够再次用另一个MRT进行延伸。
因此证实，边合成边测序能够基于对每个延伸阶段荧光信号的分析通过聚合反应成功进行。
工业实用性
不同于常规SBS，因为在结束荧光分析并除去荧光基团后不会残留有分子疤，本发明中的测序方法(边合成边测序)用于连续聚合时较为高效。此外，本发明中的方法可促进荧光标记和阻断基团的同时除去，提供了较高的产率。因此，其能够有效地用于高效、快速的测序。
本领域技术人员可以理解，在前面的说明书中所公开的概念和具体的实施方式可以容易地作为变化或设计其他实施方式的基础来实现与本发明相同的目的。本领域技术人员还可以理解此类等同的实施方式并没有脱离在附加的权利要求中所阐明的本发明的精神和范围。
SEQUENCE LIST序列表
<110>Korea Institute of Science and Technology韩国科学技术研究院
<120>3’-O-FLUORESCENTLY MODIFIED NUCLEOTIDES AND USES THEREOF
     3′-O-荧光修饰的核苷酸及其用途
<130>9fpo-08-06cn
<160>2
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence人工序列
<220>
<223>primer引物
<400>1
gctacgactc actatggacg                        20
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence人工序列
<220>
<223>template模板
<400>2
aaaaaaaaaa cgtccatagt gagtcgtagc             30

Claims (11)

1.一种核苷酸单体，所述的核苷酸单体在三磷酸核苷的3′-OH部分具有可通过物理方法或化学方法除去的可逆荧光基团，所述的三磷酸核苷含有核糖或脱氧核糖作为糖的骨架结构。
2.如权利要求1所述的核苷酸单体，其中所述的可逆荧光基团为荧光团本身，或是由所述的荧光团与将所述荧光团连接到所述3′-OH部分的连接子组成。
3.如权利要求2所述的核苷酸单体，其中所述的荧光团选自于由下列物质所组成的组：香豆素、AlexaFluor、Bodipy、荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3、得克萨斯红以及这些物质的衍生物。
4.如权利要求2所述的核苷酸单体，其中所述的连接子选自于由下列物质所组成的组：烷基、烯丙基、叠氮甲基、二硫基、2-硝基苄基或4-硝基苄基及其混合物。
5.如权利要求1所述的核苷酸单体，其中所述的单体包括由式2表示的化合物：
[式2]
Figure F2009102059988C00011
式2中，
R1为三磷酸酯基团，
R2为核苷碱基，
R3为荧光团，以及
R4为氢或羟基。
6.一种测序方法，所述的测序方法包括下列步骤：
(1)合成如权利要求1所述的核苷酸单体；
(2)以目标核苷酸链作为模板，使用步骤(1)所述的核苷酸单体以及DNA聚合酶或RNA聚合酶将引物延伸一个核苷酸；
(3)通过测定荧光信号，对延伸后的核苷酸链中的碱基进行鉴别，所述的荧光信号来自于可逆的荧光阻断基团，所述的荧光阻断基团连接到由步骤(2)的聚合反应所产生的延伸后的核苷酸链的3′-OH基团上；
(4)除去来自于步骤(3)中延伸后的核苷酸链的可逆的荧光阻断基团，然后复原为游离的3′-OH基团，从而继续进行聚合反应；以及
(5)重复步骤(2)至步骤(4)，从而对目标模板进行测序。
7.如权利要求6所述的测序方法，其中步骤(2)中所述的模板核酸链选自于由基因组DNA、质粒和寡聚核苷酸所组成的组。
8.如权利要求6所述的测序方法，其中步骤(2)所述的聚合酶选自于由嗜热聚合酶、嗜温聚合酶及其突变体所组成的组。
9.如权利要求6所述的测序方法，其中步骤(3)中所述的荧光信号通过下列方法进行测定：测量固定有所述模板的双链DNA和引物的固相的荧光或测量含有所述双链DNA的溶液的荧光。
10.如权利要求6所述的测序方法，其中步骤(4)中所述的可逆荧光基团优选通过使用化学试剂或酶或照射的方法除去。
11.一种用于边合成边测序(SBS)的试剂盒，所述的试剂盒含有如权利要求1所述的核苷酸单体或其多聚体。
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