CN102016572A

CN102016572A - 母体尿液的还原/氧化活性作为胎儿性别相关特性的指标

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Publication number: CN102016572A
Application number: CN2009801161794A
Authority: CN
Inventors: 库尔迪普·C·维尔马
Original assignee: UROBIOLOGICS LLC
Current assignee: UROBIOLOGICS LLC
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2011-04-13
Also published as: WO2009114579A2; EP2863220B1; US9057720B2; WO2009114579A8; WO2009114579A3; EP2257803A4; EP2863220A2; US20090233321A1; EP2863220A3; US20150316540A1; EP2257803A2

Abstract

本发明提供了一种通过测定母体尿液或其他体液的总还原/氧化或氧化还原活性来确定未出生胎儿性别的方法。该方法可用于在整个妊娠期间的任意时间点，最早是在错过月经第一天确定胎儿性别。在测定之前可对体液进行处理。处理可涉及老化体液、或纯化各种组分。本发明的方法还提供了通过测定未妊娠女性尿液或其他体液的总氧化还原活性进行受孕前婴儿性别设计的方式。尿液样品的总氧化还原活性与特定月经周期期间释放的卵子的性别特异适合性相关。因此，测定未妊娠女性尿液的总氧化还原活性可帮助夫妻怀上具有期望性别的婴儿。

Description

母体尿液的还原/氧化活性作为胎儿性别相关特性的指标

相关申请的参考

本申请要求于2008年3月11日提交的美国临时申请第61/069,008号在35U.S.C.§119(e)下的权益。

技术领域

本发明涉及一种通过评价母体尿液的总还原/氧化活性确定未出生胎儿性别的方法。本发明还涉及一种通过在受孕之前评价未妊娠女性尿液的总还原/氧化活性进行受孕前婴儿性别设计的方法。

背景技术

人们对尽可能早地准确确定未出生胎儿性别非常感兴趣。可利用的技术典型地在妊娠后期进行。在妊娠18周之后可使用超声波确定胎儿性别。Y-特异性DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增需要母体血液样品以及昂贵的设备。PCR可早在孕期第六周进行，准确率仅为约80％。Lagona等人Multiple testing in fetal gender determination from maternal blood by polymerase chain reaction.Hum. Genet.102，6：1(1998)。在妊娠18周之后可进行羊膜穿刺术，但是由于侵入性，它伴随着流产的风险。在妊娠第10周和第13周之间进行的绒膜绒毛取样(CVS)也可以提供准确信息，但该方法同样是侵入性的并且所需设备成本高。

可替换地，可以通过测定性激素确定未出生胎儿性别。性激素是对正常生长和发育发挥重要作用的类固醇。另外，性激素影响哺乳动物性器官的发育和第二性征的维持。睾丸酮，主要的雄性激素，主要由雄性睾丸分泌，而雌性卵巢分泌的程度要少得多。平均而言，成年男人产生的睾丸酮是成年妇女的约40到60倍。类似地，雌激素充当主要的雌性激素，通常它在女性中存在的水平显著高于男性。当与怀有女胎的母体尿液相比时，怀有男胎的母体尿液含有较丰富的睾丸酮。该差异可能是由于男胎分泌的性激素的作用引起的。Jost A.A new Look at the Mechanisms Controlling Sex Differentiation in Mammals.John Hopkins Med.J.130：38(1972)。基于妊娠妇女的个体性激素水平确定胎儿性别的方法已被探究，但到目前为止尚未导致开发出任何在统计学上可靠的方法。例如，在一个研究中，将抗睾丸酮的抗体用在放射免疫测定法中以确定妊娠母体尿液中睾丸酮水平。这个研究在确定胎儿性别中的准确率较低。Loewit等人Determination of fetal sex from maternal testosterone excretion in early pregnancy.Dtsch.Med.Wschr.99：1656(1974)。

妊娠妇女尿液已用于开发简单而非侵入性测试的各种尝试中以确定胎儿性别。这些方法中大部分利用母体尿液的简单特性，如它的pH或与铝化合物形成络合物的能力。因此，这些测试通常伴随较差的可靠性。例如，美国专利第6,420,182号公开了一种通过在妊娠第12至第14周之后测定母体尿液的pH来检测胎儿性别的方法。该测试所基于的假设是怀有女胎的妇女具有酸性尿液，但这个方法的准确率仅为约65％。在另一个测定法中，可以在妊娠20周之后对妊娠妇女尿液进行比色测试。美国专利第4,840,914号。这个测试在确定胎儿性别上的准确率同样较低，仅为约60％(也参见：www.intelligender.com)。

本申请人已注意到评价妊娠女性尿液样品的还原/氧化活性可提供确定胎儿性别的更好方法。依据该处理和测定方法，可促进尿液样品还原活性的激素是孕酮、睾丸酮和人绒毛膜促性腺激素(hCG)，而雌激素可以促进尿液的氧化活性。与胎儿性别直接相关的主要激素是性激素，即，睾丸酮和雌激素。怀有男胎的妊娠母体尿液样品的总还原/氧化活性与怀有女胎的妊娠母体尿液样品的总还原/氧化活性不同，使得可以用来确定胎儿性别。

仍需要开发一种在受孕之后尽可能早地确定未出生胎儿性别的简单、非侵入性且可靠的方法。也需要利用简单、非侵入性且可靠的技术进行受孕前婴儿性别设计。由于人和其他哺乳动物具有相似的生殖生物学，因而这些方法也可为动物饲养员创造很大的商业价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于确定未出生胎儿性别的方法，该方法包括以下步骤：(a)使妊娠女性的体液与至少一种氧化还原指示剂接触；(b)测量该体液的氧化还原活性；以及(c)将该体液的氧化还原活性与至少一种标准品进行比较，从而确定未出生胎儿性别。该体液可选自由尿液、泪液、唾液、汗液、血液、血浆、血清、脑脊液和羊水组成的组。该体液可以为尿液。该体液可在从错过(missed)月经约第一天到妊娠约40周范围内的时间段取得。该体液也可在从妊娠约5周到妊娠约15周范围内的时间段取得。

氧化还原指示剂可包含杂多酸或其盐，例如磷-24-钨酸。该氧化还原指示剂可以为显色化学品(chromogenic chemical)。该显色化学品可包含氧化-还原敏感性金属离子。该金属离子可选自由氧化态的铜、铁、铬、钨和钼离子组成的组。该显色化学品可选自由三价铁三吡啶基三嗪(Fe(III)-TPTZ)络合物和铁氰化钾(高铁氰化钾)组成的组。氧化还原活性可利用自由基例如羟基测量。水杨酸钠可用作氧化还原指示剂。氧化还原活性也可利用电化学传感器测量。氧化还原活性可在包含氧化还原指示剂，例如显色化学品的固体基质(solid substrate)上测量。显色化学品可以浸渍在条带(strip)上。

在步骤(a)之前可对体液进行处理。在步骤(a)之前可以在从约20℃到约30℃范围内的室温下老化体液至少约1周。在步骤(a)之前可以在室温下老化体液从约1周到52周范围内的时间段。体液的处理可包括化学、生物化学、物理或生物方式，例如酶处理、提取和纯化。该处理可包括使用选自由滑石、二氧化硅基颗粒如硅胶、氧化铝、弗洛里西(硅酸镁载体，florisil)、活性炭、高岭土、刀豆素A及其结合物、磷酸钙、氢氧化钙、氯化钙、溴化十六烷基三甲铵、凝集素、蛋白质或糖蛋白水解酶、玻璃纤维过滤器(玻璃纤维滤片，glassfiber filter)、离子交换树脂、亲和配体、有机溶剂、固相提取剂、尺寸排阻筛(size exclusion sieve)、以及反相色谱材料组成的组中的吸附剂。该处理也可包括使用沉淀剂，例如选自由钡、铅、钼和钨组成的组中的重金属。该沉淀剂也可选自由氯化钡、氢氧化钡、氯化锌、氯化汞、醋酸铅、硫酸铵、葡聚糖、乙腈、氯仿、氢氧化钠、三氯乙酸、碘酸钾和它们的混合物组成的组。

本发明还提供了一种试剂盒，包括：(a)尿液收集瓶；(b)包含氧化还原指示剂的固体基质，其中该氧化还原指示剂包含至少一种显色化学品；(c)指导妇女收集尿液并使该尿液与固体基质接触的印刷材料；以及(d)指导妇女将尿液样品的氧化还原活性与至少一种标准品(标准，standard)进行比较从而基于显色化学品的颜色变化确定未出生胎儿性别的印刷材料。该试剂盒可进一步包括处理尿液的化学品。该印刷材料可进一步指导妇女在使尿液与固体基质接触之前处理尿液。

本发明进一步提供了一种受孕前婴儿性别设计的方法，包括以下步骤：(a)使未妊娠女性的体液与至少一种氧化还原指示剂接触；(b)测量体液的氧化还原活性；以及(c)将该体液的氧化还原活性与至少一种标准品进行比较从而确定月经周期中释放的卵子的性别特异适合性(gender specific compatibility)。该体液可以为尿液。该体液可在接近排卵或月经周期中期取得。在步骤(a)之前可对体液进行处理。

具体实施方式

本发明提供了一种通过测定母体尿液的总还原/氧化或氧化还原活性来确定未出生胎儿性别的方法。该总氧化还原活性可在其他体液例如泪液和脑脊液中测量。可在整个妊娠期间，即，从错过月经第一天到妊娠约40周的任何时间点利用该方法确定胎儿性别。为了提高结果的准确率，可在测定之前对体液进行处理。该处理可涉及老化体液，或纯化多个组分(部分，成分，fractions)。例如，该处理可包括通过将它存储在环境温度(例如，约为20-30℃)下规定的时间段如1-4周来老化尿液，通过物理、化学或生物化学方式处理尿液从而加速老化过程，和/或通过物理、化学或生物化学方式除去多种尿液组分。在一个实施方式中，该体液是在妊娠第5周至妊娠第15周之间的妊娠女性中取得的。对在妊娠的不同时间点从同一受试者取得的尿液样品的重复分析似乎可提高分析结果的准确率。例如，如果分析三个尿液样品，我们发现该结果的准确率接近100％。

本发明的方法也提供了一种通过测定未妊娠女性尿液或其他体液的总氧化还原活性进行受孕前婴儿性别设计的方式。可在月经周期期间的任何时间测定体液，但优选在排卵期或月经周期中期左右测定体液。不局限于任何特定生理机制，据认为在交替(alternate)的月经周期期间排卵产生至少两种类型的生理条件，推测是由于两种不同类型的卵子的释放引起的。一种类型的卵子适合于通过携带Y染色体的精子受精从而产生男胎，而另一种类型的卵子适合于通过携带X染色体的精子受精从而产生女胎。精子与不适合的卵子的受精率非常低。我们已发现尿液样品的总氧化还原活性与特定月经周期期间释放的卵子的性别特异适合性相关。因此，测定未妊娠女性尿液的总氧化还原活性可帮助夫妻怀上具有期望性别的婴儿。

本发明的方法可包括测定任何合适的体液，包括尿液、泪液、唾液、汗液、血液、血浆、血清、脑脊液和羊水。Pigman等人Thereducing power of human saliva and its component secretions.J.Dent Res.37(4)：688-696(1958)。Oyawoye等人Antioxidants and reactiveoxygen species in follicular fluid of women undergoing IVF.Human Reproduction.18(11)：2270-2274(2003)。

术语体液的“总氧化还原活性”或“氧化还原活性”指的是体液作为整体的净氧化还原活性(包括抗氧化活性)，尽管体液的各种成分可单独表现出不同的氧化还原活性。体液例如尿液的总氧化还原活性不仅取决于尿液的组成，而且取决于样品在测定之前是如何处理的、以及测定条件。例如，体液可在测定前在从约20℃至约30℃范围内的室温下“老化”至少约1周。体液也可老化更长的时间段，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个月。体液也可在测定之前在室温下老化从约1周至约52周范围内的时间段。尿液样品的老化可从长达1年到约5年的范围内，但更长的时间段也是合适的。其他合适的化学、生物化学或物理处理也可用来在测定前处理尿液。

术语“胎儿性别相关特性”指的是(i)妊娠之前特定月经周期中释放的卵子的类型和适合性的评价，和(ii)妊娠之后胎儿性别的确定。术语“性别特异适合性(相容性)”指的是卵子与通过携带Y染色体的精子受精从而产生男胎的适合性，或卵子与通过携带X染色体的精子受精从而产生女胎的适合性。

本发明提供了一种用于确定未出生胎儿性别的方法，包括以下步骤：(a)使妊娠女性的体液与至少一种氧化还原指示剂接触；(b)测量该体液的氧化还原活性；以及(c)使该体液的氧化还原活性与至少一种标准品进行比较，从而确定未出生胎儿的性别。

因为体液还原或氧化试剂的能力取决于用来测量还原或氧化的特定试剂(还原剂或氧化剂)，所以将受试者体液的氧化还原活性与标准品(即胎儿性别已知的妊娠女性体液)的氧化还原活性进行比较，从而确定该受试者怀有的胎儿性别。可替换地，将受试者体液的氧化还原活性与胎儿性别已知的(多位)妊娠女性合并的体液样品的氧化还原活性进行比较，从而确定该受试者怀有的胎儿性别。类似地，对于受孕前的方法，将受试者体液的氧化还原活性与标准品(即其中产生的女性卵子性别特异适合性已知的未妊娠女性体液)的氧化还原活性进行比较，从而确定该受试者产生的卵子的性别特异性适合性。可替换地，将受试者体液的氧化还原活性与其中产生的女性卵子的性别特异适合性已知的(多位)未妊娠女性合并的体液样品的氧化还原活性进行比较，从而确定该受试者产生的卵子的性别特异适合性。标准品的氧化还原活性可使用本发明包括的任何方法进行确定。在本发明中可使用一种标准品。可替换地，可使用多于一种的标准品。

体液例如尿液的总氧化还原活性不仅取决于尿液的组成，而且取决于样品在测定之前是如何处理的、以及测定条件。例如，如果尿液样品未被老化或在温和条件下测定(见下文描述)，则该尿液的总氧化还原活性与它的体内总氧化还原活性相关。即，怀有女胎的女性的尿液与怀有男胎的女性的尿液相比具有相对较高的总还原活性(或抗氧化活性)。

受孕前测定已得到类似的观测结果。即，如果尿液样品未被老化或在温和条件下测定，则具有适合于通过携带X染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性的尿液样品与具有适合于通过携带Y染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性的尿液相比，具有相对较高的还原活性(或抗氧化活性)。

相反，如果使尿液样品老化和/或在苛刻条件(见下文描述)下测定，则该尿液将表现出与其体内活性不同的总氧化还原活性。即，怀有男胎的女性的尿液与怀有女胎的女性的尿液相比具有相对较高的总还原活性。

同样地，对于受孕前测试，如果尿液样品在苛刻条件下测定，则具有适合于通过携带Y染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性的尿液样品与具有适合于通过携带X染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性的尿液相比，具有相对较高的还原活性。在不同处理和测定条件下尿液样品的氧化还原活性见表1。

表1

术语“温和条件”指的是通过在低于约21℃的温度下处理，或利用诸如滑石、氧化铝的温和化学品处理，利用有机溶剂、固相提取(固相萃取，SPE)色谱或磷钨酸(PTA)提取(萃取)而进行的测定之前体液的处理和体液的测定。术语“苛刻条件”指的是通过在高于约21℃的温度下处理，或通过苛刻化学品，例如强酸、强碱、三氯乙酸和强氧化剂处理而进行的测定之前体液的处理和体液的测定。强氧化剂包括三价铁还原/抗氧化能力测试(FRAP)测定法中的铁氰化钾。测定前体液处理，或体液测定的特定条件可由本领域普通技术人员在无需过度实验的情况下确定。

尿液中存在许多可干扰本发明的测定的还原或氧化化合物。因此，可在测定氧化还原活性之前处理尿液从而除去这些化合物。干扰性还原和氧化剂包括尿素、肌酸、尿酸、抗坏血酸、葡萄糖、葡糖醛酸、胆红素、肌酸酐、卟啉和相关色素、亚硝酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、连二亚硫酸盐(次硫酸盐，hyposulfites)、焦亚硫酸盐、硫酸盐含氧酸(例如亚硫酸、重硫酸(bisulfurous acid)、连二亚硫酸、焦亚硫酸)、尿胆素原、血红蛋白或其他干扰性蛋白质、和白细胞。干扰剂可通过用酶处理除去，该酶包括抗坏血酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、尿酶和尿酸酶。葡萄糖可通过阴离子交换树脂如Amberlite-4B或氧化铝除去。干扰剂也可能包括孕酮、其衍生物和/或代谢产物，其可通过吸附剂，例如云母和高定向热解石墨(highlyoriented pyrolytic graphite)除去，或可通过抗孕酮的抗体、其衍生物和/或代谢产物除去。抗坏血酸可通过树脂提取、重氮化4-硝基苯胺-2，5-二甲氧基苯胺、抗坏血酸氧化酶、醋酸铅、碘酸盐、和/或它们的组合除去。Michaelson.Scand J Clin Lab Inves 20：97(1967)。Hughes.Analyst 89：618(1964)。

在测定之前也可使用化学、生物化学或物理处理，从而除去干扰性还原和/或氧化化合物。该处理可包括提取、纯化、吸附，以及通过矿物酸、酶或微波的处理。体液也可以通过用吸附剂和/或沉淀剂处理而加工。吸附剂可选自由滑石、二氧化硅基颗粒如硅胶、氧化铝、弗洛里西、活性炭、高岭土、刀豆素A及其结合物、磷酸钙、氢氧化钙、氯化钙、溴化十六烷基三甲铵、对尿促性腺激素的碳水化合物部分或糖蛋白特异的凝集素、蛋白质或糖蛋白水解酶、玻璃纤维过滤器、离子交换树脂、亲和配体、利用有机溶剂的提取(萃取)、固相提取剂、尺寸排阻筛、和反相色谱材料组成的组。沉淀剂可以是选自由钡、铅、钼和钨组成的组中的重金属的盐。沉淀剂可包含氯化钡、与氯化锌混合的氢氧化钡、氯化汞、醋酸铅和它们的混合物。沉淀剂也可包含硫酸铵、葡聚糖、乙腈、氯仿、氢氧化钠、三氯乙酸、碘酸钾和它们的混合物。可以使用一种或多于一种的吸附剂或沉淀剂，另外，吸附剂和沉淀剂可以组合使用。吸附剂或沉淀剂可用于吸附或保留干扰性还原或氧化剂。可替换地，吸附剂或沉淀剂可用于吸附或保留期望的尿组分，之后该尿组分可用适当的溶剂稀释以用于测定。

当使尿液样品老化时，似乎除去了大部分干扰性还原或氧化组分。在一个实施方式中，首先通过物理、化学或生物化学方式处理尿液样品从而加速老化过程。然后通过其他化学、物理或生物化学方式处理尿液样品从而获得纯化或部分纯化的组分，接着在苛刻条件下测定尿液样品的总氧化还原活性。

在测定之前，不溶组分例如可通过过滤或离心而从体液中除去。也可在测定之前加入非干扰性的pH指示剂。可调节体液的pH。

与胎儿性别直接相关的主要激素为性激素，即，睾丸酮和雌激素。怀有男胎的母体尿液中睾丸酮和雌激素的比率为大于约1.0，而怀有女胎的母体尿液中睾丸酮和雌激素的比率为小于约1.0。包括睾丸酮和雌激素的性激素作为它们的葡糖苷酸排泄在尿液中，该葡糖苷酸与大的糖蛋白，例如人绒毛膜促性腺素(hCG)、性激素结合球蛋白、以及其他糖蛋白相结合(associate)。在新鲜排出的尿液中，性激素保持了它们与这些大分子的结合。不局限于任何特定生理机制，据认为在温和条件下或未老化测定的尿液样品的总氧化还原活性为各种尿复合物(络合物，complexes)的净氧化还原活性，该尿复合物包含性激素和大分子，如hCG、性激素结合球蛋白、以及其他糖蛋白。

当在苛刻条件下测定尿液时，可促进尿液样品还原活性的激素为孕酮、睾丸酮和人绒毛膜促性腺素(hCG)和/或它的降解副产物，而雌激素可促进尿液的氧化活性。hCG为特别产生于妊娠过程中的糖蛋白激素，该糖蛋白激素在受孕后不久由胚胎分泌，后来由胎盘分泌。hCG的主要作用在于维持孕酮生成，孕酮生成对维持人妊娠是重要的。许多当前可用的早孕测试就是基于血液或尿液中hCG的检测或测量。尿液或血液的hCG水平本身并不与胎儿性别相关。hCG表现出还原活性。Nepomnaschy等人Human Reproduction.2008.23(2)：271。在苛刻测定条件下，如果尿液样品来自怀有男胎的女性，则该尿液样品中不存在能够保护hCG不被尿氧化剂氧化的其他更强的还原剂(或抗氧化剂)。Bowman D.E.J.Biol.Chem.1940，p293-302。Gurin等人J.Biol.Chem.1940.128：525。因此，hCG被氧化并随后被降解成其包括半乳糖和己糖胺(hexoamines)的成分，半乳糖和己糖胺与hCG相比具有强得多的还原活性。结果，与怀有女胎的女性尿液相比，半乳糖和己糖胺促使怀有男胎的女性尿液的总还原活性相对较高。相反，在未老化或在温和测定条件下的新鲜排出的尿液样品中，如果尿液样品来自怀有女胎的女性，则尿液样品中浓度相对较高的雌激素能够通过与氧化剂相互作用而保护hCG不受该氧化剂影响。因此，hCG未被相同程度地氧化或降解。相反，与怀有男胎的女性尿液样品中的hCG相比，该hCG以慢得多的速率降解。因此，在老化之后或在苛刻条件下，怀有男胎的女性尿液与怀有女胎的女性尿液相比，表现出更高的总还原活性。

性激素作为其葡糖苷酸结合物排泄在尿液中。随着尿液样品老化，葡糖苷酸结合物水解并释放游离的性激素。为了促进游离性激素从其葡糖苷酸结合物中释放，可用酶β-葡糖苷酸酶处理尿液样品。可使用从各种来源纯化出的β-葡糖苷酸酶，该来源包括牛肝脏、罗曼蜗牛(snail Helix pomatia)和大肠杆菌。在一个实施方式中，用来自大肠杆菌的β-葡糖苷酸酶处理尿液样品24小时。在另一个实施方式中，用大肠杆菌β-葡糖苷酸酶处理尿液样品2小时。

也可通过矿物酸处理尿液样品从而促进游离性激素从它们的葡糖苷酸结合物中释放。该矿物酸可以为盐酸或硫酸。水解产率可通过酸的性质和浓度确定。在一个实施方式中，可通过用3M硫酸在37℃下处理尿液样品24小时实现性激素葡糖苷酸结合物的完全水解。

也可测定体液的氧化还原电位。氧化还原电位可通过测量与体液接触的惰性指示电极与通过盐桥连接到体液的稳定的参比电极之间的电位差而确定。惰性指示电极充当用于将电子转移进或转移出参比半电池的平台(platform)。指示电极可包含铂。指示电极可包含金和石墨。参比电极可以是稳定的氢电极(SHE)、Ag/AgCl参比电极或饱和甘汞(SCE)参比电极。

能够测量体液的总氧化还原活性的任何合适的测定方法，或两种或多种此类测定方法的结合可与本发明的方法一起使用。体液的总氧化还原活性可通过使体液与至少一种氧化还原指示剂反应而测定。如本文使用的，术语“氧化还原指示剂”指的是在被还原或氧化之后经历可测量的变化的分子。氧化还原指示剂可以为还原剂或氧化剂。可测量的变化可以是颜色变化、荧光变化、化学发光变化、电磁辐射变化或可测定的任何其他适合的变化。被还原或氧化的氧化还原指示剂的量可与体液的总氧化还原活性直接相关，体液的总氧化还原活性又与胎儿性别、或产生的卵子类型相关。氧化还原指示剂可以为在被还原或氧化之后能够改变颜色的显色化学品。被还原或氧化的显色化学品的量可通过还原/氧化反应之前和之后体液在特定波长处的吸光度差异而测量。

下面提供了可用来确定体液例如尿液的总氧化还原活性的各种类型的氧化还原测定法。体液的总氧化还原活性可通过与其中胎儿性别已知的标准品、或其中卵子的性别特异适合性已知的标准品比较来确定。尿液样品的氧化还原活性的相对水平在表1中示出。每种测定法中的特定条件可由本领域普通技术人员在无需过度实验的情况下确定。

体液的总还原活性可使用杂多酸或其相应盐测定。杂多酸是各自包含金属、氢、氧和其它非金属原子特定组合的一类酸。具体地，杂多酸含有称为附属原子(addenda atom)的金属，例如钨、钼或钒；氧；一般来自周期表的p-区的称为杂原子的元素，例如硅、磷或砷；以及酸性氢原子。参见，http://en.wikipedia.org/wiki/Heteropoly_acid[联网.检索于2009年3月9日]。杂多酸中更为已知的两种为具有化学式H₃PW₁₂O₄₀的磷钨酸(PTA)以及具有化学式H₃PMo₁₂O₄₀的磷钼酸。

磷钨酸和磷钼酸对还原非常敏感，即使在中度还原之后也可产生高度有色的化合物。Wu.Contributions to the chemistry ofphosphomolybdic acid，phosphotungstic acid and allied substances.J. Biol.Chem.1920.XLIII，1：189-220。在酸性条件下，PTA与蛋白质结合，并在溶液中形成沉淀物。磷钨酸盐：酸性溶液中极性聚合物的“通用”(非专用)沉淀剂。Journal of Histochemistry and Cytochemistry.J.E.Scott.1971.19，11，689。除了蛋白质之外，PTA在低pH下也对碳水化合物具有亲和性。Pease DC.J.Ultrastucture Res.1966.15：555。随着其溶液pH增大，杂多酸一般分解成其更简单的成分酸，但可通过重新酸化(re-acidification)而再生。

使用PTA的测定法可在温和条件下进行。关于PTA测定法，怀有女胎的女性尿液如与怀有男胎的女性尿液相比将具有相对较高的总还原活性。当怀有男胎的妊娠女性的尿液样品与PTA接触时，PTA在尿液中保持完整并与尿蛋白和糖蛋白形成不溶的复合物。因而，在PTA测定法中这个尿液样品表现为白色胶体悬浮液至少约12小时。

相反，对于怀有女胎的妊娠女性尿液，尽管PTA起初与尿蛋白和糖蛋白形成不溶的复合物，但随着PTA被尿液还原，该复合物逐渐减少。该反应混合物随时间而变得透明。在不同尿液样品中，该反应混合物从白色胶体悬浮液变成澄清溶液的时间段可以不同。在一些实施方式中，该时间段的范围可以是约5分钟到约12小时。更短或更长的时间段也是适合的，例如约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时和20小时。

钨或钼优选作为本发明中使用的杂多酸或其盐的附属原子。杂多酸或其盐可由一种类型或多于一种类型的附属原子组成。附属原子的组合包括钼和钨、钒和钼，以及钒、钼和钨。杂多酸或其盐的杂原子选自由磷、砷、硅和锗组成的组。磷优选作为杂原子。包含钼和磷、钼和砷、或钨和磷的杂多酸或其盐是优选的实施方式。杂多酸或其盐可选自由磷-12-钼酸、磷-18-钼酸、12-钼砷酸、18-钼砷酸、11-钼-1-钒磷酸、10-钼-2-钒磷酸、磷-12-钨酸、磷-18-钨酸、磷-24-钨酸和9-钼-3-钒磷酸组成的组。磷-18-钼酸、磷-12-钨酸、磷-18-钨酸和磷-24-钨酸为优选的实施方式。杂多酸以及它们的盐可单独使用或可以使用它们的组合。

体液的总氧化还原活性可通过包含氧化-还原敏感性金属离子的显色化学品测定。该金属离子可选自由氧化态的铜、铁、铬、钨、钼离子组成的组。

显色化学品可以是金属有机络合物，由于该金属有机络合物氧化活性非常高(与高氧化还原电位相关)，所以它可被许多还原剂还原并经历颜色变化。三价铁还原/抗氧化能力(FRAP)测定法可用来测定体液的总还原活性。三价铁三吡啶基三嗪(Fe(III)-TPTZ)络合物在酸性条件下被还原剂还原从而形成二价铁三吡啶基三嗪(Fe(II)-TPTZ)。Fe(III)-TPTZ的颜色为黄色。由于Fe(II)-TPTZ为鲜明的蓝色并在波长593nm处具有最大吸光度，因而它的生成可容易检测和测量。

FRAP测定法可在苛刻条件下进行，其中怀有男胎的女性尿液与怀有女胎的女性尿液相比具有相对较高的总还原活性。因此，怀有男胎的女性尿液样品能够将Fe(III)还原成Fe(II)，或将Fe(III)-TPTZ还原成Fe(II)-TPTZ，反应混合物变成深蓝色。相反，怀有女胎的女性尿液样品不能还原Fe(III)、或Fe(III)-TPTZ，因而反应混合物仍然为黄色。

也可在FRAP测定法中使用铁氰化钾。Oyaizu.Studies onproducts of Browning reaction.J.Nutrition.44：307-315(1986)。在FRAP测定法的苛刻条件下，怀有男胎的女性尿液与怀有女胎的女性尿液相比具有相对较高的总还原活性。因此，怀有男胎的女性尿液样品能够将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，当加入氯化铁时该亚铁氰化钾随后能够形成深蓝色产物。相反，怀有女胎的女性尿液样品不能还原铁氰化钾，因而反应混合物的颜色仍然为金黄色或浅绿色。

对于具有不同性别的异卵多胎，当进行FRAP测定法时，与怀有女胎的女性尿液相比具有相对较高的总还原活性的尿液与至少一个男胎相关，而具有与怀有女胎的女性尿液相当的总还原活性的尿液与至少两个女胎相关。

体液的总还原活性可通过Cu²⁺到Cu⁺的还原而测定，其可通过Cu⁺与浴铜灵(bathocuproine)之间的络合物形成而检测。生成的Cu⁺的量与体液的总还原活性相关。Cu⁺-浴铜灵络合物是稳定的且在约480-490nm波长处具有最大吸光度。在一个实施方式中，生成的Cu⁺的量可通过参考使用尿酸作为还原剂的标准曲线而量化。

体液的总还原或抗氧化活性可通过其在氧化还原指示剂存在的情况下捕获自由基的能力来测定。在一个实施方式中，该自由基为通过羟基生成体系或在体液内部生成的羟基(OH·)，其中水杨酸钠作为氧化还原指示剂。在不存在其他抗氧化剂(或还原剂)的情况下，无色的水杨酸离子与OH·反应从而生成二羟基苯甲酸，二羟基苯甲酸的颜色为蓝色并且在波长510nm处具有最大吸光度。当其他抗氧化剂(或还原剂)存在时，羟基则是被该抗氧化剂(或还原剂)扣留(sequester)或捕获。结果，水杨酸钠保持完整且反应混合物仍然为无色。

在另一个实施方式中，体液的总氧化还原活性可通过其促进自由基生成的能力来测定。该测定试剂可包含水杨酸钠和包括如硫酸铁的三价铁化合物、和H₂O₂的羟基生成体系。当存在还原剂时，它将三价铁还原成二价铁，二价铁导致进一步还原H₂O₂从而通过Fenton反应生成羟基OH·。水杨酸离子然后与OH·反应从而生成颜色为蓝色的二羟基苯甲酸。该反应图示如下。

Fe3++还原剂→Fe2++被氧化的还原剂

Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+OH·+OH

水杨酸钠+2OH·→二羟基苯甲酸

在不存在还原剂的情况下，没有OH·生成。因此，水杨酸钠仍然为无色。

体液的总氧化还原活性也可使用氧化还原敏感性聚合物例如聚苯胺检测。聚苯胺可由苯胺单体聚合并具有以下结构，

其中x是半聚合度(half the degree of polymerization)。参见http://en.wikipedia.org/wiki/Polyaniline[联网.检索于2009年3月6日]。可发现以三种氧化态之一的聚苯胺。完全还原态聚苯胺(leucoemeraldine)形式的聚苯胺(n＝1，m＝0)是完全还原态并且为白色或无色。聚对苯亚胺(Pernigraniline)(n＝0，m＝1)是完全氧化态并且为蓝色或紫色。翠绿亚胺(emeraldine)(n＝m＝0.5)形式的聚苯胺是中间状态并且为绿色或蓝色。可利用与不同氧化态的聚苯胺关联的颜色变化，从而使用聚苯胺作为氧化还原指示剂。Huanga等人Development and characterization of flexibleelectrochromic devices based on polyaniline andpoly(3，4-ethylenedioxythiophene)-poly(styrene sulfonic acid).Electrochimica Acta.51，26：5858-5863(2006)。

在另一个实施方式中，体液的总还原活性可通过原位方法学测定。例如，将氧化还原指示剂固定在琼脂糖珠粒上，该氧化还原剂可以选自由亚氨嗪(thionine)、甲苯胺蓝O和甲酚紫组成的组。然后将该琼脂糖珠粒装填到流动池(flow cell)中。使体液通过该流动池并通过分光光度术监测氧化还原指示剂的氧化还原态。Jones.Evaluation of immobilized redox indicators as reversible，in situ redoxsensors for determining Fe(III)-reducing conditions in environmentalsamples.Talanta.2001.55，4：699-714。

体液的总氧化还原活性可在或可不在与O-菲咯啉络合物形成颜色的情况下通过采用铜离子、新亚铜试剂或碱性铁氰化物方法的一般还原糖测试法检测。Prado等人Phytochem.Analysis.9(2)：58-62(1998)。

体液的总氧化还原活性也可通过氧自由基吸收能力(ORAC)测定法检测，该测定法使用相同的过氧化氢自由基引发剂(radicalgenerator)测量亲脂性和亲水性抗氧化能力。ORAC测定法测量在与自由基引发剂例如偶氮引发剂化合物混合之后的荧光分子(例如β-藻红蛋白或荧光蛋白(荧光素，fluorescin))的氧化降解。偶氮引发剂化合物产生过氧化氢自由基，该过氧化氢自由基可破坏荧光分子，导致荧光丧失。抗氧化剂或还原剂，例如雌激素能够保护荧光分子不受氧化变性的影响。抗氧化剂或还原剂的保护程度可利用荧光计量化。Williams等人A comparison of mammalian and plantestrogens on vascular reactivity in young and old mice with or withoutdisruption of estrogen receptors.Current Topics in Nutraceutical Res.2，4：191(2004).还参见http://en.wikipedia.org/wiki/Oxygen_Radical_Absorbance_Capacity[联网.检索于2009年3月2日]。

体液的总氧化还原活性可通过采用3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐(ABTS)体系或TPTZ的抗氧化能力(AOC)测定法检测。Bahramikia等人A comparison of Antioxidant Capacities of ethanolextracts of S.Hortensis and A.Dracunculus leaves.Pharmacology Online2：694-704(2008)。

体液的总氧化还原活性可通过使用固定化显色基团(chromogenic radicals)检测。在一个实施方式中，两个稳定的亲脂性显色基团，DPPH(2，2-二苯基-1-苦基肼基)基团和GV(2，6-二叔丁基-α-(3，5-二叔丁基-氧代-2，5-环己二烯-1-亚基)-对甲苯氧基)(2，6-di-tert-butyl-α-(3，5-di-tert-butyl-oxo-2，5-cyclohexanedien-1-ylidene)-p-tolyloxy)基团中任一个被固定在塑化聚合物膜如聚氯乙烯(PVC)膜中。当含有固定化2，2-二苯基-1-苦基肼基(DPPH)基团的聚合物膜被体液还原时，它不可逆地从紫色(最大吸光度在波长520nm处)变色成黄色。Steinberg等人Chromogenic radical basedoptical sensor membrane for screening of antioxidant activity.Talanta8：15(2006)。

体液的总氧化还原活性可通过免疫测定法检测，例如使用抗性别相关分子的抗体的免疫荧光；化学发光；如绿色荧光蛋白的生物荧光；不同尺寸的抗体标记的金纳米颗粒；化学标记或荧光染料。Kohen等人Recent advances in chemiluminescence-basedimmunoassays for steroid hormones.J.Steroid Biochem.27，1-3：71-79(1987)。

体液的总氧化活性可通过向体液中添加二价铁离子源来测定，由此样品中的氧化剂可将至少一部分二价铁离子氧化成三价铁离子。然后将与至少一部分三价铁离子反应的显色化合物加入到样品中。美国专利公开第20040259186号。

体液的总还原活性可使用选自由铁氰化盐、重铬酸盐、高锰酸盐、钒氧化物、二氯酚靛酚(dichlorophenolindophenol)、联吡啶锇络合物(osmium bipyridine complex)和醌组成的组的试剂测定。体液的总氧化活性可使用选自由碘、三碘化物盐、亚铁氰化物盐、二茂铁、[Cu(NH₃)₄]²⁺盐和[Co(NH₃)₆]³⁺盐组成的组的试剂测定。本发明方法的氧化还原指示剂可选自由2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(3，3′，5，5′-tetramethylebenzidine，TMB)、1，4-苯二胺(DMPDA)、菲啶、2，6-二氯靛酚、2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺)酸、N，N-二甲基苯二胺、2-氨基-对甲苯酚(APC)、二甲酚橙、8-羟基-7-碘-5-喹啉-磺酸和4，5-二羟基-1，3-苯二磺酸组成的组。

本发明也提供了一种通过测定女性尿液或其他体液的总氧化还原活性进行受孕前婴儿性别设计的方法。该体液可在月经周期中的任何时间取得，但优选在排卵期左右。不局限于任何具体生理机制，据认为有两种类型的卵子，它们中的每一种在大部分排卵女性中是隔月产生的。一种类型的卵子适合于通过携带Y染色体的精子受精从而产生男胎，而另一种类型的卵子适合于通过携带X染色体的精子受精从而产生女胎。母体尿液的总氧化还原活性与特定月经周期中释放的卵子的性别特异适合性相关。

在苛刻的测定条件下或在老化的情况下，带有适合于通过携带Y染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性尿液样品与带有适合于通过携带X染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性尿液相比，具有相对更高的还原活性(见表1中的总结)。据认为女性产生两种类型的卵子，该两种类型的卵子一般每隔一月交替产生，即，如果在一个月中产生的卵子适合于通过携带X染色体的精子受精，那么在下一个月产生的卵子则适合于通过携带Y染色体的精子受精。受孕前尿液测定可帮助夫妻怀上具有期望性别的婴儿。例如，如果夫妻想要女婴，则推荐他们在产生的卵子适合于通过携带X染色体的精子受精时的任何月计划受孕。类似地，如果夫妻想要男婴，则推荐他们在产生的卵子适合于通过携带Y染色体的精子受精时的任何月份计划受孕。本发明受孕前方法的目的在于通过建议适当的受孕月经周期而提高怀上期望性别婴儿的机会。

本发明提供了一种用于受孕前婴儿性别设计的方法，包括以下步骤：(a)使未妊娠女性的体液与至少一种氧化还原指示剂接触；(b)测量该体液的氧化还原活性；以及(c)将该体液的氧化还原活性与至少一种标准品进行比较从而确定月经周期中释放的卵子的性别特异适合性。该体液可在接近排卵或月经周期中期取得。该体液可在步骤(a)之前进行处理。

如果在连续两个月中收集的两个尿液样品表现出不同的氧化还原活性，则揭示该女性具有如上所述的规则的交替排卵模式。如果两个尿液样品与带有适合于通过携带X染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性尿液相比，都显示出相对较高的还原活性，则该女性可能具有不规则的排卵模式，其难以根据本发明规范化(normalize)。如果两个尿液样品与带有适合于通过携带Y染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性尿液相比，都显示出相对较高的氧化活性，则该女性的不规则排卵模式可通过饮食和锻炼规范化。

如上所述，能够测量体液的总氧化还原活性的任何合适的测定方法、或此类测定方法中的两种或多种的组合可与本发明受孕前测定法或本发明受孕后测定法一起使用。

女性受孕的月经周期期间的体液的总氧化还原活性与她受孕后体液的氧化还原活性类似。即，如果在苛刻条件下(例如，在FRAP测定法中)她的受孕前体液与带有适合于通过携带X染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性体液相比，具有相对较高的总还原活性，则她的卵子适合于通过携带Y染色体的精子受精。一致地，她的受孕后尿液样品与怀有女胎的女性尿液相比也将具有较高的总还原活性，这与男胎相关。相反地，如果在苛刻条件下她的受孕前尿液样品与带有适合于通过携带Y染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性尿液相比具有较高的总氧化活性，则她的卵子适合于通过携带X染色体的精子受精。同样地，她的受孕后尿液样品与怀有男胎的女性尿液相比也将具有较高的总氧化活性，这与女胎相关。

本发明进一步提供了一种采用远程检测装置确定女性子宫内胎儿性别的方法。在体内，男胎作为组织块，与周围的母体组织相比具有较高的总氧化活性，或较低的还原活性，而女胎与周围的母体组织相比具有较高的总还原或抗氧化活性。如与受孕后或受孕前尿液测试的情况一样，可将胎儿组织或母体组织的氧化还原活性与其中胎儿性别已知的标准品进行比较。本发明的远程检测装置可以包括探头(probe)。该装置可通过非侵入地感测内部电化学信号、电磁信号、或任何其他合适的物理和/或化学信号检测母体内部组织不同部分的氧化还原活性。在一个实施方式中，内部氧化还原电位通过远程检测装置检测。在另一个实施方式中，内部电荷通过远程检测装置检测。在一个进一步的实施方式中，该远程检测装置包括检测胎儿和母体组织的电化学电位的验电器。

本发明远程检测装置可包括宽频带散射光谱术(broadbanddiffuse optical spectroscopy)。Lee等人Noninvasive in vivo monitoringof methemoglobin formation and reduction with broadband diffuseoptical spectroscopy.J.Appl.Physiology 100：615-622。如本领域中所知的，蛋白质和氨基酸的氧化产生超微弱光子发射。本发明远程检测装置可包括检测与男胎或女胎相关的超微弱光子发射的敏感光电倍增体系(通过超微弱光子发射(UPE)测量非侵入地检测皮肤氧化应激[联网]，[检索于2009年3月2日]。检索自互联网<URL：http://www.find-health-articles.com/rec_pub_18211608-non-invasive-monitoring-oxidative-skin-stress-ultraweak-photon.htm>)。本发明远程检测装置可包括通过使用氧化还原敏感性顺磁性对比剂的电子顺磁共振成像(EPRI)。Yamada等人Feasibility and assessment ofnon-invasive in vivo redox status using electron paramagneticresonance imaging(EPRI).Acta Radiol.43(4)：433-40(2002)。本发明远程检测装置可包括测量器官的表面氧张力。Miller A.T.Jr北卡罗来纳州大学教堂山分校.Tissue oxygen tension and the intracellularoxidation-reduction state.Personal communication。其他合适的方式也可用于本发明远程检测装置中。参见，Wang.Remote electrochemicalsensors for monitoring organic and inorganic pollutants.Trends in Anal. Chem.16：84(1997)。Balcom等人Spatial and temporal visualizationof two aqueous iron oxidation-reduction reactions by nuclear magneticresonance imaging.J.Chem Soc.Chem.Comm.1992：312-313。Livesey等人Measurement of tissue oxidation-reduction state withcarbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy.Cancer Research.49：1937-1940(1989)。

氧化还原指示剂的变化可用科学仪器例如分光光度计、荧光计、浊度计(turbiditimeter)、照度计、荧光计或色度计进行分析。显色分子颜色的变化也可目视观察。氧化还原指示剂的变化可转化成数字信号，该数字信号可被数字、电子或其他感测科学仪器或材料处理。该科学仪器可使用任何合适的方式，例如电子编程，将测定结果转化成数字文本响应。在一个实施方式中，当测定结果揭示体液来自怀有男胎的女性时该仪器示出文本“它是男孩”，而当测定结果揭示体液来自怀有女胎的女性时该仪器示出文本“它是女孩”。类似地，对于未妊娠女性体液的受孕前测定，如果在特定月经周期中产生的卵子适合于通过携带Y染色体的精子受精，则该仪器可示出“男婴时间”，而如果在特定月经周期中产生的卵子适合于通过携带X染色体的精子受精，则该仪器可示出“女婴时间”。

体液的总氧化还原活性可使用电化学传感器测定，在被还原或氧化后该电化学传感器能够产生电化学可检测信号。在这种情况下，可使用包含氧化还原指示剂并具有一次性(可任意处理，disposable)的电化学电池例如薄层电化学电池的检测装置。感测电极可由铂、钯、碳、氧化铟、金、铱、铜、钢或其混合物组成。美国专利第6,638,415号。WO2002/006806。碳纳米管可用于电化学感测。当碳纳米管在电化学反应中用作电极材料时，碳纳米管具有促进电子转移反应的能力。美国专利公开第20060096870号。利用单个法拉第电极的电化学和电致化学发光可用于本发明方法。它由法拉第工作电极和电容反电极构成。当在体液存在的情况下提供电能时，法拉第电荷将发生转移，其中(i)光、(ii)电流、(iii)电压和(iv)电荷中的至少一个可被测量，从而确定样品中分析物的存在或量。WO2007/053191。

体液的总氧化还原活性可采用任何合适的化学、物理、生物化学或生物方式测定。体液的总氧化还原活性可通过使体液与至少一种微生物例如细菌接触，并观测生理反应例如有色产物的生成、细菌纤毛的运动来测定。体液的总氧化还原活性可通过氧化还原敏感性绿色荧光蛋白(GFP)测定。Dooley等人Imaging dynamic redoxchanges in mammalian cells with GFP indicators.J.Biol.Chem.279，24：22284-22293(2004)。体液的总氧化还原活性可通过测定荧光而测量。在一个实施方式中，使用5-氰基-2，3-双甲苯基四唑氯化物(CTC)用于本发明测定法。CTC的氧化形式是无色和无荧光的，其容易被还原成有荧光的、不溶的CTC-甲臜(formazan)形式。

本发明方法可进行改进从而允许采用例如微孔板(microplate)或微阵列测试许多样品并同时读出结果。

本发明还提供了一种制品，例如试剂盒，包括：(a)尿液收集瓶；(b)包含氧化还原指示剂的固体基质，其中该氧化还原指示剂包含至少一种显色化学品；(c)指导妇女收集尿液并使该尿液与固体基质接触的印刷材料；以及(d)指导妇女将尿液样品的氧化还原活性与至少一种标准品进行比较，从而基于显色化学品的颜色变化确定未出生胎儿性别的印刷材料。该试剂盒也可包括用于处理体液和/或测定体液的总氧化还原活性的其他化学品。该印刷物也可指示，为了确定未出生胎儿性别，可使用所附化学品来测定体液的总氧化还原活性，将该活性与标准品进行比较。印刷材料可指导在使尿液与固体基质接触之前对尿液进行处理。该印刷物可就如何使用所附化学品用于测试提供指导。该印刷物中可包括指导的图示描述。该印刷物可指示，体液可在从错过月经第一天开始妊娠期间的任何时间收集。该印刷物也可指示，如果体液是在妊娠第5周与第15周之间收集的则可获得最佳结果。该印刷物可包括用于结果解释的颜色标准，并指示与男(或女)胎相关的颜色(或颜色范围)。可提供预先测量的量的化学品并且可以是溶液、固态晶体或干膜形式。该化学品可放置在加盖的瓶或瓶子中，并放置在隔室(separatecompartments)中。该化学品可被吸附或保留到固体载体上并相继设置从而形成滴流柱(trickling column)，以便确保各个过程以期望的顺序进行。试剂盒可包括以足够用于一次、两次或多次测定的量的化学品。

本发明进一步提供了一种制品，例如试剂盒，包括用于处理和/或测定体液例如尿液的总氧化还原活性的必需化学品、以及印刷物，该印刷物指示，为了确定对于怀上期望性别的婴儿的适合月经周期，所附化学品可用于测定至少两个连续月经周期中体液的总氧化还原活性。该印刷物可指示，体液可在月经周期期间的任何时间收集。该印刷物还可指示，如果体液是在排卵期左右收集的则可获得最佳结果。该印刷物就如何将所附化学品用于测试提供了指导。该印刷物也可包括用于结果解释的颜色标准，并指示与适合于通过携带Y染色体的精子受精的卵子，或与适合于通过携带X染色体的精子受精的卵子相关的颜色(或颜色范围)。该印刷物指示两种类型的卵子是隔月产生的，并建议想要男(或女)婴的妇女，从排出适合于通过携带Y染色体(或携带X染色体)的精子受精的卵子的月份开始隔月尝试受孕。

氧化还原活性可在固体基质上测量，该固体基质包含氧化还原指示剂，例如显色化学品。该显色化学品可浸渍在条带上。本发明的制品可以是测试带(test strip)。该测试带可具有其中可施加有体液的样品施加部位。该体液然后可通过各种老化、处理、过滤、吸附或色谱介质，其最终通过与至少一种氧化还原指示剂反应进行分析样品的总还原或氧化活性的步骤。该测试带可具有多于一个的样品施加部位，使得体液可同时施加在条带上多于一个的部位。施加在条带上不同部位的相同体液可经受不同处理，并可与不同显色化学品或氧化还原指示剂接触(meet)。然后，可基于颜色或其他可测量信号的具体模式，评价样品的总还原或氧化活性。

本发明的方法可用于测试取自任何哺乳动物，例如，人、马、狗、猴、羊、猪和猫的体液。

实施例示出了本发明的实施方式，但不应将其视为限制本发明。

实施例1-受孕后测定法

表2列出了在1999年与2008年之间的时间段对4,524个妇女进行的受孕后测试的结果，平均观测准确率为约90％。

在初始阶段，即，从1999年到2003年年中，使用水杨酸钠作为氧化还原指示剂结合分光光度术测试尿液样品(参见实施例4)。PTA测试(参见实施例2)开始于2002年。从2008年以后进行FRAP测定(参见实施例3)。

表2

从1999年到2001年，我们测试了在错过月经日期21天之后收集的尿液样品。自从2005年以后，我们测试了错过月经1天，即妊娠第五周收集的尿液样品。

如果尿液样品老化较长时间段，则本发明方法的准确率可达100％。但从临床前景来看，老化尿液较长时间段是不适用的。因此，开发了通过物理、化学或生物化学方式加速老化进程的技术。

实施例2-用于PTA测定法的尿液样品处理

对于PTA测定法，如下收集和处理尿液样品。受孕后尿液样品是从约2,782个女性中在从错过月经前4天到妊娠第20周范围内的妊娠各个时间点收集的。将尿液样品收集瓶分派(运送，ship)给用户，其中在该瓶中具有硼酸片剂作为防腐剂。要求用户在至少两天中收集包括清晨的休息期期间排出的尿液。对于晚上工作的用户则要求在三个连续休息期中收集白天的尿液。该样品被邮寄回诊所，取决于距离这需要2至5天。尿液样品的邮寄递送提供了样品老化的时间段。该尿液样品可进一步在室温下老化更长的时间段。

然后如下处理尿液。使2ml尿液样品通过酸性氧化铝，从而除去大量的色素和葡萄糖。通过甲醇活化C18柱，并用水预平衡。然后将澄清的尿液样品加载到该C18柱上，从而进行固相提取(SPE)。在尿液样品通过C18柱之后，约95％的性激素保留在柱上。通过或未粘合到该柱的尿液样品组分称为组分(部分，Fraction)A。然后用50μl的10％Na₂HPO₄和过量的磷酸钙(约160mg)处理组分A，从而除去胆红素、尿胆素原、卟啉、以及其他色素。将50μl饱和的氯化汞加入到组分A中从而沉淀尿酸、抗坏血酸、肌酸以及一些干扰性蛋白质。然后将50μl的10％的醋酸铅溶液加入到组分A中，从而除去肌酸、一些干扰性蛋白质和胆红素。将10mg氯化钡晶体加入到组分A中，从而除去胆红素、剩余的干扰性蛋白质和一些干扰性无机氧化剂/还原剂。然后用50μl至70μl的1M氢氧化钠将组分A的pH调节至8.5，接着离心或过滤从而除去不溶组分。

在PTA测试中，将20mg结晶磷钨酸加入到0.75ml的组分A中，并将溶液保持在21℃以下12小时。如果在12小时之后该溶液变成稳定的白色荧光胶体悬浮液，则报告该尿液样品来自怀有男胎的女性。如果该溶液最初形成白色沉淀物，后来该白色沉淀物消失从而产生透明溶液，则报告该尿液样品来自怀有女胎的女性。对老化不同时间段的同一尿液样品的重复分析提高了分析结果的准确率。

实施例3-用于FRAP测定法的尿液样品的处理

对于FRAP测定法，如下处理尿液样品。如同上述实施例2处理尿液样品，然而，在这种情况下洗脱保留在C18柱上的组分并进行测试。

使2ml尿液样品通过酸性氧化铝，从而除去大量的色素和葡萄糖。通过甲醇活化C18柱，并用水预平衡。然后将澄清的尿液样品加载到该C18柱上。在尿液样品通过C18柱之后，约95％的性激素保留在该柱上，然后用1ml HPLC级甲醇洗脱并称为组分B。用2ml水稀释组分B。将2.5ml的稀释组分B与2.5ml的0.2M磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和2.5ml的1％铁氰化钾混合。将该混合物在50℃下温育20分钟并冷却到室温。然后将该混合物与2.5ml的10％三氯乙酸混合，并在6500rpm下离心10分钟。将上清液(2.5ml)与2.5ml蒸馏水混合，之后加入0.5ml的0.1％的氯化铁。在这个测定法中，在加入氯化铁之后的1分钟内读出结果，因为该结果在较晚的时间点是不稳定的。

如果在FRAP测定之后组分B变成深蓝色，则报告该尿液样品来自怀有男胎的女性。如果在FRAP测定之后组分B变成金黄色、浅黄色或浅绿色，则报告该尿液样品来自怀有女胎的女性。对老化不同时间段的同一尿液样品的重复分析提高了分析结果的准确率。

如果通过多于一种类型的测定法分析同一尿液样品，我们发现该结果的准确率可达到100％。例如，如果在12小时之后对组分A的PTA测试产生稳定的白色荧光胶体悬浮液，且对组分B的FRAP测试产生深蓝色溶液，则该尿液样品与男胎相关的准确率几乎是100％。类似地，如果在12小时之后对组分A的PTA测试产生透明溶液，且对组分B的FRAP测试产生颜色为金黄色、浅黄色或浅绿色的溶液，则该尿液样品与女胎相关的准确率接近于100％。

可替换地，也可对组分A进行FRAP测试。当尿液样品在室温下老化至少3个月时，进行这种方法的准确率接近于100％。

实施例4-利用水杨酸钠的氧化还原活性测定法

如下使用水杨酸钠处理和测定尿液样品。对于受孕后尿液样品测定，要求用户在连续三个早晨收集清晨尿液样品，并要求用户将它们放到(drop off)诊所。单独研究同一用户的所有三个样品并在合并结果之后发布报告。为了处理尿液样品，用20mg醋酸铅处理4ml尿液样品30分钟从而沉淀干扰性蛋白质。将1ml处理的尿液样品和1ml 0.75M的盐酸加入到10ml玻璃瓶中，之后向该瓶中缓慢加入1ml的1％水杨酸钠，轻轻摇动该瓶从而混合试剂。还包括测试用对照，其中将1ml蒸馏水代替1ml的1％水杨酸钠加入到该瓶中。在50℃下温育该反应混合物2小时，然后冷却到室温。然后在分光光度计中相对于对照测量该反应混合物在波长470nm至550nm之间处的吸光度。当在波长510nm附近观测到峰值时，将这个样品的结果记录为男胎。当在波长510nm附近观测到谷值(trough)或直线基线时，将这个样品的结果记录为女胎。

实施例5-利用Fe(III)-TPTZ的FRAP测定法

Fe(III)-TPTZ也可用作FRAP测定法的氧化还原指示剂。在酸性条件下，Fe(III)-TPTZ络合物可被还原成Fe(II)-TPTZ。Fe(II)-TPTZ具有明亮的蓝色并可在波长593nm处监测。FRAP工作溶液(working solution)是通过混合10ml 300mmol/l醋酸盐缓冲液(pH3.6)、在40mmol/l HCl溶液中的1.0ml 10mmol/l TPTZ(2，4，6-三吡啶基均三嗪(2，4，6-tripyridyl-s-triazine))、和1.0ml 20mmol/lFeCl₃·6H₂O溶液而新鲜制备的。

将2滴处理的尿液样品加入到0.5ml FRAP工作溶液中，并温育该溶液10分钟。在FRAP测定法的苛刻条件下，怀有男胎的女性尿液与怀有女胎的女性尿液相比具有相对较高的总还原活性。因此，怀有男胎的女性尿液样品能够将Fe(III)-TPTZ还原成Fe(II)-TPTZ，反应混合物变成深蓝色。相反，怀有女胎的女性尿液样品不能还原Fe(III)-TPTZ，因而，该反应混合物仍然为黄色。当尿液样品在室温下老化至少3个月时，在161个尿液样品上实施的这种方法的准确率接近于100％。在161个尿液样品中，67个样品来自怀有男胎的女性；94个样品来自怀有女胎的女性。

实施例6-利用聚苯胺涂覆的膜的氧化还原活性测定法

聚苯胺涂覆的膜是通过在聚(对苯二甲酸亚乙酯)的透明膜上化学沉积聚苯胺而制备的。100ml的反应混合物包含1M硫酸、1ml苯胺、0.9g的碘酸钾和1g的5-磺基水杨酸。美国专利第5,451,526号。在室温下2.5小时的沉积时间用于产生聚苯胺膜。仔细清洗该膜两侧上的聚苯胺涂层从而除去疏松沉积物。干燥该膜，将其切割成小块(3mm×2.0cm)，并且在使用前存储在干净容器中。使用前立即在酸性氯化铁溶液中平衡该膜2分钟，从而将所有聚苯胺转化成为其氧化态的翠绿亚胺(emaraldine)态。使1.75ml的尿液通过160mg的酸性氧化铝柱进行处理，并将其转移到比色皿中。聚苯胺涂覆的膜用去离子水仔细清洗并转移到含有老化或处理的尿液的比色皿中。在分光光度计上在波长630nm处读出比色皿中液体的光密度。可替换地，在清洗之后，将该膜浸泡在纯化的尿液组分中1秒，之后取出目视观测其颜色变化。在这种测定法的温和条件下，怀有女胎的女性的老化和处理的尿液与怀有男胎的女性尿液相比具有相对较高的总还原活性，因此能够将翠绿亚胺形式的聚苯胺(蓝色)还原成其还原性更强的完全还原态聚苯胺(leucoemeraldine)态(灰白色)。怀有男胎的女性的老化和处理的尿液样品不与翠绿亚胺形式的聚苯胺(蓝色)反应。因此，该膜的颜色仍然是蓝色。当新鲜尿液样品在未处理的情况下使用时，未在这个测试中观测到任何不同。

实施例7-受孕前测定法

在女性受孕的月经周期中体液的总氧化还原活性与受孕之后其体液的氧化还原活性相似。即，如果在苛刻条件下(例如，在FRAP测定中)，她的受孕前体液与带有适合于通过携带X染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性体液相比具有相对较高的总还原活性，则她的卵子适合于通过携带Y染色体的精子受精。一致地，她的受孕后尿液样品与怀有女胎的女性尿液相比也会具有较高的总还原活性，这与男胎相关。相反地，如果在苛刻条件下她的受孕前尿液样品与带有适合于通过携带Y染色体的精子受精的卵子的未妊娠女性尿液相比具有较高的总氧化活性，则她的卵子适合于通过携带X染色体的精子受精。同样地，她的受孕后尿液样品与怀有男胎的女性尿液相比也会具有较高的总氧化活性，这与女胎相关。

FRAP测定法用于测试从同一用户获取的受孕前和受孕后尿液样品。在至少两个连续月的排卵期期间收集受孕前尿液样品。在错过月经第一或第二天收集受孕后尿液样品。如果受孕前样品指示交替的排卵模式，则如下建议用户。如果用户想要男婴，则建议她在产生的卵子适合于通过携带Y染色体的精子受精的月份尝试受孕。如果用户想要女婴，则建议她在产生的卵子适合于通过携带X染色体的精子受精的月份尝试受孕。

对于其尿液样品指示在连续两个月中释放的卵子具有相同的性别特异适合性的那些用户，建议她们收集更多的尿液样品用于附加测试。但此类用户不希望花费更多费用，因此在初步测试之后没有继续测试。

表3列出了我们在2006年与2008年8月之间的时间段对130个用户进行的受孕前测试结果。

表3

^*作为政策，由于保密考虑，我们从未向用户索要反馈。

实施例8-12示出了在测定尿液样品的总氧化还原活性之前对其处理的各种方法。

实施例8-利用酸性氧化铝、氯化钙和醋酸铅处理尿液样品

用1M HCl将3ml尿液样品的pH调节至6.4。然后离心该尿液样品从而除去不溶组分。将上清液加载到含有200mg酸性氧化铝的柱上从而除去干扰剂。然后将50μl的10％Na₂HP0₄和80mg氯化钙加入到该澄清的尿液样品中。在室温下温育该反应混合物5分钟。将10mg醋酸铅加入到该样品中，摇动试管直至所有醋酸铅溶解。在5分钟之后，用2.5M NaOH将该样品的pH调节至8.5。然后在12000rpm下离心该样品2分钟从而除去不溶组分。然后采用PTA或FRAP测定法测定处理的尿液样品(实施例2和3)。

实施例9-利用硫酸和弗洛里西处理尿液样品

将1ml新鲜尿液加入到微量离心管中并在冰上孵育。将浓硫酸缓慢加入到尿液样品中，使其在尿液样品中达到3M的最终浓度。缓慢反转该微量离心管数次并在37℃下温育该混合物24小时。然后在12000rpm下离心该样品2分钟，之后使上清液通过弗洛里西从而产生处理的尿液样品。然后将10mg的结晶磷-24-钨酸加入到0.75ml该处理的尿液样品中，并且进行PTA测定法(实施例2)。

实施例10-利用离子交换树脂处理尿液样品

用稀释的冰醋酸将2ml尿液样品的pH调节至5.3。然后在12000rpm下离心该尿液样品2分钟。将上清液分批用160mg充分清洗的DowexTM树脂(Dow化学公司)1X 8-100目Cl-型离子交换树脂处理从而除去卟啉。然后按照实施例8中描述的对该澄清的尿液样品进行处理。采用PTA或FRAP测定法测定该处理的尿液样品(实施例2和3)。

实施例11-利用尼龙过滤器处理尿液样品

用1M HCl将2ml尿液样品的pH调节至4.0，之后在12000rpm下离心该尿液样品2分钟。使上清液通过0.2μm尼龙过滤器从而除去卟啉。然后按照实施例8中描述的对该澄清的尿液样品进行处理。

实施例12-利用酸性氧化铝和滑石处理尿液样品

为了开发基于家庭(home based)的性别测试，将2ml尿液样品加入到200mg酸性氧化铝和滑石中，并摇动该管从而确保混合。在室温下温育该样品5分钟，之后过滤样品从而获得处理的尿液样品。采用FRAP测定法测定处理的尿液样品(实施例3)。

本发明的范围不受上文具体示出和描述的内容限制。本领域技术人员将认识到所描述的材料、配置、构造和尺寸的实例存在合适的替代方式。在本发明的说明书中引用并讨论了包括专利和各种出版物的许多参考文献。提供这些参考文献的引用和讨论仅仅是为了使本发明的描述变得清楚，而不是承认任何参考文献都是本文描述的发明的现有技术。说明书中引用和讨论的所有参考文献以引用方式整体结合在此。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员会想到本文描述的发明的变型、改变和其他实施方式。尽管已经示出和描述了本发明的某些实施方式，但对本领域技术人员来说显而易见的是在不偏离本发明的精神和范围的情况下可作出多种变化和改变。上述说明书和附图中陈述的内容仅通过示例的方式提供，而不是作为限制。

Claims

1.一种确定未出生胎儿的性别的方法，包括以下步骤：

(a)使妊娠女性的体液与至少一种氧化还原指示剂接触；

(b)测量所述体液的氧化还原活性；以及

(c)将所述体液的氧化还原活性与至少一种标准品进行比较，从而确定所述未出生胎儿的性别。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体液选自由尿液、泪液、唾液、汗液、血液、血浆、血清、脑脊液和羊水组成的组。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述体液是尿液。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体液在从错过月经约第一天到妊娠约40周范围内的时间段取得。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述体液在从妊娠约5周到妊娠约15周范围内的时间段取得。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氧化还原指示剂包含杂多酸或其盐。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述杂多酸是磷-24-钨酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氧化还原指示剂是显色化学品。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述显色化学品包含氧化还原敏感性金属离子。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述金属离子选自由氧化态的铜、铁、铬、钨和钼离子组成的组。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述显色化学品选自由三价铁三吡啶基三嗪(Fe(III)-TPTZ)络合物和铁氰化钾组成的组。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氧化还原活性利用自由基测量。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述自由基是羟基。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，使用水杨酸钠作为氧化还原指示剂。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氧化还原活性利用电化学传感器测量。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氧化还原活性在包含氧化还原指示剂的固体基质上测量。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述氧化还原指示剂是显色化学品。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述显色化学品浸渍在条带上。

19.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前处理所述体液的步骤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述体液是尿液。

21.根据权利要求19所述的方法，其中，在步骤(a)之前在从约20℃到约30℃范围内的室温下老化所述体液至少约1周。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，在步骤(a)之前在室温下老化所述体液从约1周到52周范围内的时间段。

23.根据权利要求19所述的方法，其中，所述处理包括化学、生物化学、物理或生物方式。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述处理包括酶处理。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述处理包括提取。

26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述处理包括纯化。

27.根据权利要求19所述的方法，其中，所述处理包括使用选自由滑石、二氧化硅基颗粒如硅胶、氧化铝、弗洛西里、活性炭、高岭土、刀豆素A及其结合物、磷酸钙、氢氧化钙、氯化钙、溴化十六烷基三甲铵、凝集素、蛋白质或糖蛋白水解酶、玻璃纤维过滤器、离子交换树脂、亲和配体、有机溶剂、固相提取剂、尺寸排阻筛、以及反相色谱材料组成的组中的吸附剂。

28.根据权利要求19所述的方法，其中，所述处理包括使用沉淀剂。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述沉淀剂包括选自由钡、铅、钼和钨组成的组中的重金属。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述沉淀剂选自由氯化钡、氢氧化钡、氯化锌、氯化汞、醋酸铅、硫酸铵、葡聚糖、乙腈、氯仿、氢氧化钠、三氯乙酸、碘酸钾和它们的混合物组成的组。

31.一种试剂盒，包括：

(a)尿液收集瓶；

(b)包含氧化还原指示剂的固体基质，其中，所述氧化还原指示剂包含至少一种显色化学品；

(c)指导妇女收集尿液并使所述尿液与所述固体基质接触的印刷材料；以及

(d)指导妇女将所述尿液样品的氧化还原活性与至少一种标准品进行比较从而基于所述显色化学品的颜色变化确定未出生胎儿的性别的印刷材料。

32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括处理尿液的化学品。

33.根据权利要求31所述的试剂盒，其中，所述印刷材料进一步指导妇女在使所述尿液与所述固体基质接触之前处理所述尿液。

34.一种受孕前婴儿性别设计的方法，包括以下步骤：

(a)使未妊娠女性的体液与至少一种氧化还原指示剂接触；

(b)测量所述体液的氧化还原活性；以及

(c)将所述体液的氧化还原活性与至少一种标准品进行比较，从而确定月经周期中释放的卵子的性别特异适合性。

35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述体液是尿液。

36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述体液在接近排卵或月经周期中期取得。

37.根据权利要求34所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前处理所述体液的步骤。